專利名稱：自動多糖比色分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及自動測定糖濃度的方法。

背景技術(shù)：
測量各種樣品中的糖含量是許多科學(xué)領(lǐng)域中的基本分析操作。眾所周知的測定糖濃度的比色法包括使用蒽酮(R.多雷伍德(Dreywood，R.)，工業(yè)與工程化學(xué)(Ind.EngChem.)，分析版(Anal.Ed.)18499，1946；E.E.莫斯(Morse，E.E.)，分析化學(xué)(Anal.Chem.)191012，1947；和D.L.莫里斯(Morris，D.L.)，科學(xué)(Science)107254，1948)、酚試劑(杜波斯(Dubois)等人，自然(Nature)168167，1951；杜波斯(Dubois)等人，分析化學(xué)(Anal.Chem.)28350-56，1956；以及布魯曼坎茲(Blumenkrantz)和埃斯波-漢森(Asboe-Hansen)，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)54484，1973)、地衣酚(orcinol)(埃文(Irwin)和里韋爾(Leaver)，自然(Nature)1771126，1956)和間苯二酚(莫塞尼(Monsigny)等人，分析生物化學(xué)(Anal.Biochem.)175525-30，1988)進(jìn)行的分析。蒽酮分析用于測量含有中性己糖的多糖的糖濃度，而酚試劑(例如，間羥基聯(lián)苯(mHDP)/3-苯基苯酚)則用于測量含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸單糖的多糖的糖濃度。
用于糖濃度測定的各種比色分析內(nèi)可變性的來源包括與操作人員進(jìn)行樣品制備和測量有關(guān)的因素，諸如樣品處理、試劑稀釋、試劑的不穩(wěn)定性、加熱和冷卻時間的變化等。取樣困難是應(yīng)用許多所述分析時所固有的，這是因?yàn)橥ǔＰ枰獜暮量?毫升濃度稀釋到微克/毫升濃度，以使樣品達(dá)到相對于標(biāo)準(zhǔn)品可定量的程度。盡管存在嚴(yán)格的方案，但取樣的困難(即，需要操作人員將濃溶液稀釋成極稀溶液)阻礙了這些分析發(fā)展成進(jìn)行藥品調(diào)配和標(biāo)示量(label claim)調(diào)配的準(zhǔn)確可靠的分析。因此，仍需要開發(fā)出自動測定糖濃度的有效方法。


發(fā)明內(nèi)容
本文提供一種自動測定糖濃度的方法。所述方法包括(1)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液(working stock solution)從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分酸試劑從酸試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)振蕩所述多孔板；和(12)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，其中步驟1-12是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
在一個實(shí)施例中，在將所述多孔板冷卻后執(zhí)行額外步驟，即將一部分顯色劑從顯色劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中。
欲使用本發(fā)明的方法分析糖濃度的多糖試樣包括含有細(xì)菌莢膜多糖、活性細(xì)菌莢膜多糖或細(xì)菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)連結(jié)物的試樣。示范性細(xì)菌莢膜多糖包括來自腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis，Nm)血清群Y和W135；B群鏈球菌(Group B Streptococcus，GBS)血清型Ia和III；和肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F的細(xì)菌莢膜多糖。
在另一個實(shí)施例中，所述方法包括(1)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，所述糖工作儲備液包括一種或多種選自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙?；?D-半乳糖胺和N-乙?；?D-甘露糖胺組成的群組的糖，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包括選自由肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分硫酸-蒽酮試劑從硫酸-蒽酮試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)振蕩所述多孔板；和(12)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，其中步驟1-12是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
