發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明屬于蛋白結(jié)合劑領(lǐng)域，特別是基于cbm32蛋白的抗體替代物。

發(fā)明背景

適應(yīng)性免疫系統(tǒng)是用于識別和中和外來生物體和大分子的高度進(jìn)化的、靈活的系統(tǒng)。適應(yīng)性免疫包括多種不同的類似結(jié)構(gòu)，其通過具有高度隨機(jī)的接頭區(qū)段的多種結(jié)構(gòu)單元的組合裝配而多樣化。高級脊椎動(dòng)物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的兩個(gè)主要識別復(fù)合物，抗體和t細(xì)胞抗原受體，類似地組裝，并通過它們的同源細(xì)胞類型，b細(xì)胞和t細(xì)胞起作用，以實(shí)現(xiàn)對病原體的協(xié)調(diào)抗性。

已經(jīng)開發(fā)了抗體，例如在診斷、治療和研究工具領(lǐng)域。然而，由于它們的復(fù)雜性，抗體可能難以產(chǎn)生用于多種應(yīng)用。因此，本領(lǐng)域需要開發(fā)具有抗體樣特性的替代蛋白質(zhì)。

碳水化合物結(jié)合模塊(cbm)存在于碳水化合物活性酶中，并且有助于介導(dǎo)完全酶與碳水化合物底物的附著。具體來說，cbm家族32是對于基于半乳糖的配體具有高親和力的結(jié)構(gòu)上較多樣化的cbm家族之一。nagh，由產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)分泌的透明質(zhì)酸氨基葡萄糖苷酶，包含四個(gè)cbm32模塊，其含有與cbm32家族成員共有的β-夾心骨架。四個(gè)模塊中的第二個(gè)對n-乙酰葡糖胺具有獨(dú)特的特異性。

發(fā)明簡述

在一個(gè)方面，本發(fā)明的特征在于親和骨架，所述親和骨架具有下式：

cr1-v-cr2-w-cr3-z-cr4，

其中：

v、w和z各自獨(dú)立地不存在或包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸；

恒定區(qū)cr1-cr4具有分別與seqidno：2、4、6和8具有至少70％同一性的氨基酸序列；和

親和骨架不包括seqidno：1的氨基酸序列的多肽。

在另一方面，本發(fā)明的特征在于親和骨架，所述親和骨架具有下式：

cr1-v-cr2-w-cr5-x-cr6-y-cr7-z-cr4，

其中：

v、w、x、y和z各自獨(dú)立地不存在或包括一個(gè)或多個(gè)氨基酸；

恒定區(qū)cr1、cr2、cr5、cr6、cr7和cr4具有分別與seqidno：2、4、9、11、13和8具有至少70％同一性的氨基酸序列；和

親和骨架不包括seqidno：1的氨基酸序列的多肽。

權(quán)利要求1的親和骨架，其中如果v、w和z是分別具有seqidno：14-16的氨基酸，則親和骨架將特異性結(jié)合麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)分子。

在前述方面的任一個(gè)中，cr1-cr7具有分別與seqidno：2、4、6、8、9、11和13具有至少80％(例如，90％，95％，99％或100％)同一性的氨基酸序列。例如，恒定區(qū)cr1-cr7包括至少一個(gè)氨基酸殘基置換突變(例如，2個(gè)或更多個(gè)，3個(gè)或更多個(gè)，4個(gè)或更多個(gè)，5個(gè)或更多個(gè)，6個(gè)或更多個(gè)，7個(gè)或更多個(gè)，8個(gè)或更多個(gè)，9個(gè)或更多個(gè)，或10個(gè)置換突變)，其中所述置換突變選自s815r，g834f，e849d，k860p，f882y，l888k，e891k，k922r，m929k，m929l，m929r和/或v944r。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，cr包含置換突變m929l。

一種蛋白質(zhì)，包括權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的親和骨架，其中所述蛋白質(zhì)包括與seqidno：1的氨基酸序列具有至少80％同一性的氨基酸序列。

在另一方面，本發(fā)明的特征在于包括任何前述親和骨架的蛋白質(zhì)(例如，特異性結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì))。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)可以具有與seqidno：1的氨基酸序列具有至少90％(例如，95％或99％)同一性的氨基酸序列。該蛋白質(zhì)可以是例如單體或多聚體。

此外在任何前述方面中，v、w、x、y和z可以包括分別與seqidno：3、5、10、12和7的氨基酸序列具有小于100％序列同一性(例如，小于70％、40％、20％同一性)的氨基酸。v、w、x、y和z可以包括四個(gè)或更多個(gè)(例如五個(gè))氨基酸。v、w、x、y和z可以獨(dú)立地或組合地有助于蛋白質(zhì)與靶分子的特異性結(jié)合。

任何前述蛋白質(zhì)可包括與cr1的n末端和/或cr4的c末端融合的多肽(例如，酶，促進(jìn)多聚化的多肽或酶的底物)。蛋白質(zhì)可以例如與標(biāo)簽(例如，選自以下：半胱氨酸(cys)，多組氨酸(多his)和表位標(biāo)簽)融合。另外或可選地，蛋白質(zhì)可以例如與一個(gè)或多個(gè)官能團(tuán)(例如半胱氨酸，生物素，熒光染料，酶，放射性官能團(tuán)，鑭系元素，鏈霉親和素衍生物，促進(jìn)多聚化的肽(例如古細(xì)菌的右手卷曲螺旋(rhcc)肽，來自人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的compcc，來自人血漿c4結(jié)合蛋白的c4bpα和古細(xì)菌rna結(jié)合蛋白sm1的七聚化結(jié)構(gòu)域)綴合。蛋白質(zhì)還可以是例如聚乙二醇化的，多元醇反應(yīng)性的，或固定至固體支持物。此外，蛋白質(zhì)可進(jìn)一步包括將cr1-7的一個(gè)或多個(gè)連接到v、w、x、y和/或z中的一個(gè)或多個(gè)的肽接頭。

在另一方面，本發(fā)明的特征是編碼任何前述親和骨架或蛋白質(zhì)的分離的cdna序列，例如在有助于表達(dá)的環(huán)境下。

在另一方面，本發(fā)明的特征在于鑒定前述蛋白質(zhì)之一的方法，所述方法包括以下步驟：

從多肽展示文庫產(chǎn)生權(quán)利要求12-44中任一項(xiàng)所述的蛋白質(zhì)，其中所述文庫是從編碼分別對應(yīng)于seqidno：3、5、10、12和7的v、w、x、y和/或z的分離的cdna序列的區(qū)域隨機(jī)化產(chǎn)生的；

使所述靶分子與所述蛋白質(zhì)接觸；和

測定蛋白質(zhì)與靶分子的特異性結(jié)合。

“親和骨架”是指非免疫球蛋白多肽框架，例如衍生自cbm32(seqidno：1)的氨基酸序列。術(shù)語“親和骨架”包括具有被發(fā)現(xiàn)賦予親和骨架特異性結(jié)合特性的可變環(huán)區(qū)域(vlr)的多肽、含有尚未鑒定或不存在特異性結(jié)合特性的vlr的多肽和缺少vlr的多肽。

術(shù)語“恒定區(qū)(cr)”是親和骨架的多肽區(qū)，其含有為骨架提供框架結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基。cr可以例如固定在骨架中，限制這些區(qū)域中的多肽序列，因?yàn)樗鼈冇兄诠羌艿目傮w穩(wěn)定性。

“可變環(huán)區(qū)域(vlr)”是指可任選地存在于親和骨架中，散布在cr之間的區(qū)域。vlr可以例如單獨(dú)地或組合地賦予包括親和骨架的蛋白質(zhì)和特定靶分子之間的結(jié)合特異性。每個(gè)vlr可以獨(dú)立地包括cbm32蛋白(例如，seqidno：1的蛋白)的相應(yīng)序列的氨基酸置換，cbm32蛋白的相應(yīng)序列的氨基酸的缺失和/或一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入。因此，vlr在長度上可以變化并且相對于cbm32蛋白的相應(yīng)區(qū)域共有低百分比的氨基酸序列同一性。

術(shù)語相對于參考多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定義為在比對序列(并且如果必要，引入空位以實(shí)現(xiàn)最大百分比序列同一性，并且不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分)之后候選序列中與參考多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為確定百分比氨基酸序列同一性的目的的比對可以以本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方式實(shí)現(xiàn)，例如使用可公開獲得的計(jì)算機(jī)軟件如blast，blast-2，align或megalign(dnastar)軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于比對序列的適當(dāng)參數(shù)，包括在被比較序列的全長上實(shí)現(xiàn)最大比對所需的任何算法。例如，對于序列a的參考多肽，當(dāng)與序列b的衍生多肽相比時(shí)，百分比氨基酸序列同一性計(jì)算為：

100乘以分?jǐn)?shù)x/y，

其中x是在a和b之間被評分為相同匹配的氨基酸序列殘基的數(shù)目，并且其中y是在b的多肽序列中的氨基酸殘基的總數(shù)。

術(shù)語“氨基酸”是指多肽序列中可以是天然存在的或合成的殘基。天然存在的氨基酸是由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后被修飾的氨基酸，例如生物素化的半胱氨酸。合成氨基酸是在化學(xué)結(jié)構(gòu)上與天然存在的氨基酸類似的氨基酸；或具有與天然存在的氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)但與天然存在的氨基酸類似地起作用的氨基酸。氨基酸在本文中可以通過它們的單字母或三字母縮寫來表示。具體氨基酸的單字母縮寫，其相應(yīng)的氨基酸和三字母縮寫如下：a，丙氨酸(ala);c，半胱氨酸(cys);d，天冬氨酸(asp);e，谷氨酸(glu);f，苯丙氨酸(phe);g，甘氨酸(gly);h，組氨酸(his);i，異亮氨酸(ile);k，賴氨酸(lys);l，亮氨酸(leu);m，甲硫氨酸(met);n，天冬酰胺(asn);p，脯氨酸(pro);q，谷氨酰胺(gln);r，精氨酸(arg);s，絲氨酸(ser);t，蘇氨酸(thr);v，纈氨酸(val);w，色氨酸(trp);和y，酪氨酸(tyr)。

“多肽”是指任何長度的氨基酸的聚合物。如本文所用，多肽序列是指通過肽鍵或非肽鍵綴合以形成所提及的多肽的氨基酸。

“參考多肽”是指除了引入的氨基酸修飾之外，序列相同的蛋白質(zhì)。

術(shù)語“隨機(jī)化”是指相對于模板序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸修飾。隨機(jī)化可以通過通常是核酸編碼序列的定向或自發(fā)序列變化來完成。隨機(jī)化可包括氨基酸置換、缺失或插入。

當(dāng)提及多肽或蛋白質(zhì)時(shí)，術(shù)語“特異性結(jié)合”或“特異性結(jié)合的”是指確定靶分子存在的結(jié)合反應(yīng)，通常當(dāng)靶分子在分子群體中時(shí)。這可以通過如本文所述的免疫測定來檢測，其中指定的骨架結(jié)合特定靶分子的選擇性是背景的至少2倍，導(dǎo)致解離常數(shù)不大于100μm。與靶分子的特異性結(jié)合需要選擇靶分子的接觸氨基酸與骨架蛋白的vlr和可能的cr之間的特異性。例如，可以如下文實(shí)施例1中所述選擇特異性結(jié)合麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)的骨架，其中使用候選骨架蛋白和mbp進(jìn)行由elisa組成的免疫測定，以計(jì)算靶分子和骨架蛋白之間的結(jié)合親和力，其中高親和力的截?cái)嘀禐椴淮笥?00nm的解離常數(shù)。

術(shù)語“置換突變”是指對seqidno：1中的參考多肽給出的序列中的任何一個(gè)氨基酸的修飾，其中對遺傳密碼的改變導(dǎo)致所得蛋白質(zhì)的改變，例如，折疊、熱穩(wěn)定性和/或靶相互作用。

術(shù)語“多元醇反應(yīng)性”是指當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與包含低分子量多羥基化的化合物的洗脫緩沖液接觸時(shí)，蛋白質(zhì)的結(jié)合性質(zhì)。特別地，“多元醇反應(yīng)性”蛋白在包含低分子量多羥基化的化合物的洗脫緩沖液存在下通常在硫酸銨存在下表現(xiàn)出降低的結(jié)合性質(zhì)。

術(shù)語“標(biāo)簽”是指向cbm32衍生蛋白添加氨基酸序列、可檢測標(biāo)記或其他分子，其能夠分離、多聚化、純化或檢測所述cbm32衍生物。

“宿主細(xì)胞”包括可以是或已經(jīng)是受試載體的受體的單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物。宿主細(xì)胞包括單個(gè)(例如親本)宿主細(xì)胞的后代。由于天然、意外或故意突變，后代可能不一定與原始親本細(xì)胞完全相同(在形態(tài)或在總dna互補(bǔ)體的基因組方面)。本文所述的宿主細(xì)胞的實(shí)例是大腸桿菌。

附圖簡述

圖1是cbm蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的圖像，其中cr是白色的，vlr是陰影的，置換的met是帶星號的。

