]綜上所述，小檗堿對(duì)耐藥細(xì)胞的細(xì)胞集落能力（colony)的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:小 檗堿可以有效抑制耐藥BaF3-P210-T315I細(xì)胞的集落形成，有效抑制細(xì)胞的惡性程度;而伊 馬替尼不能顯著抑制BaF3-P210-T315I細(xì)胞的集落形成;小檗堿也可以有效抑制BaF3-P210 細(xì)胞的集落形成，有效抑制細(xì)胞的惡性程度。
[0048] 實(shí)施例3 Real time PCR檢測(cè)BCR-ABL mRNA水平
[0049] (1)總RNA的提取:小檗堿處理BaF3-P210-T315I細(xì)胞、BaF3-P210細(xì)胞和K562細(xì)胞 24h后，1500rpm，離心5min收集細(xì)胞于1.5mL EP管中，加入500yLTrizol試劑，吹打混勻細(xì) 胞，冰上靜置5min;加入100yL氯仿(氯仿:Trizol = l :5)，劇烈震蕩15sec，冰上靜置lOmin; 12000rpm，4°C離心15min，吸取上清置于另一個(gè)EP管中，加入等體積的異丙醇(大約200yL)， 震蕩均勻，_20°C靜置1011^11，12000印111，4°(：離心101^11 ;棄上清4?管底部可見白色沉淀;每 管加入500yL體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇（用RNase-free ddH20配制），洗滌RNA沉淀；洗滌后， 12000rpm，4°C離心5min，此步驟重復(fù)3次；棄上清，室溫干燥2~3min，加入RNase-free ddH 20 30yL，輕輕吹打?qū)⒊恋硗耆芙猓?br>[0050] (2)cDNA的合成(FastQuant RT Kit(with gDNAase)，天根生物科技(北京）有限公 司）：根據(jù)RNA濃度，計(jì)算2yg RNA所需的體積。建立20yL反應(yīng)體系；將RT試劑中的試劑解凍 后，迅速放在冰上;使用前將每種溶液渦旋震蕩混勻，簡(jiǎn)短離心收集管壁上的殘留液體;根 據(jù)試劑盒提供步驟劑量去除體系中基因組DNA(5XgDNA Buffer 2yL，2yg Total RNA;并用 RNase-Free ddH20補(bǔ)足到10yL，徹底混勻；短暫離心，并置于42°C，孵育3min，然后放在冰 上；配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系混合液（10 XFast RT Buffer 2yL;RT Enzyme Mix lyL;FQ-RT Primer Mix 2yL;RNase-Free ddH20 5yL)將上述試劑充分混勻，加到gDNA去除步驟的反應(yīng) 液中，再次充分混勻;然后進(jìn)行PCR，程序設(shè)定為:42°C，孵育15min; 95°C，孵育3min;之后放 于冰上，得到的cDNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，或低溫保存；
[0051] (3)Real time PCR(SuperReal PerMix Plus(SYBR Green)購(gòu)自天根生物科技（北 京）有限公司）：將Real time PCR中的試劑，模板，引物和RNa se-Free ddH20室溫溶解，徹 底混勾，在冰上進(jìn)行Real time RCR反應(yīng)液的配制；20yL反應(yīng)體系：2XSuperReal PreMix Plus 10yL；Forward primer 0.6yL；Reberse primer 0.6yL；cDNA 2yL；RNase-Free ddH2〇 補(bǔ)足到20yL;然后蓋上反應(yīng)管，輕柔混勻，可短暫離心，確保所有組分在管底;將反應(yīng)體系放 入熒光定量PCR儀中，按照如下程序進(jìn)行反應(yīng) ：l、95°C15min;2、95°C10sec;3、55°C30sec;4、 72°C30sec;5、Plate read Go to 2,39more times;6、Mlet-curve 65〇Cto95〇Cincrement 0.5for 5sec+plate read; 7、End.開始運(yùn)行程序，程序結(jié)束關(guān)閉儀器。分析數(shù)據(jù)，革El基因的 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平用ACT和2_^eT計(jì)算。β-actin mRNA作為內(nèi)參照;其中，引物序列如下： BCR-ABL-Forward primer：AGCATTCCGCTGACCATCAA；BCR-ABL-Reverse primer： GCCTAAGACCCGGAGCTTTT，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；
[0052] 終濃度為5μΜ的小檗堿處理K562、BaF3-P210和BaF3-P210-T315I細(xì)胞24h后，提取 細(xì)胞內(nèi)總RNA，逆轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行Real time PCR檢測(cè)小檗堿對(duì)BCR-ABL mRNA水平的影響，結(jié) 果如圖7所示:小檗堿對(duì)細(xì)胞內(nèi)BCR-ABL mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性的影響。
[0053] 實(shí)施例4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞中BCR-ABL蛋白水平
