專利名稱：一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及磷酸化肽段的分離純化，具體的說是一種用于富集磷酸化 肽段的聚合物材料的制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白翻譯后修飾位點的鑒定是目前蛋白組學研究中重要挑戰(zhàn)之一，磷 酸化修飾是蛋白翻譯后最重要的修飾之一。因為可逆的蛋白磷酸化修飾反 應在細胞的信號傳導，新陳代謝等方面調(diào)節(jié)著蛋白的活性功能。最近，質(zhì) 譜技術(shù)在蛋白磷酸化的定性中，已經(jīng)發(fā)展成為重要的工具之一。在磷酸化 蛋白酶解產(chǎn)物的磷酸化肽段質(zhì)譜分析中，由于酶解產(chǎn)物中存在大量的非磷 酸化肽段，這些肽段在離子化過程中產(chǎn)生的離子信號會淹沒磷酸化肽段的 離子信號，另一方面因為磷酸化肽段在質(zhì)譜檢測中相對較低的離子化效率， 這些因素導致了磷酸化肽段在質(zhì)譜中很難被檢測。從磷酸化蛋白的酶解混 合物中分離和富集磷酸化肽段是目前進行磷酸化研究的比較理想的方法， 也是成功實現(xiàn)質(zhì)譜分析最關(guān)鍵的一步。為了提高對磷酸化肽段的檢測，親 和技術(shù)被應用到從復雜的混合樣品中純化和富集磷酸化肽段。最常用的親
和技術(shù)是固定化金屬離子螯合親和色譜(IMAC)，磷酸肽在IMAC上的保留 是基于其與固定相的螯合離子之間的螯合作用。常用的金屬離子是鐵(Fe,
和鎵(Ga3、 一般利用亞氨基二乙酸(IDA)為螯合基團將金屬離子固載在 色譜介質(zhì)上。雖然基于鐵和鎵的IMAC很常用，但是其特異性不強， 一些 酸性肽也會保留從而干擾磷酸肽的檢測。
基于利用鋯離子和磷酸基團之間的強烈相互作用，最近我們發(fā)展 出了基于磷酸酯鋯的新IMAC方法(Zr"-IMAC)。與常規(guī)IMAC相比， 該方法對磷酸化肽有更好的特異性。不同于 一 般的IMAC,在Zr4+-IMAC 中所用的螯合基團也是磷酸基團。在使用中首先將鋯離子固載于磷酸基 團修飾的介質(zhì)表面上形成磷酸酯鋯表面，磷酸化肽由于其磷酸基團與 鋯離子之間的強相互作用而獲得特異性保留。為了制備這種帶有磷酸基 團的色譜吸附材料，需要對材料表面進行改性，這需要多步化學反應，因 此比較費時費力。本發(fā)明提供了一種更為簡單的制備這種材料的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種用于富集磷酸化肽段的吸附材料的制備方 法。該方法利用帶磷酸基團的單體進行聚合反應形成帶磷酸基團的聚合物， 該聚合物敖合Zr"后，可用于磷酸化肽的高特異性富集。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法，采用帶有烯鍵和磷酸基團的化合物單體，進行聚合反應，形成磷酸基團聚合物，該材料經(jīng) 與鋯離子作用后生成磷酸酯鋯基團，可用于富集磷酸化肽段等帶有磷酸基
團白勺化合物。
所述帶有烯鍵和磷酸基團的化合物具有如式(I)結(jié)構(gòu)，
<formula>formula see original document page 4</formula>
(i)
R為CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基團以磷酸酯鍵存在于 單體中，為磷酸一酯。 具體過程為，
1) 以采用帶有烯鍵和磷酸基團的化合物為功能單體、亞甲基雙丙烯酰 胺作為交聯(lián)劑，加入有機致孔劑，形成反應物料，進行熱引發(fā)聚合反應， 形成磷酸基團聚合物；
功能單體與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為75-85: 55-65，致孔劑的加入量為反應 物料體積的75~85%;反應溫度為50 80 °C;
2) 將磷酸基團聚合物與10-lOOmM鋯離子溶液接觸，生成磷酸酯鋯基 團，其可用于富集磷酸化肽段或帶有磷酸基團的化合物。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點
本發(fā)明利用帶磷酸酯基團的單體進行聚合反應直接形成帶磷酸基團的 聚合物，其聚合物材料可以制備成整體柱模式，也可以制備成顆粒狀態(tài)。