圖2是表示編碼文庫2的cbm親和骨架的cr和vlr的噬菌粒pcomb3x的區(qū)域的示意圖。

圖3是包含用于構(gòu)建文庫2的cbm親和骨架的vlr的引物名稱和序列的表。

圖4是顯示已通過電泳分離的，含有文庫2的具有15.6kda分子量的純化cbm骨架蛋白的聚丙烯酰胺凝膠片段的圖像。

圖5a和5b是兩個(gè)聚丙烯酰胺凝膠的圖像，顯示使用含有來自文庫2的靶向麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)的特異性vlr的cbm親和骨架蛋白的柱純化的結(jié)果。圖5a顯示七個(gè)泳道，其中泳道1是分子量標(biāo)記;泳道2是來自大腸桿菌的總蛋白裂解物;泳道3是來自摻有mbp(0.018mg/ml)的大腸桿菌的總蛋白裂解物；和泳道4-7是用edta的連續(xù)柱洗滌。圖5b顯示七個(gè)泳道，其中泳道8是來自摻有mbp(0.018mg/ml)的大腸桿菌的總蛋白裂解物;泳道9是分子量標(biāo)記;泳道10-14是用多元醇洗脫緩沖液的連續(xù)柱洗脫。

圖6是聚丙烯酰胺凝膠的圖像，其顯示在用來自文庫2靶向gfp的10種特異性cbm變體之一純化后得到的純化綠色熒光蛋白(gfp)，其中泳道1是分子量標(biāo)記;泳道2-11各自含有來自所選擇的10種cbm中的一種的所得純化gfp;而泳道12是來自摻有g(shù)fp(60ng/μl)的大腸桿菌的總蛋白裂解物。

圖7是總結(jié)蛋白質(zhì)骨架cbm(pdb2w1q)、殘基807-946和各種突變體的熱遷移測定(tsa)分析的表。

圖8a和8b是蛋白質(zhì)膜和聚丙烯酰胺凝膠的圖像，顯示通過圖a中的免疫印跡和圖b中的總蛋白染色，文庫1衍生的靶向mbp的cbm骨架蛋白與產(chǎn)生的mbp檢測之間的特異性結(jié)合的結(jié)果。圖a和b中，泳道m(xù)含有分子量標(biāo)記;泳道1、3、5、7、9和11含有7μg大腸桿菌全細(xì)胞蛋白裂解物;泳道2、4、6、8、10和12含有100ng的重組麥芽糖結(jié)合蛋白。圖a顯示pvdf膜，其上轉(zhuǎn)移了總電泳蛋白，用mbp特異性6his-cbm染色，隨后用抗6his-hrp(泳道1-8)或作為陽性對照的抗mbp-hrp(泳道9和10)染色。用于探測蛋白質(zhì)的cbm的初始濃度沿著圖像的底部提供，范圍為0-7μg/ml。圖b顯示了聚丙烯酰胺凝膠，在其上分離總蛋白裂解物和重組mbp，然后印跡到圖a的pvdf膜上。

圖9a-9t是顯示使用與瓊脂糖珠綴合的基于cbm的結(jié)合劑對來自大腸桿菌bl21de3全細(xì)胞裂解物的抗原的親和純化的sds-page分析的圖像。用bper(thermo)裂解大腸桿菌，通過離心澄清，并用20mmmops，150mmnacl，ph6.5稀釋。向裂解物摻加重組抗原(除非裂解物含有過表達(dá)的抗原)，并用與指定結(jié)合劑綴合的交聯(lián)瓊脂糖珠孵育。洗滌珠粒并用多元醇洗脫緩沖液洗脫。每個(gè)實(shí)驗(yàn)的親和純化細(xì)節(jié)詳述于實(shí)施例4中并列于下表3中。泳道m(xù)=標(biāo)記。l1-l20指示表3中詳述的大腸桿菌裂解物。來自特定親和樹脂的洗脫液在泳道上方指示。例如，p860lc洗脫液表示來自與裂解物l1一起孵育的p860lc親和樹脂的洗脫液。a和b：gfp結(jié)合劑，c和d：mbp結(jié)合劑，e：migg結(jié)合劑，f：rigg結(jié)合劑，g和h：β-d-半乳糖苷酶結(jié)合劑，i和j：nusa結(jié)合劑，k：sumo結(jié)合劑，l和m：硫氧還蛋白結(jié)合劑，n和o：中性親和素(neutravidin)結(jié)合劑，p：鏈霉親和素結(jié)合劑，q：3x-v5表位結(jié)合劑，r：mcherry結(jié)合劑，s：3x-cmyc結(jié)合劑，t：flag表位結(jié)合劑。

圖10是顯示p928對固定化migg的elisa分析的圖像。中性親和素包被的微量滴定板用生物素化的migg或pbs包被并用2％m-pbs-t封閉。以來自帶有噬菌粒的大腸桿菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的形式施加第一抗體溶液，所述噬菌粒包含具有6-his標(biāo)簽和琥珀終止密碼子的結(jié)合劑的gp3融合構(gòu)建體。用第二抗his-hrp探測第一抗體，并用tmb染色。

圖11是顯示p971和p973針對固定化的sumo的elisa分析的圖像。中性親和素包被的微量滴定板用生物素化的sumo或pbs(空白)包被并用2％m-pbs-t封閉。以來自帶有噬菌粒的大腸桿菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的形式施加第一抗體溶液，所述噬菌粒含有具有6-his標(biāo)簽和琥珀終止密碼子的結(jié)合劑的gp3融合構(gòu)建體。用第二抗his-hrp探測第一抗體，并用tmb染色?？譨6和c2分別代表克隆p971和p973。在顯示的所有其他孔中測試的克隆為陰性(非-sumo結(jié)合劑)。

圖12是顯示p999對固定化的v5肽的elisa分析的圖像。將馬來酰亞胺活化的微量滴定板用含有單個(gè)c末端cys的v5肽或pbs(空白)包被，并用2％m-pbs-t封閉。以來自帶有噬菌粒的大腸桿菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的形式施加第一抗體溶液，所述噬菌粒包含具有6-his標(biāo)簽和琥珀終止密碼子的結(jié)合劑的gp3融合構(gòu)建體。用第二抗his-hrp探測第一抗體，并用tmb染色。

圖13是顯示用于構(gòu)建pcomb3x中的cbm噬菌體文庫(例如文庫2和3)和pet15b中的表達(dá)構(gòu)建體的引物的表。nnn=除cys，met和終止密碼子之外的18種亞磷酰胺三聚體的混合物。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的特征是一種新的cbm32衍生的親和骨架。在某些實(shí)施方案中，骨架包含兩種類型的區(qū)域：恒定區(qū)(cr)和可變環(huán)區(qū)(vlr)，例如，如圖1中的結(jié)構(gòu)所示。因?yàn)樘烊淮嬖诘腸bm32家族以高特異性接合各種靶標(biāo)，我們發(fā)現(xiàn)它是親和骨架結(jié)構(gòu)的理想候選物。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，cr提供了能夠?qū)崿F(xiàn)總體構(gòu)象穩(wěn)定性的結(jié)構(gòu)特征，而對應(yīng)于vlr的間插序列容許氨基酸序列隨機(jī)化。因此可以修飾vlr以提供對所需靶分子具有特異性結(jié)合特性的親和骨架蛋白，其允許結(jié)合先前具有挑戰(zhàn)性的靶分子。親和骨架蛋白小，通常缺少半胱氨酸，并且可以被修飾以除去容易氧化的含硫氨基酸；這些性質(zhì)使得親和骨架蛋白優(yōu)于用于類似應(yīng)用的傳統(tǒng)使用的抗體。此外，在某些實(shí)施方案中，親和骨架蛋白顯示與其靶分子的多元醇反應(yīng)性結(jié)合，這使得能夠溫和洗脫靶分子而不破壞潛在的靶-靶相互作用和靶活性。

cbm32蛋白具有約15.6kda的分子量(mw)，其為免疫球蛋白的約1/10，使得其相對于抗體是有利的。野生型蛋白缺乏半胱氨酸，我們發(fā)現(xiàn)它提供了不含易氧化的含硫氨基酸的額外優(yōu)點(diǎn)。cbm32由β樣鏈、環(huán)、β樣鏈、環(huán)、β樣鏈、環(huán)、β樣鏈、環(huán)、β樣鏈、環(huán)和β樣鏈組成。在某些實(shí)施方案中，維持β樣鏈的總體結(jié)構(gòu)，而不管cr突變的存在。環(huán)區(qū)域容許能夠替換序列的序列變異性。另外，可以修飾環(huán)區(qū)域的長度以使得能夠插入或缺失氨基酸殘基，其賦予與多種靶標(biāo)額外的結(jié)合特性。與免疫球蛋白中的互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)類似，這些環(huán)區(qū)賦予靶結(jié)合特異性。

親和骨架的cr提供了骨架的結(jié)構(gòu)框架，包括熱穩(wěn)定性。本發(fā)明提供少至4個(gè)或多至6個(gè)cr，這取決于所需的vlr的數(shù)量。散布在cr之間的是環(huán)區(qū)域，vlr，其對氨基酸序列和長度的多樣化具有高耐受性。本發(fā)明包括包含一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)或五個(gè)vlr的親和骨架，這些vlr單獨(dú)或組合可以提供對靶分子的期望的特異性，這取決于這些區(qū)域內(nèi)的氨基酸殘基的結(jié)合特性。可通過篩選具有針對目的靶分子的vlr的各種組合的文庫來鑒定指定靶分子的合適vlr。在某些實(shí)施方案中，通過這種篩選鑒定的候選親和骨架可以通過第二(或第三或更多)輪可變化(variabilization)和篩選進(jìn)一步優(yōu)化。

親和骨架可以在cr的數(shù)量和長度上變化，這取決于為特定親和骨架選擇的vlr。在一些情況下，親和骨架包括選自cr1-7的cr和選自v-z的vlr。如本文所提及的，衍生親和骨架的全長野生型cbm蛋白包括下面列出的氨基酸序列，下文稱為seqidno：1：

npslirseswqvyegneanlldgddntgvwyktlngdtslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnmeninkwltfsefaivsd

在一個(gè)實(shí)施方案中，親和骨架包括四個(gè)cr(cr1–cr4)和三個(gè)vlr(v、w和z)，由下式表示：

cr1—v—cr2—w—cr3—z—cr4，

其中cr1–cr4分別對應(yīng)于seqidno:2、4、6和8的序列；和v、w和z分別對應(yīng)于seqidno:3、5和7，如下文所示。

seqidno:2:npslirsesw

seqidno:3:qvye

seqidno:4:gneanlldgddntgvwy

seqidno:5:ktlngdt

seqidno:6:slagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnme

seqidno:7:ninkw

seqidno:8:ltfsefaivsd

在又一個(gè)實(shí)施方案中，親和骨架包含六個(gè)cr(cr1、cr2和cr4–cr7)和五個(gè)vlr(v、w、x、y和z)，由下式表示：

cr1—v—cr2—w—cr5—x—cr6—y—cr7—z—cr4，

其中cr1、cr2、cr5、cr6、cr7和cr4分別對應(yīng)于seqidno:2、4、9、11、13和8的氨基酸序列；和v、w、x、y和z分別對應(yīng)于seqidno:3、5、10、12和7的氨基酸序列，如下文所示。

seqidno:2:npslirsesw

seqidno:3:qvye

seqidno:4:gneanlldgddntgvwy

seqidno:5:ktlngdt

seqidno:7:ninkw

seqidno:8:ltfsefaivsd

seqidno:9:slagefigldlgkeikldgirfvigkn

seqidno:10:gggssdk

seqidno:11:wnkfkleysldneswttikeydk

seqidno:12:tgapag

seqidno:13:kdvieesfetpisakyirltnme

在一些情況下，如果存在，cr1-7包括分別與seqidno：2、4、6、8、9、11和13的氨基酸序列具有至少80％(例如，85％，90％，95％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些情況下，cr1-7包括分別與seqidno：2、4、6、8、9、11和13的氨基酸序列具有至少90％(例如91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％或99％)同一性的氨基酸序列。在一些情況下，cr1-7包含分別與seqidno：2、4、6、8、9、11和13的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些情況下，cr1-7包含分別與seqidno：2、4、6、8、9、11和13的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。作為默認(rèn)，在計(jì)算序列同一性時(shí)忽略同一性中的空位；然而，本發(fā)明包括其中當(dāng)計(jì)算序列同一性時(shí)將空位視為錯(cuò)配的上述序列的實(shí)施方案。

在另一個(gè)實(shí)例中，cr2可以根據(jù)對應(yīng)于在vlrv中被置換和/或隨機(jī)化的seqidno：1的序列的選擇而在長度上變化。當(dāng)v長達(dá)4個(gè)氨基酸殘基時(shí)，cr2可以短至17個(gè)氨基酸殘基并且包括氨基酸序列“gneanlldgddntgvwy”。當(dāng)v短至1個(gè)氨基酸殘基時(shí)，cr2可以長達(dá)21個(gè)氨基酸殘基，并且包括氨基酸序列“vyegneanlldgddntgvwyk”。在某些實(shí)施方案中，在v中被置換的seqidno：1的區(qū)域可以是1、2、3或4個(gè)氨基酸。

親和骨架的vlr在數(shù)量、長度和序列上也可以不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括選自v-z的一個(gè)或多個(gè)vlr，例如1、2、3、4或所有5個(gè)vlrv-z。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白包括選自分別具有seqidno：3、5和7的氨基酸序列的v、w和z的vlr。在另一個(gè)實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括多達(dá)5個(gè)vlr，其選自分別具有seqidno：3、5、10、12和7的氨基酸序列的v、w、x、y和z。

