本發(fā)明涉及由人乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus，hpv)感染引起的宮頸腫瘤的治療。特別地，本發(fā)明提供了用于改善宮頸腫瘤治療的方法和用于治療由hpv感染引起的宮頸腫瘤的方法。持續(xù)性病毒感染通常誘導(dǎo)病毒特異性cd8t細(xì)胞的功能性失活，損害其增殖能力，產(chǎn)生免疫刺激性細(xì)胞因子，并裂解被病毒感染細(xì)胞(wherry，e.j.和ahmed，r.，journalofvirology78：5535-5545，2004)。宮頸癌是全世界女性癌癥死亡的首要原因之一(einstein，m.h.，等thelancetinfectiousdiseases9：347-356(2009)；parkin，d.m.和bray，f.，vaccine24(3s)：11-25，2007)，并且其中約75％的病例是由最常見的高風(fēng)險人乳頭瘤病毒(hpv)類型(即hpv16和hpv18)的持續(xù)感染引起的(schiffman，m.，等，lancet370：890-907，2007；forman，d.，等，vaccine30(5s)：f12-23，2012)。hpv持續(xù)性通常與缺乏可證實的hpv特異性t細(xì)胞免疫相關(guān)，并且據(jù)報道在見于惡化前和惡性患者中的病毒特異性t細(xì)胞通常是功能障礙的，且有時甚至是抑制性的(devosvansteenwijk，p.j.，等，clinicalcancerresearch：anofficialjournaloftheamericanassociationforcancerresearch14：7188-7195，2008；trimble，c.l.，cancerimmunology，immunotherapy：cii59：799-803，2010)。這些研究結(jié)果表明病毒特異性t細(xì)胞的功能損傷可能與hpv誘導(dǎo)的宮頸癌的出現(xiàn)相關(guān)。宮頸癌通過高危hpv感染、病毒持續(xù)、克隆擴(kuò)增和持續(xù)感染的細(xì)胞分化為惡化前病變，并逐漸轉(zhuǎn)化為侵襲性癌癥的過程而產(chǎn)生(schiffman，m.，等，lancet370：890-907，2007)。惡化前宮頸上皮內(nèi)瘤變2和3(cervicalintraepithelialneoplasia，cin2和3)，特別是對hpv16陽性的那些，被認(rèn)為是具有約30％的機(jī)會發(fā)展成侵襲性癌的高等級病變(moscicki，a.b.，等，vaccine30(5s)：f24-33，2012)。因此，迫切需要一種有效的治療性疫苗，其可以預(yù)防持續(xù)性hpv感染的嚴(yán)重并發(fā)癥并根除hpv相關(guān)的瘤變。hpve6和e7通過分別結(jié)合并促進(jìn)腫瘤抑制蛋白p53和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(prb)的降解而起到病毒癌蛋白的作用(yugawa，t.和kiyono，t.，reviewsinmedicalvirology19：97-113，2009)。這些病毒癌蛋白是用于針對cin2/3和宮頸癌的治療性疫苗的理想靶標(biāo)組，不僅因為這些蛋白質(zhì)誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生，而且還因為它們在hpv感染的惡化前和惡性細(xì)胞中組成型表達(dá)(yugawa，t.和kiyono，t.，reviewsinmedicalvirology19：97-113，2009)。由于宮頸病變的消退與細(xì)胞(而不是體液)免疫應(yīng)答的存在相關(guān)(deligeoroglou，e.，等，infectiousdiseasesinobstetricsandgynecology2013：540850，2013；woo，y.l.，等，internationaljournalofcancerjournalinternationalducancer126：133-141，2010)，因此非常需要能夠選擇性誘導(dǎo)穩(wěn)健的e6/e7特異性t細(xì)胞免疫的治療性疫苗。發(fā)明簡述本發(fā)明涉及鑒定不需要手術(shù)摘除宮頸腫瘤的對象的方法，其包括向所述對象施用有效量的編碼融合蛋白的多核苷酸，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在一些具體實施方案中，本文中所述的方法還包括測量對象在施用后的提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，本文中所述的方法還包括指導(dǎo)護(hù)理提供者測量對象在施用后的提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。還公開了在不進(jìn)行手術(shù)的情況下治療宮頸腫瘤的方法，其包括施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中所述細(xì)胞免疫應(yīng)答在施用后提高為至少2倍，并且其中在不進(jìn)行手術(shù)的情況下從所述對象中摘除所述宮頸腫瘤。還公開了治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定在施用編碼融合蛋白的多核苷酸之后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(b)確定所述對象適于手術(shù)摘除宮頸腫瘤，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了在有此需要的對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定在施用編碼融合蛋白的多核苷酸之后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(b)指導(dǎo)護(hù)理提供者對對象進(jìn)行手術(shù)以摘除宮頸腫瘤，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還提供了在有此需要的對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，(b)鑒定在施用融合蛋白后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(c)確定所述對象適于手術(shù)摘除宮頸腫瘤，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在一些實施方案中，鑒定對象的操作包括測量提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。還公開了在有此需要的對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括向?qū)ο笕后w施用編碼融合蛋白的多核苷酸，其中每個對象均攜帶人白細(xì)胞抗原(humanleucocyteantigen，hla)-a02，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了在對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定攜帶hla-a02的對象，和(b)施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括(a)向?qū)ο笕后w施用編碼融合蛋白的多核苷酸，每個對象均攜帶人白細(xì)胞抗原(hla)-a02，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括(a)鑒定攜帶hla-a02的對象，和(b)向所述對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含兩個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。一些實施方案公開了改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括(a)提供從有此需要的對象獲得的血液樣品以鑒定hla類型，和(b)向攜帶hla-a02的對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在一些實施方案中，對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。還公開了治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，和(b)如果所述對象在施用所述第一劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則進(jìn)一步向所述對象施用第二劑量的所述多核苷酸，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，(b)測量施用后的細(xì)胞免疫應(yīng)答，和(c)將第二劑量的多核苷酸施用于在施用第一劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了本文中所述的方法，其還包括在施用第二劑量后測量細(xì)胞免疫應(yīng)答。還公開了本文中所述的方法，其還包括施用第三劑量的多核苷酸。某些實施方案公開了治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量和第二劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，和(b)如果所述對象在施用所述第一劑量或所述第二劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則進(jìn)一步向所述對象施用第三劑量的所述多核苷酸，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量和第二劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，(b)在施用第一劑量或第二劑量后測量細(xì)胞免疫應(yīng)答，和(c)如果對象在施用第一或第二劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則向?qū)ο笫┯玫谌齽┝康亩嗪塑账?，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了在有此需要的對象中提高全身性hpv特異性多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包括施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，并且其中所述多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括ifn-γ、il-2、tnf-α或其任意組合的提高的表達(dá)。還公開了包含藥物組合物的藥盒(pharmaceuticalkit)，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及如果在施用有效量的藥物組合物后的細(xì)胞免疫應(yīng)答沒有提高則進(jìn)行手術(shù)以摘除宮頸腫瘤的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及將有效量的藥物組合物施用于在施用初始量的多核苷酸后顯示提高數(shù)目的多功能t細(xì)胞的對象的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及向攜帶hla-a02的對象施用有效量的藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及將有效量的藥物組合物施用于在施用初始量的多核苷酸后顯示數(shù)目提高的多功能t細(xì)胞的對象的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。還公開了包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及如果單一劑量或兩個劑量的藥物組合物不使對象表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答則停止進(jìn)一步施用所述藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。實施方案實施方案(e)1.鑒定不需要手術(shù)摘除宮頸腫瘤的對象的方法，其包括向所述對象施用有效量的編碼融合蛋白的多核苷酸，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e2.實施方案e1所述的方法，其還包括測量施用后所述對象的提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。e3.實施方案e1所述的方法，其還包括指導(dǎo)護(hù)理提供者測量施用后對象的提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。e4.在不進(jìn)行手術(shù)的情況下治療宮頸腫瘤的方法，其包括施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中所述細(xì)胞免疫應(yīng)答在施用后提高為至少2倍，并且其中在不進(jìn)行手術(shù)的情況下從所述對象中摘除所述宮頸腫瘤。