一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法
【專利摘要】一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，步驟包括：將待檢牛奶加入酪蛋白磷酸肽制成成10～100ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液，脫蛋白后過陽離子交換樹脂柱脫鈣，將脫鈣后所得洗脫液過陽離子交換樹脂柱，除雜和富集，將收集液在溫度60～70℃，轉(zhuǎn)速為50～60rpm下真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，過膜后作為液相檢測樣品；然后進行液相檢測，按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。本發(fā)明在減少了實驗初期試劑、儀器等資金投入的同時，運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現(xiàn)酪蛋白磷酸肽的分離，保證了定量精度，并有效去除其他蛋白質(zhì)和脂類等雜志干擾，提高了最終檢測的靈敏度，有利于酪蛋白磷酸肽含量相對較低的樣品檢測。
【專利說明】一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種酪蛋白磷酸肽(CPP)的液相檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]酪蛋白磷酸肽(CPP)是以牛乳酪蛋白為原料，通過生物技術(shù)制得，再經(jīng)分離純化而得到的含有磷酸絲氨酸族的天然生物活性的多肽，可用于各種營養(yǎng)、保健食品中，能有效促進人體對鈣、鐵、鋅等二價礦物營養(yǎng)素的吸收和利用。德國和日本已把酪蛋白磷酸肽(CPP)定性為功能性食品。我國目前已廣泛的把酪蛋白磷酸肽(CPP)作為食品添加劑應(yīng)用于嬰幼兒奶粉和保健食品中。
[0003]雖然人們對酪蛋白磷酸肽(CPP)的功能組分、化學(xué)特點、生理功效等方面進行了廣泛深入的研究，但其在添加酪蛋白磷酸肽(CPP)的食品及保健品中的酪蛋白磷酸肽(CPP)檢測方面報道較少。據(jù)文獻報道，目前普遍采用乙醇沉淀法測定酪蛋白磷酸肽的含量，但該種方法只能檢測原料中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量大于10%的樣品，不能檢測牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量。在牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量檢測方面，存在一些難點問題，如牛奶中的蛋白質(zhì)及一些鹽類成分會嚴重干擾測定結(jié)果。目前國內(nèi)已有大公司將酪蛋白磷酸肽(CPP)添加在乳制品中，如內(nèi)蒙古伊利實業(yè)集團股份有限公司等，但都沒有建立有效的評價酪蛋白磷酸肽(CPP)的檢測方法，因此急需找到一種能檢測牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法?；谀壳暗姆椒ú荒軝z測牛奶中微量酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量，已經(jīng)不能滿足方便、快捷、靈敏度高的檢測方法的需求，建立一種高效液相色譜法測定牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法迫在眉睫，這也顯示出了高效液相色譜一定的優(yōu)勢。
[0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的:針對現(xiàn)有檢測酪蛋白磷酸肽(CPP)的技術(shù)中不適用于測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的不足，提供一種可有效地檢測出牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的高效液相色譜方法，該方法旨在將基本包括現(xiàn)有牛奶所可能涉及的各種主要酪蛋白磷酸肽(CPP)，使其能更加快速、靈敏、簡便地檢測酪蛋白磷酸肽(CPP)的含量，以滿足實際工作的需要。
[0006]本發(fā)明的目的是實現(xiàn)所述的利用高效液相色譜，測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，具體步驟為:
(1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準溶液，混勻，加標成l(Tl00ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脫蛋白，方法是取5?IOg酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料離心管中，加入5?IOg水，混勻后再加入5%。?1.5%三氯乙酸5?10g，漩渦混勻并超聲5?15min，然后以400(T4800rpm離心5?15min，離心后將離心管放入65?75°C的水浴鍋中水浴5?15min，再以400(T4800rpm離心5~15min，取上清液濾紙過濾后備用；
(3)將預(yù)先處理好的陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3~5mL，用2~3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，關(guān)閉活塞；將步驟(2)處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為1-2滴每秒；用水做洗脫劑，洗脫體積為廣2倍柱體積，收集洗脫液；
(4)將預(yù)先處理好的陰離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3~5mL，用2~3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，洗滌完成后、關(guān)閉活塞；將步驟(3)收集的洗脫液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為廣2滴每秒；首先用2~3倍柱體積的水洗脫，除去雜質(zhì)，然后用濃度為0.1-0.4mol/L HCl做洗脫劑，洗脫體積為2~3倍柱體積，收集洗脫液；
