新的EP管中，使用 Bradford蛋白濃度測定試劑盒的說明書測定蛋白濃度。測得蛋白濃度后，根據(jù)lmg蛋白加入 2yL BCR抗體(Anti-Bcr antibody購自美國ABCAM公司），放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，4°C孵育過夜。 第二天，每管中加入40yL Protein A/G.。旋轉(zhuǎn)式搖床上，4°C孵育4h。孵育結(jié)束后，放入低溫 離心機中。溫度設(shè)為4°C，2500rpm離心5min。去上清，每管加入lmL的PBS洗滌Protein A/G，4 °C，2500rpm離心5min。重復(fù)三次。每管加入40yLl X上樣緩沖液，沸水中煮lOmiruWestern blot上樣量為5yL。Western blot實驗步驟如實施例4。
[0060] (3)結(jié)果分析：
[0061] 本實施例Western blot檢測了小檗堿處理BaF3_P210后細(xì)胞中所有蛋白的泛素化 水平的改變，結(jié)果如圖10A所示，經(jīng)過小檗堿處理12h后的BaF3-P210細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)的泛素化 水平明顯增多。但是，隨著時間的延長，細(xì)胞的泛素化水平又降低到一定水平。這說明，小檗 堿可以在一定時間內(nèi)增加 BaF-P210細(xì)胞內(nèi)總的泛素化水平，但是這種改變受到時間的限 制。
[0062] 選取小檗堿處理K562、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I細(xì)胞24h后，分別使用免疫沉 淀的方法檢測各細(xì)胞中的BCR-ABL泛素化水平，結(jié)果如圖10所示。圖10B中顯示經(jīng)過小檗堿 處理的K562細(xì)胞中的BCR-ABL蛋白發(fā)生了泛素化；圖10C顯示小檗堿處理BaF3-P210細(xì)胞中 的BCR-ABL蛋白發(fā)生了泛素化；圖10D顯示小檗堿處理BaF3-P210-T315I細(xì)胞中的BCR-ABL蛋 白發(fā)生了泛素化:MG132可以抑制蛋白酶體的活性，進(jìn)而阻斷被泛素化的BCR-ABL蛋白的降 解，從圖中可以看出MG132和小檗堿共同作用于BaF3-P210-T315I的條帶比空白組有增加的 趨勢，這表明經(jīng)過小檗堿處理的BaF3-P210-T315I中的BCR-ABL也發(fā)生了泛素化。
[0063]綜上所述，在小檗堿處理BaF3_P210細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以增加細(xì)胞內(nèi)蛋白的整 體泛素化水平。采用針對BCR-ABL免疫沉淀（IP)，使用泛素化抗體Western blot檢測發(fā)現(xiàn) BCR-ABL蛋白發(fā)生了泛素化。
[0064]實施例7分子模擬對接小檗堿與BCR-ABL蛋白
[0065]從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中找到BCR-ABL蛋白三維空間結(jié)構(gòu)的文件;在藥物數(shù)據(jù)庫中找 到小檗堿的三維空間結(jié)構(gòu)PDB文件。從Disco very的官網(wǎng)上下載免費使用的Dico very Studio4.1軟件。下載完軟件Discovery Studio4.1后，將小檗堿和BCR-ABL蛋白的三維結(jié)構(gòu) 導(dǎo)入進(jìn)入軟件中。觀察小檗堿與BCR-ABL蛋白的某些空間結(jié)構(gòu)結(jié)合或者小檗堿插入到BCR-ABL蛋白空間結(jié)構(gòu)中去的結(jié)果。
[0066] Discovry Studio軟件分析小檗堿與BCR-ABL可對接的位點對接結(jié)果如圖11，小檗 堿可以與BCR-ABL中的SH2區(qū)域、蛋白激酶區(qū)域和F肌動蛋白結(jié)合區(qū)域?qū)由稀２⑶以谛￠迚A 的活性作用區(qū)域，都發(fā)現(xiàn)有潛在泛素化位點Lys的存在，說明可能的泛素化位點的存在。 [0067] 本發(fā)明使用小檗堿處理對伊馬替尼敏感的K562、BaF3_P210細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株 BaF3-P210-T315I細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以抑制K562、BaF3-P210細(xì)胞和耐藥細(xì)胞株BaF3-P210-T315I和SF02的細(xì)胞活力；且小檗堿和伊馬替尼聯(lián)合處理細(xì)胞后，小檗堿可以增加 K562、BaF3-P210細(xì)胞和耐藥的BaF3-P210-T315I對伊馬替尼的敏感性。細(xì)胞克隆形成實驗 則證明小檗堿可以顯著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210細(xì)胞的集落形成能力，有效抑制 細(xì)胞的惡性程度。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以降解細(xì)胞BaF3-P210-T315I細(xì)胞和BaF3-P210細(xì)胞中的BCR-ABL蛋白表達(dá)量:耐藥細(xì)胞株和不耐藥的細(xì)胞株經(jīng)過小檗堿處理后，BCR-ABL蛋白都有明顯降解現(xiàn)象。同時，對BCR-ABL的mRNA水平檢測發(fā)現(xiàn)，小檗堿不能引起B(yǎng)CR-ABL mRNA水平的變化。以上結(jié)果表明，小檗堿直接作用于耐藥株和敏感細(xì)胞株中的BCR-ABL 蛋白，而不影響B(tài)CR-ABL的mRNA表達(dá)水平。
