專利名稱：ZrO₂/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)及其在磷酸肽捕捉、富集和分離中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，特別涉及一種具有梭形^O2負載在氧化石墨烯上的復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，及其在磷酸肽富集、捕捉和分離中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)磷酸化被認為在許多細胞進程例如信號傳遞、細胞生長和分裂以及新陳代謝中扮演著關(guān)鍵作用，蛋白質(zhì)磷酸化位點的確定是分析了解生物系統(tǒng)調(diào)控的一個基本步驟。然而當前利用質(zhì)譜對蛋白質(zhì)磷酸化位點的測定仍然受到磷酸肽低豐度的影響，因此從復(fù)雜的多肽混合物中分離和富集磷酸肽是十分必要的。石墨烯是由單層sp2碳原子組成的六方蜂巢狀二維結(jié)構(gòu)，由于其特殊的結(jié)構(gòu)，具有一系列優(yōu)異的性質(zhì)。目前應(yīng)用較多的石墨烯衍生物主要是功能化的氧化石墨烯。氧化石墨烯含有大量的含氧活性基團，如羰基、羧基、 羥基與環(huán)氧基等，具有良好的生物相容性和水溶液穩(wěn)定性，并且可以進行化學(xué)功能化修飾， 因此在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有很強的應(yīng)用前景，可以用于生物元件、微生物檢測、疾病診斷和藥物輸運系統(tǒng)等方面。納米材料具有特殊的物理、化學(xué)性質(zhì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正在吸引越來越多的關(guān)注。開發(fā)新的復(fù)合方法，將石墨烯和納米材料有機地結(jié)合起來，充分利用兩者的優(yōu)點，將有可能帶來更加新穎的性質(zhì)和更為廣泛的應(yīng)用，對納米生物器件的深入探索和應(yīng)用開發(fā)具有重要作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種^O2和氧化石墨烯的復(fù)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的進一步目的是提供一種梭形^O2與氧化石墨烯復(fù)合生長的的溫和有效的方法。本發(fā)明的另一個目的是將上述則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，用于磷酸肽的富集和分離。本發(fā)明還有一個目的就是利用所述則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)對磷酸肽很好的捕捉能力，提供一種具有更好效果的磷酸肽的富集、捕捉和分離的方法。本發(fā)明中的&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，按如下方法制備a)將rLr (NO3) 4 · 5Η20與和氧化石墨烯溶液在NaOH水溶液中混合，Zr (NO3) 4 · 5Η20 與氧化石墨烯的質(zhì)量比在0. 4-80之間；b)將上述混合溶液倒入高壓釜中，關(guān)閉高壓釜，于攝氏160-230度保持12_48小時，然后冷卻到室溫，收集固體產(chǎn)物，洗滌后干燥，該固體產(chǎn)物即為本發(fā)明中的&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明采用^"(NO3)4 ·5Η20和NaOH為反應(yīng)物，利用氧化石墨烯的導(dǎo)向作用，高產(chǎn)率地合成了梭形與氧化石墨烯的復(fù)合結(jié)構(gòu)。實驗參數(shù)(例如濃度、摩爾比、反應(yīng)溫度和反應(yīng)時間等)在一定范圍內(nèi)變化都不會改變產(chǎn)物的形貌和結(jié)構(gòu)，但是會在一定程度上影響梭形^O2的尺寸、軸比、晶化度以及梭形&02在石墨烯上的負載量。圖1為質(zhì)量比為16地
3Zr (NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯在IOmLlOmol · L^1NaOH水溶液中混合，在水熱條件下200°C反應(yīng)M小時所得產(chǎn)物的X射線衍射(XRD)圖譜。從圖1中我們可以看出所得的產(chǎn)物具有氧化石墨烯和^O2兩種物質(zhì)的特征XRD衍射峰，其中在十度左右的為石墨烯的衍射峰，剩余的為^O2的衍射峰，說明產(chǎn)物中兩種物質(zhì)的存在。圖加為質(zhì)量比為16的^(NO3)4 · 5H20 與氧化石墨烯在IOmLlOmol · I^NaOH水溶液中混合，在水熱條件下200°C反應(yīng)M小時所得產(chǎn)物的掃描電鏡(SEM)照片，從圖中可以看出，氧化鋯納米顆粒均勻地分散在一層石墨烯的表面，呈梭狀，其長度在150-200nm。圖2b_c為所得則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的透射電鏡 (TEM)照片，同樣可以看出，具有梭狀結(jié)構(gòu)的氧化鋯納米顆粒有效地分散在石墨烯片狀結(jié)構(gòu)的表面上。圖2d選取電子衍射(SAED)圖譜和圖2e，f的高分辨透射電鏡(HRTEM)照片說明了在石墨烯片上的梭形納米顆粒具有W01]優(yōu)先生長方向。由上述結(jié)果可以看到氧化石墨烯成功導(dǎo)向了氧化鋯梭狀納米結(jié)構(gòu)的生長，獲得了梭形則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)。