(5)將收集液轉(zhuǎn)到濃縮瓶中，以濃縮溫度為6(T70°C，轉(zhuǎn)速為5(T60rpm，進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至f2mL，準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品；
(6)液相檢測:色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250 X 4.6_，流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序:從O到45min，流動相B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數(shù)，進樣量20 μ L，柱溫常溫，波長，215nm ；
(7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。
[0007]步驟(2)中，所述脫蛋白的方法也可以是:取5~10g事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5^10g水，混勻后再加入5%。~1.5%三氯乙酸5~10g漩渦混勻并超聲5~15min，然后以400(T4800rpm離心5~15min。取上清液濾紙過濾后備用。
[0008]或取5~IOg事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5~IOg的水，混勻后再加入氯仿:正丁醇溶液(預(yù)先配成體積比4:1混合液)2.5~5mL，漩渦混勻并超聲5~15min，然后以400(T4800rpm離心5~15min，取出上層重復(fù)上述操作處理3次。取上清液濾紙過濾后備用。
[0009]或取5~IOg事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5~IOg的水，漩渦混勻并超聲5~15min，將離心管放入65~75°C的水浴鍋中水浴5~15min，然后以400(T4800rpm離心5~15min。取上清液濾紙過濾后備用。
[0010]步驟(3)中，所述陽離子交換樹脂為001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹月旨、羅門哈斯AMBERJET UP6040陽離子交換樹脂、三菱WK60L陽離子交換樹脂中的一種。
[0011]步驟(4)中，所述陰離子交換樹脂為FPA98C1羅門哈斯離子交換樹脂、德國Lewatit M500陰離子交換樹脂,美國Amberlite IRA-400陰離子交換樹脂、阿拉丁陰離子交換樹脂中的一種。
[0012]本發(fā)明方法的檢測限為大約10 μ g/mL (信噪比≤3)，回收率在85%~105%之間。
[0013]本發(fā)明的檢測方法的主要特點:
本發(fā)明方法靈敏度高、準確度和精密度好，專屬性及確證性可靠，而且非常簡便并可易于實際檢測應(yīng)用，且可非常好地滿足實際檢測中的需要。采用高效液相色譜對牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)檢測的方法，目前尚未見有相應(yīng)的報道。
[0014]本發(fā)明優(yōu)點為:本發(fā)明建立了用高效液相色譜檢測牛奶實際樣品中酪蛋白磷酸肽(CPP)的定量分析方法，減少了實驗初期在實驗試劑、儀器設(shè)備等方面的資金投入的同時，運用相對簡單高效的純化步驟進行操作，實現(xiàn)酪蛋白磷酸肽(CPP)的分離，保證了定量精度，并有效去除其他蛋白質(zhì)和脂類等雜志干擾，提高了最終檢測的靈敏度。方法的檢出限為15 μ g/mL,有效地確保實驗數(shù)據(jù)的準確度，有利于酪蛋白磷酸肽(CPP)含量相對較低的樣品檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1為酪蛋白磷酸肽(CPP)標準品色譜圖。
[0016]圖2為牛奶中添加酪蛋白磷酸肽(CPP)色譜圖。
[0017]圖3為牛奶中添加酪蛋白磷酸肽(CPP)后再加入酪蛋白磷酸肽(CPP)定性色譜圖。
[0018]圖4為空白液態(tài)牛奶樣品色譜圖。
[0019]圖5為酪蛋白磷酸肽(CPP)標準品、實際樣品和空白液態(tài)牛奶樣品重疊色譜圖。
[0020]圖6為IO μ g/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP )標準品色譜圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結(jié)合實施實例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0022]實驗方法
I材料、試劑和儀器
乙腈(色譜純)，三氯乙酸(分析純)，酪蛋白磷酸肽(CPP)標準品，實驗用水為超純水(18MQ*cm, TOC 3 ppb)，F(xiàn)PA98C1羅門哈斯離子交換樹脂(北京慧德易科技有限責(zé)任公司)，001 X 7 (732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂(杭州爭光樹脂有限公司)，德國LewatitM500陰離子交換樹脂，羅門哈斯AMBERJET UP6040陽離子交換樹脂，美國AmberliteIRA-400陰離子交換樹脂，阿拉丁陰離子交換樹脂，三菱WK60L陽離子交換樹脂，島津LC-15C高效液相色譜儀配STO-15C紫外檢測器，XW-80A型旋渦混合器，L530臺式低速離心機，電子天平，JP-040型潔盟牌超聲清洗機，R201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，恒溫水浴鍋。
[0023]2實驗用試劑
0.1%三氟乙酸乙腈溶液:吸取ImL三氟乙酸用乙腈稀釋至IOOOmL ；
0.1%三氟乙酸水溶液:吸取ImL三氟乙酸用水稀釋至IOOOmL ；
0.5%三氯乙酸溶液:稱取0.5g三氯乙酸加水至IOOg ；
酪蛋白磷酸肽(CPP)標準品用超純水稀釋，配制成不同濃度的標樣進行檢測，可得到較好的色譜峰形，并且配制簡單。
[0024]標準物質(zhì):酪蛋白磷酸肽(CPP)，純度不低于90%。
[0025]按外標法以峰面積計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽(CPP)的濃度。