[0068]對細(xì)胞整體水平的泛素化檢測結(jié)果結(jié)果顯示:小檗堿可以在一定時間內(nèi)增加 BaF-P210細(xì)胞內(nèi)總的泛素化水平，但是這種改變受到時間的限制。經(jīng)過小檗堿處理K562、BaF3-P210細(xì)胞中的BCR-ABL泛素化水平都明顯增加。MG132和小檗堿共同作用于BaF3-P210-T315I的條帶比空白組有增加的趨勢，這表明經(jīng)過小檗堿處理的BaF3-P210-T315I中的BCR-ABL也發(fā)生了泛素化。
[0069] 本發(fā)明對小檗堿分子與BCR-ABL蛋白進(jìn)行分子對接模擬，發(fā)現(xiàn)BCR-ABL共有3部位 (SH2區(qū)域、蛋白激酶區(qū)域和F-肌動蛋白連接區(qū)域)可以與小檗堿分子對接上。進(jìn)一步觀察發(fā) 現(xiàn)，小檗堿與BCR-ABL蛋白的對接處序列中發(fā)現(xiàn)賴氨酸存在，提示泛素化位點的存在。
[0070] 綜上所述，小檗堿可以影響到CML耐藥細(xì)胞株和不耐藥細(xì)胞株的細(xì)胞活力和細(xì)胞 的惡性程度。同時還發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠降解BCR-ABL蛋白，然而不改變BCR-ABL的mRNA水平。進(jìn) 一步研究BCR-ABL蛋白降解機制，發(fā)現(xiàn)小檗堿可以通過泛素化的途徑降解BCR-ABL蛋白。本 研究為CML耐藥治療需找了一種可能的治療方案。為治療和克服CML耐藥，找到新的視角。同 時，也為傳統(tǒng)的中藥小檗堿找到了新的靶點。
[0071] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物 增敏劑中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒 細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的小檗堿通過促進(jìn)BCR-ABL融合蛋白泛素化降解進(jìn)而克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥 性或增加抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物對慢性粒細(xì)胞白血病的敏感 性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒 細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性為慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥性。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒 細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物為慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性逆轉(zhuǎn)劑。5. -種克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑，其特征 在于:包含小檗堿或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及小檗堿或其藥學(xué)上可接受的鹽的溶劑化合 物、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、互變異構(gòu)體或其任意比例的混合物，包括外消旋混合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥 物增敏劑，其特征在于： 所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑含有一 種或者是至少兩種藥學(xué)上可以接受的載體。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥 物增敏劑，其特征在于： 所述的載體為緩釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、吸附載 體、表面活性劑或潤滑劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥 物增敏劑，其特征在于： 所述的克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑進(jìn)一步 制成注射劑、片劑、粒劑或膠囊。9. 一種小檗堿在制備促進(jìn)BCR-ABL融合蛋白泛素化降解產(chǎn)品中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種小檗堿在制備克服慢性粒細(xì)胞白血病耐藥性藥物或抗慢性粒細(xì)胞白血病藥物增敏劑中的應(yīng)用。所述的小檗堿可以增加慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性和克服慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞對伊馬替尼的多藥耐藥性。其中，小檗堿主要通過泛素化的機制降解BCR-ABL蛋白進(jìn)而克服由于T315I突變引起的慢性粒細(xì)胞白血病的多藥耐藥性。
【IPC分類】A61K36/29, A61P35/02, A61K36/756, A61K36/718, A61K31/4375
【公開號】CN105616409
【申請?zhí)枴緾N201610125214
【發(fā)明人】費嘉, 豐茂曉, 陰釗, 古春明, 楊菊華
【申請人】暨南大學(xué)
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年3月4日