本申請一般性地涉及醫(yī)學，更具體地涉及可用于治療受損和/或受傷的結(jié)締組織，包括慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂(腱炎)，軟骨撕裂，慢性退行性關節(jié)病況例如骨關節(jié)炎以及慢性炎性皮膚病包括特應性皮炎和慢性傷口，的方法和組合物。

背景技術：

骨關節(jié)炎(“oa”)是以軟骨損傷和滑膜炎癥為特征的退行性關節(jié)疾病。以前的數(shù)據(jù)指分子炎癥級聯(lián)的變化，其導致軟骨大分子的破壞和不可逆的形態(tài)變化¹。相當多的證據(jù)表明，il-1，腫瘤壞死因子-α，il-6,8和金屬蛋白酶是主要的分解代謝和促炎分子，在骨關節(jié)炎的發(fā)病機理中起主要作用。這些細胞因子由活化的滑膜細胞，單核細胞或關節(jié)軟骨本身產(chǎn)生，并且它們的分解代謝效應可以被抑制性細胞因子例如il-4,10,13和il-1ra1成功阻斷。

類似的炎癥和分解代謝途徑參與慢性肌腱炎²和慢性肌肉撕裂愈合失敗³的發(fā)病機制。肌腱細胞通過產(chǎn)生增加水平的il-1,6，金屬蛋白酶(mmp)和其他分解代謝分子而受到持續(xù)損傷²。促炎性細胞因子il-1和tnf-α也參與慢性肌炎的發(fā)病機制³。特應性皮炎(濕疹)被認為是最常見的復發(fā)性炎癥皮膚病況。慢性傷口(包括糖尿病傷口)是由于循環(huán)不良，神經(jīng)病變，免疫障礙和全身性疾病的并發(fā)癥，年齡和反復創(chuàng)傷而在三個月內(nèi)不愈合的傷口。所有提到的病況的特征在于通過細胞因子干擾細胞信號傳導和形成真皮皮膚層的最大組分的細胞外基質(zhì)(ecm)的喪失。靶向特別的炎癥和分解代謝分子途徑可以對炎性病理學具有有益的治療效果。這種效果可以通過使用治療活性蛋白質(zhì)來實現(xiàn)。目前，制藥工業(yè)采用用于重組蛋白生產(chǎn)的高成本分子遺傳技術，例如胰島素，干擾素，凝血因子等。然而，這些重組蛋白生成方法包括在細菌細胞中表達人基因。包括糖基化的翻譯后蛋白修飾的模式可以不同于人中天然存在的那些。這可能導致產(chǎn)品在人類環(huán)境中的不穩(wěn)定性，降低生物功能或免疫應答激發(fā)。此外，最終重組產(chǎn)物的成本極高。

技術實現(xiàn)要素：

描述了用于治療受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況例如骨關節(jié)炎和皮膚炎癥性病癥的生物活性組合物。還描述了制備該組合物的方法。該組合物包括抗炎組分/抗分解代謝組分?？寡捉M分也是抗分解代謝組分。為了本發(fā)明的目的，術語抗炎組分和抗分解代謝組分可以互換使用。所述組合物還可以包括包含自體富含血小板血漿(prp)的再生組分。盡管大多數(shù)prp制備方案包括導致從血小板立即釋放生長因子和細胞因子的活化步驟，但是本發(fā)明提供未活化的prp組分用于未來通過周圍組織緩慢活化注射組合物的用途。

抗炎/抗分解代謝組分優(yōu)選包含il-1ra，即含有自體血清的il-1受體拮抗劑。此外，抗炎/抗分解代謝組分優(yōu)選包含增加水平的金屬蛋白酶組織抑制劑(timp)。

根據(jù)一個方面，提供了制備用于治療哺乳動物的受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的自體組合物的方法，其包括以下步驟：

a)制備自體組合物的包含timp和il-1ra的抗炎/抗分解代謝組分，制備抗炎/抗分解代謝組分的步驟包括以下步驟：i)從所述哺乳動物收集自體生理流體，優(yōu)選血液；ii)將所述血液遞送到管；iii)在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；iv)離心血液以將血液分離成上清液組分和細胞部分；和v)收集上清液組分；

b)制備所述自體組合物的再生組分，其包括以下步驟：i)從所述哺乳動物收集血液；ii)將血液遞送到存在約4％檸檬酸鈉的管中；iv)離心全血以分離富含血小板的血漿組分；和v)收集富含血小板的血漿組分；和

c)將抗炎/抗分解代謝組分的上清液組分與富含血小板的血漿組分混合，以提供自體組合物。

為了本公開的目的，術語檸檬酸鈉和檸檬酸可以互換使用。

根據(jù)另一方面，提供了產(chǎn)生用于治療哺乳動物的受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的自體組合物的方法，其包括以下步驟：

a)制備自體組合物的包含timp和il-1ra的抗炎/抗分解代謝組分，制備抗炎/抗分解代謝組分的步驟包括以下步驟：i)從哺乳動物收集血液；ii)將所述血液遞送到包括檸檬酸鈉的管中；iii)在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；iv)離心血液以將血液分離成上清液組分和細胞部分；和v)收集上清液組分；

b)制備所述自體組合物的再生組分，其包括以下步驟：i)從所述哺乳動物收集血液；ii)將血液遞送到存在約4％檸檬酸鈉的管中；iv)離心全血以分離富含血小板的血漿組分；和v)收集富含血小板的血漿組分；以及

c)將抗炎/抗分解代謝組分的上清液組分與富含血小板的血漿組分混合以提供自體組合物。

根據(jù)另一方面，提供了制備用于治療哺乳動物的受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的自體組合物的方法，其包括以下步驟：

i)從哺乳動物收集血液；ii)向管中加入檸檬酸鈉；iii)將所述血液遞送到所述管中；iv)在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；v)離心所述血液以將所述血液分離成上清液組分和細胞部分；和vi)收集上清液組分。

根據(jù)另一方面，提供了通過本公開的方法產(chǎn)生的用于治療哺乳動物中受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的自體組合物。

根據(jù)另一方面，提供了用于在哺乳動物中治療受損的和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的自體組合物，所述組合物包含抗炎/抗分解代謝組分，優(yōu)選包括檸檬酸鈉，所述抗炎/抗分解代謝組分包含timp和il-1ra。所述組合物還包含包含富含血小板血漿的再生組分。

