本發(fā)明涉及一種以固定化細(xì)胞與d101樹脂雙柱式生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法，屬于綠色生物制造領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,gaba)是一種具有4個碳原子的非蛋白質(zhì)組成氨基酸，為哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有利尿、降血脂、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗癌、降血壓、鎮(zhèn)靜和改善睡眠等作用，已成為備受關(guān)注的藥品和保健品成分。由于可以通過內(nèi)酰胺化作用形成2-吡咯烷酮，因此gaba還是生產(chǎn)生物塑料聚酰胺4的重要原料。
微生物生長繁殖快，以其生產(chǎn)gaba不受時間和空間限制，因此通過微生物gad(glutamatedecarboxylase，gad，ec4.1.1.15)生產(chǎn)gaba備受關(guān)注。gad是一種依賴于磷酸吡哆醛(pyridoxal5′-phosphate，plp)的裂解酶，存在于細(xì)胞質(zhì)中，是生物體催化l-谷氨酸(l-glutamicacid,l-glu)發(fā)生α-羧基脫羧作用生成gaba的唯一酶。由于gad作用的底物(l-glu)和產(chǎn)物(gaba)均為小分子，可以透過細(xì)胞膜，因此可以直接采用細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)gaba，減少胞內(nèi)酶的提取成本，簡化生產(chǎn)工藝。已有文獻(xiàn)通過唾液鏈球菌嗜熱亞種、戊糖片球菌、屎腸球菌、短小乳桿菌、大腸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化法制備gaba的報道。但是由于游離細(xì)胞不易回收重復(fù)使用，因此仍需要不斷重復(fù)培養(yǎng)高gad活力的細(xì)胞用于生產(chǎn)，而通過固定化技術(shù)將細(xì)胞固定或包埋于固態(tài)載體上，即制備成固定化細(xì)胞，則可克服游離細(xì)胞的缺點，并可實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)。
趙景聯(lián)等在文摘(生物工程學(xué)報，1989,5(2)：124-128)中報道了用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌細(xì)胞制成固定化細(xì)胞，與1%谷氨酸溶液進行間歇反應(yīng)、連續(xù)攪拌式反應(yīng)及連續(xù)柱式反應(yīng)生產(chǎn)gaba。間歇反應(yīng)5h轉(zhuǎn)化率達(dá)到了100%；連續(xù)攪拌式反應(yīng)在三角瓶反應(yīng)器中進行，以6ml/h的流速輸入底物溶液和輸出反應(yīng)液，轉(zhuǎn)化率達(dá)85%；連續(xù)柱式反應(yīng)器中進行，控制流速12ml/h，轉(zhuǎn)化率達(dá)95%。
章汝平等在文摘(長沙電力學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版)，1998,13(4)：433-435)中報道了用海藻酸鈣包埋法將大腸桿菌細(xì)胞制成固定化細(xì)胞，對后道味精母液提取谷氨酸后的廢液進行轉(zhuǎn)化生產(chǎn)gaba，獲得了gaba含量達(dá)到了98.94%，收率為49.65%。
楊勝遠(yuǎn)等在中國專利(專利號200910114016.4)中公開了一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)gaba的方法，它是以乳酸乳球菌的細(xì)胞作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸鈉，生產(chǎn)高含量的gaba，或?qū)⑷樗崛榍蚓?xì)胞采用海藻酸鈉進行固定化，通過固定化細(xì)胞技術(shù)轉(zhuǎn)化谷氨酸或谷氨酸鈉生產(chǎn)gaba。
焦陽、汪建敏和楊勝遠(yuǎn)等在文摘(核農(nóng)學(xué)報，2009，23(6):1026-1031)中以唾液鏈球菌嗜熱亞種y-2為供試菌，考察了卡拉膠、明膠和海藻酸鈣等材料將此菌株固定化的效果，并通過比較固定化細(xì)胞的gad活性及γ-氨基丁酸的產(chǎn)量和載體機械強度，確定了海藻酸鈣作為固定化細(xì)胞的適宜載體。優(yōu)化后得到的最適固定化條件(w/v)為：海藻酸鈉2%，cacl214%,菌體25%，凝膠平均顆粒直徑1.64mm，在此條件下測得固定化細(xì)胞的gad活性為游離細(xì)胞的1.2倍。細(xì)胞多批次應(yīng)用穩(wěn)定性試驗證明：固定化細(xì)胞較游離細(xì)胞有著更穩(wěn)定的gad活性，反復(fù)使用60h后，固定化細(xì)胞gad活性仍能保持其初始活性的90%以上，γ-氨基丁酸的積累量達(dá)到7.97g/l。