圖3顯示的是質(zhì)量比為16的^"(NO3)4 ·5Η20與氧化石墨烯在IOmLlOmol 'T1NaOH 水溶液中混合，在水熱條件下200°C反應(yīng)16小時所得產(chǎn)物的SEM照片，從圖中可以看出，當反應(yīng)時間為16小時時，梭狀氧化鋯納米結(jié)構(gòu)就可以被合成。圖4顯示的是采用不同質(zhì)量比的^(NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯的情況下所得產(chǎn)物的SEM照片，可以看出當^(NO3)4 · 5H20 與氧化石墨烯的質(zhì)量比為5. 2,26. 1、45. 3和73. 2時，都可以獲得梭形石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，并且隨著質(zhì)量比的升高，在石墨烯表面上負載的量逐漸升高。以上在不同條件下合成產(chǎn)物的掃描電鏡照片表明了 &02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)可以在較廣的合成條件范圍內(nèi)被合成。為了證明所制備的&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)對于磷酸肽捕捉的特殊選擇性，我們選擇牛β -酪蛋白這種含有5個已知磷酸肽的蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物為目標，利用MALDI-TOF-MS 進行測試。圖如顯示了牛β-酪蛋白的經(jīng)胰蛋白酶消化后的產(chǎn)物直接用MALDI-TOF-MS分析的結(jié)果，圖恥則顯示了相同量的牛β-酪蛋白的經(jīng)胰蛋白酶消化后的產(chǎn)物利用則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)處理之后MALDI-TOF-MS分析的結(jié)果。在圖fe中，牛β -酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物中非磷酸肽和磷酸肽的峰均可以被檢測到，其中m/z為2061. 94和3122. 56處分別為β i和β 3磷酸肽，標記為1,2,3處則分別是β r (HPO3)，β 3-2 (HPO3)和β 3" (HPO3)。相比而言，圖5b只顯示出5個峰分別對應(yīng)了 β「(HPO3)，β β 3-2 (HPO3)，β 3_ (HPO3)和β 3 磷酸肽，說明了牛β -酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物中只有磷酸肽被&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)捕獲并分離出來。我們也設(shè)計了實驗來進一步確認則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)對于磷酸肽選擇性分離的影響，牛β-酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物也分別通過&02納米材料(SEM如圖6所示)或純氧化石墨烯處理后進行MALDI-T0F-MS檢測。圖5c顯示了這些純^O2納米材料同樣可以捕捉并分離磷酸肽，但是分離出來的磷酸肽的峰強度只有經(jīng)&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)處理后所分離的磷酸肽的峰強度的1/3，而圖5d中則沒有觀察到任何來自β -酪蛋白的磷酸肽的峰，說明了石墨烯本身對磷酸肽沒有捕捉分離的能力，相比于純^O2納米顆粒，梭形則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)對磷酸肽更好的捕捉分離能力并不是由于石墨烯的存在，而是它們本身的復(fù)合結(jié)構(gòu)決定的。這種現(xiàn)象可能歸結(jié)為兩個原因首先，ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)可以有效地分散在溶液中(如圖7所示)，從而提高則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)和磷酸肽的捕捉效率；另一方面，&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)具有很高的比表面積，豐富的官能團也可以通過螯合來捕獲磷酸肽。這些都可能間接地提高了石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)捕獲分離磷酸肽的能力。
本發(fā)明合成了一種新型梭狀則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，這種由梭狀^O2負載在氧化石墨烯的復(fù)合結(jié)構(gòu)可以用于磷酸肽的捕獲、富集和分離。本發(fā)明提供了一種簡單、溫和的合成方法，實現(xiàn)了梭狀^O2納米結(jié)構(gòu)在石墨烯表面的合成，在水熱條件下，獲得了高產(chǎn)率的 ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)。所制備的則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)被應(yīng)用于磷酸肽的選擇性捕獲，結(jié)果表明石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)對磷酸肽具有高效地選擇性捕獲能力，將在磷酸肽的富集、捕獲和分離中有較好的應(yīng)用前景。