根據(jù)另一方面，提供了用于在哺乳動物中治療受損的和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的自體組合物，所述組合物包含抗炎/抗分解代謝組分，所述抗炎/抗分解代謝組分包含從哺乳動物的自體血液獲得的上清液組分，所述抗炎/抗分解代謝組分包括il-1ra和timp，所述組合物還包含包含從所述哺乳動物獲得的富含血小板的血漿的再生組分。所述抗炎/抗分解代謝組分優(yōu)選包括檸檬酸鈉。最優(yōu)選地，所述檸檬酸鈉是4％的檸檬酸鈉溶液。

根據(jù)另一方面，提供了本發(fā)明的自體組合物用于在哺乳動物中治療受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的用途。

根據(jù)另一方面，提供了在哺乳動物中治療受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的的方法，其包括以下步驟：

從哺乳動物收集血液；

將血液遞送至管中；

在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；

離心所述血液以將所述血液分離成上清液組分和細胞部分；和

收集上清液組分；和

制備所述自體組合物的再生組分，其包括以下步驟：

從哺乳動物收集血液；

將血液遞送至存在約4％檸檬酸的管中；

離心所述血液以從全血中分離富含血小板的血漿組分；

收集富含血小板的血漿組分；和

將上清液組分與富含血小板的血漿組分混合以提供自體組合物；和

向所述哺乳動物施用所述自體組合物。

根據(jù)另一方面，提供了治療哺乳動物的受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的方法，其包括以下步驟：

從哺乳動物收集血液；

向管中加入檸檬酸鈉；

將血液遞送到所述管；

在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；

離心所述血液以將所述血液分離成上清液組分和細胞部分；

收集上清液組分；

制備所述自體組合物的再生組分，其包括以下步驟：

從哺乳動物收集血液；

將血液遞送到存在檸檬酸的管中；

離心所述血液以從全血中分離富含血小板的血漿組分；

收集富含血小板的血漿組分；

將上清液組分與富含血小板的血漿組分混合以提供自體組合物；和

向所述哺乳動物施用所述自體組合物。

根據(jù)另一方面，提供了治療哺乳動物的受損和/或受傷的結(jié)締組織，慢性肌腱變性，慢性肌肉撕裂和/或慢性退行性關節(jié)病況和皮膚炎癥性病癥的方法，其包括以下步驟：

從哺乳動物收集血液；

將血液遞送至存在約4％檸檬酸鈉的管中；

在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；

離心所述血液以將所述血液分離成上清液組分和細胞部分；

收集上清液組分；和

向所述哺乳動物施用所述上清液組分。

本文所述的組合物和方法適于施用于人。它們也適用于廣泛的獸醫(yī)應用，包括治療馬，狗和駱駝。

本公開提供了用于治療人類的退行性關節(jié)疾病和用于獸醫(yī)應用包括馬，狗和駱駝的替代產(chǎn)品，其相對安全有效，穩(wěn)定，再生和成本有效。

附圖說明

圖1是以pg/ml的il-1ra濃度相對于時間的圖，其顯示在不同時間點，不同孵育條件(包括靜止和搖動)的人血清樣品中il-1ra拮抗劑蛋白水平的比較。

圖2是以pg/ml的il-1ra濃度相對于時間的圖，其顯示在空氣，ca⁺⁺(在磷酸鹽緩沖鹽水pbs中)和不同濃度血清存在下、在不同時間點的人血清樣品中il-1ra拮抗劑蛋白水平的比較。

圖3a和3b是患者在治療前(3a)和正常后處理條件(3b)下的右側(cè)椎旁區(qū)域的多普勒超聲圖像。

圖4a和4b是多普勒超聲圖像，其顯示以過度充血(a，治療前狀態(tài))為特征的慢性阿基里斯肌腱變性，其作為自體組合物治療(b，治療后成像)的結(jié)果而被解決。

圖5是顯示在孵育24小時之前和之后timp1，timp2和timp4的濃度水平的平均值的圖。

圖6是顯示在8名患者中在注射之前和之后根據(jù)視覺模擬量表(“vas”)量表的膝關節(jié)疼痛的平均基線的圖。

圖7是顯示8名患者中根據(jù)膝蓋疼痛，僵硬和日?；顒幽芰Φ钠骄降膚omac指數(shù)的點值的圖。

圖8顯示了提供第一次，第二次和第三次注射后以及兩個月和三個月隨訪之后的平均結(jié)果的分類的圖形形式的結(jié)果。

圖9是顯示在24小時孵育之前和之后人血清樣品中pgdf的平均濃度水平之間的比較的圖。

圖10是顯示在37℃孵育24h之前(基線水平)和之后人血清樣品中mmp2，mmp3，mmp7，mmp9和mmp13蛋白水平的比較的圖。

圖11是顯示在檸檬酸鈉存在下在37℃孵育24小時之前(基線水平)和之后人血清樣品中mmp2，mmp3，mmp7，mmp9和mmp13蛋白水平的比較的圖。

圖12是顯示來自圖11的mmp9數(shù)據(jù)的圖。

圖13是顯示在37℃下孵育24小時之前(基線水平)和之后的人血清樣品中，活化的prp中和最終組合物中的il-1β水平的比較的圖。

圖14是顯示在37℃下孵育24小時之前(基線水平)和之后的人血清樣品中，活化的prp中和最終組合物中的tnf-α水平的比較的圖。

圖15是顯示在37℃下孵育24小時之前(基線水平)和之后的人血清樣品中，活化的prp中和最終組合物中的timp2水平的比較的圖。

圖16是顯示在37℃下孵育24小時之前(基線水平)和之后的人血清樣品中，活化的prp中和最終產(chǎn)物中的il-1ra水平的比較的圖。

圖17是顯示在37℃下孵育24小時之前(基線水平)和之后的人血清樣品中，活化的prp中和最終組合物中的pdgf水平的比較的圖。

圖18a是顯示在17名測試患者中根據(jù)平均疼痛水平的womac指數(shù)的點值的圖。提供了ca-和ca+組的基線和注射后1個月的值。

圖18b是顯示在17名測試患者中根據(jù)平均僵硬水平的womac指數(shù)的點值的圖。提供了ca-和ca+組的基線和注射后1個月的值。

圖18c是顯示在17名測試患者中根據(jù)日?；顒幽芰Φ钠骄降膚omac指數(shù)的點值的圖。提供了ca-和ca+組的基線和注射后1個月的值。

圖18d是顯示在17名測試患者中視覺模擬疼痛量表(vas)的統(tǒng)計分析的圖。提供了ca-和ca+組的基線和注射后1個月的值。

圖19a是在用本公開的方法治療之前患有銀屑病的患者的手臂上的皮膚的照片。

圖19b是在用本公開的方法治療后三個月患有銀屑病的患者手臂上的皮膚的照片。

具體實施方式

本公開涉及一種組合物，其包含自體抗炎/抗分解代謝組分和優(yōu)選地自體富含血小板的血漿組分，其具有由具有協(xié)同抗炎/抗分解代謝、增殖、組織重塑和再生效應的生物活性蛋白富集的血清。

