相關申請

本申請要求于2014年9月8日提交的美國臨時申請?zhí)?2/047,467以及于2014年9月25日提交的美國臨時申請?zhí)?2/055,234的優(yōu)先權和權益，其各自的內(nèi)容通過引用以其整體予以結(jié)合。

發(fā)明領域

本發(fā)明總體上涉及治療癌癥。

政府利益

本發(fā)明是在由國家癌癥研究所授予的r01ca143083的政府支持下進行的。政府對本發(fā)明具有一定的權利。

發(fā)明背景

burnet和thomas于1957年正式提出癌癥監(jiān)視假說。它假設a)由于體細胞突變或病毒產(chǎn)物，存在對免疫系統(tǒng)“外來”的腫瘤抗原；b)通過限制腫瘤生長的免疫系統(tǒng)的癌癥監(jiān)視；和c)癌癥免疫療法的想法。這些假設的推論(即使當時沒有對該論題進行研究)是進行性腫瘤已被免疫編輯(immunoedited)并已經(jīng)使免疫逃避的機制逐漸形成。

腫瘤相關抗原的存在，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗腫瘤免疫應答的能力和似非而是地甚至我們對免疫逃避機制的了解，都表明腫瘤免疫療法是可行的策略。免疫療法的前景是腫瘤限制性的細胞毒性和免疫記憶的誘導；使得可以預見對于癌癥的治愈，而不僅僅是延長患者壽命以及常規(guī)治療的衰弱效應。

存在鑒定腫瘤免疫療法的需要。

發(fā)明簡述

在各個方面，本發(fā)明包括通過向接受主動免疫療法的受試者給予pparγ激動劑來增加受試者中癌癥治療方案的功效的方法。

在另一方面，本發(fā)明包括通過向受試者給予pparγ激動劑和主動免疫療法來治療受試者中的癌癥的方法。

在另一方面，本發(fā)明包括通過向有需要的受試者給予pparγ激動劑來減少所述受試者中t調(diào)節(jié)細胞(treg)數(shù)目的方法。所述受試者患有癌癥。所述受試者正接受主動免疫療法治療、免疫檢查點抑制劑或兩者。

主動免疫療法是非特異性主動免疫療法或特異性主動免疫療法。非特異性主動免疫療法是細胞因子。細胞因子是gm-csf、mcsf或il-4。gm-csf經(jīng)由gm-csf分泌細胞給予或連接到聚合物支架。特異性主動免疫療法是繼承性t細胞療法或腫瘤相關抗原疫苗。t細胞療法是嵌合抗原受體t細胞(cart)。

在一些方面，所述受試者被進一步給予免疫檢查點抑制劑。免疫檢查點抑制劑是對ctla-4、pd-1、pd-l1、pd-l2或殺傷免疫球蛋白受體(kir)特異的抗體。免疫檢查點抑制劑的非限制性實例包括易普利姆瑪(ipilimumab)、tremelimumab、pembrolizumab、納武單抗(nivolumab)、pidilizumab、mpdl3280a、medi4736、bms-936559、msb0010718c和amp-224。pparγ激動劑是噻唑烷二酮，例如羅格列酮(rosi)、吡格列酮、曲格列酮、萘格列酮或環(huán)格列酮。癌癥是黑素瘤、非小細胞肺癌(nsclc)、小細胞肺癌(sclc)、膀胱癌或前列腺癌。

除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐中，但下文描述了合適的方法和材料。本文提及的所有出版物、專利申請、專利和其它參考文獻通過引用明確地整體并入。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。另外，本文所述的材料、方法和實施例僅是說明性的，而不意圖是限制性的。

本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將從以下詳細描述和權利要求書中顯而易見并由其涵蓋。

附圖簡述

圖1：全長ppar-γ的同種型和結(jié)構(gòu)域[1]。

圖2：ppar-γ在b16細胞和各種組織中的表達。從指定的組織制備裂解物并分析ppar-γ表達。β-肌動蛋白表達用于標準化。

圖3：過表達和內(nèi)源性ppar-γ蛋白的檢測證實了在肺泡巨噬細胞中維持ppar-γ表達需要gm-csf。通過支氣管肺泡灌洗(bal)收集來自2周齡小鼠的肺泡巨噬細胞，以減少在年齡更大動物中觀察到的蛋白質(zhì)沉積的混雜效應。將來自每只小鼠的bal的全部內(nèi)容物裂解并裝載在單個泳道中。上面顯示了3只wt和3只gm-csf-/-動物，用兩種ppar-γ同種型中的每一種轉(zhuǎn)導的b16細胞用作陽性對照。

圖4：在平板接種后5小時靜息腹膜巨噬細胞中的ppar-γ表達。通過灌洗收集腹膜細胞，然后平板接種5小時。洗去非貼壁細胞，并將貼壁細胞原位裂解。每個泳道代表一只小鼠。

圖5：在巰基乙酸鹽誘導的腹膜巨噬細胞中的ppar-γ表達。通過灌洗收集腹膜細胞，并經(jīng)cd19缺失。裂解剩余的細胞，并將來自個體小鼠的裂解物加載到每個泳道中。

圖6：ppar-γ在性腺周圍的脂肪組織中的表達。將脂肪組織在裂解緩沖液中機械粉碎以獲得裂解物。每個泳道代表單個小鼠。

圖7：cd11b缺失的脾細胞中的ppar-γ表達。每個泳道代表單個小鼠。

圖8：通過流式細胞術檢測ppar-γ。a.在b16細胞中檢測過表達的ppar-γ。檢測肺泡巨噬細胞中內(nèi)源性ppar-γ。

圖9：ppar-γ的骨髓特異性ko的產(chǎn)生。收集腹膜灌洗液并平板接種2-4小時。洗去非貼壁細胞，從貼壁細胞制備裂解物。β-肌動蛋白的表達用于歸一化。

圖10：ppar-γ在骨髓細胞中的遺傳缺失降低了b16鼠黑素瘤模型中的接種效率。a.預防性疫苗方案示意圖。b.wt和ppar-γko小鼠的存活曲線。注意，當使用“僅fl”或“僅cre”小鼠作為對照時獲得相似的結(jié)果。進行4次重復(總接種conn=27，kon=25)。一些ko被保護，但是與對照相比，ko群組總是顯示對抗腫瘤攻擊的保護減少。c.腫瘤攻擊后第60天的腫瘤發(fā)生率。d.在腫瘤攻擊后第60天的存活率(不是統(tǒng)計學顯著的)。圖10e和10f描述了lysm(細胞溶素基序)介導的ppar-g的條件缺失對gvax功效的影響。圖10e是描述gvax處理的ko小鼠顯示腫瘤發(fā)生率增加的圖。圖10f描述了當與處理的對照(con)小鼠相比時ko小鼠存活率減少。

圖11：cd1d表達在幼稚ppar-γko脾中保持不變。將脾臟機械消化，并對cd11c，cd11c，cd19，cd1d和染料進行染色以區(qū)分死亡細胞。活細胞用于對指定群體門控。

圖12：cd1d表達在接種的ppar-γko脾中保持不變。將脾臟機械消化，并對cd11c，cd11c，cd19，cd1d和染料進行染色以區(qū)分死亡細胞?；罴毎糜趯χ付ㄈ后w門控。

圖13：來自ppar-γko小鼠的肺泡巨噬細胞保留cd1d的相等表面表達。bal經(jīng)染色用于流式細胞術，肺泡巨噬細胞通過cd11c表達鑒定并用cd1d共標記。

我們的研究不能解決在招募到疫苗位點的apc中cd1d表達的缺陷，因為這些在技術上是有挑戰(zhàn)性的(對于收獲和然后通過流式細胞術研究)。因此，我們使用活b16gm疫苗模型，其中gm-csf的持續(xù)釋放和可觸及的疫苗位點允許容易地收獲募集的apc。

圖14：在con和ppar-γko小鼠中，可以在活gm-疫苗位點以相等數(shù)目區(qū)分粒細胞，單核細胞和一個dc群體。檢查了超過25只對照動物和約12只ppar-γko動物。對4只動物進行gr-1鑒別，在其它中cd14用于區(qū)分cd11bsp的單核細胞部分。

圖15：在ppar-γko中未檢測到活gm疫苗位點粒細胞，單核細胞和dc的活化狀態(tài)的差異。來自con(紅色)和ko(藍色)疫苗位點的dp細胞(頂部兩個直方圖)、單核細胞(中間兩個直方圖)和粒細胞(底部兩個直方圖)上的mhcii(左)、cd80(中)和cd86(右)染色。

圖16：募集到疫苗位點的cd11bsp和cd11bcd11cdp細胞上的cd1d表達在ppar-γko小鼠中不受影響。在d11-d14處理疫苗位點。每組處理4-7只動物。

圖17：募集到疫苗位點的骨髓細胞上的pd-l1表達在ppar-γko中不受影響。來自con(紅色)和ko(藍色)疫苗位點的dp細胞(頂部兩個直方圖)，單核細胞(中間兩個直方圖)和粒細胞(底部兩個直方圖)上的pd-l1染色。

圖18：募集到疫苗位點的apc的子集。對于各con和ko，分析至少6-8只小鼠。

圖19：與幼稚或接種的cd4和cd8活疫苗位點apc共培養(yǎng)沒有顯示ppar-γko中的缺陷。使用磁珠從b16-gm腫瘤收集骨髓細胞，并與來自先前接種的或幼稚的小鼠的脾cd4和cd8細胞一起培養(yǎng)。a.foxp3+和foxp3-cd4和cd8的cfse稀釋。b.由cd4產(chǎn)生的細胞因子。c.由cd8產(chǎn)生的細胞因子。用500,000個t細胞培養(yǎng)50,000個apc。在3個實驗中每組測試7-9只小鼠。

圖20：用con或ppar-γko疫苗位點apc培養(yǎng)的nkt細胞顯示相似的細胞因子概況。來自活gm疫苗位點的50000個apc與來自體細胞核轉(zhuǎn)移小鼠的50000個24.8nkt細胞克隆或表達vb7的原代nkt一起培養(yǎng)48小時。對于agc加載，將apc與500ng/mlagc孵育2-4小時，然后重復洗滌。

圖21：gsea顯示與骨髓細胞中ppar-γ的喪失一致的kodln的差異。dln在gvax后5天收集并通過rna-seq分析。進行gsea以檢查immgen數(shù)據(jù)庫中存在的所有模塊的富集。a.已知在骨髓細胞中被ppar-γ誘導的基因集。b.已知被ppar-γ阻遏的基因集。

圖22：gsea和流式細胞術顯示ppar-γkodln中treg增加和cd8：foxp3比率減少。a.富集treg的immgen模塊顯示為紅色，具有相應的p值用于在kodln中的富集。b.在疫苗接種后6-8天通過流式細胞術，con和kodln及其cd8：treg比率的代表性比較。c.lncd8：treg比率的定量。在5個實驗中對于con和ko小鼠，各評價約25只小鼠。

圖23：腫瘤浸潤白細胞的分析揭示ppar-γko小鼠的腫瘤中較低的t細胞浸潤。con或ko雌性用活b16細胞(10^5)攻擊，并在第一天在不同部位用經(jīng)照射的分泌gm-csf的b16細胞(10^6)接種。在第14天收獲腫瘤，稱重，并加工成單細胞懸浮液，其然后用針對cd45和cd3的抗體染色。基于大小/散射分布和缺乏cd45染色，排除腫瘤細胞。每組研究8-12只小鼠。圖23a描繪了用于腫瘤攻擊和分析的治療性接種的時間表。圖23b是描繪腫瘤重量和細胞群的表征的一系列圖。