雖然以微生物合成gaba的公開技術(shù)較多，但是由于微生物gad的活性普遍不高，gaba產(chǎn)量偏低，成本高，難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求。不管是游離酶、游離細(xì)胞或固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化法，還是發(fā)酵法，gad都是生物合成gaba的關(guān)鍵酶，其活性高低與gaba的產(chǎn)量直接相關(guān)。除了gad的結(jié)構(gòu)和微生物代謝產(chǎn)酶量外，催化反應(yīng)的外部反應(yīng)條件也是影響gad活性的重要因素。因此，如何提高微生物gad活力、提高具有g(shù)ad活力的微生物細(xì)胞產(chǎn)量以及通過改善細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)體系或工藝條件，提高gaba的產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本，將是今后亟需解決的關(guān)鍵問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種通過將d101大孔吸附樹脂柱與固定化屎腸球菌細(xì)胞柱偶聯(lián)形成循環(huán)復(fù)合轉(zhuǎn)化反應(yīng)系統(tǒng)，通過d101大孔吸附樹脂對屎腸球菌gad活性的促進作用，最終實現(xiàn)提高gaba產(chǎn)量的目的，解決生物合成gaba成本高居不下的問題。
d101樹脂為大孔吸附樹脂，對物質(zhì)具有選擇吸附特性，后處理簡便，價廉易得、不污染環(huán)境、不腐蝕設(shè)備，容易分離及回收，可重復(fù)使用，已廣泛用于物質(zhì)的分離純化。但是，作為輔助催化劑在生物酶催化反應(yīng)體系中應(yīng)用尚未報道。
本發(fā)明研究表明d101大孔吸附樹脂作為輔助催化劑，在與屎腸球菌游離細(xì)胞或游離gad進行混合共催化時，屎腸球菌gad的催化活性大幅提高，說明d101大孔吸附樹脂對屎腸球菌游離細(xì)胞或游離gad活性具有顯著的促進作用。本發(fā)明進而對d101大孔吸附樹脂促進屎腸球菌游離細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的作用機制進行了深入探討，并在此基礎(chǔ)上對d101大孔吸附樹脂對固定化屎腸球菌細(xì)胞的gad轉(zhuǎn)化活性進行了研究，通過將固定化屎腸球菌細(xì)胞的反應(yīng)柱與d101大孔吸附樹脂柱偶聯(lián)，發(fā)明了可循環(huán)的雙柱式反應(yīng)方法。本發(fā)明的方法在gaba產(chǎn)量上較單一固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱可提高1.5～2倍，并且呈現(xiàn)固定化屎腸球菌細(xì)胞的gad活性越強，d101大孔吸附樹脂柱提高gaba產(chǎn)量的幅度越大的趨勢。
本發(fā)明的所使用的具有g(shù)ad活性的屎腸球菌(enterococcusfaecium)菌株分離自泡菜，已進行專利菌種保藏，其保藏編號為：gdmcc60203，保藏單位為：廣東省微生物菌種保藏中心，保藏地址為：廣州市先烈中路100號大院59號樓5樓。
為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人首先從反應(yīng)體系ph值對屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad轉(zhuǎn)化活性的影響進行了研究。結(jié)果表明細(xì)胞gad的最適反應(yīng)ph值為4.4，當(dāng)反應(yīng)體系的ph值大于4.4時，細(xì)胞gad活性迅速下降；在ph4.2～4.6范圍內(nèi)，屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的轉(zhuǎn)化活性相對較強。
l-glu是gad作用的底物，只有游離狀態(tài)的l-glu才能被gad所催化，為此本發(fā)明對l-glu和谷氨酸一鈉（味精，monosodiumglutamate，msg）在ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液中的溶解度進行了測定，結(jié)果40℃時，0.3mol/lmsg已經(jīng)基本接近飽和溶液，為了防止msg結(jié)晶析出影響，本發(fā)明選擇gad底物msg或l-glu的濃度為0.2mol/l。經(jīng)對比試驗表明，msg較l-glu更易溶解，配制更方便。
一些酶常具有底物抑制作用，為了考察底物l-glu對屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad轉(zhuǎn)化活性的影響，本發(fā)明對不同濃度的msg溶液（溶于ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液）對細(xì)胞轉(zhuǎn)化活性的影響進行了測定。結(jié)果表明，在0.025～0.25mol/l范圍內(nèi)，隨著msg溶液濃度增加，gad轉(zhuǎn)化活性增強，說明屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad不存在底物抑制作用，而且msg溶液濃度增加有助于l-glu進入細(xì)胞而提高屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的轉(zhuǎn)化活性。
一些酶常具有產(chǎn)物抑制作用，為了考察產(chǎn)物gaba對屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad轉(zhuǎn)化活性的影響，本發(fā)明對采用含0.2mol/lmsg-1mol/lgaba（溶于ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液）的混合溶液作為轉(zhuǎn)化反應(yīng)的初始底物溶液，結(jié)果屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的轉(zhuǎn)化活性較不加gaba的對照組下降了20.56%，說明轉(zhuǎn)化產(chǎn)物gaba對屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的轉(zhuǎn)化活性有抑制作用。