圖1為(a)純石墨烯的XRD圖譜；(b)質(zhì)量比為16的&(NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯在IOmLlOmol · L-1NaOH水溶液中混合，在水熱條件下200°C反應(yīng)M小時所得產(chǎn)物的XRD圖譜。圖2為質(zhì)量比為16的& (NO3) 4 ·5Η20與氧化石墨烯在IOmLlOmol .L4NaOH水溶液中混合，在水熱條件下200°C反應(yīng)M小時所得產(chǎn)物的(a) SEM照片；(b c) TEM照片；(d) SAED譜圖；(e f) HRTEM照片。圖3為質(zhì)量比為16的Zr (NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯在IOmLlOmol · L4NaOH水溶液中混合，在水熱條件下200°C反應(yīng)16小時所得產(chǎn)物的SEM照片。圖4為采用不同質(zhì)量比的&(NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯在水熱條件下200°C反應(yīng) 16 小時所得產(chǎn)物的 SEM 照片(a) 5. 2 ； (b) 26. 1 ； (c) 45. 3 ； (d) 73. 2。圖5為不同條件下牛β -酪蛋白的經(jīng)胰蛋白酶消化產(chǎn)物的MALDI-T0F-MS圖(a) 未經(jīng)任何處理；(b)經(jīng)則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)處理；(c)經(jīng)^O2納米顆粒處理；(d)經(jīng)氧化石
墨烯處理。圖6為不加氧化石墨烯，直接將& (NO3)4 · 5H20的NaOH水溶液直接在水熱條件下 200°C反應(yīng)M小時所得產(chǎn)物的SEM照片。圖7為不同濃度的&02/氧化石墨烯分散在水中的照片(a)0. 5g/L ； (b) 1. Og/L ； (c) 5. Og/L。
具體實施例方式實施例1氧化石墨烯(GO)的制備向80°C的由50mL濃硫酸、IOg K2S2O8和IOg P2O5組成的溶液中加入12g石墨，反應(yīng)6小時。混合液用3L水稀釋，離心分離，沉淀洗滌后在空氣中烘干。將干燥后的石墨加入到460mL通過冰浴冷卻至0°C硫酸中，攪拌，并緩慢加入60g高錳酸鉀并控制溫度低于10°C。混合物在35°C反應(yīng)2小時后，緩緩加入920mL去離子水，控制溫度低于50°C。繼續(xù)反應(yīng)2小時后，加入2. 8L水和50mL 30%過氧化氫，得到黃色透明溶液?；旌弦红o置至少一天后傾潷出上層清液。剩余混合物離心分離，沉淀用5L 10% HCl和 5L水洗滌。所得固體再進行一周的滲析來去除剩余的金屬離子和酸。最終，烘干產(chǎn)物，得到氧化石墨烯，用于合成&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)。實施例2ZrO2 納米顆粒的合成將 IOmL 水，0. 16g Zr (NO3) 4 ·5H20 和 IOmLlOmol .L-1NaOH 溶液混合，水熱條件下200°C反應(yīng)M小時。收集水熱釜底部的產(chǎn)品，水洗3次，空氣中干燥。所得^O2為納米顆粒。實施例3ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備將IOmLlg · L—1氧化石墨烯溶液，0. 16g Zr (NO3)4 · 5H20和IOmLlOmol · L-1NaOH溶液混合，水熱條件下200°C反應(yīng)M小時，然后冷卻到室溫。收集高壓釜底部的產(chǎn)物，用去離子水洗滌后在空氣中室溫自然干燥。所得產(chǎn)物為梭狀^O2負載在氧化石墨烯表面。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以在一定合成條件范圍內(nèi)獲得。實施例4ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備將IOmL Ig · L—1氧化石墨烯溶液，0. 16g Zr (NO3)4 · 5H20和IOmLlOmol · L-1NaOH溶液混合，水熱條件下200°C反應(yīng)16小時，然后冷卻到室溫。收集高壓釜底部的產(chǎn)物，用去離子水洗滌后在空氣中室溫自然干燥。所得產(chǎn)物為梭狀^O2負載在氧化石墨烯表面。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以在一定合成條件范圍內(nèi)獲得。實施例5ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備將Zr(NO3)4 ·5Η20與氧化石墨烯按質(zhì)量比為5. 2在 IOmLlOmol -L^1NaOH水溶液中混合，水熱條件下200°C反應(yīng)M小時，然后冷卻到室溫。收集高壓釜底部的產(chǎn)物，用去離子水洗滌后在空氣中室溫自然干燥。所得產(chǎn)物為梭狀負載在氧化石墨烯表面。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以在一定合成條件范圍內(nèi)獲得。實施例6ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備將& (NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯按質(zhì)量比為26. 1 在IOmLlOmol .I^NaOH水溶液中混合，水熱條件下200°C反應(yīng)M小時，然后冷卻到室溫。收集高壓釜底部的產(chǎn)物，用去離子水洗滌后在空氣中室溫自然干燥。所得產(chǎn)物為梭狀灶02負載在氧化石墨烯表面。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以在一定合成條件范圍內(nèi)獲得。實施例7ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備將& (NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯按質(zhì)量比為45. 3 在IOmLlOmol .I^NaOH水溶液中混合，水熱條件下200°C反應(yīng)M小時，然后冷卻到室溫。