小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐 藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)是造血干細(xì)胞異常轉(zhuǎn)化的 髓系惡性克隆性疾病。其典型的遺傳學(xué)特征為t (9; 22) (q34; ql 1)易位，并由此產(chǎn)生BCR/ABL 融合基因。全球CML占所有成人白血病的15~20 %，發(fā)病率在我國列于白血病的第三位。
[0003] 在過去的20多年中，CML的疾病進(jìn)展率和死亡率居高不下。近年來隨著分子靶向治 療藥物酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitor，TKI)伊馬替尼的問世，使得CML的 治療發(fā)生了革命性的進(jìn)步，5年無事件生存率(EFS)和總生存率(0S)分別為83%和89%。然 而，酪氨酸激酶抑制劑的耐藥性成為了慢性粒細(xì)胞白血病治療面臨的主要問題。為了解決 這一問題，先后研發(fā)出幾個新的ΤΚΙ，如〇8831：；[11；[13、附101：；[11；[13和031111861'1：；[13，但都有一定的 缺陷。
[0004] CML對伊馬替尼的耐藥現(xiàn)象于2000年首次報道，由于bcr-abl融合蛋白中abl的 TKIs結(jié)合區(qū)域發(fā)生突變，T315I是第一個被檢測到的abl突變類型。此外還有bcr-abl基因擴(kuò) 增導(dǎo)致bcr-abl融合蛋白過表達(dá)，這兩者屬于bcr-abl依賴的耐藥(bcr-ab-dependent)。還 有一類屬于bcr-abl非依賴的耐藥(bcr-abl-independent )，如藥物外流栗的上調(diào)及藥物內(nèi) 流栗的下調(diào)，過表達(dá)Lyn (-個Sr c激酶)等。在CML耐藥病例中，20 %是bcr-abl非依賴性的耐 藥，由于它通常與bcr-abl下游信號通路上的癌基因有關(guān)，因此近年來日益收到關(guān)注。
[0005] BCR-ABL突變賦予了BCR-ABL對酪氨酸激酶抑制劑較高的抵抗性，還可以促進(jìn)CML 從CP越過加速期(Accelerated Phase，AP)到BC的發(fā)展。突變改變了BCR-ABL蛋白的序列，阻 止了 BCR-ABL激酶抑制劑結(jié)合，進(jìn)而降低了對激酶抑制劑的敏感性。有報道顯示，40~90 % 的伊馬替尼耐藥的病人出現(xiàn)了BCR-ABL的突變。大多數(shù)的BCR-ABL的突變出現(xiàn)在急變期。目 前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過55種類型的BCR-ABL突變影響伊馬替尼的結(jié)合。在這些BCR-ABL中ABL激酶 區(qū)域突變中，T315I突變占具首位。
[0006] 純天然植物中潛在著豐富的抗腫瘤資源寶庫，例如小檗堿。小檗堿(Berberine， BB)又名黃連素，來源于毛莨科植物黃連的根狀莖、小檗堿科植物日本小檗堿Berbergii DC 根莖、蕓香科植物黃柏樹皮和果實(shí)等。小檗堿屬于季銨型異喹啉生物堿，中藥黃連素中的主 要生物堿，是中國傳統(tǒng)中廣泛使用的處方藥用植物。在過去3000多年，小檗堿主要作為中藥 治療消化道疾病，最新的研究進(jìn)展表明，小檗堿可通過體外和體內(nèi)不同的機(jī)制來發(fā)揮其抗 腫瘤的活性。小檗堿在腫瘤細(xì)胞、微生物和病毒的增殖和繁殖過程中能夠顯示一定的抑制 作用，例如在肝癌、食管癌、heliobacter螺旋桿菌、乙肝病毒等。同時也能調(diào)控某些癌基因 和腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)以及DNA或RNA的轉(zhuǎn)錄。此外，小檗堿是一種廣譜酶抑制劑，它影響N-乙酰轉(zhuǎn)移酶，環(huán)氧合酶-2,拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，及其基因或蛋白的表達(dá)。更重要的是，對于腫 瘤的增殖和轉(zhuǎn)移，聯(lián)合用藥更有利于藥物發(fā)揮其抑制作用。
[0007] 隨著對小檗堿及其衍生物的深入研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿對多種實(shí)體瘤均有治療作用， 其中包括肝癌、結(jié)腸癌、肺癌、食管癌、腦腫瘤、膀胱癌等等。也有研究報道小檗堿能抑制血 液病中白血病細(xì)胞的生長和增殖，如通過下調(diào)白血病人早幼粒細(xì)胞HL-60的核仁磷酸蛋白 B23和端粒酶活性誘導(dǎo)其凋亡。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的目的在于提供一種小檗堿在制備 克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：
[0010] -種小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥 物增敏劑中的應(yīng)用；
[0011] 所述的小檗堿通過促進(jìn)BCR-ABL融合蛋白泛素化降解進(jìn)而克服慢性粒細(xì)胞白血病 耐藥性或增加抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物對慢性粒細(xì)胞白血病的敏感性；
[0012]所述的慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性優(yōu)選為慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對伊馬替尼的耐 藥性；