該方法通過聚合反應的方法直接制備出帶有磷酸基團的吸附材料，不 用對材料進行額外的化學反應，因而具有簡單、方便的特點。


圖1為單體2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰 胺聚合反應的化學表達式。
圖2為聚合物吸附材料富集和檢測磷酸肽的過程。
圖3為聚合物整體材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
圖4為聚合物整體材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
圖5為聚合物顆粒材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
圖6為聚合物顆粒材料對磷酸化蛋白-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽 段的富集和純化的MALDI質(zhì)譜圖。
具體實施例方式
本發(fā)明通過利用帶磷酸酯基團的單體與交聯(lián)劑聚合反應生成帶有磷酸基團的聚合物，該聚合物敖合21"4+后可用于磷酸化肽的富集。為了制備聚合 物材料，首先需要配制聚合物反應液。單體和交聯(lián)劑是反應液的主要成份， 它們發(fā)生聚合反應后形成聚合物骨架。為了調(diào)節(jié)聚合物的物理化學性質(zhì)， 可以使用多種單體，但其中必須包括一種帶有磷酸基團的單體。多孔材料 有更大的表面積，因此有更高的吸附容量。為了制備多孔的聚合物，需要 在反應液中加入一定比例的致孔劑。致孔劑是一些有機溶劑，它們不參與 聚合反應，在聚合反應發(fā)生后它們所占據(jù)的空間將形成孔。通過調(diào)節(jié)致孔 劑在反應液中的比例可以很方便的調(diào)節(jié)聚合物中孔的大小和機械強度。此 外， 一般還需要加入少量的引發(fā)劑來引發(fā)聚合反應。獲得帶有磷酸基團的
聚合物后，將聚合物浸泡在Zr"的溶液(如ZrOCl2溶液)中，Zr"離子由于與 聚合物上的磷酸基團有強相互作用而固載在聚合物材料上，形成磷酸酯鋯 修飾的表面。磷酸酯鋯修飾的聚合物材料可以用于選擇性提取蛋白質(zhì)酶解 液中的磷酸肽。
單體2—(甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯與交聯(lián)劑亞甲基雙丙烯酰胺聚合 反應生成的聚合物具有很好的親水性，因此非特異性很小，是親和色譜良 好的載體。以下兩實施例均采用上述體系，但本發(fā)明并不局限于上述體系。
實施例l聚合物整體柱的制備
整體柱是一種特殊的液相色譜柱，它是將聚合物反應液灌入柱管中通 過原位聚合的方法形成多孔的、連續(xù)的聚合物。聚合物整體柱由于有很多 通孔而柱壓很低，由于對流傳質(zhì)而傳質(zhì)阻力很小，非常適合用于樣品預處 理。本實施例制備了帶磷酸基團的聚合物整體毛細管柱并將其用于磷酸肽 的富集。
1) 毛細管預處理
首先用0.1M NaOH溶液沖洗毛細管空柱1 h,再用去離子水沖洗毛細 管至流出液體pH值為7.0,然后用甲醇溶液沖洗毛細管柱10min,用氮氣吹 干。往毛細管中注入甲醇與甲基丙烯酰氧丙基一三甲氧基硅烷的混合物。 在20度至70度溫度下反應5—24小時。然后用甲醇及水沖洗。最后用氮 氣歡干待用。
2) 聚合物整體柱的制備
以2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯為功能單體，亞甲基雙丙烯酰胺 為交聯(lián)劑，十二醇，二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺為致孔劑，單體、交 聯(lián)劑、致孔劑按質(zhì)量百分比分別為13%、 10%和77%均勻混合，所加引發(fā) 劑的用量為聚合物單體用量的1%，將混合液用超聲振蕩15min后，將反應 液吸入已經(jīng)預處理過的空毛細管中，將毛細管的兩端用橡膠小塞封口并浸 于6(TC水浴中反應8-24h。反應完成后，以甲醇為流動相，用液相色譜泵 沖洗毛細管柱約2h，去除床層內(nèi)的致孔劑、殘留反應試劑以及反應產(chǎn)生的 一些低聚合度物質(zhì)；
如圖1所示，單體、引發(fā)劑及致孔劑在反應開始前構(gòu)成穩(wěn)定的均相反應體系，當溫度升高到一定值時，引發(fā)劑分解產(chǎn)生自由基引發(fā)聚合反應。 當反應進行到一定的程度時，聚合物鏈從溶液中沉降出來形成穩(wěn)定的分散