在一些情況下，vlrv-z中的一個(gè)或多個(gè)包含分別與seqidno：3、5、10、12和7的氨基酸序列具有小于100％(例如95％，90％，85％，80％，75％或70％)同一性的氨基酸序列。在一些情況下，vlrv-z中的一個(gè)或多個(gè)包括分別與seqidno：3、5、10、12和7的氨基酸序列具有至多70％(例如，65％，60％，55％，50％，45％或40％)同一性的氨基酸序列。在一些情況下，vlrv-z中的一個(gè)或多個(gè)包括分別與seqidno：3、5、10、12和7的氨基酸序列具有至多40％(例如，35％，30％，25％或20％)同一性的氨基酸序列。在一些情況下，vlrv-z中的一個(gè)或多個(gè)包括分別與seqidno：3、5、10、12和7的氨基酸序列具有至多20％(例如，15％，10％，5％或1％)同一性的氨基酸序列。

作為實(shí)例，vlrv可以在序列和長度上變化。在一些實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括包含短至一個(gè)氨基酸的氨基酸的vlrv。在又一個(gè)實(shí)施方案中，由于分別包括如下所示的seqidno：14、15和16的氨基酸序列的vlrv、w和z導(dǎo)致，親和骨架蛋白特異性結(jié)合麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)。

seqidno:14:qlnn

seqidno:15:vanvgtq

seqidno:16:tsgwg

在一些情況下，親和骨架蛋白包括任何vlrv-z中的一個(gè)，兩個(gè)，三個(gè)，四個(gè)或五個(gè)，其包括賦予蛋白質(zhì)對所需靶分子特異性的氨基酸序列。vlrv-z的長度的邊界是柔性的，并允許修飾氨基酸殘基的長度，其中一些實(shí)施方案包括五個(gè)或更多個(gè)氨基酸的vlr。

在一些實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括cr中的一個(gè)或多個(gè)置換突變，其可以例如增強(qiáng)或保持熱穩(wěn)定性和/或溶解度。如seqidno：1的氨基酸序列所提及的，親和骨架蛋白可以包括選自以下組的一個(gè)或多個(gè)置換突變：s815r，g834f，e849d，k860p，f882y，l888k，e891k，k922r，m929k，m929l，m929r和/或v944r(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)突變)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括如seqidno：1的氨基酸序列所提及的置換突變m929l，其中置換突變m929l除去容易氧化的含硫氨基酸殘基。在一些實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括如seqidno：1的氨基酸序列所提及的置換突變m929l和選自下組的一個(gè)或多個(gè)置換突變：s815r，g834f，e849d，k860p，f882y，l888k，e891k，k922r和/或v944r(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或9個(gè)突變)。

除了上面列出的突變之外或作為其替代，cr可以具有一個(gè)或多個(gè)另外的突變(例如，保守突變)。在某些實(shí)施方案中，親和骨架蛋白將保持其穩(wěn)定性，盡管存在上述突變?？梢酝ㄟ^將已知賦予非突變親和骨架蛋白與特定靶分子(例如mbp)結(jié)合的vlr插入含有這些突變的骨架中，然后測試這些vlr是否保留突變的親和骨架蛋白與靶分子的結(jié)合，來確定該穩(wěn)定性。例如，seqidno：14-16中所示的vlr可以包括在突變的親和骨架蛋白中，以確定是否保留了mbp結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，親和骨架蛋白結(jié)合mbp。在一個(gè)實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括四個(gè)cr和三個(gè)vlr，如seqidno：17-19的三個(gè)蛋白質(zhì)中的任一個(gè)所提及的，其能夠賦予與mbp結(jié)合。在又一個(gè)實(shí)施方案中，親和骨架蛋白包括六個(gè)cr和五個(gè)vlr，如seqidno：20-22的三個(gè)蛋白質(zhì)中的任一個(gè)所提及的，其能夠賦予與mbp結(jié)合。

在一些方面，親和骨架蛋白顯示多元醇反應(yīng)性。在這方面，親和骨架蛋白具有獨(dú)特的結(jié)合特性，其允許單獨(dú)或在復(fù)合物中溫和純化結(jié)合于靶分子的蛋白質(zhì)。該特征提供了分離靶分子而不破壞靶分子與其他分子的結(jié)合特性的優(yōu)點(diǎn)。在這方面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)在包含低分子量多羥基化的化合物的洗脫緩沖液存在下與靶分子結(jié)合時(shí)，該蛋白質(zhì)顯示出與靶分子的結(jié)合性能降低。因此，蛋白質(zhì)對靶標(biāo)的親和力降低，允許特異性結(jié)合的靶標(biāo)的洗脫。確定多元醇敏感性的方法在下面的實(shí)施例中描述。

表位

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以結(jié)合(例如，特異性結(jié)合)特定的表位。這樣的表位可以包括治療靶標(biāo)、診斷標(biāo)記物或其他分子，包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸等。這樣的表位的實(shí)例包括下面列出的那些蛋白質(zhì)：

其它表位包括蛋白標(biāo)簽，例如下表1中列出的那些：

多聚化結(jié)構(gòu)域

在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括促進(jìn)多聚化的多肽。這樣的多肽結(jié)構(gòu)域描述于wang等人(proteinengineering，designandselection(2013)26(6)：417-423)，kim等人(plosone，(2012)7：1-13)和walper等人(jimmunolmethods(2013)388(1-2)：68-77)，其通過引用以其整體并入本文。這樣的結(jié)構(gòu)域的實(shí)例包括源自古細(xì)菌的右手卷曲螺旋肽的rhcc，古細(xì)菌rna結(jié)合蛋白sm1的七聚化結(jié)構(gòu)域，鏈霉親和素衍生物，來自人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白的compcc和源自人血漿c4結(jié)合蛋白α鏈的c4bpα。這樣的結(jié)構(gòu)域可以是n-末端或c-末端融合或插入本發(fā)明的蛋白質(zhì)中(例如，在對應(yīng)于vlr的序列內(nèi))。或者，這樣的肽結(jié)構(gòu)域可以使用n-或c-末端半胱氨酸，例如通過硫醚鍵與本發(fā)明的蛋白質(zhì)共價(jià)連接。

文庫的構(gòu)建和設(shè)計(jì)變體

本發(fā)明蛋白質(zhì)的文庫(例如，包括本發(fā)明的親和骨架的蛋白質(zhì))可以如下文實(shí)施例1、2和5所述構(gòu)建。另外，包括本發(fā)明的親和骨架的蛋白質(zhì)文庫可以以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方式制備。散布的隨機(jī)置換、聚簇置換和設(shè)計(jì)(靶向)改變是已經(jīng)用于增加給定多樣化骨架對特定靶蛋白的親和力的策略。通常，這種多樣化的目的是增加親和力而不損害蛋白質(zhì)的總體穩(wěn)定性或溶解度。最廣泛使用的策略之一是表面隨機(jī)化，在蛋白質(zhì)的一個(gè)特定方面或面上替代內(nèi)源序列，以便產(chǎn)生高度多樣化的表面集合。表面隨機(jī)化的兩種常見亞型是環(huán)和袋(pocket)多樣化，用于分別是自然凸出或凹入的蛋白質(zhì)。如果骨架適當(dāng)穩(wěn)定，隨機(jī)化可以保存或改變長度。此外，骨架的天然幾何形狀可以通過摻入使隨機(jī)化或接枝序列具有特定折疊或形狀的結(jié)構(gòu)元件而改變?？捎糜谶@種目的的已知元件包括半胱氨酸殘基的放置，使得形成二硫鍵連接的環(huán)；引入螺旋或片層去穩(wěn)定化殘基，例如甘氨酸或脯氨酸；摻入β轉(zhuǎn)角或trp籠形基序；或形成額外的二級結(jié)構(gòu)元件，例如短的α螺旋或β鏈序列。

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以進(jìn)一步適于在其氨基或羧基末端包括不同的多肽序列。額外的多樣性可以通過向靶標(biāo)提供次級結(jié)合位點(diǎn)來增強(qiáng)親和力，或者可以通過結(jié)合具有增強(qiáng)的血漿半衰期的蛋白質(zhì)或已知在靶標(biāo)附近富集，或通過結(jié)合器官或組織特異性次級靶標(biāo)以器官或組織特異性方式提供濃縮可能性的蛋白質(zhì)來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。另外的多樣性還可以通過包括酶活性、熒光或顏色來增強(qiáng)涉及親和骨架蛋白的結(jié)合事件的檢測。

本發(fā)明的高親和力、高選擇性蛋白的鑒定可以通過篩選方法或選擇方法來實(shí)現(xiàn)。篩選方法通常需要兩個(gè)要素：待測試對靶的親和力的本發(fā)明的候選蛋白質(zhì)的供應(yīng)；以及用于枚舉候選物的系統(tǒng)方法，例如有序陣列或系統(tǒng)地組成的混合物，其可以去卷積以揭示最活躍變體的身份。篩選方法通常需要評價(jià)大量本發(fā)明的蛋白質(zhì)；在這種情況下，通常使用合并方案來混合候選物，從而允許利用更少的測量確定期望的候選物的存在或不存在?；钚詭爝M(jìn)一步細(xì)分以鑒定活性獨(dú)特種類。源自這種篩選的候選物可以進(jìn)行進(jìn)一步隨機(jī)化和篩選以逐漸獲得具有更高結(jié)合親和力的本發(fā)明的蛋白質(zhì)。

選擇方法通常需要本發(fā)明的候選蛋白質(zhì)的文庫，其各自以提供蛋白質(zhì)與編碼或鑒定蛋白質(zhì)的核酸之間的遺傳連鎖的形式制備。必須提供機(jī)制以物理地分離和純化候選結(jié)合蛋白及其相關(guān)核酸與缺乏活性的剩余文庫成員。在選擇方法中，通常比篩選方法進(jìn)行的測量少得多。

本發(fā)明還提供了用于鑒定具有有利的親和力、選擇性、溶解性和熱穩(wěn)定性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法。用于富集編碼結(jié)合特定靶標(biāo)的目的蛋白質(zhì)的核酸的多種選擇方法是本領(lǐng)域已知的，并且可用于產(chǎn)生本發(fā)明所需的蛋白質(zhì)。其中包括所謂的展示技術(shù)，包括噬菌體展示，酵母展示，細(xì)菌展示，病毒展示，哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示，核糖體展示，rna展示和dna展示。對于應(yīng)用特定形式的展示，必須提供適合于在發(fā)生選擇的情況中展示本發(fā)明的蛋白質(zhì)的合適的載體。例如，對于通常實(shí)施的噬菌體展示形式，必須產(chǎn)生編碼暴露于溶劑的噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白和本發(fā)明蛋白質(zhì)之間的翻譯融合物的質(zhì)粒。對于細(xì)胞展示，例如細(xì)菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞展示，在表面蛋白質(zhì)和本發(fā)明的蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生融合或穩(wěn)定的締合。對于核糖體或mrna展示，必須在多樣化的結(jié)合蛋白和編碼它的mrna之間產(chǎn)生融合或穩(wěn)定的締合。對于dna展示，必須在本發(fā)明的蛋白質(zhì)與高親和力、通常是位點(diǎn)選擇性的dna結(jié)合蛋白之間產(chǎn)生融合或穩(wěn)定的締合。對于一些類型的選擇方法，結(jié)合蛋白和編碼它的核酸的物理締合通過物理區(qū)室化提供。例如，在乳液選擇方法中，提供了小的水性液滴，其中本發(fā)明的蛋白質(zhì)由模板核酸合成。在這種情況下，通過由分離各個(gè)液滴的非水相提供的區(qū)室化，提供物理締合。

基于展示的選擇由一個(gè)或多個(gè)富集循環(huán)組成，其中每個(gè)循環(huán)包括：(i)使目的靶分子與在展示環(huán)境(例如作為噬菌體顆粒、細(xì)胞或rna融合物)中的多種蛋白質(zhì)的混合物接觸；(ii)將結(jié)合靶分子的那些噬菌體顆粒、細(xì)胞或rna融合物與不結(jié)合靶分子或以較小親合力結(jié)合靶分子的那些噬菌體顆粒、細(xì)胞或rna融合物物理分離，和(iii)通過體內(nèi)或體外方法擴(kuò)增所得分離的結(jié)合群以產(chǎn)生新的富集的多樣化親和骨架蛋白的集合，其可以經(jīng)歷另外輪的接觸和純化。對于基于展示的選擇，要求靶分子允許靶分子與本發(fā)明的親和骨架蛋白的復(fù)合物的物理分離。例如，靶分子可以用抗體結(jié)構(gòu)域，肽標(biāo)簽(例如，表1的標(biāo)簽)，熒光團(tuán)，生物素或其它親和或標(biāo)記部分進(jìn)行標(biāo)記，使得本發(fā)明的蛋白質(zhì)和靶分子的復(fù)合物與不與靶分子相互作用的本發(fā)明的蛋白質(zhì)物理分離?；蛘撸梢允褂脤Π蟹肿犹禺愋缘目贵w或結(jié)合試劑來實(shí)現(xiàn)分離。通常有必要排除本發(fā)明的不需要的蛋白質(zhì)，例如與靶分子的外來部分結(jié)合的那些或與用于實(shí)現(xiàn)物理分離的裝置的組分結(jié)合的那些。常見的分離策略依賴于抗體結(jié)構(gòu)域，肽標(biāo)簽，生物素，表位或親和部分的親和基質(zhì)，例如帶有這種抗體結(jié)構(gòu)域，標(biāo)簽，生物素，表位或親和部分的同源結(jié)合元件的珠或磁性顆粒。常見的結(jié)合元件的實(shí)例包括蛋白a，鏈霉親和素，單克隆或多克隆抗體和配位的過渡金屬二價(jià)陽離子?；蛘?，可以使用基于熒光檢測和分選的分離。這種分離通常區(qū)分由連接到靶分子的熒光部分或熒光團(tuán)傳遞的信號，并且允許通過熒光激活細(xì)胞分選來鑒定和選擇性分離帶有高濃度靶分子的細(xì)胞或顆粒。本發(fā)明不需要的蛋白質(zhì)的貢獻(xiàn)可以通過模擬靶分子暴露和富集但在不存在靶分子的情況下進(jìn)行的預(yù)吸收步驟來減少。