圖24：來自接種的ppar-γko動物的腫瘤中cd8+t細胞與foxp3+調(diào)節(jié)細胞的比率降低。con或ko雌性用活b16細胞(10^5)攻擊，并在第一天在不同部位用經(jīng)照射的分泌gm-csf的b16細胞(10^6)接種。在第14天收獲腫瘤，稱重，并加工成單細胞懸浮液，其然后用針對cd45和cd3的抗體染色。基于大小/散射分布和缺乏cd45染色，排除腫瘤細胞。每組研究8-12只小鼠。圖24a描繪了用于腫瘤攻擊和分析的治療性接種的時間表。圖24b是描述細胞群體的表征的一系列圖。

圖25：kodln產(chǎn)生較高水平的吸引treg的趨化因子。dln在gvax后指定的時間收集。平板接種5×10^5個細胞，48小時后收集上清液。通過elisa測量趨化因子水平。每個數(shù)據(jù)點表示技術重復。對于每個時間點和性別，每組測試3-4只小鼠。對con和ko各自的5個平均值(性別和時間)進行配對比較以獲得p值。

圖26：來自gvaxdln的con和kocd8產(chǎn)生響應trp-2肽的等量水平的ifn-γ。合并3-4個ln，并且用10ug/ml所示的肽平板接種500,000個淋巴細胞。在48小時收集的上清液通過elisa測定。代表3個實驗的數(shù)據(jù)。

圖27：koln具有增加的朗格漢斯細胞特異性基因模塊的表達。dln在gvax后5天收集并通過rna-seq分析。進行gsea以檢查immgen數(shù)據(jù)庫中存在的所有模塊的富集。

圖28：lc表達適度水平的溶菌酶m。使用immgen中的geneskyline數(shù)據(jù)顯示器使關鍵白細胞群體中溶菌酶m的表達可視化。

圖29：在淋巴結(jié)中表達dc的langerin的染色策略。機械消化淋巴結(jié)以獲得單細胞懸浮液。在活的b220-mhciihi細胞上門控。

圖30：在ppar-γko中，總cd207+細胞或cd103表達的頻率不受影響。在4個實驗中對于con和kolc，各分析至少14只小鼠。

圖31：rosi在治療6-8天后不影響疫苗引流淋巴結(jié)中cd8和treg之間的平衡。數(shù)據(jù)代表3組實驗，每組4-5只小鼠。

圖32：通過飲用水遞送的20mg/kg/天rosi改善了gvax處理的小鼠中的腫瘤內(nèi)cd8：treg比率。用10^5個活腫瘤細胞(左脅)攻擊小鼠，并用10^6個照射的b16-gm細胞(腹部)接種。向其飲用水中加入rosi或dmso，持續(xù)12天。在第14天收獲腫瘤。從2個實驗匯集數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)點代表一只小鼠。

圖33：rosi介導的免疫改善關聯(lián)需要ppar-γ在骨髓細胞中的表達。ppar-g激動劑rosi改善腫瘤內(nèi)cd8：treg比率，gvax+抗ctla-4組合抗腫瘤免疫療法的功效，并促進牛痘感染小鼠中的病毒清除。圖33a描述了來自實驗的圖，其中小鼠用10^5個活腫瘤細胞(左脅)攻擊并用1×10⁶個照射的b16-gm細胞(腹部)接種。向其飲用水中加入rosi或dmso，持續(xù)12天。在第14天收獲腫瘤。從2個實驗匯集數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)點代表一只小鼠。圖33b描述了rosi對具有b16黑素瘤的gvax處理的小鼠的存活率的影響(上圖)，rosi對gvax+抗ctla-4處理的腫瘤中b16腫瘤的發(fā)生率的影響(中圖)，和rosi對具有b16黑素瘤的gvax+抗ctla-4小鼠的存活率的影響。

圖34：rosi增強gvax+ctla-4處理的功效。如方法中所述，小鼠在同一天接受攻擊和接種(3×10^6)。rosi治療通過飲用水(20mg/kg/天)給予12-14天。在d0(200ug)、d3(100ug)和d6(100ug)，i.p.注射抗ctla4或同種型。

圖35：用gm-csf和ppar-γ調(diào)節(jié)劑處理人pbmc概述了在鼠研究中觀察到的treg效應。a.用rosi處理的兩種代表性供體pbmc。b.對每個供體定量的treg數(shù)。每個數(shù)據(jù)點代表一個供體。c.ppar-γ抑制對用gm-csf處理的人pbmc培養(yǎng)物中treg數(shù)的影響。

圖36：在rosi處理后，gm-csf處理的人單核細胞的ccl17表達降低。1x10⁶個cd14+人pbmc用具有10umrosi或溶媒對照的gm-csf培養(yǎng)5天，并通過elisa測量ccl17。將ccl17水平相對于每孔的單核細胞數(shù)目進行標準化。在con和rosi處理的孔之間單核細胞的數(shù)量沒有差異。

圖37：rosi處理的貼壁pbmc的分析未導致數(shù)量或活化狀態(tài)的變化。每個數(shù)據(jù)點表示供體。在培養(yǎng)4-5天后進行分析。

圖38：mlr(混合淋巴細胞反應)中ppar-g缺失對dc相關基因和功能的影響。a.在kodln中減少與kegg信號傳導“ppar-g信號傳導”相關的幾種基因的表達。在kodln中模塊296的表達減少。dc相關基因在ko中失調(diào)。

圖39：kolndc保留幼稚遷移dc標記并支持mlr中cd8的存活率減少。圖39a描述了在koln中幼稚migdc的基因標記的表達增加。用kodc培養(yǎng)的balb/c脾細胞顯示減少的增殖，對總cd8t細胞數(shù)量具有顯著影響(圖39b和39c)。

圖40：lys-m-cre;ppar-gfl小鼠的gvax引流ln中的t細胞缺陷。圖40a描述了在kodln中treg相關基因集的表達增加。圖40b描繪了dln的流式細胞術圖。圖40c描述了ln細胞構(gòu)成的定量、cd8頻率和cd8：treg比率。每個數(shù)據(jù)點代表一只小鼠。圖40d是描繪在kodln中募集treg的趨化因子的表達增加的圖。圖40e和40f是描述從培養(yǎng)4天的牛痘瘢痕的小鼠的ln獲得的cd8數(shù)目(通過流式細胞術評估)和ccl22表達(通過elisa評估)的一系列圖。

圖41：來自gvax處理的小鼠的treg表達高水平的共抑制受體tigit和ctla4。圖41a是tigit表達的流式細胞術圖。圖41b是在幼稚ln(圖41a和41b)和gvax后6-8天收獲的ln(圖41c和41d)中的ctla-4表達的流式細胞術圖。

圖42：ppar-g激動劑rosi與gvax+抗ctla4組合減少lewis肺癌的潰瘍，并改善存活率。圖42a描述了rosi對gvax+抗ctla-4小鼠中皮下lewis肺癌的潰瘍的影響。圖42b描述了rosi對具有異位皮下lewis肺癌的gvax+抗-ctla-4小鼠的存活率的影響。

圖43：ppar-g在抑制treg募集和擴增中的作用在gm-csf處理的人單核細胞中是保守的。圖43a和43b描繪了ppar-g激動劑rosi和pparginh對用gm-csf表達細胞系培養(yǎng)的人單核細胞中的ccl17(圖43a)和ccl22(圖43b)的影響。

發(fā)明詳述

本發(fā)明部分基于驚人的發(fā)現(xiàn)，即ppar-γ是由癌癥疫苗刺激的保護性免疫所需的。給予ppar-γ激動劑與免疫療法的組合產(chǎn)生更大的治療效果。此外，給藥減少t調(diào)節(jié)細胞(treg)的產(chǎn)生。

粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(gm-csf)通過骨髓譜系的細胞介導環(huán)境依賴性抗炎或促炎性功能。gm-csf信號傳導誘導轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ(ppar-γ)的表達。我們使用鼠黑素瘤的b16模型檢查了在骨髓細胞中ppar-γ在對gvax(一種基于gm-csf(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)的癌癥免疫療法)的抗腫瘤反應中的作用。gvax是gm-csf腫瘤細胞疫苗。gvax利用自體或同種異體腫瘤細胞作為免疫原；在該方法中，腫瘤細胞被遺傳修飾以表達gm-csf。

發(fā)現(xiàn)使用lysm-cre選擇性損失骨髓譜系中的ppar-γ降低了gvax的功效，其不能通過已知的機制解釋。lysm(細胞溶素基序)是通過與n-乙酰氨基葡萄糖部分的相互作用而非共價結(jié)合肽聚糖和殼多糖的蛋白基序。gvax引流淋巴結(jié)的rnaseq鑒定了調(diào)節(jié)性t細胞標志物例如lysm-cre;ppar-γfl小鼠(ppar-γko)中的foxp3和共抑制性受體ctla-4和tigit的增加。流式細胞術證實treg頻率確實在ppar-γko淋巴結(jié)中增加，在cd8t細胞與調(diào)節(jié)性t細胞(cd8：treg)的比率中觀察到強烈的降低。募集treg的趨化因子ccl17和ccl22在引流淋巴結(jié)中上調(diào)。重要的是，ppar-γko小鼠中的腫瘤具有降低的cd8：treg比例，解釋了gvax功效的損失。

在gm-csf處理的人pbmc中ppar-γ的藥理學活化或失活表明ppar-γ在調(diào)節(jié)人類t細胞數(shù)中的作用的保守性。使用fda批準的小分子配體羅格列酮(rosi)，小鼠中的ppar-γ激動改善了疫苗引流淋巴結(jié)和腫瘤中的cd8：treg比率。功能獲得性數(shù)據(jù)表明rosi可以用作免疫療法的輔助。所有腫瘤內(nèi)treg表達高水平的ctla-4和tigit。因此，我們測試了rosi對gvax和抗ctla-4聯(lián)合治療的反應的影響。我們發(fā)現(xiàn)rosi改善了用gvax和抗ctla4治療的荷瘤小鼠的腫瘤發(fā)生率和總體存活率。

我們的數(shù)據(jù)確定了在骨髓細胞中ppar-γ調(diào)節(jié)treg數(shù)目的新作用。該途徑在人類中是保守的，如在pbmc的離體研究中所見。此外，我們提供臨床前證據(jù)表明rosi可用于通過增加腫瘤內(nèi)效應物和調(diào)節(jié)細胞之間的比率來改善免疫治療反應。

因此，本發(fā)明提供了通過向接受主動免疫療法的受試者給予pparγ激動劑來增加受試者中癌癥治療方案的功效的方法。

另外，本發(fā)明包括通過向受試者給予pparγ激動劑和主動免疫療法來治療受試者中的癌癥的方法。

在另一方面，本發(fā)明包括通過向有需要的受試者給予pparγ激動劑來減少所述受試者中t調(diào)節(jié)細胞(treg)數(shù)目的方法。

在實施例部分中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示在表達lysm的細胞中在維持gvax功效方面ppar-g表達的意想不到的需求。ko中ccl22上調(diào)和對cd8數(shù)量的影響在牛痘引流ln中是保守的。此外，在人單核細胞中，ccl17和ccl22也通過ppar-g活化下調(diào)，并且共培養(yǎng)中的treg數(shù)量減少。因此，所探索的表型在細胞疫苗接種(gvax)、病毒疫苗接種(牛痘)的鼠模型和人單核細胞中是保守的。