在另一個實(shí)施例中，所述方法包括(1)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，所述糖工作儲備液包括半乳糖醛酸，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包括選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分硫酸-四硼酸鹽試劑從硫酸-四硼酸鹽試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)將一部分包括間羥基聯(lián)苯的顯色劑從顯色劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(12)振蕩所述多孔板；和(13)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，其中步驟1-13是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
由于排除了傳統(tǒng)糖濃度測定分析中與操作人員進(jìn)行樣品制備和測量有關(guān)的因素(例如，樣品處理和溶劑稀釋)，故使用本發(fā)明的方法改進(jìn)了糖濃度測定的準(zhǔn)確性。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明提供一種針對自動測定糖濃度的方法。具體說來，所述方法包括(1)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包括以下步驟(a)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，和(c)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；(2)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包括以下步驟(a)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中，(b)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中，和(c)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；(3)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；(4)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(5)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；(6)將一部分酸試劑從酸試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；(7)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；(8)用蓋子覆蓋所述多孔板；(9)加熱所述多孔板；(10)冷卻所述多孔板；(11)振蕩所述多孔板；和(12)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，其中步驟1-12是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
“糖標(biāo)準(zhǔn)品”是指各標(biāo)準(zhǔn)品具有已知的糖濃度的一系列標(biāo)準(zhǔn)品。所述一系列標(biāo)準(zhǔn)品可包括例如濃度在2.5nM到100nM范圍內(nèi)，諸如濃度為2.5nM、5nM、10nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM和100nM的糖。將理論標(biāo)準(zhǔn)品濃度(例如，nM)對所述一系列標(biāo)準(zhǔn)品中各標(biāo)準(zhǔn)品濃度的一組相同樣品的平均吸光度測量值作圖，并通過線性回歸分析計算斜率、y截距和相關(guān)系數(shù)(r)，產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。
如本文所使用，術(shù)語“糖工作儲備液”包括具有糖組合物的溶液，所述糖組合物反映來自特定細(xì)菌的莢膜多糖的多糖重復(fù)單元的組成。示范性細(xì)菌包括腦膜炎奈瑟菌血清群Y(葡萄糖重復(fù)單元)、腦膜炎奈瑟菌血清群W135(半乳糖重復(fù)單元)、B群鏈球菌血清型Ia(葡萄糖/半乳糖重復(fù)單元)、B群鏈球菌血清型III(葡萄糖/半乳糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型1(半乳糖醛酸重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型3(葡萄糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型4(半乳糖/N-乙?；?D-半乳糖胺/N-乙酰基-D-甘露糖胺/丙酮酸重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型5(半乳糖醛酸重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型6A(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型6B(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型7F(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型9V(葡萄糖/半乳糖/半乳糖醛酸重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型14(葡萄糖/半乳糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型18C(半乳糖/葡萄糖/鼠李糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型19A(葡萄糖/鼠李糖重復(fù)單元)、肺炎鏈球菌血清型19F(葡萄糖/鼠李糖重復(fù)單元)和肺炎鏈球菌血清型23F(半乳糖/鼠李糖/葡萄糖重復(fù)單元)。