親和力

對具有所需結(jié)合的本發(fā)明蛋白質(zhì)的選擇或篩選可以通過上述方法進(jìn)行，接著進(jìn)行根據(jù)其親和力、活性、選擇性、溶解度或熱穩(wěn)定性鑒定特別感興趣的本發(fā)明的候選蛋白質(zhì)的方法。用于測量親和力的許多方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)與靶分子的組合的締合常數(shù)或反應(yīng)結(jié)合速率和解離速率(reactiononandoffrates)的固相以及溶液相測量。根據(jù)這種平衡或動(dòng)力學(xué)常數(shù)的分析，可以測量本發(fā)明的蛋白質(zhì)對其靶分子的親和力。測量親和力的一些方法包括固相測定，例如平面或珠形式測定，溶液相測定或基于細(xì)胞的測定。這種測定法中的檢測可以基于對由本發(fā)明的可檢測標(biāo)記的靶分子或蛋白質(zhì)產(chǎn)生的信號的變化的分析，所述靶分子或蛋白質(zhì)例如本發(fā)明的放射性標(biāo)記的靶分子或蛋白質(zhì)，或者與酶活性或熒光團(tuán)或熒光蛋白，或者表現(xiàn)為容易監(jiān)測的反應(yīng)或性質(zhì)變化的催化劑的活性輔基綴合或締合的本發(fā)明的靶分子或蛋白質(zhì)。測量親和力的常用方法包括放射性標(biāo)記或酶聯(lián)免疫吸附測定，或基于表面等離子體共振，熒光共振，熒光偏振或熒光自相關(guān)光譜或顯微術(shù)的測定。親和力測量的常見形式是這樣的測量，其中靶分子固定在固相上，并且不同濃度的含有可檢測形式的本發(fā)明蛋白質(zhì)的溶液與固定的靶分子接觸，以測量作為本發(fā)明蛋白質(zhì)濃度的函數(shù)結(jié)合的本發(fā)明蛋白質(zhì)的量。

選擇性

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以結(jié)合靶分子家族的單個(gè)成員或靶分子家族的多個(gè)成員，以實(shí)現(xiàn)期望的治療、分析、制造或研究效用。例如，用于治療目的的生物活性的中和可能最佳地需要多于一個(gè)靶分子的拮抗作用，或者用于分析目的的這種生物活性的定量可能需要識別多于一個(gè)靶分子，或者某些目標(biāo)靶分子的純化可能需要識別相關(guān)分子的家族。本發(fā)明的候選蛋白的選擇性可以在選擇或篩選期間通過包括需要或不需要結(jié)合親和力的比較靶分子來操作。例如，為了產(chǎn)生識別靶分子的多成員家族(例如密切相關(guān)的蛋白質(zhì)家族)的一個(gè)成員的本發(fā)明的高度選擇性蛋白質(zhì)，可以預(yù)先選擇不需要的靶分子，丟棄所選擇的本發(fā)明蛋白質(zhì)，隨后用所需的靶分子進(jìn)行選擇?；蛘?，通過選擇或篩選方法鑒定的本發(fā)明蛋白質(zhì)的活性可以通過比較對所需的靶分子的結(jié)合親和力與對于其需要或不需要親和力的不相關(guān)的靶分子或相關(guān)靶分子的結(jié)合親和力來評估。這種篩選方法不需要提供精確的信息，但是為了方便起見，可以傳達(dá)相對親和力的簡單近似測量，例如基于類似于酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)的測定形式的信號強(qiáng)度。

溶解度和穩(wěn)定性

如果必要，通過選擇或篩選鑒定的本發(fā)明的候選蛋白質(zhì)可以針對應(yīng)用領(lǐng)域所需的其它性質(zhì)進(jìn)一步評價(jià)和修飾。例如，為了制備意欲用于大多數(shù)用途的本發(fā)明的蛋白質(zhì)，本發(fā)明的候選蛋白質(zhì)可以是高度可溶的和熱穩(wěn)定的。本發(fā)明提供了用于評價(jià)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的溶解度和熱穩(wěn)定性以及它們在大腸桿菌中以適當(dāng)折疊形式表達(dá)的適合性的方法。通常，用于評價(jià)熱穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域公知的，并且由在確定的溫度下的熱應(yīng)力測試或延長貯存測試，隨后測量結(jié)合活性組成。在一些情況下，相對熱穩(wěn)定性的測試可以簡單等同于在特定溫度下孵育本發(fā)明的蛋白質(zhì)一段確定的時(shí)間后測量保持可溶性的本發(fā)明的蛋白質(zhì)的分?jǐn)?shù)。用于測量熱穩(wěn)定性的另一種合適的方法是差示掃描量熱法。用于間接評估大腸桿菌中蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)的方法也是本領(lǐng)域已知的，并且在本發(fā)明中包括將本發(fā)明的候選蛋白質(zhì)與易于監(jiān)測的蛋白質(zhì)融合，所述易于監(jiān)測的蛋白質(zhì)的活性僅以其正確折疊的形式顯現(xiàn)，例如gfp或抗生素抗性。其他人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)相對折疊程度是大腸桿菌中融合蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域共有的性質(zhì)，因此如果本發(fā)明蛋白質(zhì)部分沒有正確折疊，則gfp或抗生素抗性部分折疊的可能性同等地低。在這種情況下，表達(dá)本發(fā)明的無活性或不適當(dāng)折疊的蛋白質(zhì)的細(xì)胞將不顯示高綠色熒光或高抗生素抗性。

治療用途

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用作靶向成分(targetingprinciple)以向需要治療或診斷的生物體遞送其它治療或分析元件。例如，它們可以連接到高度活性的細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒性劑，以實(shí)現(xiàn)不需要的細(xì)胞類型(例如腫瘤或前腫瘤細(xì)胞)的生長停止或消除，或用于減少肥大組織或器官例如肥大性前列腺的質(zhì)量，或用于消除不需要的免疫細(xì)胞群體，例如促進(jìn)或引起自身免疫綜合征的那些。這種細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒性劑可以是合成的或天然的小分子，例如美登素及其衍生物，蒽醌，烷基化劑例如環(huán)磷酰胺或其前藥形式，微管蛋白結(jié)合劑，格爾德霉素或其衍生物，或烯二炔抗生素如刺孢霉素，等等。細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒性劑也可以是蛋白質(zhì)毒素或小分子和蛋白質(zhì)毒素的組合。

本發(fā)明的雙特異性蛋白

本發(fā)明的二聚或更高級的多聚體蛋白質(zhì)可以用于通過受體交聯(lián)來并置細(xì)胞或誘導(dǎo)細(xì)胞作用，其可以具有有利的治療效果。例如，已經(jīng)描述了旨在放大巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或細(xì)胞毒性t細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用的治療策略，其依賴于雙特異性抗體或相關(guān)組合物的使用。這種雙特異性抗體通常提供識別待消融的細(xì)胞類型上的靶分子的一個(gè)抗體結(jié)合位點(diǎn)和識別巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞或t細(xì)胞上的細(xì)胞表面受體的第二抗體結(jié)合位點(diǎn)，如果接合的話，誘導(dǎo)這些細(xì)胞的溶細(xì)胞效應(yīng)程序，導(dǎo)致靶分子的破壞。雙特異性抗體的替代形式通過在活化受體(例如肥大細(xì)胞上的ige的高親和力受體或b細(xì)胞上的免疫球蛋白受體)和失活受體之間產(chǎn)生交聯(lián)，促進(jìn)肥大細(xì)胞或b細(xì)胞反應(yīng)的選擇性失能?；罨荏w和抑制性受體的協(xié)調(diào)阻礙了從活化受體發(fā)出的信號，導(dǎo)致有利的治療效果。類似的雙特異性組合物可以由本發(fā)明的蛋白質(zhì)提供，其可以通過多種方法連接以提供用于治療性治療的雙特異性或多特異性結(jié)合成分。

診斷用途

本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用作抗體等同物，用于許多測定目的。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以用作elisa型測定的捕獲或檢測試劑，或用作elispot測定的檢測試劑，或通過流式細(xì)胞術(shù)測量技術(shù)計(jì)數(shù)蛋白質(zhì)豐度。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與熒光團(tuán)、熒光蛋白、酶底物或酶綴合(例如，通過半胱氨酸、n-末端融合或c-末端融合)，以有助于檢測和/或定量目的分析物?？梢赃M(jìn)行本發(fā)明的蛋白質(zhì)與有助于分析物檢測的酶或其他蛋白質(zhì)的翻譯融合，并且所得融合物可以在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)，以提供方便的可更新來源的試劑。本發(fā)明的蛋白質(zhì)的有利的熱穩(wěn)定性質(zhì)允許它們在分析物檢測器陣列中使用，例如以蛋白質(zhì)結(jié)合陣列的平面形式，或在多重?zé)晒鈭F(tuán)比率索引的珠粒系統(tǒng)(例如luminex系統(tǒng))的珠形式中使用。與本發(fā)明的蛋白質(zhì)的分析物結(jié)合的檢測可遵循已經(jīng)公開用于通過抗體的高靈敏度和選擇性檢測的許多測定形式設(shè)計(jì)和檢測方案，例如光散射，光表面等離子體散射，熒光偏振，時(shí)間分辨熒光，熒光自相關(guān)，電致發(fā)光，化學(xué)發(fā)光，熒光共振能量轉(zhuǎn)移，熒光猝滅或解掩蔽，珠、細(xì)胞或其他顆粒的凝固或絮凝，或通過提供核酸或修飾的核酸標(biāo)簽用于通過擴(kuò)增方法檢測，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接介導(dǎo)的探針擴(kuò)增、分支核酸測定或等溫?cái)U(kuò)增，具有或不具有連接步驟；或通過使酶活性轉(zhuǎn)為可通過吸光度、熒光、消逝場或表面電勢微擾檢測。可以制備本發(fā)明的單特異性或多特異性蛋白以鑒定獨(dú)特的分析物或分析物家族。此外，本發(fā)明的單體或多聚體蛋白質(zhì)可以用作捕獲或檢測試劑。

本發(fā)明的標(biāo)記的蛋白質(zhì)可用于在體內(nèi)或體外對患病細(xì)胞、組織或器官成像。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與放射性核素綴合，或與摻入或結(jié)合包括放射性核素的其它分子的輔基結(jié)合。成像中使用的常見放射性核素包括f-18，i-131，i-123，tc-99m，in-111或ga-67?；蛘?，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與包圍籠蔽的超極化氙的基團(tuán)綴合，或可以連接或結(jié)合到對通過磁共振成像檢測敏感的珠粒、納米顆粒或納米晶體。放射性核素可以通過使用本領(lǐng)域公知的設(shè)備和方法的核閃爍掃描法檢測，例如γ照相機(jī)和正電子發(fā)射斷層攝影。此外，通過一種模式獲得的圖像(例如磁共振成像)可以疊加在通過其它模式例如核閃爍掃描法獲得的圖像上，或者兩種或更多種不同光譜性質(zhì)的放射性核素可以與本發(fā)明的不同蛋白質(zhì)組合，以允許更好的圖像定位和更精確的疾病狀況分期或診斷。本發(fā)明的這種綴合蛋白的用途包括腫瘤、感染、缺血性損傷或灌注不良區(qū)域、凝塊、骨或侵蝕骨、炎癥或變性部位，淀粉樣蛋白、副蛋白或朊病毒蛋白的積聚的體內(nèi)成像，或詢問假體裝置和/或其與正?；蚧疾〗M織的界面的狀態(tài)。用酶、熒光團(tuán)、熒光蛋白、鐵蛋白、金或銀顆粒或電子致密珠標(biāo)記的本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與顯微或超顯微技術(shù)結(jié)合使用以診斷病理狀況或鑒定、計(jì)數(shù)或定量相關(guān)的靶分子的負(fù)荷，其表示所研究的細(xì)胞、組織、器官或生物體的疾病狀態(tài)。

使用本發(fā)明的標(biāo)記或綴合的蛋白質(zhì)的組織成像可用于指導(dǎo)診斷或治療程序，例如活檢、切除、放射性消融、放射療法或局部遞送的化學(xué)療法。