這樣的組合物通常包括以下治療活性蛋白：il-1ra⁶，il-4⁷，il-10^8,9，il-13¹⁰，pdgf¹¹，tgf-β^10,11和vegf^12,13,14,16。

il-1ra是由單核細胞，脂肪細胞和上皮細胞分泌的。該蛋白質(zhì)的治療有效濃度通過在約37℃下孵育人單核細胞約24h來獲得¹⁷。il-4,10,13，pdgf，tgf-β是血小板和顆粒的內(nèi)容，并且在prp組分中遞送。il-4,10,13來自白細胞。pdgf由血小板產(chǎn)生，tgf-b由血小板和一些t細胞釋放。利用所述蛋白質(zhì)的協(xié)同效應導致產(chǎn)生有效的生物活性自體產(chǎn)物。因此，作為再生生物因子和抗炎細胞因子和生長因子來源的新鮮制備的prp和包含培養(yǎng)的自體血清作為il-1抑制劑來源的抗炎組分的組合提供了用于治療退行性病況如骨關節(jié)炎，慢性肌腱變性和慢性肌肉撕裂以及皮膚炎癥性病癥的強大的和成本有效的自體治療劑。

如本文所用，“治療”包括姑息治療，其中受試者的疼痛和/或炎癥減輕。

令人驚奇的是，產(chǎn)生本文的抗炎/抗分解代謝組分的方法除了產(chǎn)生il-1ra之外，還導致產(chǎn)生增加水平的金屬蛋白酶組織抑制劑(timp)?；|(zhì)金屬蛋白酶mmp在活性狀態(tài)下被認為可引起關節(jié)破壞。timp中和活性mmp，從而提供與il-1ra協(xié)同的額外的抗分解代謝益處。

還令人驚奇的是，在制備本文的抗炎/抗分解代謝組分時，在約37℃至約39℃的溫度下孵育患者血液約24小時之前加入檸檬酸鈉可防止對關節(jié)具有分解代謝作用的病理學分子試劑諸如mmp9，il-1β和tnf-α的水平增加，但是不會導致抗分解代謝和再生劑如timp，il-1ra和pdgf的水平顯著降低。

所述的用于產(chǎn)生治療骨關節(jié)炎，慢性肌腱變性和慢性肌肉撕裂以及皮膚炎癥性病癥的自體組合物的方法優(yōu)選包括通過無菌技術收集哺乳動物的自體生理流體，優(yōu)選血液的步驟。優(yōu)選地，哺乳動物是人。然而，本發(fā)明的組合物和方法也適用于廣泛的獸醫(yī)應用，例如用于治療馬，狗和駱駝。

靜脈穿刺部位和收集管的表面可以用2％的碘酊溶液清潔。在開始對該部位進行任何清潔之前，可以詢問患者對碘的任何過敏。管蓋用70％的酒精溶液清潔，以避免血液收集前可能的污染。

組合物優(yōu)選通過在優(yōu)選約37℃至約39℃的溫度下培養(yǎng)自體生理流體，優(yōu)選血液來制備。然而，本領域技術人員將理解，血液可以在該范圍之外的溫度下孵育，例如約37℃至約40℃，并具有可接受的結(jié)果。最優(yōu)選地，溫度在37℃和38℃之間。將血液優(yōu)選孵育約24小時以進行il-1ra細胞外富集并優(yōu)選用于產(chǎn)生timp。優(yōu)選地，將檸檬酸鈉，優(yōu)選以4％的濃度加入無菌玻璃管或聚苯乙烯管中，在孵育前將收集血液于其中。在特別優(yōu)選的實施方案中，孵育可以在無添加劑的無菌玻璃管(coviden)或聚苯乙烯(bd)真空管(vacutainertube)中進行。在一個實施方案中進一步提供了在搖床平臺(24rpm)上或在靜態(tài)條件下孵育自體生理流體，優(yōu)選血液。優(yōu)選地，在靜態(tài)條件下進行孵育，如圖1所示。

優(yōu)選地，血液的孵育在0.64-0.72mmca⁺⁺的存在下進行，以促進il-1ra產(chǎn)生¹⁵。在特別優(yōu)選的實施方案中，以下是可能且有利的：通過在孵育前直接使用無菌注射器和針頭將含有0.64-0.72mmca⁺⁺的無菌氯化鈣溶液加入到具有血液的管中，以用所述溶液按1:9的比例稀釋孵育的血液(1cc氯化鈣溶液對9cc全血)(圖2)。可以將等量的無菌空氣加入到含有血液的無菌管中，以將血液暴露于大氣空氣中，用于增加il-1ra的產(chǎn)生(圖2)。在特別優(yōu)選的實施方案中，在孵育前，直接使用無菌注射器和針頭使空氣通過0.22μmmillexgp過濾器到達具有血液的管中。

優(yōu)選地，在孵育之前，以9.5份全血(9.5cc)：0.5(0.5cc)優(yōu)選4％檸檬酸鈉的比例，將檸檬酸鈉加入到血液中。4％檸檬酸鹽優(yōu)選為4％檸檬酸鈉溶液。百分之四的檸檬酸鈉溶液可容易地商購獲得。

然后使孵育的血液進行離心以從細胞部分分離上清液組分。離心在約4000-10000rpm下進行約10-20分鐘。優(yōu)選地，以4000rpm進行離心10分鐘。