“源容器”(如糖工作儲備液源容器、糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器、多糖試樣源容器和多糖試樣接收容器中所用)是指在儲存和操作期間可用于容納液體溶液的任何接受器(receptacle)。所屬領(lǐng)域中眾所周知此類容器，并且其包括(但不限于)玻璃試管、塑料試管、玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料離心管和塑料微量離心管。
如本文所使用，“轉(zhuǎn)移”(如在轉(zhuǎn)移一部分糖工作儲備液、轉(zhuǎn)移一部分稀釋劑、轉(zhuǎn)移一部分多糖試樣、轉(zhuǎn)移所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分、轉(zhuǎn)移所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分和轉(zhuǎn)移一部分酸試劑中所用)包括將液體從源容器運(yùn)輸或移動到接收容器，或?qū)⒁后w從源容器/接收容器運(yùn)輸或移動到多孔板的孔中。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，可通過自動液體處理裝置實(shí)現(xiàn)液體的轉(zhuǎn)移。所述裝置一般使用一個或多個能同時轉(zhuǎn)移多個液體樣品的多通道移液歧管(multichannel pipette manifold)。
“稀釋劑”是指用于實(shí)現(xiàn)例如糖工作儲備液或多糖試樣的稀釋的試劑，以及用作“空白”(即，不含糖/多糖)以進(jìn)行依賴于輻射能吸收測量值的糖濃度測定的試劑。本發(fā)明所用的稀釋劑例如包括注射用水(WFI)、生理鹽水(即，0.9％NaCl)和琥珀酸鹽緩沖的生理鹽水?！盎旌稀笔侵冈诮邮杖萜骰蚨嗫装宓目字袑⒏鞣N組分相混或摻合。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，可通過多種方式，例如包括反復(fù)移液(諸如通過自動液體處理裝置執(zhí)行)和振蕩(諸如通過板振蕩器執(zhí)行)，來實(shí)現(xiàn)液體組分的混合。
如本文所使用，“多糖試樣”包括含有已知組成的多糖的樣品。試樣中多糖的組成須為已知的，因?yàn)槭鞘褂脧睦糜蛇m當(dāng)糖標(biāo)準(zhǔn)品得到的吸光度數(shù)據(jù)產(chǎn)生的線性回歸線獲得的方程，通過測定所存在的糖重復(fù)單元的量(例如，以納摩爾濃度為單位)，來得到糖濃度。用特定血清型多糖重復(fù)單元的分子量乘以由適當(dāng)線性回歸線獲得的多糖重復(fù)單元的納摩爾濃度，將提供多糖試樣中所存在的多糖重復(fù)單元的納克數(shù)。
已知組成的多糖的實(shí)例包括諸如來自腦膜炎奈瑟菌血清群Y、腦膜炎奈瑟菌血清群W135、B群鏈球菌血清型Ia、B群鏈球菌血清型III、肺炎鏈球菌血清型1、肺炎鏈球菌血清型3、肺炎鏈球菌血清型4、肺炎鏈球菌血清型5、肺炎鏈球菌血清型6A、肺炎鏈球菌血清型6B、肺炎鏈球菌血清型7F、肺炎鏈球菌血清型9V、肺炎鏈球菌血清型14、肺炎鏈球菌血清型18C、肺炎鏈球菌血清型19A、肺炎鏈球菌血清型19F和肺炎鏈球菌血清型23F的細(xì)菌莢膜多糖。試樣中所含多糖可為未經(jīng)修飾的、經(jīng)活化的(即，經(jīng)修飾以促進(jìn)其連結(jié))、經(jīng)連結(jié)的(例如，與諸如CRM197等載體蛋白連結(jié))或其任何組合。“稀釋過的多糖試樣”是指添加過稀釋劑的多糖試樣。
如本文所使用，“酸試劑”包括具有酸性pH值的試劑。在優(yōu)選實(shí)施例中，酸試劑包括硫酸。在一些實(shí)施例中，除硫酸外，酸試劑還包括蒽酮。在其它實(shí)施例中，除硫酸外，酸試劑還包括四硼酸鹽。
“加熱所述多孔板”是指增加多孔板各孔中內(nèi)容物的溫度。酸pH值(即，如由酸試劑提供)與熱的組合可將多糖分解成其組成單糖。對于本發(fā)明的方法，在高于環(huán)境溫度且至多100℃溫度的溫度下，諸如在75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、96℃、97℃、98℃和99℃下，加熱多孔板。在優(yōu)選實(shí)施例中，在95±5℃下，將多孔板加熱10±2分鐘。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知，將多糖分解成其組成單糖所需的加熱的時間量尤其視加熱多糖的溫度而定；溫度越低，需要加熱的時間越長。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員將有能力根據(jù)所用溫度調(diào)節(jié)加熱的時間?？赏ㄟ^所屬領(lǐng)域中眾所周知的任何方法，諸如將多孔板放入水浴中或放在加熱板上，來實(shí)現(xiàn)多孔板的加熱。
“冷卻所述多孔板”是指降低多孔板各孔中內(nèi)容物的溫度?？赏ㄟ^所屬領(lǐng)域中眾所周知的任何方法，諸如將板從其熱源移開并使其在環(huán)境溫度下冷卻，來實(shí)現(xiàn)多孔板的冷卻。或者，可將板轉(zhuǎn)移到溫度(諸如4℃)低于環(huán)境溫度的環(huán)境(例如，冰箱或水浴)中。