制造用途

本發(fā)明的蛋白質(zhì)的有利的熱穩(wěn)定性和溶解性質(zhì)還允許它們用作用于純化蛋白質(zhì)和復(fù)雜生物結(jié)構(gòu)(例如疫苗組分)的吸附劑。原核生產(chǎn)的積極制造經(jīng)濟(jì)性允許本發(fā)明的蛋白質(zhì)用于抗體試劑或材料的常規(guī)使用被認(rèn)為過于昂貴的環(huán)境中。

通常，對于制造用途，具有所需選擇性、溶解度、熱穩(wěn)定性和對靶分子的親和性的本發(fā)明蛋白質(zhì)將以允許其構(gòu)成吸附劑的形式制備，所述吸附劑可包括柱介質(zhì)、珠或靶分子流暴露于其上的包衣表面。在將靶分子吸附到固體支持物上后，通過一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟除去未結(jié)合的材料，并且通常通過提高或降低ph，如在基于抗體的親和支持物的洗脫中常見的，或通過利用本發(fā)明的蛋白質(zhì)的多元醇反應(yīng)性，來洗脫所需的靶分子材料。用作這種親和介質(zhì)的支持物的各種親水基質(zhì)是本領(lǐng)域公知的，并且包括各種通常是多孔和交聯(lián)的聚合物，例如交聯(lián)的瓊脂糖，葡聚糖，丙烯酰胺，親水丙烯酸酯，水凝膠或無機(jī)基質(zhì)，例如受控孔玻璃或無孔但細(xì)顆粒例如磁珠，以及官能化或表面鈍化的二氧化硅或纖維素顆粒。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以通過例如醛、環(huán)氧乙烷、活性碳酸酯、亞氨基碳酸酯、氰酸酯、鹵代乙酰胺、馬來酰亞胺或活化酯(包括碳二亞胺活化的羧酸)的親電攻擊的方法連接到這樣的介質(zhì)上。許多適合于連接本發(fā)明蛋白質(zhì)的預(yù)活化介質(zhì)的商業(yè)供應(yīng)商是已知的。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可通過在本發(fā)明蛋白質(zhì)中摻入有利于本發(fā)明蛋白質(zhì)與介質(zhì)連接的特異性殘基或序列，以位點(diǎn)選擇性方式來工程化。

研究用途

本發(fā)明的蛋白質(zhì)的研究和分析用途包括用于以下的抗體替代：檢測和定量各種情況下的分析物，例如在免疫印跡、elisa、elispot、流式細(xì)胞術(shù)、基于珠的凝固或檢測系統(tǒng)中；通過光散射、表面等離子體散射、生物發(fā)光干涉測量、化學(xué)發(fā)光或電致發(fā)光檢測，通過熒光偏振、時(shí)間分辨熒光、熒光自相關(guān)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移或熒光猝滅或解掩蔽來檢測分析物。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與各種熒光團(tuán)或熒光蛋白綴合以提供用于分析物的存在或不存在的探針。分析物可以包括蛋白質(zhì)、碳水化合物、核酸、脂質(zhì)；天然、合成或半合成來源的小分子，以及聚合物、玻璃、金屬和合金，或這些的組合。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以與酶、蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、脂質(zhì)、聚合物；天然、合成或半合成來源的小分子綴合，以提供分析物檢測方法或額外的功能，或者可被賦予具有用于檢測或擴(kuò)增信號的效用的另外的取代基，例如通過提供核酸或修飾的核酸標(biāo)簽的共價(jià)或穩(wěn)定的非共價(jià)連接，用于通過擴(kuò)增方法檢測，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、連接介導(dǎo)的探針擴(kuò)增、分支核酸測定或等溫?cái)U(kuò)增，進(jìn)行或不進(jìn)行連接步驟。本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以吸附在固體表面上，例如板、盤、毛細(xì)管、織物、納米管或線、柔性或剛性片、珠或顆粒，所有這些可以提供用于非共價(jià)吸附的表面或用于共價(jià)連接的化學(xué)活化表面。本發(fā)明的這種蛋白質(zhì)取代的表面可以用于提供捕獲試劑，或者在珠?；蝾w粒吸附材料的情況下，提供檢測試劑。本發(fā)明的標(biāo)記蛋白的用途的實(shí)例包括但不限于顯微術(shù)、超微顯微術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、流式顯微術(shù)、基于碳納米管的化學(xué)電阻式親和生物傳感、免疫印跡、免疫沉淀、光譜或體內(nèi)成像。

制備方法

本發(fā)明的蛋白質(zhì)通常通過在原核細(xì)胞例如大腸桿菌中表達(dá)而容易地制備。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)通常具有允許它們?nèi)菀椎厥褂眠m合于大量制造的簡單可調(diào)節(jié)規(guī)模的步驟純化的溶解度性質(zhì)。

實(shí)施例

實(shí)施例1.用于靶分子的特異性結(jié)合的衍生cbm32骨架蛋白的產(chǎn)生(文庫2)

文庫構(gòu)建

文庫2改變了以下殘基：seqidno：1、817-820(qvye或環(huán)v)、838-844(ktlngdt或環(huán)w)、931-935(ninkw或環(huán)z)。我們能夠分離在大腸桿菌中容易高水平表達(dá)(>50mg/l培養(yǎng)物)的選擇性結(jié)合劑。我們在本實(shí)施例中隨后顯示的所有數(shù)據(jù)來自文庫2結(jié)合劑。圖1顯示了陰影標(biāo)示的文庫2環(huán)和用*標(biāo)記的met。正常糖配體的一半結(jié)合袋是可變化的。

基于cbm的親和骨架

編碼碳水化合物結(jié)合模塊(蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫2w1q)的殘基807至946的cdna對于在大腸桿菌中表達(dá)進(jìn)行密碼子優(yōu)化并通過idt合成。將cdna克隆到噬菌粒pcomb3x中，使得cbm含有n-末端his標(biāo)簽和c-末端flag標(biāo)簽，并且n末端融合至截短形式的gp3(圖2)。為了構(gòu)建骨架cbm變體的文庫，我們首先使用簡并引物397t-f(由四個(gè)連續(xù)的亞磷酰胺三聚體(環(huán)v)的混合物組成)和非簡并引物398-r，在與clonamphifipcrmix的50μl反應(yīng)中，根據(jù)制造商的說明書，擴(kuò)增1ng的該噬菌粒。反應(yīng)循環(huán)為98℃10秒，65℃10秒，72℃30秒，重復(fù)30次。將所得擴(kuò)增子在1.1％瓊脂糖凝膠上使用qiagenminelute凝膠純化試劑盒進(jìn)行凝膠純化，并在12μl洗脫緩沖液中洗脫。亞磷酰胺三聚體寡核苷酸對于除了cys和met之外的每個(gè)氨基酸包含一個(gè)密碼子(并且沒有終止密碼子)。這些引物含有重疊區(qū)域，使得所得擴(kuò)增子可以使用clontech的infusionhdenzyme試劑盒在體內(nèi)進(jìn)行融合克隆和連接，所得噬菌粒是在環(huán)v中具有4個(gè)可變密碼子(由殘基817至820組成)的微型文庫。簡言之，將495ng凝膠純化的擴(kuò)增子與10μl5xinfusionhd酶在50μl反應(yīng)中融合克隆，并在50℃孵育15分鐘，并置于冰上。然后將dna濃縮并使用qiagenpcrprepminelute柱純化，用10μleb洗脫。將dna在漂浮在100mlddh2o上的millipore硝酸纖維素膜上脫鹽30分鐘，更換水并再重復(fù)30分鐘。將dna文庫通過在0.1cm電穿孔杯中在冰上加入1μl40ng/μl的dna到6個(gè)等份的25μl細(xì)胞中的每一個(gè)中，電穿孔到電感受態(tài)tg1細(xì)胞(lucigen)中。在設(shè)置ec1時(shí)，使用bioradmicropulser對dna進(jìn)行電穿孔，產(chǎn)生大約5.4的tau，之后，每次電穿孔用1ml的lucigen恢復(fù)培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞和dna，合并，并在振蕩培養(yǎng)箱中在37℃，275rpm孵育1小時(shí)。為了滴定亞文庫，將10μl恢復(fù)培養(yǎng)物稀釋10倍，并將10μl等分試樣點(diǎn)在2xyt/葡萄糖(2％)/羧芐青霉素(100μg/ml)(2xyt/glu/carb)上，并在30℃孵育過夜。將剩余的微型文庫擴(kuò)增至50ml2xyt/glu/carb，并在30℃，250rpm孵育過夜。在od600為75時(shí)，將細(xì)胞沉淀并重懸于2xyt/18％甘油中，并儲存于-80℃。

通過接種含5μl甘油儲液的50ml2xyt/gly/carb，生長過夜，并使用qiagenmidiprep試劑盒制備噬菌粒，制備噬菌粒微型文庫，得到100μl156ng/μl噬菌粒dna。為了制備該噬菌粒文庫作為構(gòu)建環(huán)w和z還被隨機(jī)化的文庫的模板，將5μg噬菌粒用30單位的psti在含緩沖液3(neb)和bsa的50μl反應(yīng)中消化，并在37℃孵育1h。通過使用引物404f和405ar擴(kuò)增2ng天然cbm(其突變了m929l)，擴(kuò)增不含有可變化殘基的環(huán)w和z之間的cbm區(qū)域來制備“插入物”：使用clonamphifipcrmix根據(jù)制造商的說明書在100μl反應(yīng)物中，并在98℃下10s，60℃下10s和72℃下10s循環(huán)，循環(huán)30次。插入物和純化的噬菌粒都在1.1％瓊脂糖凝膠上使用qiagenminelute凝膠純化柱進(jìn)行凝膠純化。

使用含有用于環(huán)w和z的隨機(jī)化密碼子的亞磷酰胺三聚體，以及用于退火到含有cbmm929l的內(nèi)部非隨機(jī)區(qū)域的插入物的重疊區(qū)域來擴(kuò)增噬菌粒。簡言之，根據(jù)制造商的說明書，使用25μl的42個(gè)反應(yīng)，使用clonamphifipcrmix，用亞磷酰胺三聚體引物402-tr和403-tf擴(kuò)增420ngpsti消化和純化的噬菌粒，以98℃10秒，65℃10s，72℃30s循環(huán)15次。引物402t-r改變了在環(huán)w中的密碼子，其編碼殘基838-844。引物403t-f改變了在環(huán)z中的密碼子，其編碼殘基931-935。擴(kuò)增子在1％瓊脂糖上凝膠純化，使用8個(gè)qiagen凝膠純化柱，用50μleb洗脫每一個(gè)并合并。擴(kuò)增的噬菌粒和插入物均分別用100μl和20μleb進(jìn)行pcrprep純化和洗脫，產(chǎn)生152ng/μl的噬菌粒和174ng/μl的插入物。使用的引物和它們各自的序列在圖3中列出。

噬菌粒和插入物的gibson裝配

通過gibson裝配產(chǎn)生噬菌粒文庫，將線性噬菌粒文庫克隆到環(huán)w和z之間的插入物區(qū)域，所述文庫在環(huán)v(殘基817-820)中含有4個(gè)可變密碼子，在環(huán)w(殘基838-844)中含有7個(gè)可變密碼子和在環(huán)z(殘基931-935)中含有5個(gè)可變密碼子，在3個(gè)環(huán)中總共16個(gè)可變殘基。簡而言之，將4.17μg噬菌粒和1.52μg插入物在830μl反應(yīng)中合并，該反應(yīng)含有415μlgibson裝配主混合物(2x)(neb)，并在50℃下孵育15分鐘并置于冰上。將連接的dna在一個(gè)qiagenminelutepcrprep柱中純化并濃縮，并在25μleb中洗脫。將dna在vswp0.025μm膜(millipore)上在ddh2o上脫鹽1小時(shí)，在30分鐘時(shí)換水。脫鹽的dna用ddh2o調(diào)節(jié)至75ng/μl，并用于電穿孔電感受態(tài)tg1細(xì)胞(lucigen)。將大約51μl的dna加入到1.25ml冰冷的tg1細(xì)胞中，并上下吹吸4次以在冰上混合，然后將25μl等分試樣轉(zhuǎn)移到冰上具有0.1cm間隙的50個(gè)冷卻的電穿孔小杯中。將細(xì)胞在biorad微脈沖發(fā)生器上在ec1水平上電穿孔，并立即用975μllucigen恢復(fù)培養(yǎng)基淬滅，合并，并在37℃，250rpm孵育1小時(shí)。為了滴定文庫，將10μl恢復(fù)培養(yǎng)物在2xyt中連續(xù)稀釋，并將10μl每種稀釋液點(diǎn)在2xyt/glu/carb上，并在30℃孵育過夜。將剩余的文庫擴(kuò)增至3l2xyt/glu/carb，并在30℃，250rpm下擴(kuò)增過夜。第二天，將文庫以10k×g，10分鐘，4℃沉淀，棄去培養(yǎng)基。將沉淀重懸于2xyt/2％葡萄糖/18％甘油中，od600為75，等分并保存于-80℃。

對麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp)的結(jié)合劑的文庫淘選

對于第一輪淘選，用4mlc11甘油儲液(od600=75)接種3l2xyt/glu/carb至od600為約0.1，并在37℃，250rpm下生長直到od600達(dá)到0.5。從最初的培養(yǎng)物中，750ml用466μlvcsm13(1e13噬菌體/ml)以大約20個(gè)噬菌體對1個(gè)細(xì)胞的比率進(jìn)行超感染，并在37℃下以100rpm孵育30分鐘，然后以250rpm孵育30分鐘。將細(xì)胞以10k×g，10分鐘沉淀，棄去培養(yǎng)基。將細(xì)胞重懸于1.5l2xyt/carb(100μg/ml)/kan(70μg/ml)中，并在30℃，250rpm孵育過夜。將細(xì)胞以10k×g沉淀10分鐘，將含有上清液的噬菌體轉(zhuǎn)移到含有0.25體積的5xpeg/nacl(20％聚乙二醇6000/2.5mnacl)的清潔管中，充分混合，并在冰上孵育25分鐘。將噬菌體以13k×g，25分鐘沉淀并棄去上清液。將噬菌體重懸于60mlpbs中并在13k×g離心10分鐘以除去不溶性物質(zhì)。上清液用5xpeg再次沉淀并在冰上孵育5分鐘，然后在13k×g再次離心噬菌體20分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸于30mlpbs中，a268為6.6。

對于生物素化mbp的溶液淘選，將兩組100μl鏈霉親和素包被的磁珠漿液用pbs-t洗滌2×1ml(在洗滌之間施加磁鐵以除去上清液)，并在具有0.05％tween20的1ml2％奶粉/pbs(2％m-pbs-t)中封閉1小時(shí)，在室溫下旋轉(zhuǎn)。除非另有說明，否則所有淘選和篩選孵育在室溫下進(jìn)行。在封閉珠粒之后，施加磁鐵并除去封閉劑。為了在與生物素化抗原孵育前預(yù)清除噬菌體溶液，將1ml噬菌體溶液(在前述步驟中制備)在一組封閉的珠上孵育1小時(shí)，旋轉(zhuǎn)。施加磁鐵并將預(yù)先清潔的噬菌體轉(zhuǎn)移到干凈的管中。將生物素化的mbp(avidity)以100nm的濃度加入到預(yù)先清潔的噬菌體溶液中，并孵育1.5小時(shí)旋轉(zhuǎn)以允許噬菌體結(jié)合抗原。

將噬菌體/抗原溶液轉(zhuǎn)移到第二組封閉的珠上，孵育20分鐘以捕獲結(jié)合抗原的噬菌體。施加磁鐵并棄去上清液。洗滌珠粒并用1mlpbs-t重懸浮8次，在第三次，第五次和第七次洗滌后切換到新鮮試管，并在每次洗滌之間用磁鐵沉淀珠粒約2分鐘。用800μl0.1m甘氨酸，ph2洗脫珠粒10分鐘，施加磁鐵，并將上清液吸入具有72μl2mtris堿的管中進(jìn)行中和，然后將全部中和的洗脫液加入到9ml中間對數(shù)期的xl1-藍(lán)細(xì)胞(od600=0.44)。將細(xì)胞在37℃，150rpm下感染45分鐘。通過制備10μl培養(yǎng)物的10倍連續(xù)稀釋液，在2xyt/glu/carb瓊脂平板上各點(diǎn)樣10μl，并在30℃孵育過夜，測量未擴(kuò)增的輸出效價(jià)。將培養(yǎng)物擴(kuò)增至100ml2xyt/glu/carb，并在30℃，250rpm孵育過夜，然后在37℃在早晨孵育幾小時(shí)。

通過測量od600，在10k×g離心細(xì)胞10分鐘，并將細(xì)胞重懸于2xyt/18％甘油中至75的od600，收獲過夜培養(yǎng)物。為了制備用于下一輪淘選的噬菌體，用5μl75od600甘油儲液接種5ml的2xyt/glu/carb，并在37℃，250rpm孵育直至od600達(dá)到0.5。將細(xì)胞以20：1噬菌體：細(xì)胞進(jìn)行超感染，充分混合，并在37℃，30分鐘，150rpm孵育，然后以250rpm孵育30分鐘。將細(xì)胞以5500×g沉淀10分鐘，棄去含葡萄糖的培養(yǎng)基，將細(xì)胞重懸于10ml2xyt/carb/kan中，并在30℃，250rpm孵育過夜。

將過夜噬菌體制備物以10k×g離心10分鐘，將上清液轉(zhuǎn)移至2.5ml5xpeg/nacl中，混合，并在冰上孵育25分鐘以沉淀噬菌體。將噬菌體以13k×g沉淀20分鐘，棄去上清液。將噬菌體重懸于1mlpbs中，并通過在20k×g離心5分鐘除去不溶性物質(zhì)。將上清液施加到0.25體積的5xpeg/nacl，并在冰上第二次沉淀5分鐘。將噬菌體以13k×g，5分鐘，4℃沉淀，除去上清液，將沉淀重懸于750μlpbs中。在2％m-pbs-t中在a268=0.8制備噬菌體，并如上所述繼續(xù)淘選，除了在第三輪中，用預(yù)清潔的噬菌體孵育的生物素化抗原的濃度降低至10mm，噬菌體濃度降低至a268為0.2，并且將洗滌次數(shù)增加至12以增加更高親和力噬菌體的選擇性。

淘選后各個(gè)克隆的elisa

在最后淘選輪(通常在3或4輪后)結(jié)束時(shí)，在45分鐘37℃，150rpm恢復(fù)被洗脫的噬菌體的感染的xl1-藍(lán)細(xì)胞后，將單個(gè)菌落鋪板到2xyt/glu/carb上。第二天將96個(gè)菌落接種到96孔深孔培養(yǎng)板中的400μl2xyt/glu/carb中，并在37℃，300rpm下生長過夜，以產(chǎn)生主板，向其中加入甘油至18％用于儲存在-80℃。為了制備用于elisa的誘導(dǎo)板，將5μl每種主板培養(yǎng)物接種到400μl新鮮的2xyt/0.1％glu/carb中，并在37℃，300rpm孵育2小時(shí)45分鐘。加入iptg至0.5mm，將板在30℃，300rpm孵育過夜。因?yàn)槭删：戌杲K止密碼子，所以一些cbm蛋白產(chǎn)生而沒有g(shù)piii，即使xl1-blue是抑制型菌株，導(dǎo)致一些cbm的周質(zhì)定位，其中一些百分比最終分泌到培養(yǎng)基中。然后可以直接在elisa中使用培養(yǎng)基。過夜誘導(dǎo)后，將板在1200×g離心10分鐘以沉淀細(xì)胞。

鏈霉親和素或中性親和素包被的微量滴定板(pierce)用200μlpbs漂洗三次，并以100μl/孔用1μg/ml的生物素化的mbp包被并孵育1小時(shí)。對于空白對照，將板僅用100μl/孔pbs孵育。用200μlpbs-t洗滌孔三次，并用200μl2％m-pbs-t封閉1至3小時(shí)。除去封閉液，并向每個(gè)孔中加入50μl的4％m-pbs-t。此時(shí)將50μl的每個(gè)誘導(dǎo)板上清液轉(zhuǎn)移到空白和mbp包被的孔中，吸取10次以混合，并孵育1小時(shí)。在使用僅分配功能的板洗滌器中用250μlpbs-t洗滌板4次，并在洗滌之間將板傾倒并且在紙巾上拍打。洗滌后，向每個(gè)孔中加入75μl在4％m-pbs-t中的1/2000稀釋抗flag-hrp并孵育1小時(shí)。傾倒第二抗體并如前所述洗滌板。通過加入75μltmbultra底物(pierce)顯色板，并與對照相比分析陽性。通過接種含3μl甘油儲液的1ml2xyt/glu/carb，并在37℃，250rpm孵育至少6小時(shí)，從主板培養(yǎng)陽性。將細(xì)胞沉淀并棄去培養(yǎng)基。使用qiagen小量制備試劑盒從沉淀制備質(zhì)粒dna，并通過genewiz的sanger測序確定序列。

結(jié)合劑的表達(dá)和純化

從使用分泌的結(jié)合劑的elisa鑒定的陽性被亞克隆到含有n或c末端半胱氨酸或c末端接頭，隨后是半胱氨酸(ggggsggggsgggc)的pet載體中。這些構(gòu)建體的命名包括將c置于結(jié)合劑編號之前，或者將c或lc置于在結(jié)合劑編號之后，以分別表示n-或c-末端cys或接頭-cys。例如，在c末端具有接頭-cys的gfp結(jié)合劑860命名為p860lc。對于c端cys構(gòu)建體，使用引物391f和450r，在25μl反應(yīng)中從前面部分中制備的pcomb3x噬菌?？寺U(kuò)增cbmcdna，包括其n-末端6-his標(biāo)簽，所述反應(yīng)含有12.5μlclonamphifipcrmix，以98℃10秒，65℃10秒，72℃30秒循環(huán)30次。使用含有天然cbmm929l的pet15b(novagen)載體作為模板(盡管可以使用pet15b)用于在含有25μlclonamphifipcrmix的50μl反應(yīng)中使用引物390r和387f擴(kuò)增載體，以相同的方式循環(huán)。對于n-末端cys構(gòu)建體，以完全相同的方式進(jìn)行克隆，除了cbm用引物508f和392r擴(kuò)增，載體用387f和507r擴(kuò)增(除了在pc896和pc923的情況下，其中cbm用493f和392r擴(kuò)增，載體用387f和494r擴(kuò)增)。對于c末端接頭-cys構(gòu)建體，以完全相同的方式進(jìn)行克隆，除了cbm用391af和527r擴(kuò)增，載體用540f和390ar擴(kuò)增(參見圖13的引物序列)。使用qiagenminelute凝膠純化試劑盒，在1.1％瓊脂糖凝膠上凝膠純化這兩個(gè)擴(kuò)增子。將20和100ng之間的插入物和載體在50℃，15分鐘的5μlinfusion反應(yīng)中融合克隆(clontech)?；瘜W(xué)感受態(tài)bl21de3大腸桿菌用1.5μlinfusion反應(yīng)進(jìn)行熱休克，并在500μlsoc中37℃，250rpm恢復(fù)1小時(shí)。將細(xì)胞鋪板在2xyt/glu/carb上，并在37℃孵育過夜。將單個(gè)菌落在3ml2xyt/glu/carb培養(yǎng)物中生長至少7小時(shí)，之后純化質(zhì)粒用于測序以確認(rèn)cbmcdna的插入。同時(shí)，將培養(yǎng)物接種到100ml2xyt/carb中，并在37℃，250rpm下生長至od600為0.8，用0.5mmiptg誘導(dǎo)，并在30℃，250rpm孵育過夜。將過夜培養(yǎng)物在4℃下以10k×g，10分鐘沉淀，棄去培養(yǎng)基。將沉淀在10ml6m胍-hcl，0.1mnah2po4，10mmtris，ph8(緩沖液a)中裂解，并在室溫下旋轉(zhuǎn)過夜孵育。將不溶性物質(zhì)在4℃下以30k×g，10分鐘沉淀，將上清液轉(zhuǎn)移至含有在相同緩沖液中平衡的1mlni-ntasf(qiagen)的干凈管中，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育過夜。將珠粒以1k×g，1分鐘沉淀，并棄去穿流物。將珠粒用包含20mm咪唑和5mmβ-巰基乙醇(b-me)的5ml8m尿素，0.1mnah2po4，10mmtris，ph8(緩沖液b)洗滌三次，用不含b-me的相同的緩沖液洗滌另外三次。用五個(gè)1ml等份的緩沖液a(包括250mm咪唑)洗脫蛋白質(zhì)，并合并在一個(gè)管中。通過使用消光系數(shù)33,690m^-1cm^-1測量280nm處的吸光度來定量蛋白質(zhì)。通過用3000da的截留的超濾使緩沖液交換一小部分蛋白質(zhì)進(jìn)入緩沖液b，然后在用gelcodeblue染色的12％bis-trisnupage上分析十或更多微克的蛋白質(zhì)，評價(jià)純度(圖4)。

結(jié)合劑與色譜樹脂的綴合

將緩沖液a中的純化蛋白直接綴合到sulfolink珠狀瓊脂糖(thermo)上。簡言之，通過用至少5個(gè)床體積的緩沖液a洗滌珠粒3次，并轉(zhuǎn)移至1.3ml柱，平衡100μl填充的樹脂。加入蛋白質(zhì)，濃度為2至12mg/ml，體積為220μl，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘。將柱直立放置30分鐘，并使其排干。將柱用600μl緩沖液a洗滌三次，然后用800μl50mml-cys孵育，并旋轉(zhuǎn)孵育15分鐘，直立放置另外15分鐘，并排至床。樹脂用800μl1mnacl洗滌兩次，并且通過用800μl20mmmops，150mmnacl，1mmcacl2，ph6.5洗滌四次來將蛋白質(zhì)重折疊在柱上。將珠粒轉(zhuǎn)移到干凈的管中，將疊氮化物以0.05％加入到mops緩沖液中以抑制微生物生長。