下一步涉及吸出上清液并將其分成等分試樣，以便將來使用無菌技術進行處理。該程序在無菌環(huán)境(具有hepa過濾器的層流罩)中進行。通過無菌注射器和針頭小心地抽取含有生物活性劑的3cc上清液層。通過在約-20℃冷凍等分試樣并在約-70℃下儲存長達6個月或長達一年，可實現(xiàn)含有il-1ra的產(chǎn)物的長期儲存。

然后，包含prp的再生組分的制備包括將血液抽入真空管。這優(yōu)選在4％檸檬酸存在下進行。優(yōu)選地，在9.5份全血(9.5cc)：0.5(0.5cc)的4％檸檬酸比率下。然后將血液在約7500rpm下進行離心優(yōu)選約30秒以分離prp部分。在優(yōu)選的實施方案中，將離心參數(shù)用于prp制備，作為用于骨關節(jié)炎和慢性肌腱變性治療和皮膚病癥的最終產(chǎn)品的一部分。在無菌條件下通過無菌注射器和針頭吸取prp部分。在用于治療慢性撕裂的特別優(yōu)選的實施方案中，將白細胞血沉棕黃層部分加入到prp中作為另外的vegf源，以促進受影響部位中的新血管發(fā)育。在如上所述的全血離心之后通過無菌注射器和針頭手動收集或使用市售的harvestsmartprep系統(tǒng)收集血沉棕黃層和血漿。包含prp的再生組分不進行冷凍或其它儲存。在將再生組分與抗炎/抗分解代謝組分混合后，迅速將自體組合物施用給患者。

將含有包含il-1ra和優(yōu)選地timp的抗炎/抗分解代謝組分的血液與包含prp部分的再生組分優(yōu)選地以1:1的比例接觸，以獲得最終產(chǎn)物。

注射該產(chǎn)品用于將來由肌腱衍生的膠原蛋白¹⁸和組織來源的凝血酶的緩慢激活。

借助于以下說明性實施例進一步描述本發(fā)明。

實施例

實施例1-比較不同培養(yǎng)條件下細胞外il-1ra的產(chǎn)生

如圖1所示，比較不同時間點暴露于孵育條件(包括靜止與搖動孵育)的人血清樣品中il-1ra拮抗劑蛋白的水平。il-1ra由活化的血液單核細胞，巨噬細胞分泌。這種活化通過使用攪拌過程使血細胞與收集管的內(nèi)表面之間接觸來實現(xiàn)。通過增加暴露于細胞組分的內(nèi)表面面積，可以使細胞活化過程和生物活性分子分泌最大化。

通過靜脈穿刺在無菌條件下將來自10個健康的男性和女性志愿者供體(21至60歲)的外周血收集至無菌的10ml玻璃管中。根據(jù)沒有孵育步驟的標準程序(對照樣品)操作一個管。將樣品在37℃下在搖動平臺(24rpm)上攪拌和不攪拌下孵育3.5小時，7小時和24小時。將孵育的樣品以4,000rpm離心10分鐘，然后過濾，并根據(jù)制造方案(可從互聯(lián)網(wǎng)上bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdf獲得)將il-1ra的最終濃度與未處理的對照樣品的那些(0h)進行比較。單因素方差分析顯示僅在孵育24小時后血清中il-1ra濃度顯著增加；在3.5h和7h孵育的樣品中沒有觀察到顯著的il-1ra濃度增加。另外，在靜止和搖動孵育條件之間沒有觀察到顯著差異。使用magpixluminex^tm技術評價il-1ra濃度。

圖2顯示暴露于以下孵育條件下的人血清樣品中il-1ra拮抗劑蛋白水平的比較：在空氣，ca⁺⁺(磷酸鹽緩沖鹽水，pbs)和不同濃度的血清存在下孵育24小時。單向anova檢驗顯示，除了在50％稀釋的血液中培養(yǎng)以外，在所有所述條件下孵育24小時后，血清中il-1ra產(chǎn)生顯著增加。

實施例2-診斷患有骨關節(jié)炎和慢性肌腱變性并用自體組合物治療的患者的案例報告

方法和材料：

對于本文的每個患者，包含il-1ra和timp的自體組合物的抗炎/抗分解代謝組分通過以下步驟制備：從患者收集血液；將血液輸送至管中；在約37℃至約39℃的溫度下孵育所述血液約24小時；離心所述血液以將所述血液分離成上清液組分和細胞部分；以及收集抗炎組分的上清液組分。同樣，自體組合物的再生組分通過以下步驟制備：從患者收集血液；將血液輸送到存在約4％檸檬酸的管中；離心所述血液以從全血成分中分離富含血小板的血漿成分；收集富含血小板的血漿成分；以及將抗炎/抗分解代謝組分的上清液組分與富血小板血漿組分混合以提供自體組合物。然后向患者施用自體組合物。

案例1：s，61歲

診斷：患者報告了雙側(cè)起病隱匿的膝蓋疼痛，其開始于幾年前，并且在前6個月內(nèi)加強。膝蓋的mri顯示膝蓋的嚴重oa：內(nèi)側(cè)間室的嚴重的軟骨病，涉及右膝關節(jié)的右側(cè)和股骨髁的全層軟骨損失的增加，以及涉及內(nèi)側(cè)股骨滑車的后側(cè)的全層軟骨損失與右膝的潛在水腫。一年前，患者服用了可的松注射液，其提供了1個月的緩解。體檢：膝關節(jié)活動范圍(rom)是完全的，所有韌帶均正常，少量雙側(cè)積液神經(jīng)血管檢查(smallbilateraleffusionneurovascularexam)正常。vas為60。

治療：將患者的局部自體組合物雙側(cè)注射到患者的膝蓋三次，相隔一周。

結(jié)果：在首次雙側(cè)局部自體組合物注射后，患者報告顯著改善，vas為3。在第三次注射時，rom是完全的，所有韌帶均正常，無關節(jié)線疼痛，無積液。患者報告強烈疼痛減輕，vas為10，患者返回身體活動。三個月后，隨訪檢查顯示患者無疼痛。

案例2：e，64歲

診斷：活躍的男性在左髖部出現(xiàn)vas60。日常活動疼痛和遠距離行走的顯著的損傷。mri顯示雙側(cè)髖部輕度oa：雙側(cè)髖關節(jié)退行性變和髖臼唇退行性撕裂。物理治療在疼痛緩解方面取得的成功有限。