如本文所使用，“振蕩所述多孔板”包括攪動多孔板以混合其孔中的內(nèi)容物。在本發(fā)明的方法中，可使用諸如板振蕩器等所屬領(lǐng)域眾所周知的任何裝置，實(shí)現(xiàn)多孔板的振蕩。“測量所述多孔板中所有所述一系列孔的內(nèi)容物的吸光度”是指使用分光光度計測量含有空白的一系列孔、含有糖標(biāo)準(zhǔn)品的一系列孔以及含有多糖試樣的一系列孔的吸光度。對于重復(fù)單元中含有諸如半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等中性己糖的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)，使用硫酸-蒽酮試劑，并測定吸光度。在一些實(shí)施例中，在625nm下測定吸光度。對于重復(fù)單元中含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)，使用硫酸-四硼酸鹽試劑與mHDP，并測定吸光度。在一些實(shí)施例中，在520nm下測定吸光度。在本發(fā)明的方法中，通過包括空白、糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖試樣的多份相同樣品，諸如2、3、4、5、6份或更多份相同樣品，來增加準(zhǔn)確性。隨后測定空白、糖標(biāo)準(zhǔn)品和多糖試樣的一組相同樣品的平均吸光度。
在某些實(shí)施例中，本發(fā)明的方法包括在冷卻多孔板后，將一部分顯色劑從顯色劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板中所有含有稀釋劑、一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中。“顯色劑”是指包括在與糖反應(yīng)后形成可檢測(例如，利用分光光度計)顏色的物質(zhì)的組合物。示范性成色物質(zhì)包括蒽酮、mHDP和咔唑。
以下實(shí)例是出于說明目的提供，并且不用作限制。
實(shí)驗(yàn) 實(shí)例1測定糖含量的自動蒽酮分析 使用蒽酮分析，測定重復(fù)單元中含有諸如半乳糖、葡萄糖和鼠李糖等中性己糖的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)的糖含量。在硫酸和熱的作用下，將多糖分解成其組成單糖。蒽酮試劑與己糖反應(yīng)，形成黃綠色復(fù)合物，利用分光光度計(例如，在625nm下)讀取其吸光度；在分析范圍內(nèi)，吸光度與所存在的己糖的量成比例。
試劑制備 使用下式計算各血清型儲備液所需的糖重量，來制備50mM糖儲備液
分子量顯示于表I中。
表I-分子量 使用50mM糖儲備液，制備1.0mM(肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)和0.5mM(肺炎鏈球菌血清型18C)糖工作儲備液，以反映各血清型的多糖重復(fù)單元的組成(表II和III)。
表II-肺炎鏈球菌糖工作儲備液
表III-腦膜炎奈瑟菌/B群鏈球菌糖工作儲備液
通過將1.0g蒽酮與500ml硫酸混合，來制備酸試劑(0.2％蒽酮-硫酸)。
標(biāo)準(zhǔn)品制備 對于所有Nm、GBS和肺炎鏈球菌血清型(除18C外)，利用杰納斯(Janus)(珀金-埃爾默公司(Perkin-Elmer)，馬薩諸塞州沃爾瑟姆(Waltham，MA))自動液體處理系統(tǒng)，在數(shù)組每一濃度5個的微量離心管中，使用適于所分析血清型的1.0mM工作儲備液并將WFI作為稀釋劑，制備15nM、30nM、45nM和60nM糖標(biāo)準(zhǔn)品(1ml等分試樣)。對于肺炎鏈球菌血清型18C，使用0.5mM工作儲備液，制備7.5nM、15nM、22.5nM和30nM糖標(biāo)準(zhǔn)品(1ml等分試樣)。使用這些體積制得默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(default standardcurve)。
樣品制備 利用杰納斯自動液體處理系統(tǒng)，在數(shù)組每一稀釋液5個的微量離心管中，制備使樣品(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；以及GBS血清型Ia和III)達(dá)到分析范圍所需的稀釋液。可使用以下計算來估算所有Nm、GBS和肺炎鏈球菌血清型(除18C外)的樣品量
如果未完全確定樣品的預(yù)期濃度，則選擇一定范圍的稀釋度(例如，1∶50、1∶75、1∶100、1∶150和1∶200)，以使至少一種落在分析范圍內(nèi)。
程序 使用整合有萊伯威爾移動臂(labware movement arm)以及供讀取器整合、溫度控制和混合的輔助儀器的杰納斯自動液體處理系統(tǒng)，將一式五份100μl稀釋劑(例如，WFI)分配到多孔板5個孔中；稀釋劑用作空白。將一式五份100μl各適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品(例如，肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；Nm血清型Y和W135；或GBS血清型Ia和III)分配到多孔板5個孔中，同樣，將一式五份100μl各試樣分配到多孔板5個孔中。
將200μl酸試劑添加到各孔中，并利用反復(fù)移液，充分混合各孔的內(nèi)容物。將多孔板覆蓋(手工或經(jīng)由萊伯威爾移動臂)并在95±5℃加熱10±2分鐘，此后在環(huán)境溫度下冷卻≥10分鐘。通過萊伯威爾移動臂將多孔板放到讀板器上，輕柔振蕩并在625nm下測定各孔中內(nèi)容物的輻射能吸收。
使用肺炎鏈球菌血清型6A糖標(biāo)準(zhǔn)品和試樣執(zhí)行的自動操作的代表性實(shí)例顯示于表IV和表V中。