使用與交聯(lián)的瓊脂糖珠綴合的結(jié)合劑從大腸桿菌全細(xì)胞裂解物中親和純化抗原

使bl21de3大腸桿菌細(xì)胞生長至od600為4.9，在10k×g，10分鐘，4℃下沉淀，棄去培養(yǎng)基，將沉淀物冷凍。通過用18mlbper(pierce)從70ml培養(yǎng)物中裂解沉淀物，并在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育20分鐘來制備全細(xì)胞裂解物。將不溶性物質(zhì)以30k×g，10分鐘，4℃沉淀，并將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的管中。將澄清的裂解物用20mmmops，150mmnacl，ph6.5(mops緩沖液)稀釋至50ml，并加入抗原(在這種情況下為麥芽糖結(jié)合蛋白，mbp)至終濃度為0.018mg/ml。摻加的裂解物的最終“od600”為6.5(如果細(xì)胞未裂解，則以最終od計(jì)算)。為了制備親和樹脂，將700μl如上所述制備的填充珠粒用10ml包含1mmcacl2的mops緩沖液洗滌三次。將摻加的裂解物與在4℃下旋轉(zhuǎn)的樹脂孵育2小時(shí)。將珠粒以1k×g，10分鐘沉淀，并通過抽吸除去ft。將珠用含有1mmcacl2和0.05％tween20的10mlmops緩沖液洗滌五次，最后一次洗滌不含cacl2或tween20。將珠粒用洗滌緩沖液轉(zhuǎn)移到柱子中并排干。將柱用700μlmops緩沖液加0.1medta洗滌四次，收集洗滌液。用700μl多元醇洗脫緩沖液(10mmtris，1mmedta，0.75m硫酸銨，40％丙二醇，ph7.9)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)7次，收集級分。如圖5所述，在煮沸5分鐘后，在mes運(yùn)行緩沖液-樣品還原緩沖液中在sds凝膠(invitrogen)中，在12％bis-trisnupagesds-page上分析洗滌液和洗脫級分。

圖6顯示了使用與sulfolink樹脂結(jié)合的幾種不同的gfp結(jié)合劑從大腸桿菌全細(xì)胞裂解物類似地純化綠色熒光蛋白(gfp)。簡言之，將gfp結(jié)合劑與如上所述的sulfolink樹脂綴合，并將50μl填充樹脂用于從摻有60ng/μlgfp的1.2ml大腸桿菌裂解物中純化gfp。將珠粒在摻加的裂解物中在4℃孵育2小時(shí)。將珠粒用1ml含有1mmcacl2和0.05％tween20的mops緩沖液洗滌4次，并用250μl多元醇洗脫緩沖液洗脫。如所述，在煮沸5分鐘后，通過sds-樣品還原緩沖液中的sds-page分析洗脫的級分和摻加的裂解物。

來自文庫2的被鑒定為結(jié)合mbp的本發(fā)明蛋白質(zhì)的實(shí)例包括以下：

819,seqidno:17:

npslirseswflwigneanlldgddntgvwywrwwgekslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqswtnltfsefaivsd

822,seqidno:18:

npslirseswqlnngneanlldgddntgvwyvanvgtqslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnletsgwgltfsefaivsd

824,seqidno:19:

npslirseswypwvgneanlldgddntgvwywhawgapslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqifahltfsefaivsd

實(shí)施例2.用于靶分子的特異性結(jié)合的衍生cbm32骨架蛋白(文庫1)

文庫1改變了以下殘基：seqidno：1：817(q)，839-844(tlngdt)，931-935(ninkw)，872-878(gggssdk)和902-907(tgapag)。我們從該文庫中分離出展示選擇性結(jié)合劑的噬菌體，但在大腸桿菌中難以高水平表達(dá)所得蛋白質(zhì)。

圖8顯示來自文庫1，me3-c11的重組結(jié)合劑，其在蛋白質(zhì)印跡應(yīng)用中特異性結(jié)合麥芽糖結(jié)合蛋白。在該實(shí)驗(yàn)中，來自大腸桿菌菌株dh10bt1r的全細(xì)胞可溶性細(xì)菌裂解物(7μg每泳道1、3、5、7、9和11)和100ng重組麥芽糖結(jié)合蛋白(0.1μg每泳道2、4、6、8、10和12)在12％bis-trissds-page上電泳，并用考馬斯藍(lán)染色(圖b)，或轉(zhuǎn)移到pvdf膜。將膜封閉，用指定濃度的me3-c11孵育1小時(shí)，洗滌，并與第二抗flag-hrp(泳道1-8)或抗mbp-hrp(泳道9和10)孵育1小時(shí)。洗滌膜并用用于膜的tmb顯色(圖a)。

結(jié)合mbp的來自文庫1的本發(fā)明蛋白質(zhì)的實(shí)例包括以下：

me3–a9,seqidno:20:

npslirseswtvyegneanlldgddntgvwykyvpstdslagefigldlgkeikldgirfvigknvffrpviwnkfkleysldneswttikeydkflpdvakdvieesfetpisakyirltnmegygisltfsefaivsd

me3–c7,seqidno:21:

npslirseswivyegneanlldgddntgvwykpldfpfslagefigldlgkeikldgirfvigknascgfdawnkfkleysldneswttikeydkispsyskdvieesfetpisakyirltnmeicvcfltfsefaivsd

me3–c11,seqidno:22:

npslirseswcvyegneanlldgddntgvwyklcpspfslagefigldlgkeikldgirfvigkngylgsdawnkfkleysldneswttikeydknhnsthkdvieesfetpisakyirltnmefclsdltfsefaivsd

實(shí)施例3.熱穩(wěn)定性cr突變體

表2概述了蛋白骨架cbm(pdb2w1q)，殘基807–946和各種突變體的熱遷移測定(tsa)分析的結(jié)果。所有蛋白質(zhì)包含n–末端his–標(biāo)簽。

實(shí)施例4.針對各種靶抗原產(chǎn)生的結(jié)合劑的驗(yàn)證

針對一組靶抗原(例如gfp，mbp，鼠igg，兔igg，β-d-半乳糖苷酶，nusa，sumo，硫氧還蛋白，中性親和素，鏈霉親和素，v5表位，mcherry，cmyc和flag)產(chǎn)生cbm結(jié)合劑，通過sds-page分析和/或elisa根據(jù)實(shí)施例1中描述的方法驗(yàn)證。每種驗(yàn)證的結(jié)合劑的氨基酸序列在下文提供，對于每個(gè)靶標(biāo)的最強(qiáng)候選結(jié)合劑作為主要結(jié)合劑列出。對于每種靶抗原，還提供了抗原的氨基酸序列，驗(yàn)證的抗原的氨基酸序列，在本文所述的實(shí)驗(yàn)中測試的應(yīng)用和/或用于該靶抗原的另外的結(jié)合劑的氨基酸序列。

圖9顯示了使用在實(shí)施例1、2和5中產(chǎn)生的基于cbm的結(jié)合劑從整個(gè)大腸桿菌細(xì)胞裂解物中純化的抗原的sds-page分析結(jié)果。對于圖9所示的數(shù)據(jù)，下表3總結(jié)了用于使用結(jié)合劑綴合的親和樹脂從大腸桿菌裂解物親和純化抗原的各種條件。如實(shí)施例1中所述進(jìn)行親和純化，除了以下例外。省略了將結(jié)合劑與sulfolink珠綴合后的1m鹽洗滌。代替高鹽洗滌，用l-cys封閉任何剩余的活性位點(diǎn)后，通過用800μl20mmmops，150mmnacl，ph6.5洗滌2次以除去磷酸鹽，然后用相同緩沖液加上1mmcacl2洗滌4次，直接重折疊珠粒以將珠粒上的結(jié)合劑重折疊。在來自大腸桿菌裂解物的抗原的親和純化期間，在將裂解物排至樹脂床之后，將珠粒用幾個(gè)柱體積的pbs或pbs-t洗滌4至8次，并用多元醇洗脫緩沖液(或8m尿素，0.1mnah2po4，10mmtris，ph8)洗脫，如表3中詳細(xì)描述的。按需要，該方案根據(jù)所需樹脂的量而調(diào)節(jié)規(guī)模。

幾個(gè)剩余的基于cbm的結(jié)合劑通過elisa驗(yàn)證。例如，migg結(jié)合劑p928的elisa數(shù)據(jù)顯示于圖10中。sumo結(jié)合劑p971和p973的elisa數(shù)據(jù)顯示于圖11中。v5結(jié)合劑p999的elisa數(shù)據(jù)顯示于圖12中。用于構(gòu)建cbm噬菌體文庫的引物組如圖13所示。

表3：圖9圖解-使用cbm親和樹脂從大腸桿菌裂解物中親和純化抗原的條件。

*過表達(dá)抗原的bl21de3細(xì)胞：未測量裂解物中的抗原濃度

**用8m尿素,100mmnah2po4,10mmtris,ph8洗脫

***用0.1m甘氨酸,ph2洗脫

1.gfp的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p860lc

mgsshhhhhhnpslirseswdewfgneanlldgddntgvwyvsfadnyslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlenrwsyltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:gfpmut2;生物素化的,c-端avitag-6his(gfps65a,v68l,s72a;源自登錄號abn41558)

mskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfayglqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykggglndifeaqkiewhegahhhhhh

驗(yàn)證的反應(yīng)性:gfp

mskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfsygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelyk

試驗(yàn)的應(yīng)用

免疫沉淀(ip)(圖9a)

另外的gfp結(jié)合劑(圖9b)

>p845c

mgsshhhhhhnpslirseswarwagneanlldgddntgvwywakknnislagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlettfggltfsefaivsdc

>p846c

mgsshhhhhhnpslirseswatwhgneanlldgddntgvwywdddynnslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlepqwggltfsefaivsdc

>p854c

mgsshhhhhhnpslirseswsawigneanlldgddntgvwyynyaknwslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleekwsyltfsefaivsdc

2.mbp的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p822lc

mgsshhhhhhnpslirseswqlnngneanlldgddntgvwyvanvgtqslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnletsgwgltfsefaivsdc

抗原:麥芽糖結(jié)合蛋白(mbp);生物素化的和c-端avitagged(源自登錄號edv67340,26–392,具有突變:a26m,i28t,q334e,d335e,d348e,a385e)

mkteegklviwingdkgynglaevgkkfekdtgikvtvehpdkleekfpqvaatgdgpdiifwahdrfggyaqsgllaeitpdkafqdklypftwdavryngkliaypiavealsliynkdllpnppktweeipaldkelkakgksalmfnlqepyftwpliaadggyafkyengkydikdvgvdnagakagltflvdliknkhmnadtdysiaeaafnkgetamtingpwawsnidtskvnygvtvlptfkgqpskpfvgvlsaginaaspnkelakeflenylltdegleavnkdkplgavalksyeeelakdpriaatmenaqkgeimpnipqmsafwyavrtavinaasgrqtvdealkdaqtnsssgslstpptpspstpptglndifeaqkiewhe

驗(yàn)證的反應(yīng)性:mbp-c,源自登錄號edv67340,26–392,具有突變:a26m,q334e,d335e,d348e,a385e,和c端來自pmal-c5x的另外序列,和c-端cys

mkieegklviwingdkgynglaevgkkfekdtgikvtvehpdkleekfpqvaatgdgpdiifwahdrfggyaqsgllaeitpdkafqdklypftwdavryngkliaypiavealsliynkdllpnppktweeipaldkelkakgksalmfnlqepyftwpliaadggyafkyengkydikdvgvdnagakagltflvdliknkhmnadtdysiaeaafnkgetamtingpwawsnidtskvnygvtvlptfkgqpskpfvgvlsaginaaspnkelakeflenylltdegleavnkdkplgavalksyeeelvkdpriaatmenaqkgeimpnipqmsafwyavrtavinaasgrqtvdealkdaqtnsssnnnnnnnnnnlgiegrc

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9c)

另外的mbp結(jié)合劑(圖9d)

>p819c

mgsshhhhhhnpslirseswflwigneanlldgddntgvwywrwwgekslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqswtnltfsefaivsdc

>p824c

mgsshhhhhhnpslirseswypwvgneanlldgddntgvwywhawgapslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqifahltfsefaivsdc

3.igg(小鼠)的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p926lc

mgsshhhhhhnpslirseswrpfygneanlldgddntgvwynsklhwrslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqssygltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:igg,小鼠(正常),生物素化的(santacruzsc-2762)

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9e)

另外的migg結(jié)合劑(圖10)

>p928

mkktaiaiavalagfatvaqaagsshhhhhhnpslirseswvrtigneanlldgddntgvwylpykrakslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleniwtyltfsefaivsddykddddkg

4.igg(兔)的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p877lc

mgsshhhhhhnpslirseswyilggneanlldgddntgvwyapywevdslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnledryfsltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:igg,兔抗山羊和抗小鼠iggh&l,生物素化的(abcamab6740,ab6727)

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9f)

另外的rigg結(jié)合劑(圖9f)

>p892lc

mgsshhhhhhnpslirseswyaewgneanlldgddntgvwyvkfnqepslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleadfvhltfsefaivsdggggsggggsgggc