e5.治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定在施用編碼融合蛋白的多核苷酸后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(b)確定所述對象適于手術(shù)摘除宮頸腫瘤，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e6.在有此需要的對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定在施用編碼融合蛋白的多核苷酸后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(b)指導(dǎo)護(hù)理提供者對所述對象進(jìn)行手術(shù)摘除子宮頸腫瘤，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e7.治療有此需要的對象中的宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，(b)鑒定在施用融合蛋白后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(c)確定所述對象適于手術(shù)摘除宮頸腫瘤，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e8.實施方案e5至e7中任一項所述的方法，其中鑒定對象的操作包括測量提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。e9.在有此需要的對象群體中治療宮頸腫瘤的方法，其包括向所述對象群體施用編碼融合蛋白的多核苷酸，其中每個對象均攜帶人白細(xì)胞抗原(hla)-a02，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e10.在有此需要的對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定攜帶hla-a02的對象，和(b)向所述對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e11.改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括向?qū)ο笕后w施用編碼融合蛋白的多核苷酸，其中每個對象均攜帶人白細(xì)胞抗原(hla)-a02，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e12.改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括(a)鑒定攜帶hla-a02的對象，和(b)向所述對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含兩個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e13.改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括：(a)提供從有此需要的對象獲得的血液樣品以鑒定hla類型，和(b)向攜帶hla-a02的對象施用編碼融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e14.實施方案e9至e13中任一項所述的方法，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。e15.治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，和(b)進(jìn)一步向在施用所述第一劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象施用第二劑量的所述多核苷酸，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e16.治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，(b)測量施用后的細(xì)胞免疫應(yīng)答，和(c)將第二劑量的多核苷酸施用于在施用第一劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e17.實施方案e15或e16所述的方法，其還包括在施用所述第二劑量后測量細(xì)胞免疫應(yīng)答。e18.實施方案e15至e17中任一項所述的方法，其還包括施用第三劑量的多核苷酸。e19.治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量和第二劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，和(b)進(jìn)一步向在施用所述第一劑量或所述第二劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象施用第三劑量的所述對象的多核苷酸，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e20.治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量和第二劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，(b)在施用第一劑量或第二劑量后測量細(xì)胞免疫應(yīng)答，和(c)如果對象在施用第一或第二劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則向?qū)ο笫┯玫谌齽┝康亩嗪塑账?，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e21.實施方案e15至e20中任一項所述的方法，其中所述第一劑量為至少約0.5mg、至少約1mg、至少約1.5mg、至少約2mg、至少約2.5mg、至少約3mg、至少約3.5mg、至少約4mg、至少約4.5mg或至少約5mg。e22.實施方案e15至e21中任一項所述的方法，其中所述第二劑量為至少約0.5mg、至少約1mg、至少約1.5mg、至少約2mg、至少約2.5mg、至少約3mg、至少約3.5mg、至少約4mg、至少約4.5mg或至少約5mg。e23.實施方案e15至e22中任一項所述的方法，其中所述第一劑量和所述第二劑量相同或不同。e24.實施方案e18至e23中任一項所述的方法，其中所述第三劑量為至少約0.5mg、至少約1mg、至少約1.5mg、至少約2mg、至少約2.5mg、至少約3mg、至少約3.5mg、至少約4mg、至少約4.5mg或至少約5mg。e25.實施方案e18至e24中任一項所述的方法，其中所述第一劑量、所述第二劑量和所述第三劑量相同。e26.實施方案e18至e24中任一項所述的方法，其中所述第一劑量、所述第二劑量和所述第三劑量不同。e27.實施方案e15至e26中任一項所述的方法，其中所述第一劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg，并且第二劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg。e28.實施方案e18至e27中任一項所述的方法，其中所述第三劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg。e29.實施方案e15至e28中任一項所述的方法，其中所述第一劑量為約1mg至約4mg，并且所述第二劑量為約1mg至約4mg。e30.實施方案e18至e29中任一項所述的方法，其中所述第三劑量為約1mg至約4mg。e31.實施方案e30所述的方法，其中所述第一劑量為約1mg，所述第二劑量為約1mg，并且所述第三劑量為約1mg。e32.實施方案e30所述的方法，其中所述第一劑量為約2mg，所述第二劑量為約2mg，并且所述第三劑量為約2mg。e33.實施方案e30所述的方法，其中所述第一劑量為約4mg，所述第二劑量為約4mg，并且所述第三劑量為約4mg。e34.實施方案e1至e8和e14至e33中任一項所述的方法，其中所述提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答是提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答、提高的cd4t細(xì)胞應(yīng)答、提高的細(xì)胞因子分泌或其任意組合。e35.實施方案e1至e8和e14至e34中任一項所述的方法，其中所述提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答是多功能t細(xì)胞的數(shù)目提高。e36.實施方案e1至e8和e14至e35中任一項所述的方法，其中當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)測量時，所述多功能t細(xì)胞表現(xiàn)出選自ifn-γ、il-2、tnf-α、mip-β和cd107a/b的至少三種、至少四種或至少五種標(biāo)志物。e37.實施方案e35或e36所述的方法，其中所述多功能t細(xì)胞的數(shù)目比施用多核苷酸之前多功能t細(xì)胞的數(shù)目提高了至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％或至少約30％。e38.實施方案e34所述的方法，其中所述提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括1fn-γ、il-2、tnf-α、mip-β、cd107a/b或其任意組合的提高的表達(dá)。e39.實施方案e34所述的方法，其中所述提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括提高的cd38+ki67+cd8t細(xì)胞。e40.實施方案e39所述的方法，其中所述提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答是cd38+ki67+cd8t細(xì)胞數(shù)目的至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍或至少約25倍提高。e41.實施方案e34至e40中任一項所述的方法，其中通過流式細(xì)胞術(shù)測量所述提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答。e42.實施方案e34至e41中任一項所述的方法，其中所述提高的cd4t細(xì)胞應(yīng)答包括提高的ifn-γ+cd4細(xì)胞。e43.實施方案e34至e42中任一項所述的方法，其中所述提高的cd4t細(xì)胞應(yīng)答是ifn-γ+cd4細(xì)胞數(shù)目至少約1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.0倍提高。e44.實施方案e34至e43中任一項所述的方法，其中所述提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答包括提高的hpv16和hpv18e6和e7特異性ifn-γ應(yīng)答。e45.實施方案e44所述的方法，其中通過ifn-γelispot測定來測量ifn-γ應(yīng)答。e46.實施方案e34至e45中任一項所述的方法，其中所述提高的細(xì)胞因子表達(dá)包括ifn-γ、il-2、tnf-α或其任意組合的提高的表達(dá)。e47.實施方案e46所述的方法，其中所述ifn-γ表達(dá)相對于施用前的水平提高為至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍。e48.實施方案e46所述的方法，其中所述il-2表達(dá)相對于施用前的水平提高為至少2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。e49.實施方案e46所述的方法，其中所述tnf-α表達(dá)相對于施用前的水平提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍或至少約25倍。e50.實施方案e1至e49中任一項所述的方法，其中il-4或il-17a表達(dá)在施用后不提高。e51.實施方案e15至e50中任一項所述的方法，其中所述第二劑量在第一劑量至少約1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周后施用。e52.實施方案e18至e51中任一項所述的方法，其中所述第三劑量在第二劑量至少約1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周后施用。e53.實施方案e1至e52中任一項所述的方法，其中所述多核苷酸通過電穿孔施用。e54.實施方案e1至e53中任一項所述的方法，其中所述宮頸腫瘤是良性腫瘤或惡性腫瘤。e55.實施方案e1至e54中任一項所述的方法，其中所述宮頸腫瘤是鱗狀細(xì)胞癌(squamouscellcarcinoma，scc)、腺癌(adenocarcinoma)、腺鱗癌(adenosquamouscarcinoma)、小細(xì)胞癌(smallcellcarcinoma)、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrinetumor，net)，玻璃樣細(xì)胞癌(glassycellcarcinoma)、絨毛腺癌(villoglandularadenocarcinoma，vga)、非癌惡性腫瘤(non-carcinomamalignancy)、黑素瘤(melanoma)、淋巴瘤(lymphoma)或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變(cin)。