專利名稱：采用金屬氧化物磁性微球分離富集磷酸化肽段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬無機材料及生化分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種超順磁性的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物包覆四氧化三鐵磁性微球應用于分離富集磷酸化肽段的方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的磷酸化在調(diào)節(jié)生命過程中發(fā)揮著重要的作用，因此研究復雜混合物樣品中的磷酸化蛋白對于揭示生命過程的調(diào)節(jié)機制是非常有意義的。生物質(zhì)譜是解析磷酸化肽段結(jié)構(gòu)的有力手段，但是由于磷酸化肽段的離子化效率相對較差，因此樣品中非磷酸化肽段信號嚴重干擾了磷酸化肽段的檢測。因此，在質(zhì)譜分析之前對磷酸化肽段進行預分離富集是非常必要的。目前，固定金屬離子親和色譜(IMAC)是廣為采用的分離富集磷酸化蛋白和肽段的有效方法。然而，該技術(shù)采用的基體材料為大孔樹脂，富集到孔中的磷酸化肽段無法被質(zhì)譜檢測到，即所謂的“孔洞效應”。但是固定金屬離子親和色譜材料中金屬離子是螯合在基體材料上，對使用體系條件要求相對較高。
近年來，人們熱衷于新的IMAC基體材料的研究。隨著磷酸化肽段分離鑒定方法的快速發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)很多金屬氧化物都能選擇性地分離富集復雜樣品中的磷酸化肽段。金屬氧化物以其高選擇性和較好的結(jié)果重現(xiàn)性成為分離富集磷酸化肽段的又一有力手段。金屬氧化物可采用裝填成柱子或是直接離心分離的方法用于分離富集磷酸化肽段。裝柱使用相對復雜；使用高速離心，仍存在兩點不足操作費時費力；高速離心可能造成“共沉淀效應”，即高質(zhì)量的非磷酸化肽段和磷酸化肽段共沉淀下來。而采用磁性材料為基體，利用材料的超順磁性就可以有效地解決以上存在的問題。將磁性分離和金屬氧化物的選擇性結(jié)合起來，可實現(xiàn)混合物中磷酸化肽段的快速簡單富集。因此，合成結(jié)構(gòu)緊密且具有完整核殼結(jié)構(gòu)的包覆金屬氧化物的磁性材料，更好地利用磁核的分離性能和金屬氧化物外殼對于磷酸化肽段的選擇性能，以便更好地實現(xiàn)對于磷酸化肽段的選擇性富集是很有必要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡單、效率高、效果好，能對痕量磷酸化肽段進行高選擇性富集的方法。
本發(fā)明涉及的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球，是在超順磁性Fe3O4微球外部包覆碳層作為模板，進而包覆金屬氧化物，然后灼燒去除碳層的方法制備而得，結(jié)構(gòu)緊密。其核為Fe3O4，粒徑為100-300nm，外殼為金屬氧化物層，厚度為30-50nm。這里金屬氧化物包括TiO2、Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3或Ce2O3等。
本發(fā)明中采用的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球的制備方法為在Fe3O4微球外部包覆碳層作為模板，進而包覆金屬氧化物，然后灼燒去除碳層。其合成路線如圖1所示。
本發(fā)明提出的分離富集磷酸化肽段的方法，是將上述具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球直接放入含有磷酸化肽的復雜肽段混合物中，進行痕量磷酸化肽選擇性富集，無需特殊處理；富集好后，采用磁場對富集的磷酸化肽和其他樣品的分離，無需離心，所以可以克服傳統(tǒng)離心造成的非磷酸化肽的共離心沉淀問題；然后對富集樣品進行洗脫，也可不洗脫，直接進行分析，克服了樣品洗脫過程造成的樣品損失問題。并且該材料不存在傳統(tǒng)材料的“孔洞效應”，可直接用于基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜分析，方法簡單實用有效。
本發(fā)明中，上述富集體系的pH值為1-6，磷酸化肽樣品濃度為0.05-5ng/μL，超順磁性微球量是10-1000μg/1mL樣品，富集時間在30秒-90分鐘，富集溫度為20-45℃，樣品洗脫體系pH值為10-14，洗脫時間為5-60分鐘。磁性微球的用量為10-1000μg/L樣品。本發(fā)明可用任何一種合成的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球，其溶液分散性非常好，體系均勻穩(wěn)定，有利于溶液中的磷酸化肽在材料上的富集。