β-d-半乳糖苷酶(bgal)的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p895lc

mgsshhhhhhnpslirseswwtrygneanlldgddntgvwyekpyqvaslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnletyfsyltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:β-d-半乳糖苷酶;生物素化的(rocklandchemical,b000-17,源自登錄號np_414878)

mtmitdslavvlqrrdwenpgvtqlnrlaahppfaswrnseeartdrpsqqlrslngewrfawfpapeavpeswlecdlpeadtvvvpsnwqmhgydapiytnvtypitvnppfvptenptgcysltfnvdeswlqegqtriifdgvnsafhlwcngrwvgygqdsrlpsefdlsaflragenrlavmvlrwsdgsyledqdmwrmsgifrdvsllhkpttqisdfhvatrfnddfsravleaevqmcgelrdylrvtvslwqgetqvasgtapfggeiiderggyadrvtlrlnvenpklwsaeipnlyravvelhtadgtlieaeacdvgfrevriengllllngkpllirgvnrhehhplhgqvmdeqtmvqdillmkqnnfnavrcshypnhplwytlcdryglyvvdeaniethgmvpmnrltddprwlpamservtrmvqrdrnhpsviiwslgnesghganhdalyrwiksvdpsrpvqyegggadttatdiicpmyarvdedqpfpavpkwsikkwlslpgetrplilceyahamgnslggfakywqafrqyprlqggfvwdwvdqslikydengnpwsayggdfgdtpndrqfcmnglvfadrtphpalteakhqqqffqfrlsgqtievtseylfrhsdnellhwmvaldgkplasgevpldvapqgkqlielpelpqpesagqlwltvrvvqpnatawseaghisawqqwrlaenlsvtlpaashaiphlttsemdfcielgnkrwqfnrqsgflsqmwigdkkqlltplrdqftrapldndigvseatridpnawverwkaaghyqaeaallqctadtladavlittahawqhqgktlfisrktyridgsgqmaitvdvevasdtphpariglncqlaqvaervnwlglgpqenypdrltaacfdrwdlplsdmytpyvfpsenglrcgtrelnygphqwrgdfqfnisrysqqqlmetshrhllhaeegtwlnidgfhmgiggddswspsvsaefqlsagryhyqlvwcqk

驗(yàn)證的反應(yīng)性:n/a

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9g)

另外的bgal結(jié)合劑(圖9h)

>pc896

mcsshhhhhhnpslirseswqvyegneanlldgddntgvwykkaknlaslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlesyfnfltfsefaivsd

>pc923

mcsshhhhhhnpslirseswqliegneanlldgddntgvwyfkdwhtaslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlesyfeyltfsefaivsd

nusa的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p955lc

mgsshhhhhhnpslirseswrydfgneanlldgddntgvwykkhhvknslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlekkltsltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:nusa;生物素化的,n端6his標(biāo)記(源自登錄號wp_044694313)

mgsshhhhhhgtnkeilavveavsnekalprekifealesalatatkkky

eqeidvrvqidrksgdfdtfrrwlvvdevtqptkeitleaaryedeslnl

gdyvedqiesvtfdrittqtakqvivqkvreaeramvvdqfrehegeiit

gvvkkvnrdnisldlgnnaeavilredmlprenfrpgdrvrgvlysvrpe

argaqlfvtrskpemlielfrievpeigeevieikaaardpgsrakiavk

tndkridpvgacvgmrgarvqavstelggeridivlwddnpaqfvinama

padvasivvdedkhtmdiaveagnlaqaigrngqnvrlasqlsgwelnvm

tvddlqakhqaeahaaidtftkyldidedfatvlveegfstleelayvpm

kelleiegldeptvealreraknalatiaqaqeeslgdnkpaddllnleg

vdrdlafklaargvctledlaeqgiddladiegltdekagalimaarnic

wfgdeagtdydipttenlyfqg

驗(yàn)證的反應(yīng)性:nusa-gfpmut2

mgsshhhhhhgtnkeilavveavsnekalprekifealesalatatkkkyeqeidvrvqidrksgdfdtfrrwlvvdevtqptkeitleaaryedeslnlgdyvedqiesvtfdrittqtakqvivqkvreaeramvvdqfrehegeiitgvvkkvnrdnisldlgnnaeavilredmlprenfrpgdrvrgvlysvrpeargaqlfvtrskpemlielfrievpeigeevieikaaardpgsrakiavktndkridpvgacvgmrgarvqavstelggeridivlwddnpaqfvinamapadvasivvdedkhtmdiaveagnlaqaigrngqnvrlasqlsgwelnvmtvddlqakhqaeahaaidtftkyldidedfatvlveegfstleelayvpmkelleiegldeptvealreraknalatiaqaqeeslgdnkpaddllnlegvdrdlafklaargvctledlaeqgiddladiegltdekagalimaarnicwfgdeagtdydipttenlyfqgskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfayglqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykiegrggkpipnpllgldst

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9i)

另外的nusa結(jié)合劑(圖9j)

>pc954

mgcshhhhhhnpslirseswavlkgneanlldgddntgvwyanykiqkslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqaflvltfsefaivsd

>pc956

mgcshhhhhhnpslirseswvfsigneanlldgddntgvwyvawwpetslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnletyfheltfsefaivsd

sumo的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p972lc

mgsshhhhhhnpslirseswedikgneanlldgddntgvwyfnevfyeslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnledkilfltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:sumo;生物素化的,6his標(biāo)記的釀酒酵母sumo蛋白smt3(源自登錄號bao66634)

mgsshhhhhhmsdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlme

afakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqigghmasmtggqq

驗(yàn)證的反應(yīng)性:sumo-mcherry

msdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqiggssglvprgshmvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelyk

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9k)

另外的sumo結(jié)合劑(圖11)

>p971

mkktaiaiavalagfatvaqaagsshhhhhhnpslirseswaavygneanlldgddntgvwyfnddvyeslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleheaiwltfsefaivsddykddddkg

>p973

mkktaiaiavalagfatvaqaagsshhhhhhnpslirseswtveygneanlldgddntgvwykkwwdakslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlewlfdeltfsefaivsddykddddkg

硫氧還蛋白的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p962lc

mgsshhhhhhnpslirseswhtyngneanlldgddntgvwynnnswfsslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleaknnltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:硫氧還蛋白;生物素化的,n-端6his(excellgencat#eg-5,源自登錄號aan83133)

mkiemhhhhhhamgsdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanla

驗(yàn)證的反應(yīng)性:硫氧還蛋白-gfpmut2

mgsshhhhhhamgsdkiihltddsfdtdvlkadgailvdfwaewcgpckmiapildeiadeyqgkltvaklnidqnpgtapkygirgiptlllfkngevaatkvgalskgqlkefldanlalyfqgskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfayglqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykiegrggkpipnpllgldst

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9l)

另外的trx結(jié)合劑(圖9m)

>pc961

mgcshhhhhhnpslirseswpvygneanlldgddntgvwyyssgtyfslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlelkyygltfsefaivsd

>pc966

mgcshhhhhhnpslirseswyigvgneanlldgddntgvwyekyhlyvslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlevgrksltfsefaivsd

中性親和素的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p975lc

mgsshhhhhhnpslirseswwirsgneanlldgddntgvwydnlywyrslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlenkygiltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:中性親和素(來自卵白的去糖基化的親和素):中性親和素包被的磁性顆粒(spherotechnvm-20-05)

驗(yàn)證的反應(yīng)性:中性親和素(pierceneutravidinproteincat#31000)

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9n)

另外的中性親和素結(jié)合劑(圖9o)

>pc977

mgcshhhhhhnpslirseswrrwsgneanlldgddntgvwyvtwpfseslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleninkwltfsefaivsd

>pc979

mgcshhhhhhnpslirseswyaifgneanlldgddntgvwyhsrnyykslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlehlwghltfsefaivsd

鏈霉親和素的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p982lc

mgsshhhhhhnpslirseswgviagneanlldgddntgvwytksnnhlslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleavffnltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:鏈霉親和素;重組體(dynabeadsmyonestreptavidint1(invitrogen))

驗(yàn)證的反應(yīng)性:鏈霉親和素(自阿維丁鏈霉菌(streptomycesavidinii)分離的鏈霉親和素.nebn7021s)

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9p)

v5表位的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p997lc

mgsshhhhhhnpslirseswvkyfgneanlldgddntgvwyfwhtasslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleqyiniltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:v5肽(cgkpipnpllgldst)

驗(yàn)證的反應(yīng)性:6his-gfpmut2-v5,6his-gfpmut2-3xv5

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9q)

另外的v5結(jié)合劑(圖12)

>p999

mkktaiaiavalagfatvaqaagsshhhhhhnpslirseswtkirgneanlldgddntgvwyaltfknihewywvvsslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnledyiydltfsefaivsdg

mcherry的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p1034lc

mgsshhhhhhnpslirseswvgskgneanlldgddntgvwypwfpkaiffknrefgslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnleyvsviltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:mcherry;生物素化的,n-端6his(源自登錄號ahh01498)

mgsshhhhhhssglvprgshmvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelyk

驗(yàn)證的反應(yīng)性:sumo-mcherry

msdsevnqeakpevkpevkpethinlkvsdgsseiffkikkttplrrlmeafakrqgkemdslrflydgiriqadqtpedldmedndiieahreqiggssglvprgshmvskgeednmaiikefmrfkvhmegsvnghefeiegegegrpyegtqtaklkvtkggplpfawdilspqfmygskayvkhpadipdylklsfpegfkwervmnfedggvvtvtqdsslqdgefiykvklrgtnfpsdgpvmqkktmgweassermypedgalkgeikqrlklkdgghydaevkttykakkpvqlpgaynvniklditshnedytiveqyeraegrhstggmdelyk

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9r)

cmyc的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p1021lc

mgsshhhhhhnpslirseswdttagneanlldgddntgvwyitgwvhrryvwetqlslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnmeninkwltfsefaivsdggggsggggsgggc

抗原:cmyc表位標(biāo)簽(ceqkliseedl)

驗(yàn)證的反應(yīng)性:gfpmut2-3x-cmyc

mgsshhhhhhskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttfayglqcfarypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelykiegrgeqkliseedlgeqkliseedlgeqkliseedl

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9s)

flag的結(jié)合劑

主要結(jié)合劑:p1015c

mgsshhhhhhnpslirseswahiwgneanlldgddntgvwywvgvslagefigldlgkeikldgirfvigkngggssdkwnkfkleysldneswttikeydktgapagkdvieesfetpisakyirltnlefgtgsltfsefaivsdc

抗原:flag標(biāo)簽(cdykddddk)

驗(yàn)證的反應(yīng)性:vhh-flag

qvqlvqsggglvqpggslrlscaasdygqqgyttpwtfmswvrqapgkalewigyihhsgstnynpslksrvtisrdnskntlylqmntlraedtamyycargnlairywgqgtlvtvsssgqaghhhhhhgdykddddkg

試驗(yàn)的應(yīng)用

ip(圖9t)

實(shí)施例5.文庫3的產(chǎn)生

文庫3是文庫2的變型，其中環(huán)w被延長至15個(gè)總殘基，并且除去了cbm的c末端的flag標(biāo)簽，同時(shí)保持相同的周圍恒定區(qū)。為了除去flag標(biāo)簽，使用2xcloneamphifipcr預(yù)混合物，在1ml的總反應(yīng)體積中，用重疊引物517f和518r以0.4um的終濃度擴(kuò)增200ng文庫2噬菌粒。將反應(yīng)以98℃下10秒，65℃下10秒和72℃下30秒循環(huán)20次。擴(kuò)增子在1.1％瓊脂糖凝膠上凝膠純化，并使用qiaquick凝膠提取試劑盒(qiagen)純化。純化的dna使用引物的重疊區(qū)域進(jìn)行g(shù)ibson克隆，通過在50℃下在270ul的總反應(yīng)體積中孵育1.35ugdna與135μlgibson裝配主混合物15分鐘，并隨后使用minelutepcrprep柱純化，以產(chǎn)生沒有flag標(biāo)簽的文庫噬菌粒。將該dna用作模板，通過用終濃度為0.4μm的亞磷酰胺三聚體引物512tf(其在環(huán)w中含有15個(gè)隨機(jī)密碼子)和引物523r，用500μl2xcloneamphifipcr預(yù)混合物，總反應(yīng)體積為1ml，以98℃10秒，65℃10秒，72℃30秒循環(huán)15次，擴(kuò)增400ngdna，來延長環(huán)w。擴(kuò)增子在1％瓊脂糖凝膠上使用8個(gè)qiaquick凝膠純化柱進(jìn)行凝膠純化，然后使用2個(gè)pcrminiprep柱進(jìn)行濃縮。將含有重疊末端區(qū)域的該dna通過5μg的gibson克隆在1ml的總反應(yīng)體積中在50℃下環(huán)化15分鐘，之后除去酶并通過pcrprepminelute柱純化dna。使用硝酸纖維素膜(vswp0.025um膜)在ddh2o上將dna脫鹽30分鐘，改變水并重復(fù)，得到124ng/ul的最終噬菌粒dna濃度。該dna用于如上所述電穿孔電感受態(tài)tg1細(xì)胞，產(chǎn)生理論多樣性為1.24e10cfu的文庫。如上所述淘選并篩選文庫，并如上所述產(chǎn)生并表征來自該文庫的結(jié)合劑。

其他實(shí)施例

在不脫離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明的所述方法和組合物的各種修飾和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。雖然已經(jīng)結(jié)合特定期望的實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是應(yīng)當(dāng)理解，所要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)該不適當(dāng)?shù)叵抻谶@樣的具體實(shí)施方案。實(shí)際上，對醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、藥理學(xué)、內(nèi)分泌學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的用于實(shí)施本發(fā)明的所述模式的各種修改意欲在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本說明書中提及的所有出版物通過引用并入本文，其程度如同每個(gè)獨(dú)立出版物具體和單獨(dú)地通過引用并入一樣。