鹽酸芐絲肼的藥物組合物及其降血糖的醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了鹽酸芐絲肼的藥物組合物及其降血糖的醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的鹽酸芐絲肼的藥物組合物中含有鹽酸芐絲肼和一種從天麻的干燥塊莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，鹽酸芐絲肼和該天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，具有降血糖作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，降血糖效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成降血糖的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
鹽酸芐絲肼的藥物組合物及其降血糖的醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及鹽酸芐絲肼的新用途，具體涉及鹽酸芐絲肼的藥 物組合物及其降血糖的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽酸芐絲肼是外周脫羧酶抑制藥，與左旋多巴聯(lián)合應(yīng)用制成復(fù)方制劑多巴絲肼。 左旋多巴是治療帕金森病的有效藥物，其藥理作用是通過在腦中經(jīng)脫羧酶作用轉(zhuǎn)化為多巴 胺實(shí)現(xiàn)的，腦中的多巴胺可改善帕金森病癥。但是大多數(shù)左旋多巴在外周經(jīng)芳香族氨基酸 脫羧酶(AADC)作用轉(zhuǎn)化為多巴胺，只有少量能進(jìn)入腦內(nèi)，鹽酸芐絲肼作為AADC抑制劑與左 旋多巴聯(lián)合使用，可抑制左旋多巴在外周轉(zhuǎn)化為多巴胺，從而使進(jìn)入腦內(nèi)的左旋多巴的量 增多，有效地改善帕金森病癥狀。
[0003] 糖尿病是一種常見的內(nèi)分泌代謝綜合癥，主要特征為糖代謝紊亂，臨床表現(xiàn)為多 飲多食、多尿，體重減輕。目前糖尿病發(fā)病率逐年升高，已成為繼惡性腫瘤、心腦血管病后第 3位嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。
[0004] 目前尚未見鹽酸芐絲肼與降血糖的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種鹽酸芐絲肼的藥物組合物，該藥物組合物中含有鹽酸 芐絲肼和一種從草本中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸芐絲肼和該天然產(chǎn)物可以協(xié) 同降血糖。
[0006] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0009] -種鹽酸芐絲肼的藥物組合物，包括鹽酸芐絲肼、如上所述的化合物（I)和藥學(xué)上 可以接受的載體。
[0010] 如上所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將天麻的干燥塊莖粉 碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水 飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a) 中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30 %乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85 %乙醇洗脫12個(gè)柱體 積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗脫濃縮物 用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到 4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的 二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅 膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫 液減壓濃縮得到化合物(I)。
[0011] 進(jìn)一步地，步驟(a)用85%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0012] 進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013] 如上所述的化合物(I)在制備降血糖的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 如上所述的鹽酸芐絲肼的藥物組合物在制備降血糖的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明提供的鹽酸芐絲肼的藥物組合物中含有鹽酸芐絲肼和一種從天麻的干燥 塊莖中分離得到的結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，鹽酸芐絲肼和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，具有降血 糖作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，降血糖效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成降血糖的藥物。本發(fā)明與現(xiàn) 有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0018] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0019]分離方法：（a)將天麻的干燥塊莖(2kg)粉碎，用85 %乙醇熱回流提取（15L X 3次）， 合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯(3LX3次)和水飽和的 正丁醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟 (a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85%乙 醇洗脫12個(gè)柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85% 乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1 (12個(gè)柱體積）、50:1 (10個(gè)柱體 積）、25:1(8個(gè)柱體積)和12:1(8個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步 驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(6個(gè)柱體積）、12:1(8個(gè)柱體 積)和2:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八 烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~ 16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (514mg，HPLC歸一化純度大于98% )。 [0020] 結(jié)構(gòu)確證：白色針晶，冊(cè)431-1^顯示[1+!1] +為111/2 293.1492，結(jié)合核磁特征可得 分子式為C2QH2Q〇2，不飽和度為11。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ Η(ΡΡπι，CDC13，500MHz): H-3 (6 · 68，S)， H-7(5.53，dd，J = 7.7，1.8Hz)，H-8(2.04，dt，J=11.5,7.2Hz)，H-9(3.26，d，J=11.5Hz)，H-12(6.15，d，J=10.5Hz)，H-13(6.62，dd，J=10.5,6.7Hz)，H-14(2.42，dd，J = 6.7,7.2Hz)， H-16a(4.73，s)，H-16b(4.74，s)，H-17(1.53，s)，H-18a(5.03，s)H-18b(4.82，s)，H-19 (1 · 88，s)，H-20(1 · 63，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ。(ppm，CDC13，125MHz): 198 · 2(C，1-C)，144 · 2 (C，2-C)，146.4(CH，3-C)，160.3(C，4-C)，207.2(C，5-C)，138.1(C，6-C)，133.9(CH，7-C)， 47.4(CH，8-C)，42.8(CH，9-C)，151.5(C，10-C)，148.9(C，11-C)，129.7(CH，12-C)，135.8 (CH，13-C)，51.4(CH，14-C)，146.4(C，15-C)，114.3(CH 2，16-C)，18.5(CH3，17-C)，109.7 (CH2，18-C)，10 · 5(CH3，19-C)，19 · 3(CH3，20-C)。紅外波譜表明該化合物含有羰基（1735cm-1 與1675CHT1)和烯烴（1632(^1)基團(tuán)；且其在245nm有紫外吸收，表明含有α，β-不飽和羰基單 元。 13C-NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有20個(gè)碳信號(hào)，包括三個(gè)甲基，兩個(gè)亞甲基(兩個(gè)烯烴碳）， 七個(gè)次甲基（四個(gè)烯烴碳），以及八個(gè)季碳(兩個(gè)羰基碳和六個(gè)烯烴碳），以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié) 合不飽和數(shù)表明該化合物為三環(huán)結(jié)構(gòu)。 1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示三個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δΗ 1.53 (3!1，8)、1.88(3!1，8)、1.63(3!1，8)，兩組端烯烴質(zhì)子信號(hào)5114.73(1!1，8)與4.74(1!1，8)、5.03 (1!1，8)與4.82(1!1，8)，一對(duì)烯烴質(zhì)子信號(hào)51 16.15(1!1，(1，了=10.5泡）與6.62(1!1，(1(1，了 = 10.5,6·7Ηζ)，兩個(gè)孤立烯烴質(zhì)子信號(hào)δΗ = COSY譜中存在H-12/H-l3/H-14/H-8/H-7以及H-8/H-9相關(guān)信號(hào)，同時(shí)HMBC譜中顯示有H-3與 01、02和04，!1-7與(：-5、(：-6、(：-8和(：-14，!12-16與(：-14、(：-15和(：-17，!13-17與(：-14，!12-18與 C-9、C-11 和 C-12，H3-19 與 C-l、C-2 和 C-3，H3-20 與 C-5、C-6 和 C-7 相關(guān)信號(hào)，通過上述 NMR 譜中 的相關(guān)信息可以構(gòu)建該化合物的連接方式，并且可以確定該化合物為rhamnofolane型二砲 類化合物。通過C-4與C-10的碳化學(xué)位移δ。160.3與151.5可知04和(：-10之間為雙鍵。綜合 氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下 所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過Ε⑶試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0021]該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
β
[0023] 實(shí)施例2:藥理作用
[0024] 1、材料與方法
[0025] 1.1材料與儀器
[0026] 健康雄性ICR小鼠，沈陽醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重18~22g;鹽酸芐絲肼購(gòu)自中國(guó) 藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例1。鏈脲佐菌素(STZ)美國(guó)Sigma化 學(xué)公司，用前用檸檬酸緩沖液配成1 % STZ溶液;其他試劑國(guó)產(chǎn)分析純。SW-CJ-2FD超凈工作 臺(tái)蘇州凈化設(shè)備有限公司；QYC-2112大型雙層全溫培養(yǎng)搖床上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公 司；SHY-2A雙功能水浴恒溫振蕩器江蘇東鵬儀器制造有限公司；TGL20W臺(tái)式高速冷凍離心 機(jī)湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；PB203-N電子天平瑞士，深圳市怡華新電子有限公 司;FW177中草藥粉碎機(jī)天津泰斯特有限責(zé)任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本，北京五洲東方科技發(fā) 展有限公司;YRD-30.2A真空冷凍干燥機(jī)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；葡萄糖試劑盒，超氧 化物歧化酶(S0D)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒四川邁克科技有限責(zé)任公司。
[0027] 1.2STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型建立
[0028] 隨機(jī)抽取體重（20±2)g小鼠，禁食16h，腹腔注射1%STZ 150mg · kg-Uh后注射 20%葡萄糖溶液。正常飼養(yǎng)3d后，禁食3h，用葡萄糖試劑盒測(cè)定血糖值，血糖值多 ll.lmmol · L-1者確定為糖尿病模型鼠。
[0029] 1.3實(shí)驗(yàn)分組及給藥
[0030]取糖尿病模型鼠40只，隨機(jī)為4組，每組10只：模型組、鹽酸芐絲肼組（100mg · kg 一4、化合物⑴組（l〇〇mg · kg_^、鹽酸芐絲肼與化合物⑴組合物組【50mg · kg^1鹽酸芐絲肼 +50mg · kg^1化合物（I)】，另取健康鼠10只，作為正常對(duì)照組。各組分別灌胃給藥(模型組和 正常對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水），連續(xù)給藥30d，測(cè)血糖值，監(jiān)測(cè)毛色，飲水量，墊料潮濕程 度和體重的基本體征。