[0054] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以30X 104cell/L的密度接種于六孔板中每孔中2mL，實(shí)驗(yàn)分 小檗堿組和空白組，檗堿濃度選擇5μΜ;小檗堿作用一段時(shí)間（Oh，4h，12h，24h)后，收集細(xì)胞 于1.5mL EP管中，5000rpm離心5min收集細(xì)胞，棄上清;PBS洗細(xì)胞，吹打均勾，5000rpm離心 5min收集細(xì)胞;根據(jù)細(xì)胞沉淀量，加入適量的細(xì)胞裂解液(RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天公 司）將細(xì)胞完全裂解:冰上裂解30min ;4°C，13000rpm離心30min，吸取上清到另一個(gè)干凈EP 管中，按照Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(購(gòu)自北京科為世紀(jì)生物有限公司）的說(shuō)明書測(cè)定 蛋白濃度;按比例添加上樣緩沖液，計(jì)算50yg蛋白所需的上樣量;加入上樣緩沖液后，沸水 浴中煮沸5min;配制SDS-PAGE膠，上樣，80V電泳30min，120V電泳lh;電泳結(jié)束，轉(zhuǎn)膜;在半干 轉(zhuǎn)裝置中按照從下到上依次為:濾紙、膜、凝膠、濾紙，用玻璃棒趕壓氣泡，蓋上儀器蓋，12V， 40min;轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，封閉:將PVDF膜放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的封閉液中，室溫條件下，在 搖床上搖動(dòng)lh;封閉結(jié)束后，孵一抗(C-ABL單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司），按照比 例稀釋抗體，將PVDF膜放入的抗體中，4°C搖床上孵育過(guò)夜;孵育結(jié)束后，TBST洗滌PVDF膜三 次，搖床上洗滌5min;室溫孵育二抗（鼠源二抗IgG-HRP購(gòu)自美國(guó)SANTA CRUZ公司），選取合 適比例濃度的二抗，用抗體稀釋液稀釋;將PVDF膜放入稀釋好的二抗中；孵育結(jié)束后，TBST 洗滌PVDF膜三次，搖床上洗滌10min;化學(xué)發(fā)光:按照說(shuō)明書配制發(fā)光液(A、B液1:1混勻），將 發(fā)光液均勻滴加到PVDF膜上，放入ALLIANCE4.7凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行拍照。以內(nèi)參蛋白（β-actin或GATOH)比較BCR-ABL蛋白相對(duì)表達(dá)水平。
[0055]檢測(cè)到小檗堿對(duì)BCR-ABL mRNA的表達(dá)水平?jīng)]有影響后，同樣選用終濃度為5μΜ的 小檗堿處理BaF3-P210-T315I細(xì)胞4h、12h和24h，收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè) BCR-ABL蛋白的表達(dá)水平。如圖8所示，在BaF3-P210-T315I細(xì)胞中小檗堿濃度一定時(shí)，隨著 小檗堿處理時(shí)間增加，相比于內(nèi)參β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白出現(xiàn)了降低的趨勢(shì)。同樣選用 終濃度為5μΜ的小檗堿處理BaF3-P210細(xì)胞4h、12h和24h，收集細(xì)胞提取蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)BCR-ABL的表達(dá)水平。如圖9所示，小檗堿濃度一定時(shí)，隨著小檗堿處理時(shí)間增加， 相比于內(nèi)參β-actin蛋白，BCR-ABL蛋白出現(xiàn)了降低的趨勢(shì)。
[0056] 綜上所述，小檗堿作用后，細(xì)胞中BCR-ABL蛋白水平和mRNA檢測(cè)結(jié)果表明：小檗堿 顯著降低BaF3-P210-T315I和BaF3-P210細(xì)胞系中的BCR-ABL蛋白水平，而對(duì)BCR-ABL的mRNA 水平無(wú)顯著改變，因而可以認(rèn)為小檗堿降解BCR-ABL融合蛋白。
[0057] 實(shí)施例5檢測(cè)BaF3-P210和BaF3-P210-T315I細(xì)胞內(nèi)泛素化水平
[0058] (1 )Western blot:為了探索小檗堿引起B(yǎng)CR-ABL蛋白降解的機(jī)制，采用Western blot檢查細(xì)胞的泛素化水平，具體方法和操作步驟同實(shí)施例4, 一抗為Anti-Ubi quit in Mouse mAb(FK2)(購(gòu)自美國(guó)美國(guó)MILLIPORE公司）。
[0059] (2)免疫沉淀:蛋白提取步驟如實(shí)施例4，每組蛋白提取液中加入5yL IgG抗體（IgG 抗體的種屬與目的蛋白抗體的種屬一致，IgG antibody(H-270))(購(gòu)自美國(guó)SIGMA公司），同 時(shí)每管加入30yL Protein A/G。放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，4°C搖勻30min。搖勻結(jié)束后，將離心管 放入低溫離心機(jī)中。溫度設(shè)為4°C，2500rpm離心5min。收集上清到新的EP管中，每管再加入 30yL Protein A/G PLUS-Agarose(購(gòu)自sigma公司）。放在旋轉(zhuǎn)式搖床上，4°C搖勾30min。搖 勻結(jié)束后，將離心管放入低溫離心機(jī)中。2500rpm離心5min。收集上清到