[0013]所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物優(yōu)選為慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性逆轉(zhuǎn) 劑；
[0014] 一種克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑，包含 小檗堿或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及小檗堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的溶劑化合物、對映異 構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、互變異構(gòu)體或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物；
[0015] 所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑還 可以含有一種或者是至少兩種藥學(xué)上可以接受的載體；
[0016] 所述的載體優(yōu)選為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、 吸附載體、表面活性劑或潤滑劑等；
[0017] 所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑可 以進(jìn)一步制成注射劑、片劑、粒劑或膠囊等多種形式，各種劑型的藥物可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的 常規(guī)方法制備；
[0018] 上述小檗堿在制備促進(jìn)BCR-ABL融合蛋白泛素化降解產(chǎn)品中的應(yīng)用；
[0019] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0020] 本發(fā)明是通過對慢性粒細(xì)胞白血病bcr-abl融合蛋白的泛素化降解機(jī)制而產(chǎn)生抗 白血病作用，對耐藥和非耐藥的慢性粒細(xì)胞白血病均有效。為慢性粒細(xì)胞白血病耐藥治療 需找了一種可能的治療方案。為治療和克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥，找到新的視角。同時， 也為傳統(tǒng)的中藥小檗堿找到了新的靶點(diǎn)。
【附圖說明】
[0021] 圖1是小檗堿和/或伊馬替尼對BaF3-P210細(xì)胞相對活力影響的結(jié)果分析圖；其中， A:小檗堿處理BaF3-P210細(xì)胞48h;B:小檗堿處理BaF3-P210細(xì)胞72h;C:伊馬替尼單獨(dú)處理 與小檗堿+伊馬替尼聯(lián)合處理BaF3-P210細(xì)胞48h。
[0022] 圖2是小檗堿和/或伊馬替尼對BaF3-P210-T315I細(xì)胞相對活力影響的結(jié)果分析 圖；其中，A:小檗堿或伊馬替尼處理BaF3-P210-T315I細(xì)胞48h;B:小檗堿或伊馬替尼處理 BaF3-P210-T315I細(xì)胞72h;C:小檗堿和伊馬替尼聯(lián)合處理BaF3-P210-T315I 48h。
[0023] 圖3是小檗堿或伊馬替尼處理SF02細(xì)胞48h后對SF02細(xì)胞相對活力影響的結(jié)果分 析圖。
[0024]圖4是小檗堿對K562細(xì)胞相對活力影響的結(jié)果分析圖；其中，A:小檗堿處理K562細(xì) 胞48h; B:小檗堿處理K562細(xì)胞72h; C:小檗堿和伊馬替尼聯(lián)合處理K562細(xì)胞48h。
[0025] 圖5是細(xì)胞集落形成法檢測小檗堿對BaF3-P210-T315I細(xì)胞惡性程度影響的結(jié)果 分析圖；其中，A:集落數(shù)統(tǒng)計分析(Mean土SD.n = 3) 集落形態(tài);與對照相比，P〈0.05。
[0026] 圖6是細(xì)胞集落形成法檢測小檗堿對BaF3_P210細(xì)胞惡性程度影響的結(jié)果分析圖； 其中，A:集落數(shù)統(tǒng)計分析(Mean土SD.n = 3) 集落形態(tài);與對照相比，P〈0.05。
[0027] 圖7是Real time PCR檢測小檗堿處理后的細(xì)胞中BCR-ABL mRNA表達(dá)水平的結(jié)果 分析圖；其中，A: BaF3-P210-T3151細(xì)胞BCR-ABL mRNA表達(dá)水平；B: BaF3-P210細(xì)胞BCR-ABL mRNA表達(dá)水平;C: K562細(xì)胞BCR-ABL mRNA表達(dá)水平。
[0028] 圖8是小檗堿處理BaF3-P210-T3151細(xì)胞后，BCR-ABL蛋白表達(dá)水平變化的結(jié)果分 析圖。
[0029]圖9是小檗堿處理BaF3-P210細(xì)胞后，BCR-ABL蛋白表達(dá)水平變化的結(jié)果分析圖。 [0030]圖10是小檗堿處理細(xì)胞后BCR-ABL泛素化水平的結(jié)果分析圖；其中，A:小檗堿處理 BaF3-P210細(xì)胞后的蛋白泛素化水平;B: K562細(xì)胞經(jīng)過小檗堿處理后BCR-ABL蛋白泛素化水 平;C: BaF3-P210細(xì)胞經(jīng)過小檗堿處理后的BCR-ABL蛋白泛素化水平;D: BaF3-P210-T315I細(xì) 胞經(jīng)過小檗堿處理后的