使用基因標記的高通量分析和功能測定的組合，我們鑒定ln樹突細胞中的缺陷。幼稚遷移性dc基因標記的持久性表明一些功能缺陷存在于migdc子集。雖然單核細胞是lysm-cre小鼠中研究最廣泛的子集，但已知其影響一些典型的dc亞型和嗜中性粒細胞。此外，在炎癥的條件下，單核細胞可以使攜帶從皮膚遷移的dc的抗原重新增加(repopulate)。因此，有可能我們的研究結(jié)果反映樹突細胞中的細胞固有缺陷。然而，另一個假設是ln巨噬細胞是有缺陷的，導致遷移性dc較少活化。除了lndc，我們不能排除其它細胞類型的缺陷。事實上，我們發(fā)現(xiàn)幾種巨噬細胞基因例如cd163，cd169，中性粒細胞基因例如彈性蛋白酶和嗜中性顆粒蛋白和編碼肥大細胞蛋白酶的基因在koln中受影響。在未來的研究中，我們希望分離和探索kodln中的復雜缺陷。

ko小鼠在對gvax的t細胞應答中具有缺陷。重要的是，腫瘤位點的cd8：treg比率降低。sato等人公布了首次臨床數(shù)據(jù)以顯示與細胞溶解性細胞的絕對數(shù)量相比，細胞溶解性和調(diào)節(jié)性t細胞之間的平衡允許清楚的分層和與患者對治療的應答相關聯(lián)。從那時起，包括gvax與抗ctla4組合的i期試驗的多個研究發(fā)現(xiàn)cd8：treg比率對于許多癌癥是預后的。雖然我們提供了作為羅格列酮治療后treg下降的基礎的細胞變化的首次證據(jù)，但有趣的是注意到，先前已顯示，rosi與吉西他濱(已知靶向骨髓衍生的抑制細胞的化合物)組合減少treg數(shù)目。

減少的cd8：treg比率與培養(yǎng)物中t細胞存活減少和募集treg的趨化因子的表達增加相關。我們提出了其中抗原特異性t細胞具有缺陷存活，但是treg數(shù)量由于增加的募集而增加的模型。ccl17和ccl22經(jīng)常涉及募集treg。然而，它們對募集各種t細胞亞群的相對效應是環(huán)境依賴性的。ccl17例如已知在動脈粥樣硬化中減少而不是募集treg。它也與改善的th2應答有關。在基因表達分析中，ccl17已經(jīng)獨立地被檢測為gm-csf和ppar-γ依賴性基因。大多數(shù)對ccl17功能的離體研究是對gm-csf衍生的樹突細胞進行的。有趣的是，發(fā)現(xiàn)ccl17是腫瘤疫苗研究中較好預后的指示物，其中除了肽疫苗之外，還向患者給予gm-csf。然而，該作用僅在用環(huán)磷酰胺(一種treg調(diào)節(jié)劑)治療的患者中觀察到。鑒于ccl17對輔助t細胞以及調(diào)節(jié)性t細胞的明顯沖突效應，使上述數(shù)據(jù)一致的一個假設是ccl17除了誘導treg之外還具有免疫刺激功能；并且一旦treg被抑制，則免疫刺激功能占優(yōu)勢。先前描述的是ccl22的gm-csf依賴性上調(diào)和來自用凋亡性胸腺細胞處理的樹突細胞的treg的誘導。因此，并不意外的是，ccl22介導的treg誘導應該在由gm-csf依賴性細胞疫苗誘導的疫苗應答中起作用。據(jù)我們所知，ccl22以前沒有與ppar-γ關聯(lián)。ccl17分泌僅在骨髓細胞中見到。ccl22的生產(chǎn)者通常也是骨髓來源的。然而，在罕見的研究中，已顯示ccl22由cd8細胞和nk細胞表達。

單獨使用gvax，rosi改善了cd8：treg比率，但對腫瘤大小和存活沒有影響。然而，與gvax和抗ctla4組合，其顯示了明顯益處。若干研究已經(jīng)表明，盡管用針對共抑制分子的單一抗體的治療不足，但雙重阻斷或treg缺失可在鼠腫瘤模型中導致成功消退。組合免疫療法也是臨床實踐中的新興標準。已經(jīng)在患者中測試了gvax和抗ctla4的連續(xù)遞送，并且我們的數(shù)據(jù)表明rosi、gvax和抗ctla-4的三重組合可以獲得顯著的益處。這些發(fā)現(xiàn)令人興奮，因為抗ctla4(易普利姆瑪)是最近批準的免疫療法。

不受任何具體機制、理論或假設的束縛，可以形成關于rosi僅在抗ctla-4存在下影響腫瘤生長的原因的若干假設。腫瘤具有許多用于免疫逃避的冗余機制。因此，可能的是，盡管有利的cd8：treg比率，但是cd8是功能障礙的，直到ctla4被阻斷。ctla4阻斷可以是發(fā)揮cd8固有作用，或可以是通過其在持續(xù)的treg或甚至腫瘤駐留骨髓細胞上的表達。此外，rosi提供了在患者中靶向腫瘤內(nèi)treg的一類療法。在小鼠中，存在幾種策略靶向treg，包括抗cd25，但是在臨床中無一靶向treg。cd25阻斷對于臨床應用是不切實際的，因為其可以影響效應t細胞上的cd25水平。

測試ko小鼠和用其它疫苗接種方法(細胞和非細胞的)的rosi治療，將允許進一步闡明ppar-γ的免疫刺激作用及其治療價值。可以探索的一種協(xié)同作用是與rosi治療組合的pd-1/pd-l1途徑的阻斷。pd-1在gvax處理的小鼠中在tils中表達，而pd-1不作為在kodln的rnaseq中差異表達的基因出現(xiàn)。與pd-1阻斷的組合將提供我們對于rosi和檢查點阻斷之間的協(xié)同作用機制的理解。在kodln中升高的共抑制受體是新鑒定的tigit。來自gvaxdln或腫瘤位點(來自con或ko動物)的treg是tigit陽性的?？紤]到我們關于gvax中的treg和ppar-γ的作用的數(shù)據(jù)，gvax、tigit阻斷和rosi的三重組合似乎是待探索的有希望的途徑。

疫苗反應和t細胞和dc表型的缺陷是部分的，但是顯著的。重要的是注意，ppar-γ具有已知的免疫抑制作用。與以前公布的ppar-g對ifn-g反應的抑制一致，ifn-g誘導的基因的基因集在ko中被上調(diào)。因此，我們看到的適度缺陷是ppar-γ的免疫抑制和促腫瘤免疫效應的總和。這意味著系統(tǒng)性rosi治療可具有細胞依賴性的促炎或抗炎作用。未來的研究計劃局部提供rosi或?qū)⑵浒邢蛞阎募毎愋汀?/p>

治療方法

向受試者給予ppar-γ激動劑增加癌癥治療的功效。受試者正接受主動免疫療法。ppar-γ激動劑可以在受試者接受主動免疫療法治療的同時，之前或之后給予。在一些方面，向所述受試者進一步給予免疫檢查點抑制劑。本發(fā)明還包括通過向受試者給予ppar-γ激動劑來減少有此需要的受試者中t調(diào)節(jié)細胞(treg)數(shù)目的方法。有需要的受試者包括患有癌癥，接受主動免疫療法治療和/或免疫檢查點抑制劑的受試者。

本文所述的方法可用于減輕各種癌癥的癥狀。

如果治療導致臨床益處(例如，受試者中腫瘤的大小，患病率或轉(zhuǎn)移潛力降低)，則治療是有效的。當預防性地施用治療時，“有效的”是指治療延遲或防止腫瘤形成或預防或減輕腫瘤的臨床癥狀的癥狀。結(jié)合用于診斷或治療特定腫瘤類型的任何已知方法來確定有效性。

pparγ激動劑

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(ppar-γ或pparg)，也稱為格列酮受體或nr1c3(核受體亞家族1，c組，成員3)，是ii型核受體，在人中由pparg基因編碼。在人和小鼠中檢測到pparg的兩種同種型：ppar-γ1(在除肌肉之外的幾乎所有組織中發(fā)現(xiàn))和ppar-γ2(主要在脂肪組織和腸中發(fā)現(xiàn))。

pparg調(diào)節(jié)脂肪酸儲存和葡萄糖代謝。由pparg激活的基因刺激脂肪細胞的脂質(zhì)攝取和脂肪形成。pparg敲除小鼠在喂食高脂肪飲食時不能產(chǎn)生脂肪組織。

ppar-γ激動劑是結(jié)合受體并激活受體以產(chǎn)生生物反應的化合物。

ppar-γ激動劑可以是小分子。如本文所使用的“小分子”是指具有在小于約5kd至50道爾頓范圍內(nèi)的分子量的組分，例如小于約4kd，小于約3.5kd，小于約3kd，小于約2.5kd，小于約2kd，小于約1.5kd，小于約1kd，小于750道爾頓，小于500道爾頓，小于約450道爾頓，小于約400道爾頓，小于約350道爾頓，小于300道爾頓，小于250道爾頓，小于約200道爾頓，小于約150道爾頓，小于約100道爾頓。小分子可以是例如核酸，肽，多肽，肽模擬物，碳水化合物，脂質(zhì)或其它有機或無機分子?；瘜W和/或生物混合物，例如真菌，細菌或藻類提取物的文庫是本領域已知的，并且可以用本發(fā)明的任何測定法進行篩選。

例如，ppar-γ激動劑是噻唑烷二酮。優(yōu)選地，噻唑烷二酮是羅格列酮(rosi)，吡格列酮，曲格列酮，萘格列酮，環(huán)格列酮，萘格列酮或利格列酮。在另一方面，所述ppar-γ激動劑是saroglitazar，厚樸酚，和厚樸酚，發(fā)卡二醇，白藜蘆醇，amorfrutin1，槲皮素或亞麻酸。

ppar-γ激動劑是激活ppar-γ的抗體或其片段。設計和產(chǎn)生激動劑抗體的方法是本領域熟知的。

主動免疫療法

主動免疫療法試圖通過以觸發(fā)免疫應答的方式呈遞抗原來刺激免疫系統(tǒng)。

為了使免疫系統(tǒng)獲得針對腫瘤的應答，腫瘤必須具有將其與周圍正常組織區(qū)分開的抗原。

有兩種類型的主動免疫療法;非特異性免疫療法和特異性免疫療法。

非特異性主動免疫療法使用細胞因子和其它細胞信號傳導產(chǎn)生一般性免疫系統(tǒng)應答。細胞因子包括例如gm-csf和mcsf。細胞因子通過工程改造成分泌細胞因子的細胞遞送，或細胞因子連接到聚合物支架。

特異性主動免疫療法包括產(chǎn)生針對由癌細胞表達的特異性抗原的細胞介導的和抗體免疫應答。特異性主動免疫療法包括例如抗原特異性疫苗或抗腫瘤t細胞的過繼轉(zhuǎn)移。已經(jīng)開發(fā)并臨床評估了許多平臺以誘導針對腫瘤相關抗原的免疫應答。抗原特異性接種包括基于全細胞的疫苗以及基于肽和完整蛋白的方法。作為替代方法，抗原特異性疫苗包括通過繼承性t細胞轉(zhuǎn)移來提高腫瘤特異性t細胞群的頻率。抗腫瘤t細胞的過繼轉(zhuǎn)移繞過了對內(nèi)源性宿主免疫系統(tǒng)的需要以響應外源疫苗，并且可涉及遞送大量細胞，提供定量優(yōu)勢。該方法還允許直接操縱所給予的t細胞群，并且還允許調(diào)節(jié)宿主以支持最佳t細胞持久性和功能性維持。繼承性t細胞轉(zhuǎn)移包括使用嵌合抗原受體t細胞(carts)。