本發(fā)明的對磷酸化肽進行有效選擇性富集的方法簡單有效并具有很好的磁場感應性；富集過程無需離心分離，采用磁場作用就可實現(xiàn)材料和樣品的分離；與基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜有很好的相容性，被具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球吸附后的樣品也可無需樣品洗脫步驟可直接進行基質(zhì)輔助激光解析電離-飛行時間質(zhì)譜分析，避免了洗脫過程造成的樣品損失；方法簡單有效。本發(fā)明可對低至2fmol/μL級的復雜肽段混合物中的磷酸化肽實現(xiàn)高選擇性富集，富集效率提高一個數(shù)量級以上。該磷酸化肽選擇性富集方法在蛋白質(zhì)組學翻譯后修飾研究等領(lǐng)域有良好的實用價值和應用前景。


圖1為本發(fā)明方法中采用的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球的合成路線圖。
圖2為本發(fā)明方法中采用的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球的透射電鏡圖。可見磁球外部均勻包覆了一層金屬氧化物。
圖3為10μg具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球富集2×10-8M(a和b)和2×10-9M(d和e)β-casein的胰蛋白酶酶解混合肽段的前后的MALDI-TOF MS譜圖。比較a和b圖，c和d圖，可見磷酸化肽富集效率均超過一個數(shù)量級以上。
圖4為10μg具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球富集2×10-8M(a和b)β-casein的胰蛋白酶酶解混合肽段前后的MALDI-TOF MS譜圖。富集到材料上的磷酸化肽段采用10μL 0.5％的氨水洗脫。將洗脫的樣品進行質(zhì)譜分析。比較圖3b和圖4可見，將樣品洗脫分析與直接點樣法兩者所得的磷酸肽信號強度相近，并沒有表現(xiàn)出很大的差距，說明了利用具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球富集磷酸化肽段的方法具有較高的回收率，也顯示出使用該方法富集分離磷酸化肽在實驗操作上具有較強的靈活性。
圖5為20μg具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球富集2×10-7M casein蛋白的胰蛋白酶酶解混合肽段前后的MALDI-TOF MS譜圖(a和b)。比較a和b，可見肽段混合物中的磷酸化肽得到了選擇性富集。富集到的磷酸化肽段如表1所示。
具體實施例方式
通過實施例是對本發(fā)明所提供的超順磁性的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球材料進行樣品富集和基質(zhì)輔助激光解吸離子化/質(zhì)譜直接分析過程的進一步說明。
實施例1復雜肽段混合物中磷酸化肽的選擇性富集和質(zhì)譜測定取200μL濃度為2×10-8M β-酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物，加入10μL的1mgmL-1的具有核殼結(jié)構(gòu)的Fe3O4@TiO2磁性微球，用三氟乙酸調(diào)節(jié)體系pH值為2，在37攝氏度下振蕩5分鐘，對所述肽段進行富集；在磁場作用下，分離上清液和富集了磷酸化肽段的材料。用50％(體積比)的乙腈水溶液清洗材料兩次，在沉淀中加入10μL的50％(體積比)的乙腈水溶液，振蕩使之懸浮。懸浮液0.4μL與等體積30mg mL-12，5-DHB(50％乙腈水溶液，v/v)和1％(v/v)H3PO4水溶液，1∶1(v/v)混合點至MALDI靶板上，在MALDI-TOF MS(4700 Proteomics Analyzer，Applied Biosystems)上進行分析；激光器為Nd-YAG激光，波長355nm，激光脈沖頻率200Hz；加速電壓20KV；正離子模式，反射式TOF檢測。由圖3(b(所示，磷酸化肽段得到了有效選擇性富集。
實施例2調(diào)整將富集到材料上的樣品采用10μL 0.5％的氨水洗脫5min，將洗脫后得到的樣品再進行MALDI-TOF MS分析。結(jié)果如圖4所示，得到了選擇性富集的磷酸化肽段被從材料上洗脫下來并得到了有效檢測。