從上述研究表明，反應(yīng)體系ph值、底物濃度和產(chǎn)物濃度是影響屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad轉(zhuǎn)化活性的重要因素，在生產(chǎn)中，如能及時調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph值、底物濃度和產(chǎn)物濃度將可顯著提高gaba的產(chǎn)量。l-glu脫羧基生成gaba，會造成反應(yīng)體系ph值升高，從而降低細(xì)胞gad活性，特別是當(dāng)以固定化細(xì)胞采用柱式進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備gaba時，固定化細(xì)胞柱中段和后段的轉(zhuǎn)化液ph值往往較高，產(chǎn)物gaba濃度在中段和后段也較高，而底物l-glu濃度則相對較低。因此，在固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)gaba的方法中，固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞柱的催化效率從前段至后段是逐漸降低的。由于固定化反應(yīng)柱是一個密閉系統(tǒng)，因此要在固定化細(xì)胞柱中實現(xiàn)調(diào)節(jié)反應(yīng)體系ph值、底物濃度和產(chǎn)物濃度是非常困難的。為了解決這一問題，本發(fā)明通過固定化細(xì)胞柱與d101大孔吸附樹脂柱相偶聯(lián)的循環(huán)雙柱反應(yīng)法解決上述問題，取得了很好的效果。固定化細(xì)胞和d101大孔吸附樹脂雙柱式生產(chǎn)gaba的方法的示意圖如附圖1。
為了實現(xiàn)穩(wěn)定屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad轉(zhuǎn)化體系的ph和減少反應(yīng)液中游離的gaba濃度的目的，本發(fā)明對不同性質(zhì)lx-17大孔吸附樹脂、bs-67-1大孔吸附樹脂、d101大孔吸附樹脂和凹凸棒對l-glu和gaba的吸附能力及穩(wěn)定反應(yīng)體系的ph值的能力進行了測試。結(jié)果，以d101大孔吸附樹脂的效果最佳，當(dāng)以經(jīng)過ph4.2、0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的d101大孔吸附樹脂按樹脂質(zhì)量與0.2mol/ll-glu-0.2mol/lgaba混合溶液(溶于0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph4.2)體積為1∶2混合5min，結(jié)果d101大孔吸附樹脂對l-glu和gaba的均有吸附能力，當(dāng)以樹脂質(zhì)量∶洗脫液體積為1∶20的70%乙醇溶液進行洗脫，洗脫液中l-glu和gaba分別為(37.45±0.11)mmol/l和(27.51±0.15)mmol/l。在ph4.2～5.2范圍內(nèi)，隨著乙酸-乙酸鈉緩沖液ph值升高，gaba吸附量增加，l-glu吸附量呈下降趨勢。當(dāng)以ph5.2的固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的轉(zhuǎn)化反應(yīng)液進行測試，結(jié)果經(jīng)d101大孔吸附樹脂對轉(zhuǎn)化液中的gaba吸附后，轉(zhuǎn)化反應(yīng)液的ph值由5.2下降到4.6，可見ph4.2、0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液平衡的d101大孔吸附樹脂對反應(yīng)液的ph值也具有一定穩(wěn)定作用，但隨著樹脂吸附量增多，這種對ph值的調(diào)節(jié)作用逐漸減弱。由于d101大孔吸附樹脂對l-glu同樣具有一定吸附能力，l-glu被吸附后會造成第二次循環(huán)反應(yīng)的底物濃度下降，本發(fā)明通過將d101大孔吸附樹脂用前采用0.2mol/lmsg（溶于ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液）溶液進行平衡，產(chǎn)物gaba經(jīng)d101大孔吸附樹脂吸附后，置換出的l-glu可及時補充到底物溶液中，降低底物對gad活性的影響，效果顯著。
谷氨酸脫羧基生成gaba后，會造成反應(yīng)體系ph值升高，從而降低細(xì)胞gad活性，特別是當(dāng)以固定化細(xì)胞采用柱式進行轉(zhuǎn)化反應(yīng)制備gaba時，固定化細(xì)胞柱后段的轉(zhuǎn)化液ph值往往較高，而通過酸堿調(diào)節(jié)固定化細(xì)胞柱內(nèi)的轉(zhuǎn)化體系ph值，是非常困難的，為了發(fā)揮固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞gad的活力，本發(fā)明選擇固定化細(xì)胞柱的初始反應(yīng)底物溶液ph值為4.2。