體系，經(jīng)進一步聚合、交聯(lián)硬化形成直徑約為1 pm左右的小顆粒。這些顆
粒以化學鍵互相連接形成較大的"簇"，這些"簇"最終堆積形成一個完整的聚 合物體系。由于所采用的單體，2— (甲基丙烯酰氧)乙基磷酸酯，有一個 磷酸基團，該基團在聚合反應過程中不發(fā)生反應，從而使產(chǎn)生的聚合物材 料表面帶有磷酸基團。該材料敖合鋯離子后，形成對磷酸肽有特異性吸附 作用的磷酸酯鋯吸附材料。
3) 鋯離子的固載
用20mM二氯氧鋯溶液沖洗毛細管，使聚合物柱床上的磷酸基團與鋯 形成穩(wěn)定的配合物，然后用pH為2的甲酸溶液沖洗，備用。
4) 磷酸肽的選擇性富集
樣品溶液的制備1 mg的a-酪蛋白和|3-酪蛋白的分別溶解在lmL, 50 mM的碳酸氫胺溶液中(pH8.2)，按照與胰蛋白酶的質(zhì)量比40:1的比例加 入胰蛋白酶進行酶解反應，反應時間為16h,酶解溫度控制在37t:。獲得 的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存?zhèn)溆谩?br> 磷酸化肽段的富集用甲酸調(diào)節(jié)-酪蛋白酶解液的pH為2，取2pmol含 50%乙腈的酶解液通過15cm的整體柱，依次用含200 mM氯化鈉pH 2的 甲酸溶液，pH2的甲酸溶液，沖洗毛細管，最后用pH 10的氨水溶液沖洗 毛細管，使富集的磷酸化肽段洗脫到離心管中，冷凍干燥后，經(jīng)基質(zhì)輔助 激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI)檢測，獲得的譜圖見圖3，圖中 序號1的[M+H;T為2061.83，其所對應的肽段上帶有1個磷酸化位點；
序號2的[M+H]+為2352.85，其所對應的肽段上帶有4個磷酸
化位點；
序號3的[M+H廣為2966.16，其所對應的肽段上帶有4個磷酸
化位點；
在圖3中的強峰均為磷酸肽的峰，這說明磷酸肽在磷酸酯鋯修飾的整 體柱中獲得了特異性富集。用整體柱富集ot-酪蛋白酶解液樣品同-酪 蛋白，所獲得的譜圖見附圖4，
圖中序號1的[M+Hr為1237.5，其所對應的肽段上帶有1個磷酸化位點； 序號2的,+司+為1331.53，其所對應的肽段上帶有1個磷酸化位點； 序號3的[M+H]"為1411.5，其所對應的肽段上帶有2個磷酸化位點； 序號4的[M+H]"為1466.61，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點； 序號5的[M+Hf為1539，其所對應的肽段上帶有2個磷酸化位點； 序號6的[M+Hf為1594.7，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點； 序號7的[M+Hf為1660.79，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點； 序號8的[M+H獷為1832.83，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點; 序號9的[M+H廣為1847.69，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點；序號10的[]^+司+為1927.69，其所對應的肽段上帶有2酸化位點； 序號11的[M+Hf為1944，其所對應的肽段上帶有2個磷酸化位點； 序號12的[]\4+司+為1951.95，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點; 序號13的[]\4+司+為2079.04，其所對應的肽段上帶有1磷酸化位點; 序號14的[M+Hf為2619.04，其所對應的肽段上帶有4磷酸化位點; 序號15的[14+司+為2720.91，其所對應的肽段上帶有5磷酸化位點; 序號16的[M+H]+為3008.01，其所對應的肽段上帶有4磷酸化位點； 序號17的[M+Hf為3087.99，其所對應的肽段上帶有5磷酸化位點； 很明顯用該整體柱處理后磷酸化肽獲得很好的富集。 本發(fā)明制備的材料主要用于高特異性的富集磷酸肽，由于磷酸酯鋯與 磷酸基團有強相互作用，其也可以用于富集其它含磷酸基團的化合物；如 圖2所示，其給出了利用本吸附材料富集和檢測磷酸肽的過程。從單個蛋 白質(zhì)的酶解液中純化出來的磷酸肽可以直接使用MALDI質(zhì)譜儀來分析，而 對于復雜樣品如蛋白質(zhì)組樣品中提純出來的磷酸化肽需要利用液質(zhì)聯(lián)用和 數(shù)據(jù)庫檢索來鑒定其中的磷酸化肽。