治療：超聲引導為患者制備的局部自體組合物注射進入左髖x2，相隔一周。

結(jié)果：在首次注射局部自體組合物后，患者報告疼痛改善了85％(患者個人評估)。第二次注射局部自體組合物后，vas為10。五個月后vas也為10。

案例3：a，70歲

診斷：患有慢性疼痛(vas為6)的女性患者左膝壓痛和腫脹。她在步行，站立和爬樓梯方面有很大困難。她去過一名物理治療師(6次訪問)，一名脊椎按摩師(6次訪問)幫助她的膝蓋疼痛，沒有結(jié)果。mri顯示左膝重度oa，由于內(nèi)側(cè)股骨髁和內(nèi)側(cè)脛骨平臺的承重部分全層軟骨損失導致內(nèi)側(cè)間室狹窄。

治療：制備局部自體組合物并注射入左膝三次，相隔一周。

結(jié)果：用局部自體組合物治療后5個月隨訪時：患者報告癥狀改善約80％，無腫脹；vas是20。

案例4：j，26歲，職業(yè)游泳者。

診斷：椎旁肌肉損傷后狀態(tài)，慢性椎旁肌腱炎?；颊弑г棺蹬约∪馓弁?。長期的物理治療沒有顯示結(jié)果。后背rom是完全的，神經(jīng)血管檢查正常。在彩色多普勒圖3a)中鑒定出右側(cè)椎旁充血的區(qū)域，vas為80。

治療：使用超聲技術標記發(fā)炎區(qū)域，肌內(nèi)注射自體組合物×4，相隔一周。

圖3a和3b是多普勒超聲圖像，其在治療前(圖3a)和正常的治療后狀況下(圖3b)顯示右側(cè)椎旁區(qū)域的充血。

結(jié)果：多普勒顯示無炎癥(圖3b)，治療后4個月vas是10。

案例5：s，18歲

診斷：右側(cè)阿基里斯肌腱撕裂后的狀態(tài)?；颊弑г拱⒒锼辜‰觳迦胩弁矗郝园⒒锼辜‰煅缀碗烨恃?。多普勒顯示在該區(qū)域嚴重的腱內(nèi)充血(圖4a)。vas是60。

治療：長期的物理治療和脊椎按摩治療沒有顯示任何積極的結(jié)果。制備自體組合物，并用超聲波引導將其注射到肌腱中三次，相隔一周。

圖4a和4b是顯示以過度充血為特征的慢性阿基里斯肌腱變性(圖4a，治療前狀態(tài))的多普勒超聲圖像，其由自體組合物治療解決(圖4b，治療后成像)。

結(jié)果：多普勒成像時沒有顯示充血(圖4b)，注射后5個月隨訪評估vas為0。

實施例3-體外研究

通過靜脈穿刺在無菌條件下將來自健康男性和女性志愿者供體(21至60歲)的外周血收集到10ml無菌玻璃管。根據(jù)標準程序操作一個管，不具有孵育步驟(對照樣品)。將樣品暴露于不同的孵育條件下，將來自每個樣品的500μl血清用于測定。在4℃下將樣品以10,000×g離心10分鐘，然后分析以除去細胞碎片和聚集體。根據(jù)制造商的說明書(可在以下網(wǎng)址獲得：bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10014905.pdf)在平底微量滴定板中進行使用magplex^tm珠粒的bioplexpro^tm人類細胞因子27-plex平板，人類timp磁性luminex^tm性能測定4-plex平板^tm(bio-rad實驗室，加拿大，ltd)分析。

簡言之，樣品在樣品稀釋液中以1:4稀釋。將標準品重構(gòu)并以四倍稀釋系列稀釋。制備抗體偶聯(lián)捕獲珠粒并接種。在加入每個孔之前將珠粒溶液渦旋。洗滌板，手動進行所有洗滌步驟。首先，將洗滌溶液加入板中，隨后用密封帶覆蓋。將板在振蕩器上以1100rpm孵育30s，然后在300rpm下孵育1.5分鐘。將板從振蕩器中取出，并在磁體上孵育1分鐘，然后棄去上清液。洗滌后，稀釋的樣品和標準品一式二份地加入孔中的珠粒。將板在振蕩器上孵育30分鐘，孵育和洗滌后，向每個孔中加入檢測抗體30分鐘。將板再次在振蕩器上孵育，并且在另一洗滌步驟之后，向孔中加入鏈霉親和素溶液10分鐘。在最后的孵育步驟之后，將珠粒重新懸浮在測定緩沖液中，并使用xponenttm軟件(luminexcorporation，austin，tx，usa)用magpixtm(luminexcorporation)讀取該板。使用xponenttm軟件分析結(jié)果。通過構(gòu)建每個分析物的標準曲線來確定樣品的絕對濃度。

統(tǒng)計分析：使用graphpadprism^tm版本5.01進行所有統(tǒng)計檢驗。使用方差分析(anova)與bonferroni驗后檢驗進行統(tǒng)計學比較，以進行組間比較。分析實驗數(shù)≥3，數(shù)據(jù)顯示為平均值±s.e.m.，p<0.05。

圖5是顯示在37℃孵育24小時之前(基線水平)和之后人血清樣品中timp1，timp2和timp4(mmps拮抗劑)蛋白水平的比較的圖。雙因素anova測試顯示孵育后24小時timp1和timp2水平顯著升高。

圖9是顯示未處理的人血清樣品中pgdf的平均濃度水平與24小時孵育樣品中pgdf的平均水平之間的比較的圖。測試數(shù)據(jù)分析顯示處理樣品中pgdf蛋白濃度的統(tǒng)計學顯著增加。使用magpixluminex^tm技術評估pdgf濃度。

實施例4–經(jīng)膝骨關節(jié)炎關節(jié)疼痛治療的患者的結(jié)果

8例患者接受膝骨關節(jié)炎關節(jié)疼痛癥狀治療。根據(jù)實施例2中概述的程序，給予患者四次注射局部自體組合物，間隔一周。

患者在接受注射后用視覺模擬疼痛量表(vas)和西部安大略和麥克馬斯特大學關節(jié)炎指數(shù)(womac)問卷調(diào)查進行評估，以評估髖關節(jié)和/或膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者的疼痛，僵硬度和身體功能。womac問卷數(shù)據(jù)的分析顯示，在長時間(多達3個月)內(nèi)，患者的日常活動有統(tǒng)計學意義的顯著改善，但是在疼痛和僵硬度參數(shù)方面沒有統(tǒng)計學意義的顯著改善但具有正面動態(tài)的改善，如圖7所示。視覺模擬疼痛量表的統(tǒng)計學分析顯示在第三次注射后疼痛顯著減輕，如圖6所示。