e56.實施方案e1至e55中任一項所述的方法，其中所述宮頸腫瘤是cin1、cin2、cin3或?qū)m頸癌。e57.在有此需要的對象中提高全身性hpv特異性多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包括施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，并且其中所述多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括ifn-γ、il-2、tnf-α或其任意組合的提高的表達(dá)。e58.實施方案e57所述的方法，其中所述施用包括至少兩個劑量或三個劑量。e59.實施方案e57或e58所述的方法，其中所述ifn-γ表達(dá)相對于施用前水平提高為至少5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍。e60.實施方案e57至e59中任一項所述的方法，其中所述il-2表達(dá)相對于施用前水平提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。e61.實施方案e57至e60中任一項所述的方法，其中所述tnf-α表達(dá)相對于施用前水平提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍或至少約25倍。e62.實施方案e57至e61中任一項所述的方法，其中il-4或il-17a表達(dá)在施用后不提高。e63.包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及如果在施用有效量的藥物組合物后的細(xì)胞免疫應(yīng)答沒有提高則進(jìn)行手術(shù)以摘除宮頸腫瘤的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e64.包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及將有效量的藥物組合物施用于在施用初始量的多核苷酸后顯示提高數(shù)目的多功能t細(xì)胞的對象的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e65.包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及向攜帶hla-a02的對象施用有效量的所述藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e66.實施方案e63至e65中任一項所述的藥盒，其中所述有效量為至少1mg、2mg、3mg、4mg、5mg或6mg。e67.包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及如果單一劑量或兩個劑量的藥物組合物不使對象表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答則停止進(jìn)一步施用所述藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。e68.實施方案e67所述的藥盒，其中所述單一劑量為至少約0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg或5mg。e69.實施方案e67或e68所述的藥盒，其中所述兩個劑量包含第一劑量和第二劑量，其中所述第一劑量為至少約0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg或5mg；并且所述第二劑量為至少約0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg或5mg。e70.實施方案e67至e69中任一項所述的藥盒，其中所述第一劑量和所述第二劑量相同。e71.實施方案e67至e69中任一項所述的藥盒，其中所述第一劑量和所述第二劑量不同。e72.實施方案e67至e71中任一項所述的藥盒，其中所述第一劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg；并且所述第二劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg。e73.實施方案e67至e71中任一項所述的藥盒，其中所述第一劑量為約1mg至4mg，并且所述第二劑量為約1mg至約4mg。e74.實施方案e73所述的藥盒，其中所述第一劑量為約1mg，并且所述第二劑量為約1mg。e75.實施方案e73所述的藥盒，其中所述第一劑量為約2mg，并且所述第二劑量為約2mg。e76.實施方案e73所述的藥盒，其中所述第一劑量為約4mg，并且所述第二劑量為約4mg。e77.實施方案e1至e62中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e76中任一項所述的藥盒，其中所述融合蛋白包含至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或八個氨基酸序列，所述氨基酸序列選自：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分。e78.實施方案e1至e62和77中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e77中任一項所述的藥盒，其中所述融合蛋白包含與hpv16的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e7蛋白和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的相同數(shù)目的表位，或比hpv16的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e7蛋白和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的表位更多的表位。e79.實施方案e1至e62和e77和e78中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e78中任一項所述的藥盒，其中hpv16的e6蛋白的n末端部分、hpv16的e6蛋白的c末端部分、hpv18的e6蛋白的n末端部分和hpv18的e6蛋白的c末端部分各自不包含完整的e6相關(guān)蛋白(e6-associatedprotein，e6ap)結(jié)合位點。e80.實施方案e79所述的方法或藥盒，其中所述完整的e6ap結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：2(e6hpv16)的第35至136位氨基酸或?qū)?yīng)于seqidno：4(e6hpv18)的第30至131位氨基酸。e81.實施方案e1至e62和e77至e80中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e76和e77至e80中任一項所述的藥盒，其中hpv16的e7蛋白的n末端部分、hpv16的e7蛋白的c末端部分、hpv18的e7蛋白的n末端部分和hpv18的e7蛋白的c端部分各自不包含完整的cr2結(jié)構(gòu)域或完整的cr3結(jié)構(gòu)域。e82.實施方案e81所述的方法或藥盒，其中所述完整的cr2結(jié)構(gòu)域和cr3結(jié)構(gòu)域是對應(yīng)于seqidno：6(e7hpv16)的第18至98位氨基酸或?qū)?yīng)于seqidno：8(e7hpv18)的第21至105位氨基酸。e83.實施方案e1至e62和e77至e82中任一項所述的方法，以及實施方案e63至e76和e77至e82中任一項所述的藥盒，其中hpv16的e6蛋白的n末端部分包含與seqidno：2(16e6na-b)的n末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中a是選自對應(yīng)于seqidno：2的氨基酸殘基1或2的氨基酸，并且b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第35至135位氨基酸殘基的氨基酸，并且其中hpv16的e6蛋白的c末端部分包含與seqidno：2(16e6cc-d)的c末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中c是選自對應(yīng)于seqidno：2的等于或高于第36位氨基酸殘基和等于或低于第b+1位氨基酸的氨基酸殘基的氨基酸，并且d是選自對應(yīng)于seqidno：2的第157或158位氨基酸殘基的氨基酸。e84.實施方案e83所述的方法或藥盒，其中b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第35至39、57至62、69至85、87至88、98至99、107、109、114和135位氨基酸殘基的氨基酸。e85.實施方案e83或e84所述的方法或藥盒，其中對應(yīng)于seqidno：2，b是第35位氨基酸殘基，并且c是第36位氨基酸殘基；b是第36位氨基酸殘基，并且c是第36或37位氨基酸殘基；b是第37位氨基酸殘基，并且c是第36、37或38位氨基酸殘基；b是第38位氨基酸殘基，并且c是第36、37、38或39位氨基酸殘基；b是第39位氨基酸殘基，并且c是第36、37、38、39或40位氨基酸殘基；b是第57位氨基酸殘基，并且c是選自第36至58位氨基酸殘基的氨基酸；b是第58位氨基酸殘基，并且c是選自第36至59位氨基酸殘基的氨基酸；b是第59位氨基酸殘基，并且c是選自第36至60的氨基酸位氨基酸殘基；b是第60位氨基酸殘基，并且c是選自第36至61位氨基酸殘基的氨基酸；b是第61位氨基酸殘基，并且c是選自第36至62位氨基酸殘基的氨基酸；b是第62位氨基酸殘基，并且c是選自第36至63的氨基酸位氨基酸殘基；b是第69位氨基酸殘基，并且c是選自第36至70的氨基酸位氨基酸殘基；b是第70位氨基酸殘基，并且c是選自第36至71位氨基酸殘基的氨基酸；b是第71位氨基酸殘基，并且c是選自第36至72位氨基酸殘基的氨基酸；b是第72位氨基酸殘基，并且c是選自第36至73位氨基酸殘基的氨基酸；b是第73位氨基酸殘基，并且c是選自第36至74位氨基酸殘基的氨基酸；b是第74位氨基酸殘基，并且c是選自第36至75位氨基酸殘基的氨基酸；b是第75位氨基酸殘基，并且c是選自第36至76位氨基酸殘基的氨基酸；b是第76位氨基酸殘基，并且c是選自第36至77位氨基酸殘基的氨基酸；b是第77位氨基酸殘基，并且c是選自第36至78的氨基酸位氨基酸殘基；b是第78位氨基酸殘基，并且c是選自第36至79位氨基酸殘基的氨基酸；b是第79位氨基酸殘基，并且c是選自第36至80位氨基酸殘基的氨基酸；b是第80位氨基酸殘基，并且c是選自第36至81位氨基酸殘基的氨基酸；b是第81位氨基酸殘基，并且c是選自第36至82位氨基酸殘基的氨基酸；b是第82位氨基酸殘基，并且c是選自第36至83位氨基酸殘基的氨基酸；b是第83位氨基酸殘基，并且c是選自第36至84位氨基酸殘基的氨基酸；b是第84位氨基酸殘基，并且c是選自第36至85位氨基酸殘基的氨基酸；b是第85位氨基酸殘基，并且c是選自第36至86位氨基酸殘基的氨基酸；b是第87位氨基酸殘基，并且c是選自第36至88位氨基酸殘基的氨基酸；b是第88位氨基酸殘基，并且c是選自第36至89位氨基酸殘基的氨基酸；b是第98位氨基酸殘基，并且c是選自第36至99位氨基酸殘基的氨基酸；b是第99位氨基酸殘基，并且c是選自第36至100的氨基酸位氨基酸殘基；b是第107位氨基酸殘基，并且c是選自第36至108位氨基酸殘基的氨基酸；b是第109位氨基酸殘基，并且c是選自第36至110的氨基酸位氨基酸殘基；b是第114位氨基酸殘基，并且c是選自第36至115位氨基酸殘基的氨基酸；或者b是第135位氨基酸殘基，并且c是選自第36至136位氨基酸殘基的氨基酸。e86.實施方案e1至e62和e77至e85中任一項所述的方法和實施方案e63至e85中任一項所述的藥盒，其中hpv18的e6蛋白的n末端部分包含與seqidno：4(18e6ni-j)的n末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中i是選自對應(yīng)于seqidno：4的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且j是選自對應(yīng)于seqidno：4的第30至130位氨基酸殘基的氨基酸，并且其中hpv18的e6蛋白的c末端部分包含與seqidno：4(18e6ck-1)的c末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中k是選自對應(yīng)于seqidno：4的等于或高于第31位氨基酸殘基和等于或低于第j+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且l是選自對應(yīng)于seqidno：4的第157或158位氨基酸殘基的氨基酸。e87.實施方案e85所述的方法或藥盒，其中j是選自對應(yīng)于seqidno：4的第30至34、52至57、64至80、82至83、93、94、102、104、109和130位氨基酸殘基的氨基酸。