表IV-肺炎鏈球菌血清型6A 表V-肺炎鏈球菌血清型6A
使用9個不同的96孔板執(zhí)行9個實(shí)驗(yàn)；在各板上制備一式六份的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品。對于實(shí)驗(yàn)1-6，使用15nM、30nM和60nM標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。對于實(shí)驗(yàn)7-9，使用8nM、15nM、23nM和30nM標(biāo)準(zhǔn)品產(chǎn)生標(biāo)準(zhǔn)曲線。顯示樣品濃度(mg/ml)。AVG.平均值；Stnd.Dev.標(biāo)準(zhǔn)差；RSD相對標(biāo)準(zhǔn)差。
實(shí)例2測定糖含量的自動糖醛酸分析 使用糖醛酸分析，測定重復(fù)單元中含有半乳糖醛酸或葡萄糖醛酸的多糖(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)的糖含量。在硫酸、四硼酸鈉和熱的作用下，將多糖分解成其組成單糖。添加mHDP引起紫紅色復(fù)合物的形成，并利用分光光度計(例如在520nm下)讀取吸光度；在分析范圍內(nèi)，吸光度與所存在的糖醛酸的量成比例。
試劑制備 使用下式計算所需半乳糖醛酸的重量，來制備50mM半乳糖醛酸儲備液
使用50mM半乳糖醛酸儲備液，制備1.0mM半乳糖醛酸工作儲備液。
通過將2.38g十水合四硼酸鈉與500ml硫酸混合，來制備酸試劑(12.5mM四硼酸鈉-硫酸)。
標(biāo)準(zhǔn)品制備 利用杰納斯自動液體處理系統(tǒng)，在數(shù)組每一濃度5個的微量離心管中，使用1.0mM半乳糖醛酸工作儲備液并將WFI作為稀釋劑，制備2nM、4nM、8nM、12nM和16nM糖標(biāo)準(zhǔn)品(1ml等分試樣)。使用這些體積制得默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
樣品制備 利用杰納斯自動液體處理系統(tǒng)，在數(shù)組每一稀釋液5個的微量離心管中，制備使樣品(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)達(dá)到分析范圍所需的稀釋液?？墒褂靡韵掠嬎銇砉浪銉煞N肺炎鏈球菌血清型的樣品量
如果未完全確定樣品的預(yù)期濃度，則選擇一定范圍的稀釋度(例如，1∶50、1∶75、1∶100、1∶150和1∶200)，以使至少一種落在分析范圍內(nèi)。
程序 使用整合有萊伯威爾移動臂以及供讀取器整合、溫度控制和混合的輔助儀器的杰納斯自動液體處理系統(tǒng)，將一式五份40μl稀釋劑(例如，WFI)分配到多孔板5個孔中；稀釋劑用作空白。將一式五份40μl各適當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品(例如，肺炎鏈球菌血清型1和5)分配到多孔板5個孔中，同樣，將一式五份40μl各試樣分配到多孔板5個孔中。
將250μl酸試劑添加到各孔中，并利用反復(fù)移液，充分混合各孔的內(nèi)容物。將多孔板覆蓋(手工或經(jīng)由萊伯威爾移動臂)并在90℃加熱20分鐘，此后在環(huán)境溫度下冷卻≥20分鐘。將5μl 0.15％mHDP添加到各孔中，并利用反復(fù)移液，充分混合各孔的內(nèi)容物。使多孔板的內(nèi)容物在環(huán)境溫度下反應(yīng)15-20分鐘，此后通過萊伯威爾移動臂將多孔板放到讀板器上，輕柔振蕩并在520nm下測定各孔內(nèi)容物的輻射能吸收。
冠詞“一”在本文中用于指一個或多于一個(即，至少一個)所述冠詞的語法賓語。舉例說來，“一因素”意思指一個或多個因素。
本說明書中提及的所有公開案和專利申請案都指示本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。所有公開案和專利申請案都以引用的方式并入本文中，引用的程度就如同指出將各個別公開案或?qū)＠暾埌柑囟ㄇ覀€別地以引用的方式并入本文中一般。
盡管已借助說明以及出于理解清楚的目的而提供的實(shí)例相當(dāng)詳細(xì)地描述了前述本發(fā)明，但顯然，可在隨附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)行某些修改和變更。
權(quán)利要求
1.一種自動測定糖濃度的方法，其包含以下步驟
a)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包含以下步驟
(i)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中；
(ii)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中；和
(iii)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；
b)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包含以下步驟
(i)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中；
(ii)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中；和
(iii)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；
c)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；
d)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；