免疫檢查點抑制劑

免疫檢查點是指許多硬連接(hardwire)到免疫系統(tǒng)中的抑制性途徑，其對于維持自身耐受性和調(diào)節(jié)外周組織中生理學免疫應答的持續(xù)時間和幅度是至關重要的，以使附加的組織損傷最小化?，F(xiàn)在清楚的是，腫瘤共同選擇某些免疫檢查點途徑作為免疫抗性的主要機制，特別是對腫瘤抗原特異性的t細胞。因為許多免疫檢查點是由配體-受體相互作用引發(fā)的，它們可以容易地被抗體阻斷或被重組形式的配體或受體調(diào)節(jié)。

免疫檢查點包括ctla-4，pd-1，pd-l1，pd-l2，殺傷免疫球蛋白受體(kir)，lag3，b7-h3，b7-h4，tim3，a2ar，cd40l，cd27，ox40，4-1bb，tcr，btla，icos，cd28，cd80，cd86，icos-l，b7-h4，hvem，4-1bbl，ox40l，cd70，cd40和gal9。

免疫檢查點抑制劑的非限制性實例包括易普利姆瑪(ipilimumab)、tremelimumab、pembrolizumab、納武單抗(nivolumab)、pidilizumab、mpdl3280a、medi4736、bms-936559、msb0010718c和amp-224。

治療性給藥

本發(fā)明包括向受試者給予含有主動免疫療法化合物，ppar-γ激動劑，免疫檢查點抑制劑或其任何組合的組合物。

或者，本發(fā)明包括向受試者給予主動免疫療法化合物或免疫檢查點抑制劑，或增加在ppar-γko研究中下調(diào)的一種或多種基因(完整列表參見圖38)的表達的化合物，使得一種或多種下調(diào)基因的表達增加；或者向受試者給予降低在ppar-γko研究中上調(diào)的一種或多種基因(完整列表參見圖38)的表達的化合物，使得上調(diào)的一種或多種基因的表達降低；或其任何組合。

治療化合物的有效量優(yōu)選為約0.1mg/kg至約150mg/kg。如本領域技術人員所認識到的，有效劑量根據(jù)給藥途徑，賦形劑使用和與其它治療性治療的共同給予(包括使用其它抗增殖劑或用于治療、預防或緩解癌癥的癥狀的治療劑)而改變。治療方案通過使用標準方法鑒定哺乳動物，例如患有癌癥的人類患者來進行。

劑量可以給予一次或多于一次。在一些實施方案中，優(yōu)選治療化合物每周給予一次，每周兩次，每周三次，每周四次，每周五次，每周六次或每周七次，持續(xù)預定的持續(xù)時間。預定的持續(xù)時間可以是1周，2周，3周，4周，5周，6周，7周，2個月，3個月，4個月，5個月，6個月，7個月，8個月，9月，10個月，11個月或長達1年。

使用本領域已知的方法將藥物化合物給予這樣的個體。優(yōu)選地，所述化合物經(jīng)口，直腸，鼻，局部或胃腸外，例如皮下，腹膜內(nèi)，肌肉內(nèi)和靜脈內(nèi)給予。所述抑制劑任選地配制為治療藥物的混合物的組分以治療癌癥。適于胃腸外給藥的制劑的實例包括活性劑在等滲鹽溶液，5％葡萄糖溶液或另一種標準藥學上可接受的賦形劑中的水溶液。標準增溶劑例如pvp或環(huán)糊精也用作用于遞送治療化合物的藥物賦形劑。

使用常規(guī)方法將本文所述的治療化合物配制成用于其它給藥途徑的組合物。例如，將治療化合物配制成用于口服給藥的膠囊或片劑。膠囊可以含有任何標準的藥學上可接受的材料，例如明膠或纖維素。片劑可以根據(jù)常規(guī)方法通過壓縮治療化合物與固體載體和潤滑劑的混合物來配制。固體載體的實例包括淀粉和糖膨潤土。所述化合物以含有粘合劑例如乳糖或甘露糖醇、常規(guī)填充劑和壓片劑的硬殼片劑或膠囊的形式給藥。其它制劑包括軟膏劑，栓劑，糊劑，噴霧劑，貼劑，霜劑，凝膠，可再吸收海綿或泡沫。這樣的制劑使用本領域熟知的方法制備。

治療性化合物在化合物與受影響的組織直接接觸時是有效的。因此，局部給予化合物?；蛘?，全身性給予治療化合物。例如，化合物通過吸入給予?；衔镆詠碜院泻线m的推進劑、例如氣體(例如二氧化碳)的加壓容器或分配器，或噴霧器的氣溶膠噴霧劑的形式遞送。

此外，通過將固體或可再吸收基質(zhì)植入(直接進入器官或皮下)給予化合物，所述基質(zhì)將化合物緩慢釋放到受試者的相鄰和周圍組織中。

在一些實施方案中，優(yōu)選本文所述的治療化合物與另一種治療劑(例如化療劑，放射療法或抗有絲分裂劑)組合給予。在一些方面，在給予本治療化合物之前給予抗有絲分裂劑，以誘導額外的染色體不穩(wěn)定性，以增加本發(fā)明靶向癌細胞的功效?？褂薪z分裂劑的實例包括紫杉烷類(即紫杉醇，多西他賽)和長春花生物堿(即長春花堿，長春新堿，長春地辛，長春瑞濱)。

定義

“治療”是以防止病癥發(fā)展或改變病癥的病理或癥狀為目的進行的干預。因此，“治療”是指治療性治療和預防性(prophylactic或preventative)措施。需要治療的那些包括已經(jīng)患有該病癥的那些以及其中要預防該病癥的那些。在腫瘤(例如癌癥)治療中，治療劑可以直接減少腫瘤細胞的病理，或使腫瘤細胞對其它治療劑(例如，放射和/或化療)的治療更敏感。如本文所用，“改善的”或“治療”是指接近歸一化值(例如在健康患者或個體中獲得的值)的癥狀，例如與歸一化值差異小于50％，優(yōu)選為與歸一化值差異小于約25％，更優(yōu)選與歸一化值差異小于10％，并且還更優(yōu)選與歸一化值沒有顯著差異，如使用常規(guī)統(tǒng)計學檢驗確定的。

因此，治療可包括阻止，抑制，預防，治療或其組合。治療尤其指增加至持續(xù)進展的時間，加速緩解，誘導緩解，增加緩解，加速恢復，增加替代療法的效力或降低對替代療法的抗性或其組合?！白柚埂被颉耙种啤庇绕渲秆舆t癥狀的發(fā)作，防止疾病復發(fā)，減少復發(fā)事件的數(shù)量或頻率，增加癥狀發(fā)作之間的潛伏期，降低癥狀的嚴重性，降低急性發(fā)作的嚴重性，減少癥狀數(shù)目，減少疾病相關癥狀的發(fā)生率，減少癥狀的潛伏期，改善癥狀，減少繼發(fā)性癥狀，減少繼發(fā)感染，延長患者存活或其組合。癥狀是原發(fā)性的，而在另一個實施方案中，癥狀是繼發(fā)性的?！霸l(fā)性”是指作為增殖性疾病的直接結(jié)果的癥狀，而繼發(fā)性是指源自原發(fā)性原因或由其導致的癥狀。癥狀可以是疾病或病理狀況的任何表現(xiàn)。

“癌癥或腫瘤細胞的治療”是指在整個說明書中描述的肽或核酸的量，其能夠引起一種或多種以下效應：(1)抑制腫瘤生長，包括(i)減緩(ii)完全生長停滯;(2)腫瘤細胞數(shù)量的減少;(3)維持腫瘤大小;(4)腫瘤大小減小;(5)抑制，包括(i)減少，(ii)減緩或(iii)完全預防腫瘤細胞浸潤到外周器官;(6)抑制，包括(i)減少，(ii)減慢或(iii)完全防止轉(zhuǎn)移;(7)增強抗腫瘤免疫應答，其可以導致(i)維持腫瘤大小，(ii)減小腫瘤大小，(iii)減慢腫瘤的生長，(iv)減少，減慢或防止侵襲和/或(8)在一定程度上緩解與疾病相關的一種或多種癥狀的嚴重性或數(shù)目。

如本文所用，“改善的癥狀”或“治療的癥狀”是指接近歸一化值的癥狀，例如與歸一化值差異小于50％，優(yōu)選與歸一化值差異小于約25％，更優(yōu)選地與歸一化值差異小于10％，并且還更優(yōu)選地與歸一化值沒有顯著差異，如使用常規(guī)統(tǒng)計檢驗確定的。

如本文所用，“藥學上可接受的”組分是適合與人和/或動物一起使用而沒有過度不良副作用(例如毒性，刺激和過敏反應)，與合理的利益/風險比相稱的組分。

如本文所用，術語“安全和有效的量”或“治療量”是指當以本發(fā)明的方式使用時，足以產(chǎn)生期望的治療反應而沒有過度不良副作用(例如毒性，刺激和過敏反應)，與合理的利益/風險比相稱的組分的量?！爸委熡行Я俊笔侵赣行Мa(chǎn)生所需治療反應的本發(fā)明化合物的量。例如，有效延遲癌癥生長或引起癌癥萎縮或預防轉(zhuǎn)移的量。具體的安全和有效的量或治療有效量將隨著以下因素而變化：例如，所治療的具體病癥，患者的身體狀況，所治療的哺乳動物或動物的類型，治療的持續(xù)時間，并行治療的性質(zhì)(如果有的話)，和所用的具體制劑以及化合物或其衍生物的結(jié)構(gòu)。

如本文所用，“癌癥”是指在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的所有類型的癌癥或腫瘤或惡性腫瘤，包括但不限于：白血病，淋巴瘤，黑素瘤，癌和肉瘤。癌癥的實例是腦，乳腺，胰腺，子宮頸，結(jié)腸，頭和頸，腎，肺，非小細胞肺，黑素瘤，間皮瘤，卵巢，肉瘤，胃，子宮和成神經(jīng)管細胞瘤的癌癥。另外的癌癥包括例如霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤，多發(fā)性骨髓瘤，成神經(jīng)細胞瘤，乳腺癌，卵巢癌，肺癌，橫紋肌肉瘤，原發(fā)性血小板增多癥，原發(fā)性巨球蛋白血癥，小細胞肺腫瘤，原發(fā)性腦腫瘤，胃癌，結(jié)腸癌，惡性胰腺胰島瘤，惡性類癌，膀胱癌，惡變前皮膚損傷，睪丸癌，淋巴瘤，甲狀腺癌，神經(jīng)母細胞瘤，食道癌，泌尿生殖道癌，惡性高鈣血癥，子宮頸癌，子宮內(nèi)膜癌，腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌。

“增殖性病癥”是由比正常細胞生長得更快的細胞，即腫瘤細胞引起的疾病或病況。增殖性病癥包括良性腫瘤和惡性腫瘤。當根據(jù)腫瘤的結(jié)構(gòu)分類時，增殖性病癥包括實體瘤和造血腫瘤。

術語“患者”或“個體”在本文中可互換使用，并且是指待治療的哺乳動物受試者，優(yōu)選人類患者。在一些情況下，本發(fā)明的方法可用于實驗動物，獸醫(yī)應用和用于疾病的動物模型的開發(fā)中，包括但不限于嚙齒動物，包括小鼠，大鼠和倉鼠；和靈長類動物。

術語“調(diào)節(jié)”是指任何所提到的活性例如增加，增強，增加，提高，激動(作為激動劑)，促進，降低，減少，抑制，阻斷或拮抗(作為拮抗劑)。與基線值相比，調(diào)節(jié)可以增加活性超過1倍，2倍，3倍，5倍，10倍，100倍等。調(diào)節(jié)也可以將其活性降低到低于基線值。