實施例3-5調(diào)整將富集到材料上的樣品采用10μL 0.5％的氨水洗脫的時間為分別為5min、15min、60min，將洗脫后得到的樣品再進行MALDI-TOF MS分析。實驗結(jié)果表明富集到材料上的磷酸化肽段在5分鐘內(nèi)就能得到基本完全的洗脫。
實施例6調(diào)整β-酪蛋白胰蛋白酶酶解的肽段混合物的濃度為2×10-9M，其他條件同實施例1。結(jié)果如圖3(c)和3(d)，對比兩圖可見，富集后磷酸化肽段得到了有效的選擇性富集。
實施例7調(diào)整采用的混合肽段樣品是200μL濃度為2×10-7M的Casein蛋白的胰蛋白酶酶解的肽段混合物，其他條件同實施例1，進行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實驗。實驗結(jié)果如圖5(a)和圖5(b)所示。復雜肽段混合物中的磷酸化肽段得到了選擇性富集。
實施例8-10調(diào)整吸附時間為30秒，15分鐘，60分鐘，其他條件同實施例1，進行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實驗。實驗結(jié)果表明具有核殼結(jié)構(gòu)的磁性微球在30秒的時間時就能實現(xiàn)對磷酸化肽段的有效富集。
實施例11-12調(diào)整吸附溫度為25，45度，其他條件同實施例1，進行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實驗。
實施例13-14調(diào)整吸附體系pH值為4，6，其他條件同實施例1，進行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實驗。
實施例15-19調(diào)整采用的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球材料其表面分別為包覆Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3、Ce2O3，其他條件同實施例1，進行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實驗。
實施例20-24調(diào)整采用的具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球材料其表面分別為包覆Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3、Ce2O3，其他條件同實施例2，進行選擇性富集濃縮和質(zhì)譜實驗。
實施例4-21的結(jié)果與實施例1，2，3相似。
表1 MALDI-TOF MS檢測到的casein蛋白胰蛋白酶酶解肽段混合物中的磷酸化肽段


權(quán)利要求
1.一種采用金屬氧化物磁性微球分離富集磷酸化肽段的方法，其特征在于直接將金屬氧化物磁性微球加入含有磷酸化肽的復雜肽段混合物中，進行痕量磷酸化肽選擇性富集，然后采用磁場對富集的磷酸化肽和其他樣品分離；最后對富集樣品進行洗脫；其中，富集體系pH值為1-6，樣品濃度為0.05-5ng/μL，富集時間為30秒-90分鐘，富集溫度為20-45℃；樣品洗脫體系pH值為10-14，洗脫時間為5-60分鐘；磁性微球用量是10-1000μg/mL樣品；上述金屬氧化物微球為核殼結(jié)構(gòu)，其核為Fe3O4，粒徑為100-300nm，外殼為金屬氧化物層，厚度為30-50nm，這里金屬氧化物為TiO2、Al2O3、Ga2O3、ZrO2、In2O3或Ce2O3。
全文摘要
本發(fā)明屬于無機材料和生化分析技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種采用具有核殼結(jié)構(gòu)的金屬氧化物磁性微球分離富集磷酸化肽段的方法。本發(fā)明將上述磁性微球作為微吸附劑直接加入含有痕量磷酸化肽段混合溶液中，在一定條件下進行富集。操作簡便，無需離心，避免了離心過程造成的“共沉淀效應”及傳統(tǒng)固定金屬離子親和材料的“孔洞效應”，且具有更高的化學惰性和穩(wěn)定性。本發(fā)明方法對于復雜體系中磷酸化肽段具有很好的選擇性富集性能，富集效率可提高一個數(shù)量級以上；既可將富集的樣品洗脫也可不洗脫直接進行基質(zhì)輔助激光解析電離－飛行時間質(zhì)譜分析，方法靈活。該方法在蛋白質(zhì)組學翻譯后修飾研究等領(lǐng)域具有良好的實用價值。
文檔編號B01J20/06GK101054406SQ200710041168
公開日2007年10月17日 申請日期2007年5月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月24日
發(fā)明者鄧春暉, 徐秀青, 李嫣, 張祥民 申請人:復旦大學