雖然通過上述采用控制初始反應(yīng)底物溶液ph值為4.2和d101大孔吸附樹脂吸附gaba的方式，反應(yīng)體系的ph值獲得了很大改善，但是由于固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞密度大，gad活性高，反應(yīng)體系的ph升高幅度較大，因此本發(fā)明將d101大孔吸附樹脂流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)底物溶液的ph為4.2，然后再進入固定化屎腸球菌gdmcc60203柱進行循環(huán)反應(yīng)。高濃度的酸調(diào)節(jié)ph值可以避免底物濃度稀釋過大，同時循環(huán)貯罐中沒有屎腸球菌gdmcc60203，因此采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph值也不會因屎腸球菌gdmcc60203受到酸損害而造成gad失活，固定化屎腸球菌gdmcc60203可處于溫和的環(huán)境而發(fā)揮高效催化作用。
流速是影響底物l-glu在固定化屎腸球菌gdmcc60203柱中停留的時間，也是影響生產(chǎn)效率的重要因素，流速慢則單次反應(yīng)轉(zhuǎn)化生成gaba的量多，但是轉(zhuǎn)化液的ph值升高幅度較大，容易影響中后段固定化屎腸球菌gdmcc60203gad活性；流速快，則可克服前述缺點，但是會增加后續(xù)工藝的負(fù)擔(dān)，增加動力消耗。由于屎腸球菌gdmcc60203產(chǎn)gad與發(fā)酵條件有很大關(guān)系，隨著不同批次培養(yǎng)條件不盡相同而造成同樣固定化屎腸球菌gdmcc60203柱床體積的gad活力不同，流速控制不能只根據(jù)柱床體積而定，本發(fā)明根據(jù)研究結(jié)果確定以固定化屎腸球菌gdmcc60203柱流出液的ph值作為監(jiān)測指標(biāo)對流速進行調(diào)節(jié)控制，使流出液ph值不大于4.6。監(jiān)測指標(biāo)靈敏、快速，對流速調(diào)節(jié)反應(yīng)及時。
按照本發(fā)明上述的技術(shù)參數(shù)，在相同反應(yīng)時間和同等固定化屎腸球菌gdmcc60203的條件下，與僅采用固定化細(xì)胞的單柱反應(yīng)法相比較，本發(fā)明的固定化細(xì)胞柱-d101大孔吸附樹脂柱循環(huán)雙柱反應(yīng)法的gaba產(chǎn)量提高196.32%。
以上所述為本專利申請的研究過程示例，但不僅限于上述研究內(nèi)容。
基于上述研究，形成了本發(fā)明的技術(shù)方案。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
參照焦陽、汪建敏和楊勝遠(yuǎn)等在文摘(核農(nóng)學(xué)報，2009，23(6):1026-1031)的細(xì)胞固定化方法，采用海藻酸鈣細(xì)胞包埋法制備固定化屎腸球菌細(xì)胞，將固定化屎腸球菌細(xì)胞以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照常規(guī)方法裝柱制備成固定化細(xì)胞反應(yīng)柱；將已再生或預(yù)處理的d101大孔吸附樹脂以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照常規(guī)方法裝柱制備成輔助反應(yīng)柱；將固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱和d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱與調(diào)配罐、轉(zhuǎn)化液貯罐、泵、循環(huán)貯罐、泵、高位罐、70%乙醇貯罐、洗脫液貯罐、管路及閥門等連接成循環(huán)雙柱反應(yīng)體系；先采用含0.2mol/ll-glu或msg的ph4.2、0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液對d101大孔吸附樹脂進行平衡，然后再進行循環(huán)反應(yīng)生產(chǎn)gaba；循環(huán)反應(yīng)生產(chǎn)gaba的方法為：將5倍固定化屎腸球菌細(xì)胞柱床體積的0.2mol/lmsg或l-glu溶液（溶于ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液）用泵輸送到高位罐，經(jīng)高位罐流入固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱，于40℃柱溫下轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過監(jiān)測轉(zhuǎn)化液流出液的ph控制流速，使流出液ph值不大于4.6，流出的轉(zhuǎn)化液貯存于轉(zhuǎn)化液貯罐；將轉(zhuǎn)化液貯罐內(nèi)的轉(zhuǎn)化液用泵輸送至d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對產(chǎn)物gaba進行吸附，減少轉(zhuǎn)化液中的游離gaba濃度，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為4.2，然后再用泵輸入固定化屎腸球菌反應(yīng)柱于40℃柱溫進行循環(huán)反應(yīng)，通過檢測轉(zhuǎn)化液流出液的l-glu濃度，以l-glu的摩爾轉(zhuǎn)化率大于85%作為循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點；將70%乙醇溶液通過泵輸送到d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對d101大孔吸附樹脂吸附的gaba進行洗脫，分別收集合并或分別收集洗脫液和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱的流出液，即可獲得純度不同的gaba母液。