如本文所用，術語“給予細胞”(例如，表達載體，核酸，遞送媒介，試劑等)是指用分子轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)染，顯微注射，電穿孔或射擊細胞。在一些方面，通過使靶細胞與遞送細胞接觸(例如通過細胞融合或通過當遞送細胞接近靶細胞時裂解遞送細胞)將分子引入靶細胞中。

如本文所用，“分子”一般性用于包括在療法中使用的任何載體，抗體，蛋白質(zhì)，藥物等，并且可以通過本發(fā)明的方法在患者中檢測。例如，編碼不同類型的基因的多種不同類型的核酸遞送載體可以一起作用以促進治療效果或增加細胞中基因轉(zhuǎn)移和/或基因表達的功效或選擇性。核酸遞送載體可以作為裸核酸提供，或在與一個或多個分子締合的遞送媒介中提供，用于促進核酸進入細胞。合適的遞送媒介包括但不限于：脂質(zhì)體制劑；多肽；多糖；脂多糖；病毒制劑(例如，包括病毒，病毒顆粒，人工病毒包膜等)；細胞遞送媒介等。

實施例

實施例1：gm-csf在維持骨髓細胞和非骨髓細胞中ppar-γ表達的作用

方法

病毒生成

使用標準重組dna技術將編碼ppar-γ的每種同種型的cdna插入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pmfg中。將pmfg-ppar-γ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到包裝細胞系293gpg中，其使用lipofectamine表達病毒裝配所需的蛋白質(zhì)組分。從第2天開始收集含有分泌的病毒的上清液，持續(xù)數(shù)天。病毒顆粒通過高速超速離心沉淀，重懸于optimem中并在-80℃下儲存直到需要。

b16培養(yǎng)和感染

b16在含有10％fcs和抗生素的dmem中培養(yǎng)。對于感染，平板接種1x10^5-5x10^5個b16，并與聚凝胺和濃縮的病毒一起孵育。24小時后，洗滌培養(yǎng)物并使其匯合。

裂解液制備和蛋白質(zhì)印跡檢測ppar-γ蛋白

使用磁珠(miltenyibiotec)進行cd11b細胞的排除。細胞在以下中裂解：含有10％蛋白酶抑制劑(sigma-aldrich;目錄號p8340)和1mmna3ov4和pmsf的ripa緩沖液。裂解后立即將樣品短暫超聲處理，然后在4℃下以15000g離心15分鐘。收集上清液并用含有十二烷基硫酸鋰和100mmdtt的上樣緩沖液加熱至70℃。

對于蛋白質(zhì)印跡，使用兔抗-ppar-γ抗體(cellsignaling，81b8)，然后是堿性磷酸酶綴合的第二抗體。使用化學發(fā)光底物使印跡顯色(vectorlabs，sk-6605)。使用imagej軟件進行密度測定。

通過蛋白質(zhì)印跡檢測ppar-γ

我們需要檢測ppar-γ的穩(wěn)健測定法以確認在gm-csf-/-小鼠中其與gm-csf和骨髓特異性損失的關系。我們產(chǎn)生了過表達每種同種型的b16衍生細胞系并篩選市售可得的抗體，以選擇穩(wěn)健和特異性檢測ppar-γ的抗體(圖2)。我們篩選肺泡和腹膜巨噬細胞;和cd11b+脾細胞。cd11b在單核細胞和嗜中性粒細胞上表達。因此，該群體包括脾單核細胞，巨噬細胞，單核細胞衍生的樹突細胞和嗜中性粒細胞。我們還測試了性腺周圍的脂肪墊(作為內(nèi)源性陽性對照)，總骨髓和cd11b分級后留下的大量脾臟。我們不能檢測脾髓樣細胞或新鮮回收的腹膜巨噬細胞中的ppar-γ。最重要的是，使用這種抗體在肺泡巨噬細胞中可檢測到內(nèi)源性ppar-γ(圖2)。如在引言中所綜述的，gm-csf介導肺泡巨噬細胞生物學的重要方面，因此它們代表研究gm-csf誘導的基因的重要細胞類型。

結(jié)果

ppar-γ是肺泡巨噬細胞中gm-csf的靶標

肺泡巨噬細胞中的ppar-γ表達先前顯示為gm-csf依賴性的。我們能夠證實這些發(fā)現(xiàn)。來自gm-csfko小鼠的肺泡巨噬細胞為ppar-γ完全缺陷的(圖3)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)新鮮分離的腹膜巨噬細胞不表達可檢測量的ppar-γ蛋白。粘附至組織培養(yǎng)皿上調(diào)表達，其不是gm-csf依賴性的(圖4)。我們還測試了巰基乙酸鹽引發(fā)是否會導致ppar-γ表達及其對gm-csf的依賴性。在巰基乙酸鹽引發(fā)時可以在腹膜巨噬細胞中檢測到顯著但不依賴gm-csf的ppar-γ(圖5)。此外，在性腺周圍的脂肪墊和cd11b缺失的脾中的ppar-γ表達也是gm-csf非依賴性的(圖6和7)。對于性腺周圍的脂肪顯示了兩個實驗，因為小鼠之間的表達是相當可變的。這些研究結(jié)果表明ppar-γ是某些巨噬細胞中的gm-csf靶，并且分化或解剖位置賦予ppar-γ表達對gm-csf的差異依賴性。在不表達gm-csf受體的脂肪和淋巴細胞(cd11b缺失的脾)中，預期ppar-γ表達不依賴于gm-csf。

我們還測試了ppar-γ表達是否可以通過流式細胞術檢測。我們能夠檢測b16中的異位表達(圖8)，但不能檢測肺泡巨噬細胞中的內(nèi)源性表達。

討論

上述研究是對各種骨髓以及選擇的非骨髓組織中ppar-γ表達的系統(tǒng)分析。鑒于缺乏ppar-γ的各種骨髓群體的凋亡細胞吞噬作用的缺陷，令人驚訝的是，我們僅能夠檢測肺泡巨噬細胞中的ppar-γ表達。我們發(fā)現(xiàn)在肺泡巨噬細胞中的穩(wěn)態(tài)ppar-γ表達完全依賴于gm-csf的存在。gm-csf在粘膜表面中起重要作用，因此腸粘膜中的骨髓群體也可能顯示gm-csf依賴性ppar-γ表達。我們的數(shù)據(jù)根據(jù)最近公布的在各種骨髓亞型中ppar-γmrna表達的分析。gautier等人還發(fā)現(xiàn)腹膜巨噬細胞在炎性條件下僅表達ppar-γ。據(jù)我們所知，這是粘附導致巨噬細胞中ppar-γ表達的首次證據(jù)。gautier等人還顯示募集到炎癥部位的單核細胞表達ppar-γ。因此，在下一章節(jié)中，我們在lysm-cre;ppar-γfl小鼠中測試了對gvax的免疫應答是否受到影響。

實施例2：在單核細胞譜系中遺傳性功能喪失對gvax的影響：對候選機制的研究

方法

產(chǎn)生lysm-cre;ppar-γfl

將市售可得的lysm-cre(jacksonlaboratory，4781)和ppar-γfl(jacksonlaboratory，4584)小鼠一起雜交。f1xf1雜交導致cre和fl純合動物，其是活的和能育的。

脾細胞的再刺激

將脾破碎，進行紅細胞裂解并通過70um過濾器以獲得單細胞懸浮液。將2×10^6個細胞平板接種在含有50,000個照射的b16細胞的2ml培養(yǎng)基中。4天后測量細胞因子水平。

腫瘤處理

收獲b16-gm腫瘤并稱重。將腫瘤切成1-3mm片，并在37℃下在含有200單位膠原酶iv和10ug/mldna酶的培養(yǎng)基中孵育45-75分鐘。孵育后，反復吸取組織，并用70um過濾器過濾。使用optiprep(sigma-aldrich)產(chǎn)生用于離心的梯度。將25ml含0.85％nacl和10mmtricine的蒸餾水溶液與另一5ml蒸餾水和8.71mloptiprep混合。將該梯度在含有腫瘤單細胞懸浮液的培養(yǎng)基下分層，并在室溫下以400g在緩慢減速下旋轉(zhuǎn)25分鐘。收集界面并分析以進行流式細胞術或用于共培養(yǎng)。

共培養(yǎng)實驗

將幼稚和接種的脾臟加工成單細胞懸浮液。cd8通過使用抗cd8標記的磁珠選擇。隨后，通過陰性選擇，再次使用磁珠回收cd4。50,000個apc與500,000個cd4或cd8一起孵育。

對于nkt細胞共培養(yǎng)，將50,000個apc與50,000個來自vb7體細胞核轉(zhuǎn)移小鼠的24.8或原代nkt一起孵育。這些小鼠中的所有cd4是nkt細胞。還有cd4-nkt細胞。為了純化原代nkt，使用磁珠對cd4進行陰性選擇。對于agc加載，將apc與500ng/mlagc孵育2-4小時，然后重復洗滌。

結(jié)果

lysm-cre;ppar-γfl小鼠顯示出ppar-γ的顯著損失并概括了gm-csfko小鼠的肺病理學

我們將lysm-cre小鼠與具有位于pparg部位側(cè)翼的loxp位點的小鼠雜交。如圖9所示，來自ppar-γko小鼠的腹膜巨噬細胞的ppar-γ蛋白表達減少大于90％。ppar-γko小鼠顯示出bal中蛋白質(zhì)積累和炎癥的一些證據(jù)，并且組織學分析顯示與肺泡蛋白質(zhì)沉積一致的輕度病理變化(數(shù)據(jù)未顯示)。先前已經(jīng)顯示，ppar-γko小鼠中的蛋白質(zhì)沉積不如在gm-csf缺陷小鼠中那樣嚴重，這意味著ppar-γ僅是參與gm-csf調(diào)節(jié)的表面活性劑穩(wěn)態(tài)的下游效應子之一。

ppar-γko小鼠在預防性gvax后顯示減少的針對腫瘤攻擊的保護

使用lysm-cre小鼠的組織特異性缺失ppar-γ允許我們解決髓系ppar-γ在gvax誘導的抗腫瘤免疫應答中的作用。預防性給予gvax(在用活的wt腫瘤細胞攻擊前一周)的小鼠被保護免于腫瘤生長，并顯示長期無腫瘤存活(圖10a，b)。在不存在先前接種的情況下，腫瘤生長不受髓樣ppar-γ的損失的影響(圖10b)。令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)在ppar-γko小鼠中疫苗功效降低(圖10b-代表性生存曲線，來自四次重復研究的統(tǒng)計學：(c)腫瘤發(fā)生率和(d)存活率)。

這些數(shù)據(jù)表明表達lysm-cre的細胞中的ppar-γ功能是完全gvax誘導的保護性免疫所需的。考慮到已知ppar-γ發(fā)揮的免疫抑制作用，這是一個意想不到的發(fā)現(xiàn)。我們尋求候選機制以解釋在ppar-γko中疫苗效力的損失，并發(fā)現(xiàn)報告表明在dc中的ppar-γ功能可能對于最佳nkt細胞激活是重要的。我們從cd1dko小鼠知道nkt細胞是gvax誘導的腫瘤保護所需的。在我們對cd1dko小鼠的研究中，nkt細胞的喪失導致gvax誘導的th2應答的喪失，如用經(jīng)照射的b16細胞在體外再刺激的脾細胞所測量的[5]。這種gm-csf/nkt細胞/th2細胞因子軸(axis)可能與ppar-γ缺陷小鼠中疫苗接種活性的喪失有關，因為已假定ppar-γ對巨噬細胞的“m2”活化是重要的。在balb/c背景上ppar-γko小鼠缺乏對利什曼原蟲的th2應答[6]。因此，使用再刺激測定以及其它離體和體外測定，我們測試了nkt功能或th2生成是否在ppar-γko小鼠中受損。