[0031] 1.4葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)
[0032]另取一批小鼠，造模及給藥同上，末次給藥lh后，灌胃2g · kg-1葡萄糖溶液，灌胃后 0、30、60、12〇111；[11測(cè)定血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積(41]〇。
[0033] 計(jì)算方法:mmol · h · L-1 = 12A+B+C+12D;
[0034] 其中，A、B、C、D分別為 0、30、60、12011^11血糖值。
[0035] 1.5α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定
[0036] 禁食處死小鼠，取小腸上段，0.01Μ PBS，pH7.4漂洗，反轉(zhuǎn)小腸內(nèi)腔，剝離小腸刷狀 緣膜，擦干，按w: V = 1:9加 PBS后冰浴勻漿，4 °C離心(4000r/min)取上清液，-34 °C冷凍備用。 小腸黏膜葡萄糖苷酶活性測(cè)定：用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定提取液組織蛋白含量。稀釋小腸粘膜 提取液至最佳濃度，取〇. 2mL，分別加入ρΗ6.8磷酸鹽緩沖液0.7mL，37 °C水浴1 Omin后，加入 0.5mol · L-1鹿糖溶液0.1mL，37°C水浴20min加入0.1 mol · L-iNasCOslmL終止反應(yīng)。測(cè)定葡 萄糖濃度，平行測(cè)定3管，取平均值，計(jì)算α_葡萄糖苷酶活力。
[0037] 1.6抗氧化活性的測(cè)定
[0038] 給藥20d后，取血3mL，3500r/min離心5min，提取血清。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定 S0D活性，采用硫代巴比妥酸法測(cè)定MDA含量，按照SOD、MDA檢測(cè)試劑盒說明書步驟操作。 [0039] 1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析
[0040] 用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，以X土s表示。
[0041 ] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0042] 2.1對(duì)小鼠糖耐受量的影響
[0043] 各組小鼠灌胃葡萄糖后血糖開始升高。其中鹽酸芐絲肼與化合物（I)組合物組的 AUC值最低，顯示出最強(qiáng)的糖耐量作用（P〈0.01)，其次是鹽酸芐絲肼組、化合物（I)組(P〈 0.05)。組合物糖耐受能力強(qiáng)于單一組。結(jié)果見表1，〇111；[11、30111；[11、60111；[11和120111；[11血糖值單位 為mmol · L-1，AUC單位為mmol · h · L-1。
[0044] 表1小鼠糖耐受量
[0045]
[0046] 2.2糖尿病小鼠 α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定
[0047] 給藥后的糖尿病小鼠 α-葡萄糖苷酶活性見表2。給藥組α-葡萄糖苷酶活性在0.3~ 0.7U · mg^1之間。與模型組相比，鹽酸芐絲肼與化合物（I)組合物組小鼠小腸黏膜葡萄糖苷 酶活性顯著下調(diào)(P〈〇.01)，鹽酸芐絲肼組、化合物（I)組小鼠小腸黏膜葡萄糖苷酶活性也有 明顯下調(diào)(P〈〇.05)。通過抑制該酶活性，降低了人體對(duì)攝入的淀粉、蔗糖等碳水化合物的吸 收。
[0048] 表2糖尿病小鼠 α-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定
[0050] 2.3抗氧化活性的測(cè)定
[0051] 糖尿病小鼠抗氧化活性見表3。與模型組相比，鹽酸芐絲肼與化合物（I)組合物組 的S0D活性明顯升高(Ρ〈0.01)，MDA含量有顯著下降（Ρ〈0.01)，且這種作用強(qiáng)于鹽酸芐絲肼 組或化合物（I)組。
[0052] 表3對(duì)糖尿病小鼠 S0D活性和MDA含量影響
[0054]試驗(yàn)表明，鹽酸芐絲肼和化合物（I)單獨(dú)使用時(shí)，可以顯著提高糖尿病模型小鼠的 糖耐受量，抑制葡萄糖苷酶活性，同時(shí)提高糖尿病模型小鼠的抗氧化損傷能力。鹽酸芐絲 肼與化合物(I)聯(lián)合作用時(shí)，具有更好的藥理活性，二者存在協(xié)同作用，可開發(fā)成降糖藥物。
[0055]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種鹽酸芐絲肼的藥物組合物，其特征在于:包括鹽酸芐絲肼、如權(quán)利要求1所述的 化合物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體。3. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將天 麻的干燥塊莖粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油 醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃 取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85% 乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中 85 %乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50 :1、25:1和12:1的二氯甲 烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比 為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷 基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88%的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16 個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用85%乙醇熱回 流提取，合并提取液。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。6. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備降血糖的藥物中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求2所述的鹽酸芐絲肼的藥物組合物在制備降血糖的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K31/122GK106045835SQ201610459119
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月23日
【發(fā)明人】不公告發(fā)明人
【申請(qǐng)人】崔坤峰