本發(fā)明的方法是：
本發(fā)明所述的一種以固定化細(xì)胞與d101樹脂雙柱式生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步驟：
①將固定化屎腸球菌細(xì)胞以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液進行裝柱制備成固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱；
②將已再生或預(yù)處理的d101大孔吸附樹脂以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液進行裝柱制備成d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱；
③將固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱和d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱與調(diào)配罐、轉(zhuǎn)化液貯罐、泵、循環(huán)貯罐、泵、高位罐、平衡貯罐、洗脫液貯罐、管路及閥門等連接成循環(huán)雙柱反應(yīng)體系；
④在平衡貯罐中加入3倍d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱柱床體積的0.2mol/l底物溶液，泵入d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱對d101大孔吸附樹脂進行平衡，備用；
⑤將5倍固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱柱床體積的0.2mol/l底物溶液用泵輸送到高位罐，經(jīng)高位罐流入固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱，于40℃柱溫下轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過監(jiān)測轉(zhuǎn)化液流出液的ph控制流速，使流出液ph值不大于4.6，流出的轉(zhuǎn)化液貯存于轉(zhuǎn)化液貯罐；
⑥將轉(zhuǎn)化液貯罐內(nèi)的轉(zhuǎn)化液用泵輸送至d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對產(chǎn)物gaba進行吸附，減少轉(zhuǎn)化液中的游離gaba濃度，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為4.2；
⑦將循環(huán)貯罐的溶液再用泵輸入固定化屎腸球菌細(xì)胞反應(yīng)柱于40℃柱溫進行反應(yīng)；
⑧按⑥和⑦進行循環(huán)反應(yīng)，通過檢測轉(zhuǎn)化液流出液的l-glu濃度，以l-glu的摩爾轉(zhuǎn)化率大于85%作為循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點；
⑨循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將70%乙醇溶液通過泵輸送到d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對d101大孔吸附樹脂吸附的gaba進行洗脫，合并或分別收集洗脫液和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱的流出液，即可獲得純度不同的gaba母液。
上述所述底物為l-谷氨酸或谷氨酸一鈉；所述底物溶液為l-谷氨酸或谷氨酸一鈉溶于0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph為4.2。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
本發(fā)明通過d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱可有效控制轉(zhuǎn)化液的gaba和ph值，實現(xiàn)屎腸球菌gad能始終在適宜的轉(zhuǎn)化條件下發(fā)揮其催化活性，顯著提高gaba的產(chǎn)量；在相同反應(yīng)時間和同等固定化屎腸球菌的條件下，本發(fā)明的固定化細(xì)胞柱-d101大孔吸附樹脂柱循環(huán)雙柱反應(yīng)法較傳統(tǒng)的固定化細(xì)胞單柱法的gaba產(chǎn)量提高196.32%，gaba產(chǎn)量將近為單柱法的3倍。d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱可以通過吸附gaba而起到固體酸的作用，減少調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化液ph值的用酸量；同時，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱吸附gaba后，實現(xiàn)了gaba與屎腸球菌分離，可以減少產(chǎn)物對gad的反饋抑制作用及屎腸球菌下游酶對gaba的代謝，增加gaba產(chǎn)量。另外，101大孔吸附樹脂對gaba的吸附作用也是一種gaba純化的過程，可以簡化下游提取純化工藝，降低生產(chǎn)成本。
附圖說明
圖1為固定化細(xì)胞和d101大孔吸附樹脂雙柱式生產(chǎn)gaba的方法的示意圖；