實施例2 聚合物顆粒的制備
絕大多數(shù)液相色譜柱、固相萃取柱都使用顆粒狀填料如瓊脂糖顆粒、 有機聚合物顆粒、無機物顆粒作為固定相，本實施例制備了帶磷酸基團的 聚合物顆粒并將其用于磷酸肽的富集。
1)聚合物顆粒的制備 把聚合反應液(配比同實施例1)裝于離心管中，封口并浸于60°C水 浴中反應8-24h。反應完成后，研磨成顆粒用甲醇浸泡除去致孔劑、殘留反 應試劑以及反應產(chǎn)生的一些低聚合度物質(zhì)。
2) 鋯離子的固載
制備的顆粒浸泡在20mM二氯氧鋯溶液，振蕩15分鐘，離心，收集沉 積物，得到磷酸酯鋯聚合物顆粒
3) 磷酸化肽段的富集
取2 pmol -酪蛋白酶解液放入含有0.4 mg顆粒的100mM氯化鈉，50 X乙腈pH2的甲酸溶液中，振蕩，離心后，棄去上清液，用200mM氯化 鈉pH 2的甲酸溶液洗滌沉積物，離心后，棄去上清液，用pH2的甲酸溶 液洗滌沉積物，離心后，棄去上清液，最后用pH 10的氨水溶液處理沉積 物，離心后收集上清液，冷凍干燥后，用MALDI分析，譜圖見附圖5。 使用相同的方法用于-酪蛋白酶解液中磷酸化肽段的富集，所獲得的 MALDI譜圖見附圖6。從譜圖上看，顯著的峰都是磷酸肽的峰，說明 磷酸肽在聚合物顆粒上有高特異性的富集。
權(quán)利要求
1. 一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法，其特征在于采用帶有烯鍵和磷酸基團的化合物單體，進行聚合反應，形成磷酸基團聚合物，該材料經(jīng)與鋯離子作用后生成磷酸酯鋯基團，可用于富集磷酸化肽段等帶有磷酸基團的化合物。
2. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述帶有烯鍵和 磷酸基團的化合物具有如式(I)結(jié)構(gòu)，<formula>formula see original document page 2</formula>(i)R為CH2、 CH2CH2、 CH2CH2CH2之一，磷酸基團以磷酸酯鍵存在 于單體中，為磷酸一酯。
3. 按照權(quán)利要求l所述的制備方法，其特征在于 具體過程為，1) 以采用帶有烯鍵和磷酸基團的化合物為功能單體、亞甲基雙丙烯酰 胺作為交聯(lián)劑，加入有機致孔劑，形成反應物料，進行熱引發(fā)聚合反應， 形成磷酸基團聚合物；功能單體與交聯(lián)劑的質(zhì)量比為75-85: 55-65，致孔劑的加入量為反應 物料體積的75~85%;反應溫度為50 8(TC;2) 將磷酸基團聚合物與10-lOOmM鋯離子溶液接觸，生成磷酸酯鋯基 團，其可用于富集磷酸化肽段或帶有磷酸基團的化合物。
4. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述致孔劑為十二 醇，二甲基亞砜和N,N-二甲基甲酰胺，十二醇、二甲基亞砜和N,N-二甲基 甲酰胺的體積比為18-22: 25 -30: 3-7。
5. 按照權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于引發(fā)劑為偶氮二異 丁腈、正丁基鋰或硫酸銨或硫代硫酸鈉，引發(fā)劑的加入量為功能單體與交 聯(lián)劑總重量的0.1~5%。
全文摘要
本發(fā)明涉及磷酸化肽的高選擇性富集，具體的說是一種用于富集磷酸化肽段的聚合物材料的制備方法。本方法采用帶有磷酸基團的單體進行聚合反應直接形成帶有磷酸基團的聚合物材料。該材料用含鋯離子的溶液作用后生成磷酸酯鋯基團，使其可以從復雜的蛋白酶解液中特異地富集和純化磷酸肽。本發(fā)明采用聚合的方法直接合成出含功能基團的聚合物材料，無需額外化學改性，具有簡單方便的特點。
文檔編號B01J20/281GK101412778SQ20071015752
公開日2009年4月22日 申請日期2007年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年10月17日
發(fā)明者葉明亮, 周厚江, 靖 董, 鄒漢法 申請人:中國科學院大連化學物理研究所