e)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；
f)將一部分酸試劑從酸試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；
h)用蓋子覆蓋所述多孔板；
i)加熱所述多孔板；
j)冷卻所述多孔板；
k)振蕩所述多孔板；和
l)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，
其中步驟a-1是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其進(jìn)一步包含以下步驟在冷卻所述多孔板后，將一部分顯色劑從顯色劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述顯色劑包含間羥基聯(lián)苯。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述糖工作儲備液包含一種或多種選自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙?；?D-半乳糖胺和N-乙酰基-D-甘露糖胺組成的群組的糖。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述多糖試樣包含細(xì)菌莢膜多糖、活性細(xì)菌莢膜多糖或細(xì)菌莢膜多糖-蛋白質(zhì)連結(jié)物中的一種或多種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)菌莢膜多糖包含選自由以下組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖腦膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)血清群Y、腦膜炎奈瑟菌血清群W135、B群鏈球菌(Group B Streptococcus)血清型Ia、B群鏈球菌血清型III、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)血清型1、肺炎鏈球菌血清型3、肺炎鏈球菌血清型4、肺炎鏈球菌血清型5、肺炎鏈球菌血清型6A、肺炎鏈球菌血清型6B、肺炎鏈球菌血清型7F、肺炎鏈球菌血清型9V、肺炎鏈球菌血清型14、肺炎鏈球菌血清型18C、肺炎鏈球菌血清型19A、肺炎鏈球菌血清型19F、肺炎鏈球菌血清型23F和其組合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酸試劑包含硫酸和蒽酮。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酸試劑包含硫酸和四硼酸鹽。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述糖工作儲備液源容器、所述糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器、所述多糖試樣源容器和所述多糖試樣接收容器都選自由玻璃試管、塑料試管、玻璃小瓶、塑料小瓶、塑料離心管、塑料微量離心管和其組合組成的群組。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述稀釋劑選自由注射用水、生理鹽水、琥珀酸鹽緩沖的生理鹽水和其組合組成的群組。
11.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述稀釋劑為注射用水。
12.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)移是由自動液體處理裝置執(zhí)行。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述自動液體處理裝置包含多通道移液歧管。
14.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述混合是通過反復(fù)移液來執(zhí)行。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中加熱所述多孔板是通過板式加熱器執(zhí)行。
16.一種自動測定糖濃度的方法，其包含以下步驟
a)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包含以下步驟
(i)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，所述糖工作儲備液包含一種或多種選自由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、丙酮酸、N-乙?；?D-半乳糖胺和N-乙?；?D-甘露糖胺組成的群組的糖；
(ii)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中；和
(iii)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；
b)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包含以下步驟
(i)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包含選自由以下組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F；
(ii)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中；和
(iii)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；