來自接種的小鼠的脾細胞的再刺激不識別ppar-γko抗腫瘤細胞因子應答中的任何明顯缺陷。

在接種后幾天收獲并用經(jīng)照射的b16培養(yǎng)的脾細胞顯示明顯的細胞因子應答。我們的實驗室以前表明這種應答的th2組分是nkt細胞介導的。我們發(fā)現(xiàn)ppar-γko小鼠產(chǎn)生相當或稍微增強的測試的th1和th2型細胞因子的水平，所述細胞因子包括ifn-γ，gm-csf，il-5，il-13和il-10(表1)。

表1：用b16細胞再刺激的ppar-γko脾細胞在其細胞因子譜中沒有顯示改變。數(shù)據(jù)代表5-6只小鼠。用50,000個照射的b16細胞培養(yǎng)2×10^6個脾細胞。通過elisa測量上清液中的細胞因子水平。nd-未檢測到。

cd1d表達在ppar-γko小鼠中不受影響

已經(jīng)顯示ppar-γ配體rosi在gm-csf和il-4衍生的人dc中誘導cd1d表達。這種增加的表達導致nkt細胞活化的增加[7]。因此，我們測試了cd1d在ppar-γko骨髓亞群中的表達。如圖11所示，我們沒有檢測到由cd11b或cd11c表達定義的幼稚脾髓樣亞群中cd1d表達的差異。cd11b+cd11c-細胞可以是單核細胞，巨噬細胞或嗜中性粒細胞。cd11b+cd11c+細胞被認為是單核細胞衍生的樹突細胞，而cd11c+cd11b-細胞是經(jīng)典dc。使用許多可用的標志物進一步分類是可能的，但是我們使用這兩種標志物作為進行cd1d表達的初步篩選的工具。我們發(fā)現(xiàn)，在幼稚脾臟中的各種骨髓細胞群體中，cd1d表達在ppar-γko中不受影響。作為對照，我們還測試了b細胞，其中一個亞群(邊緣區(qū)b細胞)已知表達高水平的cd1d，并發(fā)現(xiàn)野生型和ppar-γ缺陷細胞都顯示出相當?shù)谋磉_。然而，根據(jù)在第2章所述的研究和經(jīng)gautier等人[8]后來證實，我們知道ppar-γ在穩(wěn)態(tài)的骨髓脾亞群中不容易檢測到。我們在接種疫苗的小鼠中測試了脾髓樣細胞，并再次發(fā)現(xiàn)ppar-γko中沒有缺陷(圖12)。由于ppar-γ在肺泡巨噬細胞中是穩(wěn)健可檢測的，我們測試了在肺泡巨噬細胞中的表達是否受到影響。甚至來自ppar-γko小鼠的肺泡巨噬細胞也沒有cd1d表達的缺陷(圖13)。

流式細胞術沒有揭示來自活b16-gm接種位點的ppar-γkoapc的主要缺陷

我們再次使用cd11b和cd11c作為標志物來鑒定活的gm疫苗位點中的骨髓群體(圖14a)。此外，我們使用gr-1將cd11b單陽性細胞分類為粒細胞(gr-1+)或單核細胞(gr-1-)(圖14b)。由于這些疫苗位點實際上是進行性腫瘤，重要的是注意到它們的生長在ppar-γko小鼠中不受影響(圖14c)。我們也沒有發(fā)現(xiàn)在ppar-γko疫苗位點(14d和e)中由cd11b，cd11c和gr-1定義的各種骨髓亞群的頻率或它們的絕對數(shù)(數(shù)據(jù)未顯示)中的任何差異。我們進一步使用mhcii，cd80和cd86測試了粒細胞，單核細胞和樹突級分的活化狀態(tài)，并且在ppar-γko中沒有發(fā)現(xiàn)任何差異(圖15)。

然后我們測試了cd11bsp(單核細胞和粒細胞)和cd11ccd11bdp(單核細胞衍生的樹突細胞)的cd1d的表達。如圖16所示，我們發(fā)現(xiàn)在來自ppar-γko小鼠的疫苗位點apc中cd1d表達沒有缺陷。因此，我們得出結(jié)論表達lysm的細胞中ppar-γ損失不影響鼠cd1d表達。我們想知道是否可以使用公開的報告rosi對培養(yǎng)的人dc的影響的數(shù)據(jù)，以揭示可能有助于降低疫苗在ppar-γko中的功效的更多候選物。我們重新分析公開可用的數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)通過rosi處理培養(yǎng)的人dc減少了pd-l1表達(由vladimirbrusic和daviddeluca在dfcibioinformaticscore進行的生物信息學分析)。這表明pd-l1表達可以在ppar-γko中上調(diào)。已知pd-l1被gm-csf誘導，并且apc上的增加的表達可導致疫苗功效的降低。然而，募集到疫苗位點的細胞的流式細胞術分析在pd-l1中沒有顯示任何缺陷(圖17)。

這些激活標志物的廣泛表達表明這些骨髓細胞的進一步亞分類是可能的。我們測試了標志物cd14，cd103和ly6c(圖18)。在單核細胞上觀察到cd14和ly6c表達。表達ly6c的細胞可以進一步細分為ly6hi(炎性單核細胞)和ly6lo。cd103+dc在多個解剖學位點中發(fā)現(xiàn)，并通過treg在穩(wěn)態(tài)條件下保持耐受性。然而，它們在交叉呈遞和在免疫應答期間產(chǎn)生cd8應答是非常有效的[7]。gm-csfko在幾個非淋巴區(qū)室中具有減少的cd103+dc數(shù)目。我們沒有檢測到任何這些標志物或ppar-γko亞群中的差異(數(shù)據(jù)未顯示)。

疫苗位點apc與各種效應細胞亞群的共培養(yǎng)沒有顯示ppar-γko中的任何缺陷

基于表達標志物，與野生型小鼠相比，似乎來自疫苗位點的ppar-γkoapc存在并表達相似的表面標志物。我們擴展我們的分析以研究ppar-γ缺陷apc的功能能力。我們使用來自幼稚或接種疫苗的小鼠的脾的cd4和cd8細胞培養(yǎng)來自b16-gm腫瘤的骨髓細胞(使用cd11b和cd11c作為標志物)。在這些測定中響應于疫苗位點apc而增殖的僅有的t細胞是來自幼稚小鼠的foxp3+cd4+調(diào)節(jié)性t細胞(圖19a)。已知gm-csf對于腸中的treg穩(wěn)態(tài)是必需的，并且可以促進培養(yǎng)中的treg。與對照apc相比，當treg與疫苗位點ppar-γkoapc培養(yǎng)時，treg增殖沒有差異(圖19a)。來自接種疫苗的小鼠的cd4和cd8產(chǎn)生響應于apc的細胞因子，但是如果apc來源于ppar-γko小鼠，則cd4(19b)產(chǎn)生的il-2，ifn-γ和il-5水平和cd8(19c)產(chǎn)生的ifn-γ水平?jīng)]有不同。

我們還繼續(xù)調(diào)查nkt細胞(如果有的話)在ko中的疫苗缺陷中的作用。在一項研究中，表明cd1d上的脂質(zhì)抗原可用性被ppar-γ誘導的組織蛋白酶d調(diào)節(jié)。因此，我們用疫苗位點apc培養(yǎng)nkt以測量其細胞因子應答。使用兩種不同的nkt細胞來源：源自通過體細胞核轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的vb7限制性小鼠的細胞系或原代nkt細胞(stephaniedougan，未公布的數(shù)據(jù))。簡而言之，提取來自表達vb7的nkt細胞的細胞核并置于去核的卵母細胞中，然后使其生長到胚泡期。將源自vb7胚細胞的胚胎干細胞系注射到wt胚泡中。將嵌合胚泡植入假孕小鼠中?？梢允顾玫那逗嫌揍探慌湟垣@得vb7小鼠系。由于tcrα基因座在wt動物中不顯示絕對等位基因排除(所有t細胞的30％具有重排的tcrα的兩個等位基因和10％表達兩個等位基因)，t細胞區(qū)室在這些小鼠中極度受限制，但不是純系的。vb7小鼠中的t細胞區(qū)室傾向于nkt細胞發(fā)育，盡管存在一些cd8t細胞。

在來自con或ko疫苗位點的apc存在下，nkt細胞系(24.8)或原代vb7nkt細胞的細胞因子譜相似(圖20)。在來自活gm疫苗位點的cd11b+細胞和24.8細胞的共培養(yǎng)物中可檢測到的唯一細胞因子是il-2，其不受用α-半乳糖苷神經(jīng)酰胺加載cd11b細胞顯著影響(agc，數(shù)據(jù)未顯示)。當用koapc刺激時，24.8細胞產(chǎn)生的il-2沒有差異(圖20a)。原代vb7nkt細胞在agc刺激時而不是用內(nèi)源性配體產(chǎn)生il-2，il-5(圖20b)，il-13和ifn-γ(圖20c)。ppar-γkoapc中cd1d表達或再循環(huán)的任何改變將影響nkt細胞對agc的應答。類似地，如果共刺激配體(細胞表面或分泌的)在ko中不同，其可以影響nkt細胞對agc的應答。然而，當使用ppar-γkoapc時，原代nkt細胞對agc負載的apc的細胞因子應答也保持不變。

討論

已知ppar-γ在巨噬細胞和樹突細胞中具有許多免疫抑制功能。與我們的預期相反，使用lysm-cre缺失ppar-γ降低了照射的gm-csf分泌性b16細胞刺激針對隨后的腫瘤攻擊的保護性免疫的能力。雖然以前的報告表明ppar-γ在nkt細胞活化中的作用，但我們未能檢測到ppar-γ缺陷小鼠中涉及nkt細胞的明顯缺陷。相反，我們發(fā)現(xiàn)a)cd1d表達在ppar-γko小鼠中不受影響，和b)通過細胞因子釋放測量的通過疫苗位點apc的nkt細胞活化也不受影響。我們還進行疫苗位點apc與來自幼稚和接種疫苗的小鼠的cd4和cd8細胞的共培養(yǎng)測定，但不能揭示ppar-γko疫苗位點中的缺陷。此外，相似的骨髓細胞募集到野生型和ppar-γ缺陷小鼠中gm-csf分泌性腫瘤細胞的位點。總之，這些結(jié)果提高了以下的可能性：以前未知的ppar-γ功能可能參與受損的疫苗接種應答，這是我們在下一個實施例中通過詳細的表達譜分析來解決的問題。

實施例4：gvax引流淋巴結(jié)中基因表達的高通量分析和骨髓細胞中ppar-γ的新作用的鑒定

方法

rnaseq

dln在疫苗接種后5天收獲。合并來自4只小鼠的ln并提取rna。對rna進行hiseq并對約20000個基因測定轉(zhuǎn)錄物水平(centerforcantercomputationalbiology，dfci)。對于con進行了2個技術重復和對于ko進行了3個技術重復。

基因集富集分析(gsea)

使用immgen數(shù)據(jù)庫中的所有可用基因集(在當時約300個)進行gsea以鑒定其基因標記在con或koln中差異表示的模塊和相關細胞類型。

組合免疫療法

對于探索gvax+ctla-4與rosi的協(xié)同作用的實驗，我們使用兩種不同的攻擊劑量：10^5或4×10^5。疫苗接種劑量為3×10^6個細胞b16-gm，皮下在腹部注射一次，與攻擊劑量的脅腹相對。rosi或dmso在飲用水中以20mg/kg/天給予12天。小鼠在腹膜內(nèi)如下注射抗ctla-4(9d9，bioxcell)或同種型：在d0，200ug；在d3和d6，100ug。