圖1中：1.l-谷氨酸一鈉或l-谷氨酸溶液調(diào)配罐；2.泵；3.閥門；4.高位罐；5.閥門；6.固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱；7.轉(zhuǎn)化液貯罐；8.d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱；9.循環(huán)貯罐；10.平衡貯罐；11.洗脫液貯罐。
具體實施方式
本發(fā)明實施方式是以海藻酸鈣細(xì)胞包埋法制備的固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞柱與d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱組成雙柱式轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)gaba為例，但對不僅限于海藻酸鈣細(xì)胞包埋法制備的固定化屎腸球菌細(xì)胞，對其他方法制備的固定化屎腸球菌細(xì)胞同樣可以與d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱構(gòu)成雙柱式gaba生產(chǎn)體系。
實施例1
本發(fā)明所述的一種以固定化細(xì)胞與d101樹脂雙柱式生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步驟：
①參照焦陽、汪建敏和楊勝遠(yuǎn)等在文摘(核農(nóng)學(xué)報，2009，23(6):1026-1031)的細(xì)胞固定化方法，采用海藻酸鈣細(xì)胞包埋法制備固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液將固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞按照常規(guī)方法裝柱制備成固定化細(xì)胞反應(yīng)柱；
②將d101大孔吸附樹脂按照樹脂說明書用95%乙醇和蒸餾水進行預(yù)處理，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照常規(guī)方法裝柱制備成輔助反應(yīng)柱；
③將步驟①制備的固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱和步驟②制備的d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱與調(diào)配罐、轉(zhuǎn)化液貯罐、泵、循環(huán)貯罐、泵、高位罐、平衡貯罐、洗脫液貯罐、管路及閥門等連接成循環(huán)雙柱反應(yīng)體系；
④在平衡貯罐中加入3倍d101大孔吸附樹脂柱床體積的底物溶液，泵入輔助反應(yīng)柱對d101大孔吸附樹脂進行平衡，備用；
⑤將5倍固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞柱床體積的底物溶液用泵輸送到高位罐，經(jīng)高位罐流入固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱，于40℃柱溫下轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過監(jiān)測轉(zhuǎn)化液流出液的ph控制流速，使流出液ph值不大于4.6，流出的轉(zhuǎn)化液貯存于轉(zhuǎn)化液貯罐；
⑥將轉(zhuǎn)化液貯罐內(nèi)的轉(zhuǎn)化液用泵輸送至d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對產(chǎn)物gaba進行吸附，減少轉(zhuǎn)化液中的游離gaba濃度，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為4.2；
⑦將循環(huán)貯罐的溶液再用泵輸入固定化屎腸球菌gdmcc60203反應(yīng)柱于40℃柱溫進行反應(yīng)；
⑧按⑥和⑦進行循環(huán)反應(yīng)，通過檢測轉(zhuǎn)化液流出液的l-glu濃度，以l-glu的摩爾轉(zhuǎn)化率大于85%作為循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點；
⑨循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將70%乙醇溶液通過泵輸送到d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對d101大孔吸附樹脂吸附的gaba進行洗脫，合并或分別收集洗脫液和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱的流出液，即可獲得純度不同的gaba母液。
上述所述底物為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉；所述底物溶液為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉溶于0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph為4.2。
實施例2
本發(fā)明所述的一種以固定化細(xì)胞與d101樹脂雙柱式生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步驟：
①參照沈俞等在文摘(精細(xì)化工，2008，25(5):459-462)的細(xì)胞固定化方法，采用卡拉膠與明膠復(fù)合載包埋制備固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液將固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞按照常規(guī)方法裝柱制備成固定化細(xì)胞反應(yīng)柱；