圖6是一個條形圖，其顯示根據(jù)8個患者的vas量表的平均基線和注射后關節(jié)疼痛的比較。結(jié)果顯示疼痛平均減少統(tǒng)計學顯著，效果穩(wěn)定多達3個月。

圖7是根據(jù)womac指數(shù)對8名患者的疼痛，僵硬度和日?；顒幽芰ζ骄降狞c值的圖。提供了基線、注射后(注射后兩個月和三個月)的數(shù)值。

圖8顯示了八名患者的曲線圖形式的結(jié)果，其提供了在第一次，第二次，第三次注射后，在第四次注射后兩個月和三個月的分類平均結(jié)果。

在圖6-8中顯示的結(jié)果是8名測試患者的平均結(jié)果。

實施例5-在孵育之前加入檸檬酸鈉(ca)在制備抗炎/抗分解代謝組分中的作用

測試15名患者，以確定在血液孵育約24小時之前在患者血液中添加檸檬酸鈉(ca)對抗炎組分中和最終產(chǎn)物中(其是抗炎組分和再生或prp組分的組合)的mmp(包括mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf)的水平的影響。

術語“血液”和“血清”在下面的討論中可以互換使用。

方法和材料：

對于此處的每個患者，如下制備抗炎/抗分解代謝組分。從患者收集約9.5cc的血液。然后將約9.5cc血液遞送到含有約0.5cc鹽水溶液的第一管中。鹽水溶液含有約0.9％的nacl。另外從患者收集約9.5cc血液，并遞送至含有約0.5cc4％檸檬酸鈉的第二管。收集血液后，將第一管和第二管在約37℃至約39℃的溫度下孵育約24小時。然后將第一管和第二管離心以將每個管中的血液分離成上清液組分和細胞部分。分別收集第一管和第二管的上清液組分，以提供來自含有鹽水的第一管的第一抗炎/抗分解代謝組分和來自含有檸檬酸鈉的第二管的第二抗炎/抗分解代謝組分。對于每個患者，通過以下方式制備再生組分：從患者收集血液；將血液遞送到存在約4％檸檬酸的管中；并離心血液以將富含血小板的血漿組分與全血組分分離。對于每個患者，收集富含血小板的血漿組分并分別與第一管和第二管的上清液組分混合以提供來自含有鹽水的第一管的第一最終產(chǎn)物和來自含有檸檬酸鈉的第二管的第二最終產(chǎn)物。

對于每個患者，在抽血后立即測量mmp2，mmp3，mmp7，mmp9，mmp13，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的基線水平。對于15名患者中的每一名患者，在孵育后約24小時，在含有鹽水和患者血液的第一管中測量了mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。類似地，對于15名患者中的每一個，在孵育后約24小時，在含有檸檬酸鈉和患者血液的第二管中測量了mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。對于每個患者，將富含血小板的血漿組分與凝血酶混合，然后測量mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。對于每個患者，在第一和第二最終產(chǎn)物的每一個中測量了mmp9，il-1β，tnf-α，timp2，il-1ra和pdgf的水平。在圖10-17中以圖形顯示的測量結(jié)果表示所測試的十五名患者的平均值。

在測試的十五名患者中，在孵育0小時時天然血清(血液)中的il-1ra的平均水平測量為9±4pg/ml。在由抗炎/抗分解代謝組分與再生或prp組分組合產(chǎn)生的最終產(chǎn)物中，天然血清(血液)中il-1ra的平均測量值為920±80pg/ml。無論是向抗炎/抗分解代謝組分中加入檸檬酸鈉，還是沒有添加檸檬酸鈉，都是這種情況。

在測試的十五名患者中，在孵育0小時時天然血清(血液)中pdgf的平均水平測量為1100±300pg/ml。在由抗炎/抗分解代謝組分與再生或prp組分組合產(chǎn)生的最終產(chǎn)物中，天然血清(血液)中pdgf的平均測量值為1920±380pg/ml。無論是向抗炎/抗分解代謝組分中加入檸檬酸鈉，還是沒有添加檸檬酸鈉，都是這種情況。

在測試的十五名患者中，在孵育0小時時天然血清(血液)中的timp2的平均水平測量為1800±150pg/ml。在由抗炎/抗分解代謝組分與再生或prp組分組合產(chǎn)生的最終產(chǎn)品中，天然血清(血液)中timp2的平均測量值為5500±360pg/ml。無論是向抗炎/抗分解代謝組分中加入檸檬酸鈉，還是沒有添加檸檬酸鈉，都是這種情況。

在這些圖中，血清0h是收集后立即測量的患者血液中分析物水平的基線測量。血清24h+0.5cc鹽水是在孵育24小時后與鹽溶液混合的患者血液中分析物的水平。血清24h+0.5ccca是在孵育24小時后與4％檸檬酸鈉溶液混合的患者血液中分析物的水平。prp+凝血酶是與作為凝血劑的凝血酶組合的prp組分中的分析物的水平。該測量顯示prp組分中分析物的基線水平。prp+血清+凝血酶或prp+血清24h+凝血酶是由抗炎/抗分解代謝組分與再生或prp組分組合產(chǎn)生的最終產(chǎn)物中分析物的水平，其中抗炎/抗分解代謝組分僅用鹽水制成，不含檸檬酸鈉。prp+血清+ca+凝血酶或prp+血清24h+ca+凝血酶是由抗炎/抗分解代謝組分與再生或prp組分組合產(chǎn)生的最終產(chǎn)物中分析物的水平，其中抗炎/抗分解代謝組分用檸檬酸鈉制備。