e88.實施方案e86或e87所述的方法或藥盒，其中對應(yīng)于seqidno：4，j是第30位氨基酸殘基，并且k是第31位氨基酸殘基；j是第31位氨基酸殘基，并且k是第31或32位氨基酸殘基；j是第32位氨基酸殘基，并且k是第31、32或33位氨基酸殘基；j是第33位氨基酸殘基，并且k是第31、32、33或34位氨基酸殘基；j是第34位氨基酸殘基，并且k是第31、32、33、34或35位氨基酸殘基；j是第52位氨基酸殘基，并且k是選自第31至53位氨基酸殘基的氨基酸；j是第53位氨基酸殘基，并且k是選自第31至54位氨基酸殘基的氨基酸；j是第54位氨基酸殘基，并且k是選自第31至55位氨基酸殘基的氨基酸；j是第55位氨基酸殘基，并且k是選自第31至56位氨基酸殘基的氨基酸；j是第56位氨基酸殘基，并且k是選自第31至57位氨基酸殘基的氨基酸；j是第57位氨基酸殘基，并且k是選自第31至58位氨基酸殘基；j是第64位氨基酸殘基，并且k是選自第31至65位氨基酸殘基的氨基酸；j是第65位氨基酸殘基，并且k是選自第31至66位氨基酸殘基的氨基酸；j是第66位氨基酸殘基，并且k是選自第31至67位氨基酸殘基的氨基酸；j是第67位氨基酸殘基，并且k是選自第31至68位氨基酸殘基的氨基酸；j是第68位氨基酸殘基，并且k是選自第31至69位氨基酸殘基的氨基酸；j是第69位氨基酸殘基，并且k是選自第31至70位氨基酸殘基的氨基酸；j是第70位氨基酸殘基，并且k是選自第31至71位氨基酸殘基的氨基酸；j是第71位氨基酸殘基，并且k是選自第31至72位氨基酸殘基的氨基酸；j是第72位氨基酸殘基，并且k是選自第31至73位氨基酸殘基的氨基酸；j是第73位氨基酸殘基，并且k是選自第31至74位氨基酸殘基的氨基酸；j是第74位氨基酸殘基，并且k是選自第31至75位氨基酸殘基的氨基酸；j是第75位氨基酸殘基，并且k是選自第31至76的氨基酸位氨基酸殘基；j是第76位氨基酸殘基，并且k是選自第31至77的氨基酸位氨基酸殘基；j是第77位氨基酸殘基，并且k是選自第31至78位氨基酸殘基的氨基酸；j是第78位氨基酸殘基，并且k是選自第31至79位氨基酸殘基的氨基酸；j是第79位氨基酸殘基，并且k是選自第31至80位氨基酸殘基的氨基酸；j是第80位氨基酸殘基，并且k是選自第31至81位氨基酸殘基的氨基酸；j是第82位氨基酸殘基，并且k是選自第31至83位氨基酸殘基的氨基酸；j是第83位氨基酸殘基，并且k是選自第31至84位氨基酸殘基的氨基酸；j是第93位氨基酸殘基，并且k是選自第31至94位氨基酸殘基的氨基酸；j是第94位氨基酸殘基，并且k是選自第31至95位氨基酸殘基的氨基酸；j是第102位氨基酸殘基，并且k是選自第31至103位氨基酸殘基的氨基酸；j是第104位氨基酸殘基，并且k是選自第31至105位氨基酸殘基的氨基酸；j是第109位氨基酸殘基，并且k是選自第31至110位氨基酸殘基的氨基酸；或者j是第130位氨基酸殘基，并且k是選自第31至131位氨基酸殘基的氨基酸。e89.實施方案e1至e62和e77至e88中任一項所述的方法和em63至88中任一項所述的藥盒，其中hpv16的e7蛋白的n末端部分包含與seqidno：6(16e7ne-f)的n末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中e是選自對應(yīng)于seqidno：6的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至97位氨基酸殘基的氨基酸，并且其中hpv16的e7蛋白的c末端部分包含與seqidno：6(16e7cg-h)的c末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中g(shù)是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第19位的氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且h是選自對應(yīng)于seqidno：6的第97或98位氨基酸殘基的氨基酸。e90.實施方案e89所述的方法或藥盒，其中f為選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至39和44至97位氨基酸殘基的氨基酸。e91.實施方案e89或e90所述的方法或藥盒，其中f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至39位的氨基酸殘基，并且g是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第19位的氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸殘基的氨基酸，或者其中f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第44至97位氨基酸殘基的氨基酸殘基，并且g是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第45位氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸的氨基酸殘基的氨基酸。e92.實施方案e1至e62和e77至e91中任一項所述的方法和實施方案e63至e91中任一項所述的藥盒，其中hpv18的e7蛋白的n-末端部分包含與seqidno：8(18e7nm-n)的n末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中m是選自對應(yīng)于seqidno：8的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且n是選自對應(yīng)于seqidno：8的第21至104位氨基酸殘基的氨基酸，并且其中hpv18的e7蛋白的c末端部分包含與seqidno：8(18e7co-p)的c末端序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中o是選自對應(yīng)于seqidno：8的等于或高于第22位氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且p是選自對應(yīng)于seqidno：8的第104或105位氨基酸殘基的氨基酸。e93.實施方案e92所述的方法或藥盒，其中n為選自對應(yīng)于seqidno：8的第21至42和47至104位氨基酸殘基的氨基酸。e94.實施方案e92或e93所述的方法或藥盒，其中對應(yīng)于seqidno：8，n是選自第21至41位的氨基酸殘基，并且o是選自等于或高于第22位氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸，或其中n是選自氨基酸殘基47至104的氨基酸殘基，并且o是選自等于或高于第48位氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸。e95.實施方案e1至e62和e77至e94中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e94中任一項所述的藥盒，其中所述融合蛋白不包含hpv16的天然存在的全長e6蛋白、hpv16的天然存在的全長e7蛋白、hpv18的天然存在的全長e6蛋白和hpv18的天然存在的全長e7蛋白。e96.實施方案e95所述的方法或藥盒，其中所述融合蛋白包含：從n末端至c末端，(i)16e6na-b-16e7ne-f-16e6cc-d-16e7cg-h-18e6ni-j-18e7nm-n-18e6ck-l-18e7co-p；(ii)18e6ni-j-18e7nm-n-18e6ck-1-18e7co-p-16e6na-b-16e7ne-f-16e6cc-d-16e7cg-h；(iii)16e7ne-f-16e6na-b-16e7cg-h-16e6cc-d-18e7nm-n-18e6ni-j-18e7co-p-18e6ck-l；(iv)18e7nm-n-18e6ni-j-18e7co-p-18e6ck-l-16e7ne-f-16e6na-b-16e7cg-h-16e6cc-d；(v)18e6ni-j-16e7ne-f-16e6cc-d-18e6ck-l-18e7nm-n-16e6na-b-18e7co-p-16e7cg-h；(vi)16e6na-b-18e6ni-j-18e7co-p-16e6cc-d-16e7ne-f-18e7nm-n-16e7cg-h-18e6ck-l；(vii)18e7nm-n-16e6na-b-18e7co-p-16e7cg-h-16e7ne-f-18e6ni-j-16e6cc-d-18e6ck-l；或(viii)16e7ne-f-18e6ni-j-16e7cg-h-18e7co-p-18e7nm-n-16e6na-b-18e6ck-l-16e6cc-d。e97.實施方案e96所述的方法或藥盒，其中所述融合蛋白包含：從n末端至c末端，16e6na-b-16e7ne-f-16e6cc-d-16e7cg-h-18e6ni-j-18e7nm-n-18e6ck-l-18e7co-p，a是seqidno：2的第1位氨基酸殘基，b是seqidno：2的第85位氨基酸殘基，c是seqidno：2的第71位氨基酸殘基，d為seqidno：2的第158位氨基酸殘基，e是seqidno：6的第1位氨基酸殘基，f是seqidno：6的第65位氨基酸殘基，g是seqidno：6的第51位氨基酸殘基，h為seqidno：6的第98位氨基酸殘基，i是seqidno：4的第1位氨基酸殘基，j是seqidno：4的第85位氨基酸殘基，k是seqidno：4的第71位氨基酸殘基，l是seqidno：4的第158位氨基酸殘基，m是seqidno：8的第1位氨基酸殘基，n是seqidno：8的第65位氨基酸殘基，o是seqidno：8的第51位氨基酸殘基，且p是seqidno：8的第105位氨基酸殘基。e98.實施方案e95所述的方法和藥盒，其中所述融合蛋白包含與seqidno：10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。e99.實施方案e95至e98中任一項所述的方法或藥盒，其中所述多核苷酸對于人表達(dá)是密碼子優(yōu)化的。e100.實施方案e95至e99中任一項所述的方法或藥盒，其中所述多核苷酸包含與seqidno：9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列。e101.實施方案e1至e62和e77至e100中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e100中任一項所述的藥盒，其中所述多核苷酸還包含編碼異源多肽的核酸序列。e102.實施方案e101所述的方法或藥盒，其中所述異源多肽包含fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(“flt3l”)或其一部分。e103.實施方案e102所述的方法或藥盒，其中所述flt3l或其一部分包含flt3l的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。e104.實施方案e102或e103所述的方法或藥盒，其中所述flt3l或其一部分包含與seqidno：12具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。e105.實施方案e101至e104中任一項所述的方法或藥盒，其中所述編碼異源多肽的核酸序列包含與seqidno：11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。e106.實施方案e1至e62和e77至e105中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐63至e105中任一項所述的藥盒，其中所述多核苷酸還包含編碼信號肽的核苷酸序列。e107.實施方案e106所述的方法或藥盒，其中所述信號肽選自：組織纖溶酶原激活物(tissueplasminogenactivator，tpa)的信號肽、單純皰疹病毒糖蛋白d(herpessimplexvirusglycoproteind，hsvgd)的信號肽、生長激素的信號肽及其任意組合。e108.實施方案e106所述的方法或藥盒，其中所述信號肽是tpa的信號肽。e109.實施方案e108所述的方法或藥盒，其中所述信號肽包含與seqidno：14具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。e110.實施方案e109所述的方法或藥盒，其中所述編碼信號肽的核苷酸序列包含與seqidno：13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。e111.實施方案e1至e62和e77至e110中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐77至e110中任一項所述的藥盒，其中所述多核苷酸是載體。e112.實施方案e111所述的方法或藥盒，其中所述載體是質(zhì)粒。e113.實施方案e112所述的方法或藥盒，其中所述質(zhì)粒還包含sv40polya序列、sv40增強(qiáng)子、pcmv啟動子、givs或其任意組合。e114.實施方案e113所述的方法或藥盒，其中所述質(zhì)粒還包含sv40polya序列、sv40增強(qiáng)子、cole1、pcmv啟動子和givs。e115.實施方案e1至e62和e77至e114中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐77至e114中任一項所述的藥盒，其中所述多核苷酸是dna或rna。