[0026]實施例1:本發(fā)明所提供的測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步驟:
(1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準溶液，混勻，加標成IOOppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脫蛋白。方法是取5g事先配置好的酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料離心管中，加入5g水,混勻后再加入5%。三氯乙酸5g鏇潤混勻并超聲5min,然后以4800rpm離心lOmin，離心后將離心管放入70°C的水浴鍋中水浴lOmin，再以4800rpm離心lOmin。取上清液濾紙過濾后備用；
(3)過001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂柱脫鈣。將預(yù)先處理好的001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為5mL，用2倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，關(guān)閉活塞。將步驟(2)處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為2滴每秒。用水做洗脫劑，洗脫體積為I倍柱體積，收集洗脫液；
(4)將洗脫液過FPA98C1羅門哈斯離子交換樹脂柱，除雜和富集。將預(yù)先處理好的FPA98C1羅門哈斯離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為5mL。用2倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，洗滌完成后、關(guān)閉活塞；將步驟(3)收集的洗脫液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為2滴每秒；首先用2倍柱體積的水洗脫，除去雜質(zhì)，然后用濃度為0.2mol/L HCl做洗脫劑，洗脫體積為2倍柱體積，收集洗脫液；
(5)將收集液轉(zhuǎn)到濃縮瓶中，以濃縮溫度為60°C，轉(zhuǎn)速為50rpm，進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至ImL,準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品；
(6)液相檢測。色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6mm，流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序:從O到45min，流動相B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數(shù)，進樣量20 μ L，柱溫常溫，波長，215nm ；
(7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。
[0027]實施例2:本發(fā)明所提供的測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步驟:
(1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準溶液，混勻，加標成IOppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脫蛋白。方法是取IOg事先配置好的酪蛋白磷酸肽分散溶液樣品于50mL塑料離心管中，加入IOg水,混勻后再加入1%。三氯乙酸IOg鏇潤混勻并超聲IOmin,然后以4000rpm離心15min,離心后將離心管放入75°C的水浴鍋中水浴15min,再以4000rpm離心15min。取上清液濾紙過濾后備用；
(3)過三菱WK60L陽離子交換樹脂柱脫鈣。將預(yù)先處理好的三菱WK60L陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3mL，用3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，關(guān)閉活塞。將步驟(2)處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為I滴每秒。用水做洗脫劑，洗脫體積為2倍柱體積，收集洗脫液；
(4)將洗脫液過阿拉丁陰離子交換樹脂柱，除雜和富集。將預(yù)先處理好的阿拉丁陰離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3mL。用3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，洗滌完成后、關(guān)閉活塞。將步驟(3)收集的洗脫液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為I滴每秒。首先用3倍柱體積的水洗脫，除去雜質(zhì)，然后用濃度為0.4mol/L HCl做洗脫劑，洗脫體積為3倍柱體積，收集洗脫液；
(5)將收集液轉(zhuǎn)到濃縮瓶中，以濃縮溫度為70°C，轉(zhuǎn)速為60rpm，進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2mL,準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品；
(6)液相檢測。色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6_，流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序:從O到45min，流動相B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數(shù)，進樣量20 μ L，柱溫常溫，波長，215nm ；
(7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。
[0028]實施例3:本發(fā)明所提供的測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步驟:
(1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準溶液，混勻，加標成50ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脫蛋白。方法是取5g事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5g水，混勻后再加入氯仿:正丁醇溶液(預(yù)先配成體積比4:1混合液)2.5mL，漩渦混勻并超聲15min，然后以4800rpm離心5min,取出上清重復(fù)上述操作處理3次。取上清液濾紙過濾后備用；
(3)過羅門哈斯AMBERJETUP6040陽離子交換樹脂柱脫鈣。將預(yù)先處理好的羅門哈斯AMBERJET UP6040陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3mL，用3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，關(guān)閉活塞。將步驟(2)處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為I滴每秒。用水做洗脫劑，洗脫體積為2倍柱體積，收集洗脫液；
(4)將洗脫液過德國LewatitM500陰離子交換樹脂柱，除雜和富集。將預(yù)先處理好的德國Lewatit M500陰離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3mL。用2倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，洗滌完成后、關(guān)閉活塞。將步驟(3)收集的洗脫液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為I滴每秒。首先用3倍柱體積的水洗脫，除去雜質(zhì)，然后用濃度為0.4mol/L HCl做洗脫劑，洗脫體積為3倍柱體積，收集洗脫液:
(5)將收集液轉(zhuǎn)到濃縮瓶中，以濃縮溫度為70°C，轉(zhuǎn)速為60rpm，進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2mL,準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品；
(6)液相檢測。色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6mm，流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序:從O到45min，流動相B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數(shù)，進樣量20 μ L，柱溫常溫，波長，215nm ；
(7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。
[0029]實施例4:本發(fā)明所提供的測定牛奶中添加的酪蛋白磷酸肽(CPP)含量的方法，包括以下步驟:
(1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準溶液，混勻，加標成50ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；
(2)脫蛋白。方法取IOg事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入IOg水，混勻后再加入1.5%。三氯乙酸IOg鏇潤混勻并超聲15min,然后以4400rpm離心15min,離心后將離心管放入65°C的水浴鍋中水浴15min，再以4400rpm離心15min。取上清液濾紙過濾后備用；
(3)過001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂柱脫鈣。將預(yù)先處理好的001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為5mL，用3倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，關(guān)閉活塞。將步驟(2)處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為I滴每秒。用水做洗脫劑，洗脫體積為2倍柱體積，收集洗脫液；
(4)將洗脫液過美國AmberliteIRA-400陰離子交換樹脂柱，除雜和富集。將預(yù)先處理好的美國Amberlite IRA-400陰離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為5mL。用2倍柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，洗滌完成后、關(guān)閉活塞。將步驟(3)收集的洗脫液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為I滴每秒。首先用3倍柱體積的水洗脫，除去雜質(zhì)，然后用濃度為0.2mol/L HCl做洗脫劑，洗脫體積為3倍柱體積，收集洗脫液；
(5)將收集液轉(zhuǎn)到濃縮瓶中，以濃縮溫度為65°C，轉(zhuǎn)速為50rpm，進行真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至2mL,準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品；
(6)液相檢測。色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250X4.6_，流動相A:0.1%三氟乙酸水溶液，流動相B:0.1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序:從O到45min，流動相B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數(shù)，進樣量20 μ L，柱溫常溫，波長，215nm ；
(7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。
[0030]結(jié)果與討論
1、前處理方法討論
前處理中有幾個注意點，首先是樣品加入液態(tài)奶中需要充分混勻，以免重復(fù)取樣檢測時結(jié)果相差較大。其次脫蛋白`時使用的三氯乙酸溶液的濃度及水浴溫度要適宜，防止產(chǎn)生因三氯乙酸溶液濃度過高或溫度過高對酪蛋白磷酸肽(CPP)的影響及過低導(dǎo)致除雜效果不好的問題。因此適宜的三氯乙酸溶液的濃度及水浴的溫度是本方法的一個關(guān)鍵點。