②將d101大孔吸附樹脂按照樹脂說明書用95%乙醇和蒸餾水進行預(yù)處理，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照常規(guī)方法裝柱制備成輔助反應(yīng)柱；
③將步驟①制備的固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱和步驟②制備的d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱與調(diào)配罐、轉(zhuǎn)化液貯罐、泵、循環(huán)貯罐、泵、高位罐、平衡貯罐、洗脫液貯罐、管路及閥門等連接成循環(huán)雙柱反應(yīng)體系；
④在平衡貯罐中加入3倍d101大孔吸附樹脂柱床體積的底物溶液，泵入輔助反應(yīng)柱對d101大孔吸附樹脂進行平衡，備用；
⑤將5倍固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞柱床體積的底物溶液用泵輸送到高位罐，經(jīng)高位罐流入固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱，于40℃柱溫下轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過監(jiān)測轉(zhuǎn)化液流出液的ph控制流速，使流出液ph值不大于4.6，流出的轉(zhuǎn)化液貯存于轉(zhuǎn)化液貯罐；
⑥將轉(zhuǎn)化液貯罐內(nèi)的轉(zhuǎn)化液用泵輸送至d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對產(chǎn)物gaba進行吸附，減少轉(zhuǎn)化液中的游離gaba濃度，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為4.2；
⑦將循環(huán)貯罐的溶液再用泵輸入固定化屎腸球菌gdmcc60203反應(yīng)柱于40℃柱溫進行反應(yīng)；
⑧按⑥和⑦進行循環(huán)反應(yīng)，通過檢測轉(zhuǎn)化液流出液的l-glu濃度，以l-glu的摩爾轉(zhuǎn)化率大于85%作為循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點；
⑨循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將70%乙醇溶液通過泵輸送到d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對d101大孔吸附樹脂吸附的gaba進行洗脫，合并或分別收集洗脫液和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱的流出液，即可獲得純度不同的gaba母液。
上述所述底物為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉；所述底物溶液為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉溶于0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph為4.2。
實施例3
本發(fā)明所述的一種以固定化細(xì)胞與d101樹脂雙柱式生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步驟：
①參照趙偉睿等在文摘(高?；瘜W(xué)工程學(xué)報，2015，29(1):138-144)首先采用低介電常數(shù)(<6)、高疏水性(logp>0.68)的有機溶劑對屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞進行透性化處理，再參照焦陽等在文摘(核農(nóng)學(xué)報，2009，23(6):1026-1031)的細(xì)胞固定化方法，采用海藻酸鈣細(xì)胞包埋法制備固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液將固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞按照常規(guī)方法裝柱制備成固定化細(xì)胞反應(yīng)柱；
②將d101大孔吸附樹脂按照樹脂說明書用95%乙醇和蒸餾水進行預(yù)處理，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照常規(guī)方法裝柱制備成輔助反應(yīng)柱；
③將步驟①制備的固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱和步驟②制備的d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱與調(diào)配罐、轉(zhuǎn)化液貯罐、泵、循環(huán)貯罐、泵、高位罐、平衡貯罐、洗脫液貯罐、管路及閥門等連接成循環(huán)雙柱反應(yīng)體系；
④在平衡貯罐中加入3倍d101大孔吸附樹脂柱床體積的底物溶液，泵入輔助反應(yīng)柱對d101大孔吸附樹脂進行平衡，備用；
⑤將5倍固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞柱床體積的底物溶液用泵輸送到高位罐，經(jīng)高位罐流入固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱，于40℃柱溫下轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過監(jiān)測轉(zhuǎn)化液流出液的ph控制流速，使流出液ph值不大于4.6，流出的轉(zhuǎn)化液貯存于轉(zhuǎn)化液貯罐；