c)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；
d)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；
e)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；
f)將一部分硫酸-蒽酮試劑從硫酸-蒽酮試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；
h)用蓋子覆蓋所述多孔板；
i)加熱所述多孔板；
j)冷卻所述多孔板；
k)振蕩所述多孔板；和
l)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，
其中步驟a-1是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖為活性細(xì)菌莢膜多糖。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型3、4、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白連結(jié)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。
20.一種自動測定糖濃度的方法，其包含以下步驟
a)制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品，其包含以下步驟
(i)將一部分糖工作儲備液從糖工作儲備液源容器轉(zhuǎn)移到多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中，所述糖工作儲備液包含半乳糖醛酸；
(ii)將一部分稀釋劑從稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中；和
(iii)混合所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品；
b)制備一個或多個稀釋過的多糖試樣，其包含以下步驟
(i)將一部分多糖試樣從多糖試樣源容器轉(zhuǎn)移到多個多糖試樣接收容器中，所述多糖試樣包含選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖；
(ii)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多個多糖試樣接收容器中；和
(iii)混合所述多個多糖試樣接收容器的內(nèi)容物，以制備所述一個或多個稀釋過的多糖試樣；
c)將一部分所述稀釋劑從所述稀釋劑源容器轉(zhuǎn)移到多孔板的一系列孔中；
d)將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品的一部分從所述多個糖標(biāo)準(zhǔn)品接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；
e)將所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分從所述多個多糖試樣接收容器中每一個轉(zhuǎn)移到所述多孔板的一系列孔中；
f)將一部分硫酸-四硼酸鹽試劑從硫酸-四硼酸鹽試劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
g)混合所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物；
h)用蓋子覆蓋所述多孔板；
i)加熱所述多孔板；
j)冷卻所述多孔板；
k)將一部分包含間羥基聯(lián)苯的顯色劑從顯色劑源容器轉(zhuǎn)移到所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔中；
l)振蕩所述多孔板；和
m)測量所述多孔板中所有所述含有所述稀釋劑、所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，
其中步驟a-m是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖為活性細(xì)菌莢膜多糖。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述選自由肺炎鏈球菌血清型1和5組成的細(xì)菌群組的細(xì)菌莢膜多糖與載體蛋白連結(jié)。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述載體蛋白為CRM197。
全文摘要
本文提供一種自動測定糖濃度的方法。所述方法包括制備一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和一個或多個稀釋過的多糖試樣；將所述一個或多個糖標(biāo)準(zhǔn)品和所述一個或多個稀釋過的多糖試樣的一部分連同稀釋劑一起轉(zhuǎn)移到多孔板中的一系列孔中；將一部分酸試劑轉(zhuǎn)移到所述多孔板中的所述一系列孔中；混合所述多孔板中所述一系列孔的內(nèi)容物；加熱并冷卻所述多孔板中所述一系列孔的內(nèi)容物；振蕩所述多孔板；和測量所述多孔板中所述一系列孔的內(nèi)容物的輻射能吸收，其中所有步驟都是在無人工介入的情況下執(zhí)行。
文檔編號G01N35/02GK101657726SQ200880012342
公開日2010年2月24日 申請日期2008年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月14日
發(fā)明者文森特·圖魯拉, 肖內(nèi)·沃爾特斯, 蘇迪漢姆·辛格, 拉薩帕·阿魯姆汗 申請人:惠氏公司