e116.實施方案e1至e62和e77至e115中任一項所述的方法或?qū)嵤┓桨竐77至e115中任一項所述的藥盒，其中所述多核苷酸是dna疫苗。e117.制備編碼融合蛋白的多核苷酸的方法，所述融合蛋白有效治療或預(yù)防由人乳頭瘤病毒感染引起的宮頸腫瘤，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含選自以下的至少三個氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，以及(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。e118.實施方案e117所述的方法，其中所述融合蛋白不包含完整的e6相關(guān)蛋白(ap)結(jié)合位點。e119.制備編碼融合蛋白的多核苷酸的方法，所述融合蛋白有效治療或預(yù)防由人乳頭瘤病毒感染引起的宮頸腫瘤，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼融合蛋白的多核苷酸，其包含：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白包含hpv16和hpv18的天然存在的e6蛋白以及hpv16和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的至少所有免疫原性表位，和(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，其中所述融合蛋白被表達(dá)。e120.去除融合蛋白中的p53結(jié)合位點和prb結(jié)合位點的方法，所述融合蛋白包含hpv16的e6蛋白的序列、hpv16的e7蛋白的序列、hpv18的e6蛋白的序列和hpv18的e7蛋白的序列，同時也包含hpv16的天然存在的e6蛋白、hpv16的天然存在的e7蛋白、hpv18的天然存在的e6蛋白和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的至少所有免疫原性表位，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中(a)hpv16的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：2的第35至135位氨基酸的c末端被分割成hpv16的e6蛋白的n末端部分(16e6na-b)和hpv16的e6蛋白的c-末端部分(16e6cc-d)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv16的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(b)hpv16的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：6的第18至97位氨基酸的c末端被分割成hpv16的e7蛋白的n末端部分(16e7ne-f)和hpv16的e7蛋白的c-末端部分(16e7g-h)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv16的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(c)hpv18的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：6的第30至130位氨基酸的c末端被分割成hpv18的e6蛋白的n末端部分(18e6ni-j)和hpv18的e6蛋白的c-末端部分(18e6nk-l)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv18的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；和(d)hpv18的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：8的第21至104位氨基酸的c末端被分割成hpv18的e7蛋白的n末端部分(18e7nm-n)和hpv18的e7蛋白的c-末端部分(18e7co-p)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv18的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列。(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。e121.實施方案e120所述的方法，其中(a)中hpv16的e6蛋白的所述重疊序列包含至少一個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少三個氨基酸、至少四個氨基酸、至少五個氨基酸、至少10個氨基酸、至少15個氨基酸或至少20個氨基酸；(b)中hpv16的e7蛋白的所述重疊序列包含至少一個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少三個氨基酸、至少四個氨基酸、至少五個氨基酸、至少10個氨基酸、至少15個氨基酸或至少20個氨基酸；(c)中hpv18的e6蛋白的所述重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；或(d)中hpv18的e7蛋白的所述重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸。e122.防止融合蛋白中hpv16和/或hpv18的e6蛋白和/或hpv16和/或hpv18的e7蛋白的同源二聚體形成的方法，所述融合蛋白包含hpv16的e6蛋白的序列、hpv16的e7蛋白的序列、hpv18的e6蛋白的序列和hpv18的e7蛋白的序列，同時也包含hpv16的e6蛋白、hpv16的e7蛋白、hpv18的e6蛋白和hpv18的e7蛋白的所有免疫原性表位，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中(a)hpv16的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：2的第37至72位氨基酸的c末端被分割成hpv16的e6蛋白的n末端部分(16e6na-b)和hpv16的e6蛋白的c-末端部分(16e6cc-d)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv16的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(b)hpv16的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：6的第44至97位氨基酸的c末端被分割成hpv16的e7蛋白的n末端部分(16e7ne-f)和hpv16的e7蛋白的c-末端部分(16e7g-h)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv16的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(c)hpv18的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：4的第32至67位氨基酸的c末端被分割成hpv18的e6蛋白的n末端部分(18e6ni-j)和hpv18的e6蛋白的c-末端部分(18e6nk-l)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv18的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；和(d)hpv18的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：8的第47至104位氨基酸的c末端被分割成hpv18的e7蛋白的n末端部分(18e7nm-n)和hpv18的e7蛋白的c-末端部分(18e7co-p)，當(dāng)將其在一起比對時，包含hpv18的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列。(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。e123.實施方案122所述的方法，其中(a)中hpv16的e6蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；(b)中hpv16的e7蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；(c)中hpv18的e6蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；或(d)中hpv18的e7蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸。e124.實施方案117至123中任一項所述的方法，其中所述融合蛋白不是seqidno：10。附圖說明圖1a示出了治療分子(例如，hpve6/e7dna治療性疫苗，命名為gx-188)的圖。圖1a顯示了通過將混編的hpv16和hpv18類型的e6和e7基因的重疊n-和c-末端結(jié)構(gòu)域插入pgx27載體中構(gòu)建的gx-188疫苗。在e6和e7結(jié)構(gòu)域之前是組織纖溶酶原激活物(tpa)的分泌信號序列和fms樣酪氨酸激酶-3配體(flt3l)的胞外結(jié)構(gòu)域。插入的病毒結(jié)構(gòu)域根據(jù)hpv株、基因和結(jié)構(gòu)域而縮寫；例如，16e6n代表hpv16e6的n末端結(jié)構(gòu)域。使用的其他縮寫：mcs，多克隆位點(multi-cloningsite)；sv40polya，猿猴病毒40晚期多腺苷酸化序列(simianvirus40latepolyadenylationsequence)；sv40增強(qiáng)子，猿猴病毒40增強(qiáng)子(simianvirus40enhancer)；kanr，卡那霉素抗性基因(kanamycinresistancegene)；cole1，cole1型細(xì)菌復(fù)制起點(cole1-typebacterialoriginofreplication)；pcmv，巨細(xì)胞病毒早期增強(qiáng)子/啟動子(cytomegalovirusearlyenhancer/promoter)；givs，兔β-珠蛋白介入序列(rabbitβ-globininterveningsequence)。每個基因區(qū)段上方的數(shù)字表示相應(yīng)的氨基酸序列。圖1b顯示了臨床試驗的示意圖。臨床試驗有三個階段：篩選所招募的患者，通過3次注射疫苗進(jìn)行治療，并對患者進(jìn)行隨訪監(jiān)測。在要檢查的指定時間點和/或接受疫苗接種的這三個時期期間患者對診所進(jìn)行了篩查訪問(vs，visitsforscreening)、治療訪問(vt，visitsfortreatment)和隨訪監(jiān)測訪問(vf，visitsforfollow-upmonitoring)。圖2a-2c顯示了gx-188e6/e7融合蛋白的亞細(xì)胞定位及其對細(xì)胞p53和prb蛋白降解的影響。用pgx27對照載體、插入有野生型e6或e7基因的pgx27或gx-188轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時，制備細(xì)胞裂解物，并通過免疫印跡分析蛋白質(zhì)表達(dá)。圖2a顯示重懸于裂解緩沖液a(10mmhepes，ph7.9，10mmkcl，0.2mmedta，1mmdtt，0.25mmpmsf和蛋白酶抑制劑混合物)中的細(xì)胞，并收集提取物的上清液作為細(xì)胞質(zhì)提取物。將沉淀重懸于緩沖液b(20mmhepes，ph7.9，420mmnacl，2mmedta，1mmdtt，10.25mmpmsf和pic)中，并且收集其沉淀后的上清液作為核提取物。通過針對微管蛋白和核纖層蛋白進(jìn)行western印跡檢測級分的純度，以分別確定細(xì)胞質(zhì)和核級分。圖2b和2c顯示重懸于裂解緩沖液(20mmhepes，ph7.4，150mmnacl，5mmedta，10％甘油，0.5％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf，1mmnaf，1mmna3vo4和pic)中的細(xì)胞。收集上清液作為全細(xì)胞裂解物。圖2b顯示對細(xì)胞p53蛋白的表達(dá)水平的分析。圖2c顯示對細(xì)胞prb蛋白表達(dá)水平的分析。圖3a-3i顯示通過電穿孔接種gx-188誘導(dǎo)顯著的hpvl6和hpv18e6/e7特異性ifn-γ應(yīng)答。在以gx-188向所有患者接種前(vs)、接種期間(vt2，vt4)和接種后(vf1，vf2)收獲患者的外周血單核細(xì)胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)，并冷凍保存。在指定時間點用hpv16或hpv18e6和e7肽庫刺激48小時后，通過本文中所述的ifn-γelispot測定，單獨測定pbmc中hpv16/18e6-和e7-特異性ifn-γ分泌細(xì)胞的數(shù)目。顯示了在減去背景值的斑點后，每個抗原的一式三份孔中每106個pbmc的平均斑點形成單位(sfu)，其為5.7±2.2(平均值±s.d.)。圖3a顯示在患者a01中施用1mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a01的斑點總數(shù)中的百分比為76.6％。