結(jié)果

疫苗引流淋巴結(jié)的基因表達譜分析

同側(cè)腹股溝淋巴結(jié)在形態(tài)學和細胞構(gòu)成上顯著擴大(5-10倍，數(shù)據(jù)未顯示)，支持了由疫苗誘導的保護性反應。為了分析疫苗效應機制而不偏向一種特定的細胞類型，在疫苗接種后5天我們從引流淋巴結(jié)收集rna和進行rna-seq。合并來自4只小鼠的引流淋巴結(jié)以減少變異性。

為了鑒定引流淋巴結(jié)中基因表達的變化，通過基因集富集分析(gsea)分析從rnaseq數(shù)據(jù)獲得的轉(zhuǎn)錄物水平。我們使用通過免疫基因組計劃聯(lián)盟(immgen.org)可獲得的基因集來鑒定對應于特定細胞類型和信號傳導途徑的模塊。有趣的是，與對照相比，之前在肺泡巨噬細胞中顯示富集的ppar-γ依賴性基因表達模塊在ppar-γko淋巴結(jié)中顯示不足，證實了ppar-γ依賴性骨髓基因表達降低(圖21a)。已知被ppar-γ抑制的基因集在ko中被上調(diào)，證實了ppar-γ的功能缺陷(圖21b)?？傊@些研究結(jié)果表明更詳細的基因表達譜的分析可能提供了在ppar-γ缺陷小鼠中受損的疫苗應答的見解。

有趣的是，ctla4是在ko淋巴結(jié)中顯示最多上調(diào)的基因之一(圖21b最后一個基因，上一頁)。ctla4在調(diào)節(jié)性t細胞和激活的和耗盡的效應細胞上強表達。gsea顯示了對treg特異性的基因表達模塊在ko中上調(diào)(圖22a)。我們尋求通過流式細胞術證實treg中的這種可能的改變。如圖22b所示，treg頻率增加。由于treg是抗腫瘤效應t細胞的主要調(diào)節(jié)劑，我們想知道這是否可能影響cd8+t細胞。實際上，在疫苗給予后6-8天，與對照小鼠相比，ko引流淋巴結(jié)中的cd8：treg比率降低(圖22c)。

有趣的是，ctla4是在ko淋巴結(jié)中顯示最多上調(diào)的基因之一(圖21b最后一個基因，上一頁)。ctla4在調(diào)節(jié)性t細胞和激活的和耗盡的效應細胞上強表達。gsea顯示了對treg特異性的基因表達模塊在ko中上調(diào)(圖22a)。我們尋求通過流式細胞術證實treg中的這種可能的改變。如圖22b所示，treg頻率增加。由于treg是抗腫瘤效應t細胞的主要調(diào)節(jié)劑，我們想知道這是否可能影響cd8+t細胞。實際上，在疫苗給予后6-8天，與對照小鼠相比，ko引流淋巴結(jié)中的cd8：treg比率降低(圖22c)。

腫瘤中的cd8：treg比率在ko中也降低

我們想知道在引流淋巴結(jié)中觀察到的cd8t效應子和foxp3+treg的改變的平衡是否也在腫瘤位點見到。對于這些實驗，我們轉(zhuǎn)移到治療疫苗模型，使得所有小鼠都具有進行性腫瘤。如圖23所示，來自gvax處理的ko小鼠的d14b16腫瘤在腫瘤的單細胞懸浮液中沒有顯示cd45+細胞頻率的改變。然而，與對照相比，ko小鼠中cd3+t細胞的頻率顯著降低。對于較大腫瘤大小有非顯著趨勢。對腫瘤生長的效應的缺乏可能反映了分泌gm-csf的腫瘤細胞疫苗影響已建立腫瘤的進展的有限能力，排除檢測主要ppar-γ依賴性貢獻的能力。用d11腫瘤獲得相似的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

我們基于cd8、cd4表面表達和foxp3的細胞內(nèi)染色進一步分類cd3浸潤。如預期的，由于較低的cd3，cd8和treg的總回收率在ko腫瘤中減少(圖24)。然而，這種效應在cd8室中更顯著(且統(tǒng)計學顯著)，導致ko小鼠中較低的cd8：treg比率。腫瘤位點的cd8與treg的平衡已經(jīng)作為臨床研究中許多癌癥的重要預后變量出現(xiàn)。

對dc導致的kodln和t細胞刺激中dc相關基因的影響

為了確定減少的cd8：treg比率的來源，我們分析了引流ln。我們通過rnaseq進行了整個ln的高通量和無偏分析。在gvax給藥后5天收集來自每只小鼠的引流ln。對每個樣品，合并4-5個引流淋巴結(jié)。

骨髓細胞是引流淋巴結(jié)中相對稀有的群體。因此，我們首先測試使用lysmcre刪除ppar-g是否導致整個引流ln的rnaseq中ppar-g靶基因表達的可識別差異。我們發(fā)現(xiàn)幾個典型的ppar-g靶基因在ko引流淋巴結(jié)中減少(圖38a)。以前，ppar-g控制的基因模塊已經(jīng)在肺泡巨噬細胞中被鑒定。該模塊中的幾個巨噬細胞基因也在ko中減少(圖38b)。這些數(shù)據(jù)證實，我們能夠鑒定在我們整個淋巴結(jié)rnaseq中的骨髓限制基因表達變化，并還驗證了ppar-g的功能缺陷。

然后我們獲得在immgen數(shù)據(jù)庫(immgen.org，一個通過微陣列對小鼠中的所有免疫細胞類型進行譜分析的實驗室聯(lián)盟)中進行譜分析的所有基因模塊(約300)?；蚰K被定義為被發(fā)現(xiàn)共表達并注釋有它們在其中表達的細胞類型和刺激物的基因。我們通過基因集富集分析(gsea)詢問是否任何這些基因模塊在ko中改變。我們發(fā)現(xiàn)樹突細胞中富集的大基因集在ko中減少(圖38c，immgen.org上的粗模塊26)。在immgen.org上通過微陣列分析各種鼠免疫細胞亞群經(jīng)驗確定dc富集。

流式細胞術分析顯示，引流淋巴結(jié)中大部分cd11c+(dc標志物)細胞是mhciihi和ccr7+，表明gvax引流淋巴結(jié)中的主要dc群體是遷移性dc(數(shù)據(jù)未顯示)。以前的研究已經(jīng)確定了幼稚鼠遷移性dc中的耐受性標記。我們發(fā)現(xiàn)migdc的幼稚耐受性標記保留在kodln中(圖39a)，與被下調(diào)的許多dc基因相反。這些數(shù)據(jù)表明樹突細胞在ko引流淋巴結(jié)中的免疫刺激潛力降低。在混合淋巴細胞反應(mlr)中，來自kodln的cd11c+細胞具有降低的活化t細胞的能力(圖39b，39c)。

對kodln中的調(diào)節(jié)性t細胞基因標記和cd8：treg比率的影響

dc基因標記和功能缺陷提示對t細胞功能的影響。因此，我們下一步評估rnaseq是否顯示任何t細胞缺陷。根據(jù)腫瘤位點處treg增加，我們發(fā)現(xiàn)ko中treg特異性基因模塊的增加(圖40a)。treg特異性或富集的基因例如foxp3，il2ra(cd25)，ctla-4在kodln中顯著富集。我們通過流式細胞術證實了treg頻率的增加(圖40b和40c)。有趣的是，根據(jù)til數(shù)據(jù)和mlr中降低的t細胞增殖，我們還發(fā)現(xiàn)kodln中cd8的頻率降低和cd8：treg比率降低(圖40c)。

為了探索調(diào)節(jié)性t細胞頻率增加的基礎，我們再次聚焦于樹突細胞基因表達。在kodln中，我們發(fā)現(xiàn)ccl22(由骨髓細胞產(chǎn)生的趨化因子，已知其募集調(diào)節(jié)性t細胞)的表達增加(數(shù)據(jù)未顯示)。類似的功能由與ccl22共享共同受體的ccl17進行。因此，我們通過elisa在con和kodln中測試ccl17和ccl22的表達。我們發(fā)現(xiàn)kodln中兩種趨化因子的水平增加，提供了引流lndc中的ppar-g缺乏與對treg的影響之間的可能聯(lián)系(圖40d)。

要了解組織特異性刪除ppar-g的這些影響是否延伸到我們的皮膚接種疫苗模型，我們比較了來自痘苗病毒疤痕的con和ko小鼠的dln中ccl22和cd8存活的水平。我們發(fā)現(xiàn)，與也在痘苗疤痕化模型中的con小鼠相比，在ko小鼠中cd8存活降低(圖40e)和ccl22增加(圖40f)。這些數(shù)據(jù)表明在皮膚接種疫苗中促進保護性t細胞功能需要骨髓ppar-g。

我們有興趣注意到共抑制受體ctla-4和tigit的表達在ko中被上調(diào)(圖40a)。我們發(fā)現(xiàn)這些受體在幼稚ln中的有限的細胞表面表達(圖41a，b)。在gvax處理的小鼠中，在dln中表達這些受體的主要t細胞群是foxp3陽性調(diào)節(jié)性亞群(圖41c，d)。foxp3-細胞，統(tǒng)稱為“效應t細胞”)甚至在接種疫苗后保持ctla-4和tigit陰性(圖41c，d)。此外，我們發(fā)現(xiàn)在gvax治療小鼠(con和ko)中所有腫瘤內(nèi)treg是tigit陽性。

羅格列酮對ppar-g的藥理學活化改善了對免疫療法的應答

在前面的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)在表達溶菌酶m的細胞中ppar-g的遺傳缺陷可以降低gvax的功效。我們現(xiàn)在詢問我們是否可以通過藥理學功能獲得來提高疫苗功效。羅格列酮是臨床批準的ppar-g配體。我們轉(zhuǎn)向我們的治療性疫苗接種模型以測試腫瘤內(nèi)淋巴細胞。我們發(fā)現(xiàn)在用gvax和羅格列酮(在飲用水中20mg/kg)處理的小鼠中，cd8：treg比率增加。在lysm-cre;ppar-gfl小鼠中沒有發(fā)生cd8：treg比率的改善，或提供證據(jù)表明羅格列酮通過作用于骨髓ppar-g改善cd8：treg比率。這些數(shù)據(jù)補充了功能喪失數(shù)據(jù)，并提供了ppar-g可以支持對gvax的免疫應答的進一步證據(jù)。然而，盡管改善了cd8：treg比率，但小鼠的存活沒有改善(圖33b)。

單獨用gvax的治療性疫苗接種不足以在我們的方案中顯示保護功效(圖33b，上圖)。因此，我們假設，提供檢查點阻斷形式的額外免疫療法可能使模型允許顯示采用羅格列酮的生存改善。我們使用ctla-4阻斷抗體，其是在臨床中積極追求的策略。gvax和抗ctla4的組合確實在我們的模型中提供了一些治療益處(圖33b，中間和下圖)。重要的是，羅格列酮在gvax和抗ctla4處理的小鼠中進一步改善了腫瘤發(fā)生率(圖33b，中圖)和存活率(圖33b，中圖)。

為了消除這些數(shù)據(jù)限于一個特定細胞系的可能性，我們測試了羅格列酮對另一個模型(皮下移植的異向性lewis肺癌)中的gvax+抗ctla4處理的小鼠的影響。lewis肺癌是一種侵襲性細胞系，可導致潰瘍。我們發(fā)現(xiàn)，在gvax+抗ctla-4處理的小鼠中，羅格列酮所致的潰瘍發(fā)生率(圖42a)和存活率(圖42b)適度但顯著改善。因此，我們的數(shù)據(jù)在兩個獨立的模型中提供ppar-g的新的促炎作用的證據(jù)，提示使用fda批準藥物羅格列酮的新適應癥。