⑥將轉(zhuǎn)化液貯罐內(nèi)的轉(zhuǎn)化液用泵輸送至d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對產(chǎn)物gaba進行吸附，減少轉(zhuǎn)化液中的游離gaba濃度，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為4.2；
⑦將循環(huán)貯罐的溶液再用泵輸入固定化屎腸球菌gdmcc60203反應(yīng)柱于40℃柱溫進行反應(yīng)；
⑧按⑥和⑦進行循環(huán)反應(yīng)，通過檢測轉(zhuǎn)化液流出液的l-glu濃度，以l-glu的摩爾轉(zhuǎn)化率大于85%作為循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點；
⑨循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將70%乙醇溶液通過泵輸送到d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對d101大孔吸附樹脂吸附的gaba進行洗脫，合并或分別收集洗脫液和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱的流出液，即可獲得純度不同的gaba母液。
上述所述底物為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉；所述底物溶液為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉溶于0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph為4.2。
實施例4
本發(fā)明所述的一種以固定化細(xì)胞與d101樹脂雙柱式生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法主要包括以下步驟：
①參照焦陽、汪建敏和楊勝遠(yuǎn)等在文摘(核農(nóng)學(xué)報，2009，23(6):1026-1031)的細(xì)胞固定化方法，采用海藻酸鈣細(xì)胞包埋法制備固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液將固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞按照常規(guī)方法裝柱制備成固定化細(xì)胞反應(yīng)柱；
②將d101大孔吸附樹脂按照樹脂說明書用95%乙醇和蒸餾水進行預(yù)處理，然后以ph4.2的0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液按照常規(guī)方法裝柱制備成輔助反應(yīng)柱；
③將步驟①制備的固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱和步驟②制備的d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱與調(diào)配罐、轉(zhuǎn)化液貯罐、泵、循環(huán)貯罐、泵、高位罐、平衡貯罐、洗脫液貯罐、管路及閥門等連接成循環(huán)雙柱反應(yīng)體系；
④將5倍固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞柱床體積的底物溶液用泵輸送到高位罐，經(jīng)高位罐流入固定化屎腸球菌gdmcc60203細(xì)胞反應(yīng)柱，于40℃柱溫下轉(zhuǎn)化反應(yīng)，通過監(jiān)測轉(zhuǎn)化液流出液的ph控制流速，使流出液ph值不大于4.6，流出的轉(zhuǎn)化液貯存于轉(zhuǎn)化液貯罐；
⑤將轉(zhuǎn)化液貯罐內(nèi)的轉(zhuǎn)化液用泵輸送至d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對產(chǎn)物gaba進行吸附，減少轉(zhuǎn)化液中的游離gaba濃度，d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱流出液通入循環(huán)貯罐，采用3mol/lhcl調(diào)節(jié)ph為4.2；
⑥將循環(huán)貯罐的溶液再用泵輸入固定化屎腸球菌gdmcc60203反應(yīng)柱于40℃柱溫進行反應(yīng)；
⑦按⑤和⑥進行循環(huán)反應(yīng)，通過檢測轉(zhuǎn)化液流出液的l-glu濃度，以l-glu的摩爾轉(zhuǎn)化率大于85%作為循環(huán)轉(zhuǎn)化反應(yīng)的終點；
⑧循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將70%乙醇溶液通過泵輸送到d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱，對d101大孔吸附樹脂吸附的gaba進行洗脫，合并或分別收集洗脫液和轉(zhuǎn)化反應(yīng)液經(jīng)d101大孔吸附樹脂輔助反應(yīng)柱的流出液，即可獲得純度不同的gaba母液。
上述所述底物為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉；所述底物溶液為l-谷氨酸或l-谷氨酸一鈉溶于0.2mol/l乙酸-乙酸鈉緩沖液，ph為4.2。