在制備如實施例2的方法中所述的抗炎/抗分解代謝組分時，觀察到該組分的產(chǎn)生導致孵育步驟后il-1ra(抗炎劑)，timp(抗分解代謝劑)和pdgf(再生劑)的水平增加。產(chǎn)生自體生物活性組合物的方法是基于活化血液單核細胞分泌陽性生物活性分子的能力。然而，現(xiàn)在已經(jīng)確定，相同的免疫細胞在其活化時不選擇性地產(chǎn)生病理分子試劑及其抑制劑。因此，自體生物活性組合物還含有升高濃度的分解代謝分子如mmp9。這通過在鹽水存在24小時下將患者血液在約37℃至約39℃下孵育約24小時后制備的抗分解代謝組分中的四種mmp類型的定量測量來確認，如圖10所示。盡管mmp2,3,7,13的濃度在孵育后沒有發(fā)現(xiàn)顯著改變，然而對于骨關節(jié)炎的發(fā)病機理最為關鍵mmp9的濃度顯著增加，如圖10所示。單因素anova檢驗顯示在孵育后24小時mmp9水平有統(tǒng)計學意義的顯著升高。

自體生物活性組合物中增加的mmp9濃度的存在可能導致在患者治療過程中的不良反應表現(xiàn)。因此，期望選擇性地消除該負面成分?？鼓齽幟仕徕c的存在顯著下調(diào)人血白細胞的mmp9釋放¹⁹。在檸檬酸鈉(ca)以9.5cc血液：0.5cc檸檬酸鈉的比例存在下的人血液在約37℃至約39℃的溫度下孵育24小時，發(fā)現(xiàn)強烈的動態(tài)變化，特別表現(xiàn)在mmp9分泌中，如圖11和12中所示。特別地，在制備抗炎/抗分解代謝組分時添加檸檬酸鈉顯著降低了由抗炎/抗分解代謝組分與再生組分組合的最終產(chǎn)物(凝血酶活化的prp+24h血清)中的mmp9濃度。當在制備抗炎/抗分解代謝組分時加入檸檬酸鈉，與基線水平(0h)相比，24h孵育后的mmp9水平?jīng)]有變化。進行具有凝血酶的prp組分中的mmp9水平的測量，以顯示prp組分中的mmp9的基線水平。該測定顯示，在生成prp組分時不產(chǎn)生顯著量的mmp9。

考慮到血液孵育過程導致促分解代謝分子mmp9的升高，在孵育的血清中和在由抗炎/抗分解代謝組分和再生組分的組合的最終產(chǎn)物(凝血酶激活的prp+孵育24小時的血清)中測試了其它病理分子試劑(即il-1β和tnf-α)的濃度。測試了檸檬酸鈉對在孵育期間由活化白細胞釋放的這些分子的影響。發(fā)現(xiàn)il-1β和tnf-α濃度在孵育時顯著增加。如圖13和14所示，通過在制備抗炎/抗分解代謝組分時添加檸檬酸鈉可以有效阻止該影響。

參考圖13，雙因素anova檢驗顯示，與先前的產(chǎn)品制備方法(prp+血清24h+鹽水)相比，在檸檬酸鈉存在下在約37℃至約39℃孵育24小時的血清中以及在最終產(chǎn)物(prp+血清24h+檸檬酸鈉(ca)+凝血酶)中的il-1β濃度統(tǒng)計學顯著地降低。如通篇所提及的，最終產(chǎn)物(prp+血清24h+ca+凝血酶)是抗炎/抗分解代謝組分和再生組分的組合。

參考圖14，雙因素anova檢驗顯示，與以前的產(chǎn)品制備方法(prp+血清24h+鹽水)相比，在檸檬酸鈉存在下在約37℃至約39℃孵育24小時的血清中以及在最終產(chǎn)物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的tnf-α濃度統(tǒng)計學顯著地降低。

為了評估在生物活性組合物制備過程中將檸檬酸鈉添加到抗炎/抗分解代謝組分是否影響病理分子抑制劑，在類似的條件下測試timp，ii-1ra和pdgf濃度。沒有觀察到檸檬酸鈉對timp，il-1ra和pdgf產(chǎn)生的負面影響，如圖15,16和17所示。

參考圖15，在37℃孵育24小時之前(基線水平)和之后進行人血清樣品中，活化的prp和最終產(chǎn)物中timp2水平的比較。雙因素anova檢驗顯示，與之前的產(chǎn)品制備方法(prp+血清24h+鹽水)相比，檸檬酸鈉不降低在檸檬酸鈉存在下的24小時孵育血清中和最終產(chǎn)物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的timp的濃度。

參考圖16，雙因素anova檢驗顯示，與之前的產(chǎn)品制備方法(prp+serum24h+鹽水)相比，檸檬酸鈉不降低在檸檬酸鈉存在下的24小時孵育血清中和最終產(chǎn)物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的il-1ra的濃度。

參考圖17，雙因素anova檢驗顯示，與先前的產(chǎn)品制備方法(prp+血清24h+鹽水)相比，檸檬酸鈉不降低24小時孵育血清中以及最終產(chǎn)物(prp+血清24h+ca+凝血酶)中的pdgf濃度。

實施例6-患有膝骨關節(jié)炎關節(jié)疼痛的患者的治療

根據(jù)本文所述的方法，對17例患者進行膝骨關節(jié)炎關節(jié)疼痛的癥狀治療，如實施例2所述。兩組患者每隔一周提供兩次注射。第一組7名患者接受包含不存在檸檬酸鈉(ca-)下制備的抗炎/抗分解代謝組分的產(chǎn)品。第二組10名患者接受包含存在檸檬酸鈉(ca+)下制備的抗炎/抗分解代謝組分的產(chǎn)品。兩種治療方法并沒有導致任何不良事件，并被發(fā)現(xiàn)是安全有效的。

患者接受西部安大略和麥克馬斯特大學關節(jié)炎指數(shù)(womac)問卷調(diào)查，用于評估髖關節(jié)和/或膝關節(jié)骨關節(jié)炎患者的疼痛，僵硬度和身體功能。womac問卷數(shù)據(jù)的一個月注射后初步分析顯示用含有檸檬酸鹽(ca+)的抗炎/抗分解代謝組分治療的患者的患者疼痛，僵硬度和日?；顒泳哂薪y(tǒng)計學顯著改善，分別如圖18a，18b，18c所示。對于用不具有檸檬酸鹽(ca-)的抗炎/抗分解代謝組分進行治療的患者組，觀察到所提及的參數(shù)的統(tǒng)計學上不顯著但正面動態(tài)的改善，分別如圖18a，18b和18c所示。視覺模擬疼痛量表(vas)的統(tǒng)計學分析顯示，兩組患者疼痛明顯減輕，如圖18d所示。