圖3b顯示在a02中施用1mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a02的斑點總數(shù)中的百分比為69.3％。圖3c顯示在患者a03中施用1mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a03的斑點總數(shù)中的百分比為88.9％。圖3d顯示在患者a04中施用2mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a04的斑點總數(shù)中的百分比為89.2％。圖3e顯示在a05中施用2mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a05的斑點總數(shù)中的百分比為69.1％。圖3f顯示在a06中施用2mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a06的斑點總數(shù)中的百分比為89.4％。圖3g顯示在患者a07中施用4mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a07的斑點總數(shù)中的百分比為84.2％。圖3h顯示在患者a08中施用4mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a08的斑點總數(shù)中的百分比為75.1％。圖3i顯示在患者a09中施用4mggx-188的結(jié)果。在vf1處，e6特異性應(yīng)答在患者a09的斑點總數(shù)中的百分比為70.1％。在見于每個患者中的hpv類型表示在括號中。n.d；未確定(notdetermined)。圖4a-4e顯示gx-188疫苗接種引起hpv16特異性ifn-γ+cd4和/或cd8t細(xì)胞的頻率的顯著提高。對以gx-188疫苗接種之前(vs)和之后(vf1)所收獲的患者的冷凍保存的pbmc以hpv16e6和e7肽庫的組合混合物刺激13小時。通過細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，然后通過多色流式細(xì)胞術(shù)分析來測定hpv16特異性ifn-γ+cd4和cd8t細(xì)胞的頻率。圖4a顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)確定產(chǎn)生ifn-γ的cd4和cd8t細(xì)胞的設(shè)門策略(gatingstrategy)。圖4b顯示了在接種疫苗之前(vs)和之后(vf1)的cd4產(chǎn)生ifn-γ之頻率的代表性圖。圖4b顯示了圖4b圖的匯總圖。圖4d顯示了在疫苗接種前(vs)和接種后(vf1)cd8產(chǎn)生ifn-γ的頻率的代表性圖。圖4e顯示了圖4d圖的匯總圖。圖4c和4e的圖中所示的數(shù)據(jù)表示兩次獨立實驗的平均值，每次實驗重復(fù)兩次，誤差條表示s.d.。背景值由僅作為對照的培養(yǎng)基的應(yīng)答確定，對于cd4為0.004±0.002％，并且對于cd8t細(xì)胞為0.003±0.002％(平均值±s.d.)。圖5a-5f顯示gx-188免疫接種產(chǎn)生hpv16特異性th1，而不是th2或th17應(yīng)答。對在接種之前(vs)和之后(vf1+vf2)來自患者的冷凍保存的pbmc以hpv16e6和e7肽庫的混合物刺激48小時。將合并的vf1和vf2的pbmc用于所有患者，除了對其使用vf1細(xì)胞的患者a04之外，因為她在vf2之前接受了手術(shù)。使用th1/th2/th17細(xì)胞計數(shù)珠陣列試劑盒對培養(yǎng)物上清液中指定的細(xì)胞因子進(jìn)行定量。所顯示的是經(jīng)過重復(fù)的平均值±s.d.。水平虛線表示由每種細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定的截斷水平。圖5a顯示了在gx-188免疫接種后測量的ifn-γ水平。作為背景的單獨培養(yǎng)基的平均值(平均值±s.d.，pgml-1)為4.19±0.41。圖5b顯示了在gx-188免疫接種后測量的il-2水平。作為背景的單獨培養(yǎng)基的平均值(平均值±s.d.，pgml-1)為5.11±0.63。圖5c顯示了在gx-188免疫接種后測量的tnf-α的水平。作為背景的單獨培養(yǎng)基的平均值(平均值±s.d.，pgml-1)為5.58±0.88。圖5d顯示了在gx-188免疫接種后測量的il-4水平。作為背景的單獨培養(yǎng)基的平均值(平均值±s.d.，pgml-1)為3.3±0.24。圖5e顯示了在gx-188免疫接種后測量的il-10水平。對于il-10(e)，作為背景的單獨培養(yǎng)基的平均值(平均值±s.d.，pgml-1)為5.01±0.64。圖5e顯示了在gx-188免疫接種后測量的il-17a水平。作為背景的單獨培養(yǎng)基的平均值(平均值±s.d.，pgml-1)為5.45±0.28。圖6a-6f顯示gx-188疫苗接種誘導(dǎo)hpv16特異性cd8t細(xì)胞的多功能性。如圖4a-4e所示在接種前(vs)和接種(vf1)后刺激患者的pbmc，然后用多色流式細(xì)胞術(shù)分析以檢測il-2、ifn-γ、tnf-α、mip-1β和細(xì)胞毒性脫顆粒標(biāo)記物cd107a/b的hpv16特異性表達(dá)。圖6a顯示在設(shè)門cd8t細(xì)胞上共表達(dá)il-2的ifn-γ+cd8t細(xì)胞之頻率的總結(jié)圖；圖6b顯示共表達(dá)tnf-α的ifn-γ+cd8t細(xì)胞之頻率的總結(jié)圖；圖6c顯示共表達(dá)mip-1β的ifn-γ+cd8t細(xì)胞之頻率的總結(jié)圖；圖6d顯示共表達(dá)cd107a/b的ifn-γ+cd8t細(xì)胞之頻率的總結(jié)圖。圖6e顯示a08患者在接種疫苗后(vf1)的布爾設(shè)門(booleangating)之后對hpv16e6/e7肽的多功能應(yīng)答的代表圖。沿x軸列出了5個函數(shù)，cd107a/b、ifn-γ、il-2、mip-1β和tnf-α，以及它們各自的31種可能組合。x軸下方的五個橫條表示五個、四個、三個、兩個或一個功能應(yīng)答的群體。圖6f顯示了表示hpv16e6/e7特異性cd8t細(xì)胞與接種后(vf1)5種功能應(yīng)答的每種組合的相對頻率的每個餅狀圖。每個餅形圖右下角的數(shù)字表示產(chǎn)生3個或更多個功能分子的hpv16特異性cd8t細(xì)胞的百分比。a04患者的多功能譜不可用，因為用于分析的應(yīng)答cd8t細(xì)胞的頻率太低。圖中所示的數(shù)據(jù)表示兩次獨立實驗的平均值，每次實驗重復(fù)兩次，誤差條表示s.d.。背景值由僅培養(yǎng)基的應(yīng)答確定，對于ifn-γ+il-2+為0.0008±0.001％，對于ifn-γ+tnf-α+為0.0016±0.0014％，對于ifn-γ+mip-1β+，0.0015±0.0019％，對于ifn-γ+il-2+cd8t細(xì)胞為0.0009±0.0012％(平均值±s.d.)。圖7a-7e示出gx-188接種強(qiáng)烈誘導(dǎo)hpv16特異性cd8t細(xì)胞的多功能性。將在gx-188疫苗接種之前(vs)和之后(vf1)后收獲的患者的冷凍保存的pbmc以hpv16e6和e7肽庫的組合混合物刺激13小時，然后用多色流式細(xì)胞術(shù)分析以檢測il-2、ifn-γ、tnf-α、mip-1β和cd107a/b的hpv16特異性表達(dá)。圖7a顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)確定產(chǎn)生功能性分子的cd8t細(xì)胞的設(shè)門策略。圖7b顯示在設(shè)門cd8t細(xì)胞上共表達(dá)il-2的ifn-γ+cd8t細(xì)胞的頻率的代表性圖；圖7c顯示共表達(dá)tnf-α的ifn-γ+cd8t細(xì)胞的頻率的代表性圖；圖7d顯示共表達(dá)mip-1β的ifn-γ+cd8t細(xì)胞的頻率的代表性圖；并且圖7e顯示共表達(dá)cd107a/b的ifn-γ+cd8t細(xì)胞的頻率的代表性圖。圖中的數(shù)字表示在設(shè)門cd8t細(xì)胞上的應(yīng)答群體的頻率。圖8a-8c顯示gx-188疫苗接種誘導(dǎo)hpv16特異性cd8t細(xì)胞的增殖。在接種前(vs)和接種(vf1)后刺激患者的pbmc，并通過如下所述的流式細(xì)胞術(shù)分析以檢查cd38和ki67在病毒特異性cd8t細(xì)胞上的表達(dá)。圖8a顯示了通過流式細(xì)胞術(shù)確定cd8t細(xì)胞上的ki67和cd38表達(dá)的設(shè)門策略。圖8b顯示增殖性cd38+ki67+cd8t細(xì)胞的頻率的代表性圖。圖8c中所示的數(shù)據(jù)代表重復(fù)的平均值，誤差條表示s.d.。對圖8b所示的細(xì)胞在cd8t細(xì)胞上設(shè)門。圖8c中的數(shù)字表示疫苗接種后的倍數(shù)提高。背景值由僅培養(yǎng)基對照的應(yīng)答確定，其對于cd38+ki67+cd8t細(xì)胞為0.011±0.015％(平均值±s.d.)。圖9a-9l顯示了在gx-188疫苗接種后hpv16/18e6和e7蛋白的igg滴度。通過elisa在稀釋范圍內(nèi)測量每個患者的針對hpv16和hpv18的重組e6和e7蛋白的血漿igg抗體滴度。圖9a顯示了在免疫接種前(vs)和免疫接種后(vt2、vt4和vf)施用1mggx-188后，每個疫苗劑量組的hpv16e6igg滴度結(jié)果；圖9b顯示了hpv16e7igg滴度結(jié)果；圖9c顯示了hpv18e6igg滴度結(jié)果；且圖9d顯示hpv18e7igg滴度結(jié)果。圖9e顯示了在免疫接種前(vs)和免疫接種后(vt2、vt4和vf)施用2mggx188之后每個疫苗劑量組的hpv16e6igg滴度結(jié)果；圖9f顯示了hpv16e7igg滴度結(jié)果；圖9g顯示了hpv18e6igg滴度結(jié)果；圖9h顯示了hpv18e7igg滴度結(jié)果。圖9i顯示在免疫接種前(vs)和免疫接種后(vt2、vt4和vf)施用4mggx-188后，每個疫苗劑量組的hpv16e6igg滴度結(jié)果；圖9j顯示了hpv16e7igg滴度結(jié)果；圖9k顯示了hpv18e6igg滴度結(jié)果；并且圖9l顯示了hpv18e7igg滴度結(jié)果。數(shù)據(jù)表示為樣品的稀釋倍數(shù)，其顯示如果樣品的平均光密度大于陰性截斷值則認(rèn)為其是陽性(hpv16e6為0.173，hpv16e7為0.213，hpv18e6為0.214，并且hpv18e7為0.227)。由于在包被有不相關(guān)的重組促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，epo)的孔中測試患者的血漿，所有樣品的光密度低于陰性截斷值。圖10a-10c示出，通過陰道鏡檢查、細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)確定，gx-188接種導(dǎo)致宮頸病變的清除。圖10a顯示來自代表性應(yīng)答者(a05)和無應(yīng)答者(a09)患者在gx-188免疫接種之前(vs)和之后(vf2)的宮頸陰道鏡檢查照片。在圖10a中，在vs處，患者a05在轉(zhuǎn)化區(qū)中顯示致密的醋酸白色(acetowhite)上皮，具有粗糙的點，但是在vf2處顯示減少的中間醋酸白色上皮而沒有點；在vs和vf2處，患者a09在轉(zhuǎn)化區(qū)中顯示密集的醋酸白色上皮與翻卷的邊緣和粗糙的點。圖10b顯示來自代表性應(yīng)答者(a05)和無應(yīng)答者(a09)患者在gx-188免疫接種之前(vs)和之后(vf2)的宮頸內(nèi)細(xì)胞學(xué)照片。在圖10b中，vs處的患者a05表現(xiàn)出具有擴(kuò)大的核尺寸和增色的高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-gradesquamousintraepitheliallesion，hsil)(×400)；但在vf2只顯示沒有上皮內(nèi)病變(nointraepitheliallesion，nil)的正常色素上皮(×400)；患者a09在vs和vf2顯示hsil可變核尺寸和增色(×400)。圖10c顯示來自gx-188免疫接種前(vs)和之后(vf2)的代表性應(yīng)答者(a05)和無應(yīng)答者(a09)患者的組織學(xué)照片。在圖10c中，在vs處的患者a05被診斷為具有完整上皮厚度的cin3，并且在上層中具有可見的有絲分裂(×400)；但在vf2顯示正常鱗狀上皮而沒有非典型的腫瘤細(xì)胞(×200)；在vs和vf2處，患者a09被診斷為具有厚且異常上皮的cin3，并且在上層具有非典型核的角質(zhì)化細(xì)胞的存在(×200)。圖11a-11b顯示了gx-188疫苗接種的無應(yīng)答者和應(yīng)答者中的hpv特異性t細(xì)胞的多功能測定。使用布爾設(shè)門在接種后20周(vf1)測量hpv16特異性il-2、ifn-γ、tnf-α、mip-1β或cd107a/b產(chǎn)生性cd8t細(xì)胞的頻率。根據(jù)臨床和病毒學(xué)結(jié)果，將患者分組為無應(yīng)答者(a04和a09)和應(yīng)答者(a01、a02、a03、a05、a06、a07和a08)。