[0031]2、方法的線性相關(guān)性及檢出限
濃度分別為 0.0800,0.1200,0.1600,0.2000,0.2400,0.2800mg/mL 的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準品溶液依次進樣，進樣量均為20 μ L，外標法定量。以峰面積A為縱坐標，濃度C為橫坐標進行線性回歸，得到Α=9.9Χ 105C-21143，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999。酪蛋白磷酸肽(CPP)在0.0800mg/mL-0.2800mg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。
[0032]經(jīng)實驗測定，方法檢測限為10 μ g/mL,圖6為10 μ g/mL的酪蛋白磷酸肽(CPP)標準品色譜圖，此濃度下信噪比達到了 3。
[0033]3、實際樣品檢測結(jié)果 HPLC檢測結(jié)果見圖2和表5。
[0034]表5牛奶中酪蛋白磷酸肽(CPP)檢測結(jié)果
【權(quán)利要求】
1.一種牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，其特征在于，步驟包括：(1)將待檢牛奶置于燒杯中，加入濃度為5mg/mL的酪蛋白磷酸肽（CPP)標準溶液，混 勻，加標成l(Tl00ppm的酪蛋白磷酸肽分散溶液；(2)脫蛋白，方法是取5?10g酪蛋白磷酸肽分散溶液于50mL塑料離心管中，加入 5?10g水，混勻后再加入5 %。?1. 5%三氯乙酸5?10g，漩渦混勻并超聲5?15min，然后以 400(T4800rpm離心5?15min，離心后將離心管放入65?75°C的水浴鍋中水浴5?15min，再以 400(T4800rpm離心5?15min，取上清液濾紙過濾后備用；(3)將預(yù)先處理好的陽離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3?5mL，用2?3倍 柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，關(guān)閉活塞；將步驟（2)處理好的樣品緩慢地加入 層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為廣2滴每秒；用水做洗脫劑，洗脫體積為廣2 倍柱體積，收集洗脫液；(4)將預(yù)先處理好的陰離子交換樹脂填料裝入層析柱中，裝柱體積為3飛mL，用2?3倍 柱體積的水洗滌填料，除去樹脂中的雜質(zhì)，洗滌完成后、關(guān)閉活塞；將步驟（3)收集的洗脫 液處理好的樣品緩慢地加入層析柱中，打開活塞，使液體緩慢流下，流速為廣2滴每秒；首 先用2?3倍柱體積的水洗脫，除去雜質(zhì)，然后用濃度為0. ro. 4mol/L HC1做洗脫劑，洗脫體 積為2?3倍柱體積，收集洗脫液；(5)將收集液轉(zhuǎn)到濃縮瓶中，以濃縮溫度為6(T70°C，轉(zhuǎn)速為5(T60rpm，進行真空旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)至f2mL，準確記錄濃縮后的體積，過膜后作為液相檢測樣品；(6)液相檢測:色譜柱DiamosilC18(2) 5u，250 X 4. 6mm，流動相A :0. 1%三氟乙酸水溶 液，流動相B ：0. 1%三氟乙酸乙腈溶液，流速lmL/min ;梯度洗脫程序：從0到45min，流動相 B濃度由5%梯度洗脫到35%，洗脫時段中均以流動相A補足余下的百分數(shù)，進樣量20 y L，柱 溫常溫，波長，215nm ；(7)按外標法以峰面積法計算牛奶中添加酪蛋白磷酸肽的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，其特征在于，步驟(2)中，所述脫蛋白的方法是：取5?10g事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入 5?10g水，混勻后再加入5 ?1. 5%三氯乙酸5?10g漩渦混勻并超聲5?15min，然后以 400(T4800rpm離心5?15min，取上清液濾紙過濾后備用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，其特征在于，步驟（2) 中，所述脫蛋白的方法是取5?10g事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5?10g 的水，混勻后再加入氯仿和正丁醇混合溶液2. 5?5mL，漩渦混勻并超聲5?15min，然后以 4000^4800rpm離心5?15min，取出上層重復(fù)上述操作處理3次，取上清液濾紙過濾后備用， 所述氯仿和正丁醇混合溶液的體積配比為4:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，其特征在于，步驟（2) 中，所述脫蛋白的方法是：取5?10g事先配置好的樣品于50mL塑料離心管中，加入5?10g 的水，漩渦混勻并超聲5?15min，將離心管放入65?75°C的水浴鍋中水浴5?15min，然后以 4000^4800rpm離心5?15min，取上清液濾紙過濾后備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，其特征在于，步驟(3)中，所述陽離子交換樹脂為001X7(732)強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂、羅門哈斯 AMBERJET UP6040陽離子交換樹脂、三菱WK60L陽離子交換樹脂中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛奶中酪蛋白磷酸肽液相檢測方法，其特征在于，步驟(4)中，所述陰離子交換樹脂為FPA98C1羅門哈斯離子交換樹脂、德國Lewatit M500陰離子交換樹脂，美國Amberlite IRA-400陰尚子交換樹脂、阿拉丁陰尚子交換樹脂中的一種。
【文檔編號】G01N30/06GK103760246SQ201310712472
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月23日
【發(fā)明者】曹庸, 李雙祁, 劉飛, 彭維, 郭斌, 吳成順 申請人:廣州綠萃生物科技有限公司