實施例7-慢性炎性皮膚疾病

在四周時間內(nèi)對患有嚴重銀屑病的59歲的女性患者進行實施例2的方法。通過將抗炎/抗分解代謝組分與富含血小板的血漿成分組合而產(chǎn)生的自體組合物在每周一次、四次分開注射自體組合物來施用給女性患者。治療涉及整個病變部位的真皮內(nèi)注射。治療后4周觀察到劇烈的視覺變化。結(jié)果在注射后三個月后穩(wěn)定，具有消除銀屑病的效果。圖19是治療前女性患者的手臂受影響區(qū)域的照片。圖19b是第四次注射后三個月的女性患者手臂的受影響區(qū)域的照片。

在制備抗炎/抗分解代謝組分時添加和不添加檸檬酸鈉的情況下，對患有慢性炎性皮膚疾病如特應性皮炎和慢性傷口的受試者進行實施例2的方法。慢性炎性皮膚疾病的嚴重程度降低。

實施例8-馬、狗和駱駝

在制備抗炎/抗分解代謝組分時添加和不添加檸檬酸鈉的情況下，對具有受損和/受傷結(jié)締組織的馬、狗和駱駝進行實施例2的方法。與受損和/受傷結(jié)締組織相關的疼痛的嚴重程度降低。

雖然已經(jīng)參照說明性實施方案描述了本發(fā)明，但是應當理解，本發(fā)明不限于這些精確實施方案。在不脫離本發(fā)明的范圍的情況下，可以對上述本發(fā)明的具體實施方案進行許多修改，變化和改編。權利要求的范圍不應受到實施例中闡述的優(yōu)選實施方案的限制，而應當給出與整個描述一致的最廣泛的解釋。

參考文獻

1.fernandesjc,martel-pelletierj,pelletierjp.theroleofcytokinesinosteoarthritispathophysiology.biorheology.2002；39(1-2):237-46.

2.fredbergu,stengaard-pedersenk.chronictendinopathytissuepathology,painmechanisms,andetiologywithaspecialfocusoninflammation.scandjmedscisports.2008feb；18(1):3-15.

3.loelli,lundbergie.canmuscleregenerationfailinchronicinflammation:aweaknessininflammatorymyopathies？jinternmed.2011mar；269(3):243-57.

4.ritae,mirza,miliem.fang,1williamj,timothyj.koh.blockinginterleukin-1βinducesahealing-associatedwoundmacrophagephenotypeandimproveshealingintype2diabetes.diabetes.2013jul；62(7):2579–2587.

5.emingsa,kriegt,davidsonjm.inflammationinwoundrepair:molecularandcellularmechanisms.jinvestdermatol.2007；127:514.

6.dinarelloca.interleukin-1,interleukin-1receptorsandinterleukin-1receptorantagonist.intrevimmunol.1998；16(5-6):457-99.

7.mosmanntr,cherwinskih,bondmw,giedlinma,coffmanrl.twotypesofmurinehelpertcellclone.i.definitionaccordingtoprofilesoflymphokineactivitiesandsecretedproteins.jimmunol.1986apr1；136(7):2348-57.

8.brandtzaegp1,osnesl,r,gb,westvikab,kierulfp.netinflammatorycapacityofhumansepticshockplasmaevaluatedbyamonocyte-basedtargetcellassay:identificationofinterleukin-10asamajorfunctionaldeactivatorofhumanmonocytes.jexpmed.1996jul1；184(1):51-60.

9.clarkecj1,halesa,hunta,foxwellbm.il-10-mediatedsuppressionoftnf-alphaproductionisindependentofitsabilitytoinhibitnfkappabactivity.eurjimmunol.1998may；28(5):1719-26.

10.dewaalmalefytr,figdorcg,huijbensr,mohan-petersons,bennettb,culpepperj,dangw,zurawskig,devriesje.effectsofil-13onphenotype,cytokineproduction,andcytotoxicfunctionofhumanmonocytes.comparisonwithil-4andmodulationbyifn-gammaoril-10.jimmunol.1993dec1；151(11):6370-81.

11.alvarezrh1,kantarjianhm,cortesje.biologyofplatelet-derivedgrowthfactoranditsinvolvementindisease.mayoclinproc.2006sep；81(9):1241-57.

12.robertsab,flanderskc,kondaiahp,thompsonnl,vanobberghen-schillinge,wakefieldl,rossip,decrom-bruggheb,heineui,spornmb:transforminggrowthfactorbeta:biochemistryandrolesinembryogenesis,tissuerepairandremodeling,andcarcinogenesis.recproghormres44:157–197,1988

13.robertsab,heineui,flanderskc,spornmb:tgf-beta:majorroleinregulationofextracellularmatrix.annnyacadsci."structure,molecularbiologyandpathologyofcollagen".580:225–232,1990.

14.gospodarowicz,d.,abraham,j.a.,andschilling,j.isolationandcharacterizationofavascularendothelialcellmitogenproducedbypituitary-derivedfolliculostellatecells.proc.natl.acad.sci.usa86,7311–7315,1989.

15.hiratah,nagakurat,tsujiim,moritaa,fujisawak,uchidaa.therelationshipofvegfandpge2expressiontoextracellularmatrixremodellingofthetenosynoviuminthecarpaltunnelsyndrome.jpathol.2004dec；204(5):605-12.

16.pengh,usasa,olshanskia,hoam,gearhartb,coopergm,huardj.vegfimproves,whereassflt1inhibits,bmp2-inducedboneformationandbonehealingthroughmodulationofangiogenesis.jboneminerres.2005nov；20(11):2017-27.

17.poutsiakadd,clarkbd,vanniere,dinarelloca.productionofinterleukin-1receptorantagonistandinterleukin-1betabyperipheralbloodmononuclearcellsisdifferentiallyregulated.blood.1991sep1；78(5):1275-81.

18.fufad,shealyb,jacobsonm,etal.activationofplatelet-richplasmausingsolubletypeicollagen.joralmaxillofacsurg2008；66:684–90

19.mannellof.serumorplasmasamples？the"cinderella"roleofbloodcollectionprocedures:preanalyticalmethodologicalissuesinfluencethereleaseandactivityofcirculatingmatrixmetalloproteinasesandtheirtissueinhibitors,hamperingdiagnostictruenessandleadingtomisinterpretation.arteriosclerthrombvascbiol.2008apr；28(4):611-4.

這些參考文獻的內(nèi)容通過引用并入本文。