圖11a顯示gx-188疫苗接種后對hpv16e6/e7肽的無應(yīng)答者的多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答，如圖所示。在圖中，黑色條表示平均應(yīng)答，點對應(yīng)于來自單個對象的應(yīng)答。沿著x軸列出了細(xì)胞因子的每種可能的功能組合。在x軸下方的不同顏色的五個水平條描述了五、四、三、二或一個功能應(yīng)答的群體。圖11b顯示gx-188疫苗接種后對hpv16e6/e7肽的應(yīng)答者的多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答，如餅狀圖所示。餅狀圖表示hpv16e6/e7特異性cd8t細(xì)胞與五種功能應(yīng)答的每種組合的相對頻率。圖12a-12f示出了由細(xì)胞計數(shù)珠陣列產(chǎn)生的th1/th2/th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)。為了確保有效分析低于10pgml-1(默認(rèn)用于定量的限值)的蛋白質(zhì)，將人th1/th2/th17細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)品在50μl測定稀釋液中重構(gòu)，并且標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建為從5至5,000pgml-1(稀釋率；1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256、1∶512和1∶1028)。獲得樣品后使用冪擬合產(chǎn)生細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)曲線，對于所有細(xì)胞因子，r2＞0.96。通過從相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行插值來確定細(xì)胞上清液中每種細(xì)胞因子的濃度。圖12a顯示ifn-γ測量；圖12b顯示il-2測量；圖12c顯示tnf-α測量；圖12d顯示il-4測量；圖12e顯示il-10測量；并且圖12f顯示il-17a測量。圖13a-13d顯示了hpv16或hpv18的e6或e7蛋白的天然存在的變體。圖13a顯示了hpv16的e6蛋白的天然存在的變體的序列比較：genbank登錄號：aaa91670.1(seqidno：19)；aaa91673.1(seqidno：20)；aaa91669.1(seqidno：21)；aaa91674.1(eqidno：22)；aaa91680.1(seqidno：23)；aaa91681.1(seqidno：24)；aaa91668.1(seqidno：25)；aaa91658.1(seqidno：26)；aaa91662.1(seqidno：27)；aaa91667.1(seqidno：28)；aaa91676.1(seqidno：29)；aaa91671.1(seqidno：30)；aaa91656.1(seqidno：31)；aaa91682.1(seqidno：32)；aaa91657.1(seqidno：33)；aaa91660.1(seqidno：34)；aaa91677.1(seqidno：35)；aaa91678.1(seqidno：36)；aaa91672.1(seqidno：37)；aaa91661.1(seqidno：38)；aaa91664.1(seqidno：39)；aaa91675.1(seqidno：40)；aaa91665.1(seqidno：41)；aaa91663.1(seqidno：42)；aaa91659.1(seqidno：43)；aaa91654.1(seqidno：44)；aaa91666.1(seqidno：45)；aaa91679.1(seqidno：46)；和aaa91655.1(seqidno：47)。圖13b顯示了hpv18的e6蛋白的天然存在的變體的序列比較：genbank登錄號：ahz96678.1(seqidno：48)；abp99784.1(seqidno：49)；cab53096.1(seqidno：50)；agu90327.1(seqidno：51)；adc35660.1(seqidno：52)；ahz96677.1(seqidno：53)；abp99736.1(seqidno：54)；abp99704.1(seqidno：55)，agm34425.1(seqidno：103)，和agm34423.1(seqidno：104)。圖13c顯示hpv16的e7蛋白的天然存在的變體的序列比較：genbank登錄號：abl96587.1(seqidno：56)；abl96591.1(seqidno：57)；afj19726.1(seqidno：58)；afj19722.1(seqidno：59)；afj19752.1(seqidno：60)；afj19732.1(seqidno：61)；afj19762.1(seqidno：62)；afj19668.1(seqidno：63)；afj19664.1(seqidno：64)；afj19766.1(seqidno：65)；afj19756.1(seqidno：66)；afj19680.1(seqidno：67)；afj19772.1(seqidno：68)；afj19696.1(seqidno：69)；afj19690.1(seqidno：70)；afj19712.1(byseqidno：71)；ago04504.1(seqidno：72)；afj19770.1(seqidno：73)；afj19520.2(seqidno：74)；afj19708.1(seqidno：75)；afj19674.1(seqidno：76)；ago04498.1(seqidno：77)；ago04496.1(seqidno：78)；afj19684.1(seqidno：79)；afj19678.1(seqidno：80)；afj19698.1(seqidno：81)；afj19746.1(seqidno：82)；aaf13395.1(seqidno：83)；afu06654.1(seqidno：84)；afu06650.1(seqidno：85)；aab70738.1(seqidno：86)；acn22555.1(seqidno：87)；abk32510.1(seqidno：88)；abc54573.1(seqidno：89)；acn22554.1(seqidno：90)；abk32511.1(seqidno：91)；acq90216.1(seqidno：92)；ady75576.1(seqidno：93)；aam03025.1(seqidno：94)；和aal96634.1(seqidno：95)。圖13d顯示了hpv18的e7蛋白的天然存在的變體的序列比較：genbank登錄號：abp99785.1(seqidno：96)；agu90416.1(seqidno：97)；agu90384.1(seqidno：98)；cab53097.1(seqidno：99)；p06788.2.1(seqidno：100)；cab53098.1(seqidno：101)；和cab53099.1(seqidno：102)。圖14顯示了gx-188dna疫苗變體的圖。泳道1(a)代表陰性對照：僅pgx27載體；泳道2(b)代表gx-188陽性對照：如圖1a所示的gx-188dna疫苗；泳道3(c-1)代表hpv16e6突變體：c-1構(gòu)建體，與gx-188相比，其在hpv16e6的組氨酸(h)21、酪氨酸(y)85和纈氨酸(v)90處分別含有谷氨酰胺(q)、組氨酸(h)和亮氨酸(l)突變/替換；泳道4(c-2)代表hpv16e7突變體；與gx-188相比，c-2構(gòu)建體在hpv16e7的甲硫氨酸(m)12處含有賴氨酸(k)突變/替換，并且在hpv16e7的天冬酰胺(n)29、精氨酸(r)77和甘氨酸(g)85處含有絲氨酸(s)突變/替換；泳道5(d-1)代表dna疫苗變體，其中有hpv16e7的第1至78位氨基酸、hpv16e7的第1至58位氨基酸、hpv16e6的第79至158位氨基酸、hpv16e7的第59至98位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至第65位氨基酸、hpv18e6的第71至158位和hpv18e7的第51至105位氨基酸的序列；泳道6(d-2)代表dna疫苗變體，其中有hpv16e7的第1至130位氨基酸、hpv16e7的第1至第85位氨基酸、hpv16e6的第45至158位氨基酸、hpv16e7的第44至第98位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至第65位氨基酸、hpv18e6的第71至158位和hpv18e7的第51至105位氨基酸；泳道7(e-1)代表具有不同混編順序的dna疫苗變體(即ncncncnc)：e-1構(gòu)建體從n末端到c末端含有hpv16e6的第1至85位氨基酸、hpv16e7的第51至第98位氨基酸、hpv16e7的第1至第65位氨基酸和hpv16e6的第71至158位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至第65位氨基酸、hpv18e6的第71至158位和hpv18e7的第51至105位氨基酸。e-2代表具有不同混編順序的dna疫苗變體(即ccnnccnn)：e-2構(gòu)建體從n末端到c末端含有hpv16e7的第71至158位氨基酸、hpv16e7的第51至第98位氨基酸、hpv16e6的第1至第85位氨基酸、hpv16e7的第1至第65位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至第65位氨基酸、hpv18e6的第71至158位和hpv18e7的第51至105位氨基酸。圖15顯示了gx-188疫苗變體的疫苗接種計劃的示意圖。對c57/bl/6小鼠用每種疫苗變體以電穿孔遞送：a(陰性對照)、b(陽性對照)、c-1、c-2、d-1、d-2、e-1和e-2。在單次免疫接種2周后分析小鼠或在初次免疫2周后給予加強(qiáng)注射。然后對接受加強(qiáng)注射的小鼠在最后一次免疫接種的2周后進(jìn)行分析。圖16a顯示了如圖15所示的單次接種后疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的結(jié)果。y軸顯示sfc/1×106個脾細(xì)胞，而x軸顯示gx-188疫苗變體。圖16b顯示如圖15所示的加強(qiáng)免疫接種后疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答的結(jié)果。y軸顯示sfc/1×106個脾細(xì)胞，而x軸顯示gx-188疫苗變體。發(fā)明詳述i.定義除非另有定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。在沖突的情況下，將以包含定義的本發(fā)明為準(zhǔn)。除非上下文中另有要求，沒有數(shù)量詞修飾的名詞表示一個/種或更多個/種。對于所有目的而言，本文中提及的所有出版物、專利和其他參考文獻(xiàn)通過引用整體并入本文，如同每個單獨的出版物或?qū)＠暾埍痪唧w且單獨地指示通過引用并入。盡管與本文中所述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于本發(fā)明的實踐或測試，但是下面描述了合適的方法和材料。材料、方法和實施例僅是舉例說明性的，而不旨在是限制性的。從詳細(xì)描述和權(quán)利要求書中，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將是顯而易見的。為了進(jìn)一步限定本發(fā)明，提供以下術(shù)語和定義。應(yīng)當(dāng)注意，未指明數(shù)目之實體的術(shù)語是指該實體中的一個或多個；例如“多肽”應(yīng)理解為表示一種或更多種多肽。因此，未指明數(shù)目的術(shù)語、術(shù)語“一個或多個”和“至少一個”在本文中可以互換使用。術(shù)語“約”在本文中用于表示大概、大致、大約或在...的區(qū)域中。當(dāng)術(shù)語“約”與數(shù)值范圍結(jié)合使用時，其通過將邊界擴(kuò)展至高于和低于所列出數(shù)值的來修飾該范圍。一般來說，本文中使用的術(shù)語“約”用于將數(shù)值修飾為以10％上下(更高或更低)的差異高于或低于所述值。應(yīng)當(dāng)理解，對于在本文中用語言“包括/包含”描述的任何方面，也提供以“由...組成”和/或“基本上由......組成”描述的其他類似方面。還應(yīng)理解，對于在本文中描述為治療方法形式的任何實施方案，也提供描述為瑞士型醫(yī)藥用途形式和/或藥物組合物用于形式的其他類似形式。術(shù)語“多核苷酸”或“核苷酸”旨在包括單個核酸以及多個核酸，并且是指分離的核酸分子或構(gòu)建體，例如信使rna(messengerrna，mrna)或質(zhì)粒dna(plasmiddna，pdna)。在某些實施方案中，多核苷酸包含常規(guī)磷酸二酯鍵或非常規(guī)鍵(例如，酰胺鍵，例如見于肽核酸(peptidenucleicacid，pna)中)。術(shù)語“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一個或更多個核酸區(qū)段，例如dna或rna片段?！胺蛛x的”核酸或多核苷酸意指已從其天然環(huán)境中移出的核酸分子、dna或rna。分離的多核苷酸的實例包括保持在異源宿主細(xì)胞中的或從溶液中其他多核苷酸中純化(部分或基本上)的重組多核苷酸。