人類單核細胞中ppar-g功能的保守性

為了了解這些數(shù)據(jù)的臨床相關性和檢查ppar-g的這種作用是否在人類中是保守的，我們用gm-csf處理人單核細胞以誘導ppar-g的表達。除了gm-csf，單核細胞用rosi或t0070907(一種ppar-g拮抗劑)處理。通過羅格列酮減少單核細胞中ccl17(圖43a)和ccl22(圖43b)的表達。增加了這些數(shù)據(jù)穩(wěn)健性的是，用t0070907處理產(chǎn)生了增加ccl17和ccl22表達的相反效果。此外，我們發(fā)現(xiàn)與其中沒有效果的非gm-csf處理的培養(yǎng)物相比，羅格列酮降低了與自體t細胞共培養(yǎng)的這些gm-csf處理的單核細胞中的treg數(shù)(圖35a和35b)。

koln具有增加的促進treg的細胞因子ccl17和ccl22的表達

為了解釋增加的treg頻率和對cd8：treg比率的影響，我們返回到我們的rnaseq數(shù)據(jù)。有趣的是，趨化因子ccl17(tarc)和ccl22(mdc)的表達在ko基因集中上調(diào)。ccl17和ccl22涉及通過其受體ccr4募集treg。有趣的是，已知產(chǎn)生ccl17和ccl22的主要亞群是巨噬細胞和樹突細胞。我們通過elisa測試了ccl17和ccl22產(chǎn)生的變化。圖25顯示在3個不同時間點ppar-γkogvaxdln所致的ccl17和ccl22表達增加。

cd8t細胞的ifn-γ應答在ko中無缺陷

我們詢問增加的treg對cd8功能具有什么影響。如圖26所示，來自con和koln的cd8響應于來自trp-2的免疫優(yōu)勢肽(一種在針對gvax的抗b16應答中靶向的黑素細胞特異性蛋白)分泌等量水平的ifn-γ。這些數(shù)據(jù)不令人驚訝，因為我們已經(jīng)見到在脾的再刺激(第3章，表2)中相等的ifn-γ水平，和在rnaseq中增加的ifn-γ應答基因標記(圖21)。我們目前正在優(yōu)化細胞毒性測定，以確定cd8介導的b16腫瘤的殺傷作用是否由于treg增加的結(jié)果而有缺陷。然而，從rnaseq，我們沒有檢測到顆粒酶或穿孔素在ko中的任何減少(數(shù)據(jù)未顯示)。

koln具有朗格漢斯細胞的增強的基因表達標記

有可能ppar-γ缺陷導致在引流淋巴結(jié)中的細胞中呈遞的抗原的改變，特別是因為骨髓細胞是ccl17和ccl22的主要生產(chǎn)者。在該情況中，與對照相比，朗格漢斯細胞(lc)的immgen模塊在koln中富集(圖27)。與此想法一致，已發(fā)表的報告顯示ppar-γ可以通過lc表達。

我們使用immgen數(shù)據(jù)庫來檢查溶菌酶m是否在lc中表達，因此可以直接受到ppar-γ缺失的影響。如圖28所示，lc的確表達溶菌酶m。

lc在激活時移動到皮膚淋巴結(jié)。lc表達langerin或cd207。然而，在最近的研究中，皮膚dc也已經(jīng)顯示表達cd207?；趀pcam和cd103的進一步區(qū)分是可能的，盡管仍然有一些關于它們在定義皮膚樹突細胞亞群中的效用的爭論[2]。圖29顯示了我們的染色策略以鑒定lc并區(qū)分lc和表達dc的皮膚langerin。我們將lc鑒定為cd207+epcam+細胞。我們可以基于cd103表達檢測兩個亞群。此外，我們可以檢測cd207-mhciihiepcam-樹突細胞亞型。所有3個dc亞群表達ccr7，表明這些是遷移性dc。因此，cd207亞群可能是皮膚dc。如預期的，lc對于cd8表達是陰性的。

基于我們的門控策略，我們不能鑒定總lc或cd103+lc的相對群體中的數(shù)值缺陷(圖30)。需要進一步研究以確定lc功能是否隨ppar-γ缺乏而改變。我們正在計劃lnapc與各種t細胞亞群的共培養(yǎng)研究，以識別ko中的潛在功能缺陷。

使用羅格列酮藥理學活化ppar-γ顯示一致的功能獲得表型，并確定其作為免疫療法的潛力

幾種ppar-γ的合成激動劑是可用的。其中之一，羅格列酮(rosi)，被充分表征并臨床批準用于糖尿病的管控?？紤]到在我們的模型系統(tǒng)中，ppar-γ的選擇性損失導致treg數(shù)量增加，我們測試了用gvax治療的小鼠中的羅格列酮治療是否會降低treg數(shù)量并改善ln和腫瘤中的cd8：treg比率。

將rosi口服給予患者。因此，我們決定通過飲用水將其遞送給小鼠。我們在接種疫苗的同一天開始進行rosi治療。為了使rosigof實驗與遺傳lof相當，我們在接種疫苗后6-8天比較dmso和rosi處理的ln。如圖31所示，在rosi或dmso處理的gvax小鼠中cd8或treg頻率或cd8：treg比率沒有顯著差異。(似乎存在增加的cd8/treg比率的趨勢)

然而，rosi治療12天顯示對腫瘤浸潤性淋巴細胞的顯著增強(圖32)。引人注目的是，盡管ko小鼠減少了cd3浸潤，但rosi治療的小鼠具有改善的cd3浸潤和總cd45+浸潤。與此一致，雖然cd8和treg的絕對數(shù)目較高，但rosi治療的小鼠具有較高的cd8：treg比。這種功能獲得表型與ppar-γ在骨髓譜系中的遺傳功能喪失一致。

采用rosi的全身遞送改進cd8：treg比率需要骨髓ppar-γ

預期口服rosi治療將影響幾種細胞類型。因此，我們想要解決rosi介導的免疫浸潤的改善是否確實需要骨髓ppar-γ。如圖33所示，在骨髓細胞中不存在ppar-γ表達的情況下，用rosi處理，cd45+浸潤、cd3+浸潤以及cd8：treg比率保持不變(沒有統(tǒng)計學顯著性)。

rosi改善了對用gvax和ctla-4阻斷的組合治療的抗腫瘤應答

我們注意到，rosi治療用照射的、分泌gm-csf的b16細胞接種的小鼠不影響攻擊腫瘤的大小，盡管具有改善的cd8：treg比率(圖32)。與該結(jié)果一致，組合治療未能延長存活率(數(shù)據(jù)未顯示)。然而，我們想知道cd8/treg比率的改善是否可能導致已知增強疫苗接種效力的其它組合策略的功效增強。在這種情況下，已知ctla-4抗體阻斷與gvax組合改善腫瘤內(nèi)cd8功能并且消耗腫瘤內(nèi)treg。ctla-4也作為kodln中的上調(diào)基因出現(xiàn)。此外，已知尋靶到b16的t細胞(效應和調(diào)節(jié)的)表達ctla-4。因此，我們測試了rosi治療對針對gvax+ctla4的應答的效果。如圖34所示，rosi治療顯著增加了采用gvax+ctla4的存活率。觀察到rosi對兩種不同的攻擊劑量的益處。

討論

我們已經(jīng)揭示了以前未確定的ppar-γ在骨髓細胞中的功能：在小鼠中抑制響應于分泌gm-csf的腫瘤細胞接種的treg數(shù)。ppar-γ的這種功能不同于先前描述的免疫抑制作用。然而，在我們的測定中，ppar-γ的這種免疫刺激作用是占主導的，因為gvax功效在ko中降低。我們已經(jīng)證明ppar-γ損失導致dln和腫瘤中的treg數(shù)目增加，效應子與treg比例降低，并且淋巴結(jié)上清液中募集treg的細胞因子增加。為了描述增加的treg對疫苗缺陷的貢獻，我們使用抗cd25抗體測試了在耗盡預先存在的treg的con和ko小鼠中的疫苗功效。

我們能夠使用ppar-γ的合成配體羅格列酮證明一致的gof表型。此外，我們能夠證明rosi可以增強對gvax+ctla-4的免疫應答。這些是潛在的臨床相關數(shù)據(jù)，因為rosi是fda批準的小分子，并且可以在患者中作為潛在的免疫治療劑進行評價。

實施例5：ppar-γ調(diào)節(jié)在人pbmc的gm-csf功能研究中的作用

方法

用gm-csf培養(yǎng)人pbmc

通過來自血小板供體的白細胞分離法環(huán)(leukapheresiscollar)的梯度離心獲得人pbmc。用10^5個k562-wt或k562-gm平板接種4x10^6個細胞。將對照和gm處理的條件每48小時暴露于10umrosi或dmso。在培養(yǎng)的第4-6天，收獲細胞。通過在37℃下與2mmedta孵育獲得貼壁細胞。在1mmedta存在下對細胞染色以進行流式細胞術。通過使用來自invitrogen的活/死可固定染料來區(qū)分死細胞。抗體來自bdbiosciences，biolegend和ebioscience。

ppar-γ調(diào)節(jié)

rosi以粉末形式從adipogen獲得。將其重懸于dmso中，每48小時使用10umrosi或等體積的dmso。以1um使用ppar-γ拮抗劑t0070907，每48小時加入。

ccl17測量

使用elisa(dy364，r＆dsystems)測量ccl17水平。

結(jié)果

用被骨髓ppar-γ激動作用抵消的gm-csf處理時，人外周血單核細胞培養(yǎng)物顯示增加的treg細胞

我們發(fā)現(xiàn)ppar-γ配體rosi可以降低gm-csf誘導的treg擴增的程度(圖35a，b)。通過ppar-γ拮抗劑增加gm-csf誘導的treg擴增，進一步強調(diào)了小鼠和人之間的該途徑的保守性(圖35c)。ppar-γ拮抗劑的研究模擬鼠遺傳功能喪失。ppar-γ調(diào)節(jié)僅在gm-csf存在下有效，而在具有k562-wt的培養(yǎng)物中無效。

rosi降低了用gm-csf處理的原代人單核細胞的ccl17產(chǎn)生

為了測試ppar-γ活化是否也將減少在鼠功能喪失研究中觀察到的趨化因子過表達，我們用gm-csf從人pbmc培養(yǎng)cd14+細胞。此外，這些培養(yǎng)物用dmso或rosi處理。在初步數(shù)據(jù)中，我們發(fā)現(xiàn)rosi處理降低了用gm-csf處理的人單核細胞的ccl17產(chǎn)生(圖36)。

rosi沒有影響貼壁pbmc中的對照或gm處理的單核細胞的激活狀態(tài)

我們接下來評價rosi處理對培養(yǎng)中的骨髓細胞的影響?；谏⑸浜蚦d14陽性計算總骨髓細胞。將hla-dr和cd40表達定量為活化的量度。此外，貼壁細胞表達cd1c，暗示樹突細胞表型(數(shù)據(jù)未顯示)。在rosi處理的對照或gm條件中，骨髓細胞總數(shù)，cd1c的活化狀態(tài)或表達不受影響(圖37)。

討論

上述研究顯示ppar-γ在抑制gm-csf誘導的treg中的作用在人類中是保守的。在pbmc培養(yǎng)中，所有細胞暴露于rosi，因此我們可能觀察到對各種細胞類型的作用的總和。然而，重要的是注意到，rosi能夠僅在存在gm-csf的情況下降低treg數(shù)，這意味著需要骨髓細胞。與鼠數(shù)據(jù)一起，我們的研究已經(jīng)確定了ppar-γ的新穎和治療上重要的功能。