收集高壓釜底部的產(chǎn)物，用去離子水洗滌后在空氣中室溫自然干燥。所得產(chǎn)物為梭狀灶02負載在氧化石墨烯表面。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以在一定合成條件范圍內(nèi)獲得。實施例8ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)的制備將& (NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯按質(zhì)量比為73. 2 在IOmLlOmol .I^NaOH水溶液中混合，水熱條件下200°C反應(yīng)M小時，然后冷卻到室溫。收集高壓釜底部的產(chǎn)物，用去離子水洗滌后在空氣中室溫自然干燥。所得產(chǎn)物為梭狀灶02負載在氧化石墨烯表面。這種復(fù)合結(jié)構(gòu)也可以在一定合成條件范圍內(nèi)獲得。實施例9&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)捕捉磷酸肽在2 μ Llpmol的牛β -酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物中加入10μ L15mg/mL的&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)懸濁液中，在室溫下攪拌30分鐘，離心分離。然后，將離心所得則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)分別使用含200mM氯化鈉和不含氯化鈉的緩沖液洗滌。接著，使用15yL pH為11. 5的氨水與上述處理所得的&02/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)混合并超聲超聲15min后離心，將所得濾液與MALDI的2，5-DHB基質(zhì)混合，放入MALDI靶作質(zhì)譜分析。實施例10
ZrO2納米顆粒捕捉磷酸肽在2 μ Llpmol的牛β -酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物中加入IOyL米顆粒的懸濁液中，在室溫下攪拌30分鐘，離心分離。然后， 將離心所得^O2納米顆粒分別使用含200mM氯化鈉和不含氯化鈉的緩沖液洗滌。接著，使用15 μ L pH為11. 5的氨水與上述處理所得的^O2納米顆粒混合并超聲15min后離心，將所得濾液與MALDI的2，5-DHB基質(zhì)混合，放入MALDI靶作質(zhì)譜分析。實施例11石墨烯捕捉磷酸肽在2yL Ipmol的牛β -酪蛋白的胰蛋白酶消化產(chǎn)物中加入 IOuL 15mg/mL的石墨烯懸濁液中，在室溫下攪拌30分鐘，離心分離。然后，將離心所得石墨烯分別使用含200mM氯化鈉和不含氯化鈉的緩沖液洗滌。接著，使用15 μ L
的氨水與上述處理所得的石墨烯混合并超聲超聲15min后離心，將所得濾液與MALDI的2， 5-DHB基質(zhì)混合，放入MALDI靶作質(zhì)譜分析。
權(quán)利要求
1.一種則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于一維^O2納米顆粒均勻分散在氧化石墨烯表面。
2.如權(quán)利要求1所述的則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于按如下方法制備a)將ττ(NO3) 4 · 5Η20和氧化石墨烯溶液在NaOH水溶液中混合，Zr (NO3) 4 · 5Η20與氧化石墨烯的質(zhì)量比在4-80之間；b)將上述混合溶液倒入高壓釜中，關(guān)閉高壓釜，于攝氏160-230度保持12-48小時，然后冷卻到室溫，收集固體產(chǎn)物，洗滌后干燥。
3.如權(quán)利要求1所述的則石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于所述&(NO3)4 · 5H20與氧化石墨烯的質(zhì)量比在10-70之間，于200度保持16-M小時。
4.一種如權(quán)利要求1所述的石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于可以用于磷酸肽的富集、捕捉和分離。
5.一種如權(quán)利要求1所述的石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)，其特征在于可以用于胰蛋白酶消化的多肽中磷酸肽的富集、捕捉和分離。
全文摘要
本發(fā)明ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)及其在磷酸肽捕捉、富集和分離中的應(yīng)用，涉及一種復(fù)合納米結(jié)構(gòu)，所述復(fù)合結(jié)構(gòu)由梭形ZrO2負載在氧化石墨烯上組成，制備方法將Zr(NO3)4·5H2O與和氧化石墨烯溶液在NaOH水溶液中混合，在水熱條件下發(fā)生反應(yīng)，所得固體產(chǎn)物即為所述的ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)。本發(fā)明ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)具有很好的對磷酸肽的富集、捕捉和分離作用。本發(fā)明提供了一種簡單、溫和的合成方法，實現(xiàn)了梭狀ZrO2納米結(jié)構(gòu)在石墨烯表面的合成，獲得了高產(chǎn)率的ZrO2/石墨烯復(fù)合結(jié)構(gòu)。
文檔編號C07K1/14GK102351942SQ20111027625
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者龐歡, 陸輕銥, 高峰 申請人:南京大學(xué)