分離的rna分子包括本發(fā)明的多核苷酸的體內(nèi)或體外rna轉(zhuǎn)錄物。根據(jù)本發(fā)明的分離的多核苷酸或核酸還包括合成產(chǎn)生的此類分子。此外，多核苷酸或核酸可以包括調(diào)節(jié)元件，例如啟動子、增強(qiáng)子、核糖體結(jié)合位點或轉(zhuǎn)錄終止信號。本文中使用的“編碼區(qū)”或“編碼序列”是由可翻譯成氨基酸的密碼子組成的多核苷酸的一部分。雖然“終止密碼子”(tag、tga或taa)通常不翻譯成氨基酸，但可以認(rèn)為它是編碼區(qū)的一部分，但是任何側(cè)翼序列(例如啟動子、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄終止子、內(nèi)含子等)不是編碼區(qū)的一部分。編碼區(qū)的邊界通常由5’末端的起始密碼子、編碼所得多肽的氨基末端的起始密碼子和編碼所得多肽的羧基末端的3’末端的翻譯終止密碼子確定。本發(fā)明的兩個或多個編碼區(qū)可以存在于單個多核苷酸構(gòu)建體中，例如在單個載體上；或在分離的多核苷酸構(gòu)建體中，例如在分離的(不同的)載體上。因此，單個載體可以僅包含單個編碼區(qū)，或包含兩個或更多個編碼區(qū)，例如單個載體可以分別編碼如下所述的嵌合分子的第一多肽鏈和第二多肽鏈。此外，本發(fā)明的載體、多核苷酸或核酸可以編碼與編碼本發(fā)明的嵌合分子的核酸融合或非融合的異源編碼區(qū)。異源編碼區(qū)包括但不限于專門的元件或基序，例如分泌信號肽或異源功能結(jié)構(gòu)域。本文中使用的關(guān)于核苷酸序列的術(shù)語“優(yōu)化的”是指編碼多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列已經(jīng)突變以增強(qiáng)該多核苷酸序列的性質(zhì)。在一些實施方案中，進(jìn)行優(yōu)化以提高轉(zhuǎn)錄水平，提高翻譯水平，提高穩(wěn)態(tài)mrna水平，提高或降低調(diào)節(jié)蛋白(例如通用轉(zhuǎn)錄因子)的結(jié)合，提高或降低剪接，或提高由多核苷酸序列產(chǎn)生的多肽的產(chǎn)量?？梢詫Χ嗪塑账嵝蛄羞M(jìn)行改變以對其進(jìn)行優(yōu)化的實例包括密碼子優(yōu)化，g/c含量優(yōu)化，去除重復(fù)序列，去除富含at的元件，去除隱蔽剪接位點，去除抑制轉(zhuǎn)錄或翻譯的順式作用元件，添加或去除poly-t或polya序列，添加轉(zhuǎn)錄起始位點周圍的增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的序列(例如kozak共有序列)，去除可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，去除去穩(wěn)定序列及其兩種或更多種組合。哺乳動物細(xì)胞分泌的某些蛋白質(zhì)與分泌信號肽相關(guān)，一旦生長的蛋白質(zhì)鏈已經(jīng)開始穿過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)運出，所述信號肽即被從成熟蛋白質(zhì)上切割下來。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚的是，信號肽通常融合到多肽的n末端，并被從完整或“全長”多肽上切割以產(chǎn)生多肽的分泌型或“成熟”形式。在某些實施方案中，天然信號肽或該序列的保留指導(dǎo)與其可操作地締合的多肽之分泌能力的功能性衍生物。或者，可以使用異源信號肽，例如組織纖溶酶原激活物(tpa)、單純皰疹病毒糖蛋白d(hsvgd)的信號肽、生長激素的信號肽及其任意組合。在一些實施方案中，本文中所述的多核苷酸還包含編碼tpa的信號肽的核酸序列。在某些實施方案中，本文中所述的多核苷酸還包含編碼包含fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(“flt3l”)或其一部分的異源多肽的核酸序列。flt3l是誘導(dǎo)樹突細(xì)胞(dendriticcell，dc)的增殖和成熟的因子，其可以增強(qiáng)針對抗原的免疫應(yīng)答，并且當(dāng)與腫瘤抗原融合時顯示出優(yōu)良的緩解腫瘤的效果。術(shù)語“下游”是指位于參考核苷酸序列3’端的核苷酸序列。在某些實施方案中，下游核苷酸序列涉及在轉(zhuǎn)錄起始位點之后的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的下游。術(shù)語“上游”是指位于參考核苷酸序列5’端的核苷酸序列。在某些實施方案中，上游核苷酸序列涉及位于編碼區(qū)或轉(zhuǎn)錄起始位點的5’側(cè)的序列。例如，大多數(shù)啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始位點的上游。本文中使用的術(shù)語“調(diào)節(jié)區(qū)”是指位于編碼區(qū)上游(5’非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3’非編碼序列)，并且其影響相關(guān)編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄、rna加工、穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)區(qū)可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸化識別序列、rna加工位點、效應(yīng)物結(jié)合位點和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。如果意在將編碼區(qū)用于在真核細(xì)胞中表達(dá)，則多聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列將通常位于編碼序列的3’端。編碼基因產(chǎn)物(例如多肽)的多核苷酸可以包括與一個或更多個編碼區(qū)可操作地締合的啟動子和/或其他轉(zhuǎn)錄或翻譯控制元件。在可操作的締合中，基因產(chǎn)物(例如多肽)的編碼區(qū)以這種方式與一個或更多個調(diào)節(jié)區(qū)相締合，以便在調(diào)節(jié)區(qū)的影響或控制下進(jìn)行基因產(chǎn)物的表達(dá)。例如，如果啟動子功能的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼由編碼區(qū)編碼的基因產(chǎn)物的mrna的轉(zhuǎn)錄，并且如果啟動子與編碼區(qū)之間的連接的性質(zhì)不干擾啟動子指導(dǎo)基因產(chǎn)物的表達(dá)的能力或干擾dna模板被轉(zhuǎn)錄的能力，則編碼區(qū)與啟動子是“可操作地締合的”。除了啟動子之外的其他轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強(qiáng)子、操縱子、阻遏子和轉(zhuǎn)錄終止信號)也可以與編碼區(qū)可操作地相締合以指導(dǎo)基因產(chǎn)物表達(dá)。多種轉(zhuǎn)錄控制區(qū)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。這些包括但不限于在脊椎動物細(xì)胞中起作用的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)，例如但不限于來自巨細(xì)胞病毒(cmv)(立即早期啟動子，連同內(nèi)含子-a)、猿猴病毒40(sv40)(早期啟動子)和逆轉(zhuǎn)錄病毒(例如勞氏肉瘤病毒)的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)段。其他轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括來自脊椎動物基因(例如肌動蛋白、熱休克蛋白、牛生長激素和兔β-球蛋白的那些)，以及能夠控制真核細(xì)胞中基因表達(dá)的其他序列。其他合適的轉(zhuǎn)錄控制區(qū)包括組織特異性啟動子和增強(qiáng)子以及淋巴因子誘導(dǎo)型啟動子(例如，可由干擾素或白介素誘導(dǎo)的啟動子)。在某些實施方案中，轉(zhuǎn)錄控制區(qū)可以是sv40polya、sv40增強(qiáng)子、pcmv早期增強(qiáng)子/啟動子、兔β-珠蛋白介入序列(givs)或其任意組合。類似地，多種翻譯控制元件對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。這些包括但不限于核糖體結(jié)合位點、翻譯起始和終止密碼子，以及衍生自小rna病毒(picornavirus)(特別是內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點，或ires(internalribosomeentrysite)，也稱為cite序列)的元件。本文中使用的術(shù)語“表達(dá)”是指多核苷酸產(chǎn)生基因產(chǎn)物(例如rna或多肽)的過程。其包括但不限于多核苷酸轉(zhuǎn)錄成信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)移rna(transferrna，trna)、小發(fā)夾rna(smallhairpinrna，shrna)、小干擾rna(smallinterferingrna，sirna)或任何其他rna產(chǎn)物，以及將mrna翻譯成多肽。表達(dá)產(chǎn)生“基因產(chǎn)物”。本文中使用的基因產(chǎn)物可以是核酸(例如通過基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的信使rna)，或從轉(zhuǎn)錄物翻譯的多肽。本文中所述的基因產(chǎn)物還包括具有轉(zhuǎn)錄后修飾(例如多聚腺苷酸化或剪接)的核酸，或具有翻譯后修飾(例如甲基化、糖基化、添加脂質(zhì)、與其他蛋白質(zhì)亞基締合或蛋白水解切割)的多肽。“載體”是指用于將核酸克隆和/或轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的任何載體。載體可以是復(fù)制子，另一個核酸區(qū)段可以連接到該復(fù)制子上，以引起所連接的區(qū)段的復(fù)制?！皬?fù)制子”是指在體內(nèi)充當(dāng)自主復(fù)制單位(即能夠在其自身控制下復(fù)制)的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、噬菌體、黏粒、染色體、病毒)。術(shù)語“載體”包括用于在體外、離體或體內(nèi)將核酸引入細(xì)胞的病毒和非病毒載體。大量載體是已知的并且在本領(lǐng)域中使用，包括例如質(zhì)粒、經(jīng)修飾的真核病毒或經(jīng)修飾的細(xì)菌病毒。將多核苷酸插入到合適的載體中可以通過將合適的多核苷酸片段連接到選擇為具有互補(bǔ)黏性末端的載體中來實現(xiàn)?？梢詫⑤d體改造以編碼選擇性標(biāo)志或報道分子，其為已經(jīng)并入載體的細(xì)胞提供了選擇或鑒定。選擇性標(biāo)志或報道分子的表達(dá)允許鑒定和/或選擇并入并表達(dá)載體上所包含的其他編碼區(qū)的宿主細(xì)胞。本領(lǐng)域已知和使用的選擇性標(biāo)志基因的實例包括：提供對氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨膦除草劑(bialaphosherbicide)、磺酰胺等的抗性的基因；和用作表型標(biāo)記的基因，即花色苷調(diào)節(jié)基因、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因等。本領(lǐng)域已知和使用的報道分子的實例包括：螢光素酶(luciferase，luc)、綠色螢光蛋白(greenfluorescentprotein，gfp)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(chloramphenicolacetyltransferase，cat)、半乳糖苷酶(galactosidase，lacz)、葡糖醛酸糖苷酶(glucuronidase，gus)等。選擇性標(biāo)志也可以被認(rèn)為是報道分子。術(shù)語“質(zhì)?！笔侵竿ǔy帶非細(xì)胞中心代謝的一部分基因的染色體外元件，并且通常是環(huán)狀雙鏈dna分子的形式。這樣的元件可以是來自于任何來源的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性、環(huán)狀或超螺旋的單鏈或雙鏈dna或rna，其中許多核苷酸序列已經(jīng)連接或重組到獨特的構(gòu)建體中，其能夠?qū)⑺x擇基因產(chǎn)物的啟動子片段和dna序列連同合適的3’非翻譯序列一起導(dǎo)入細(xì)胞中。可以使用的真核病毒載體包括但不限于腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、痘病毒載體(例如痘苗病毒載體)、桿狀病毒載體或皰疹病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞抑制素)、dna-蛋白復(fù)合物和生物聚合物。“克隆載體”是指“復(fù)制子”，其是連續(xù)復(fù)制的核酸的單位長度并且包含復(fù)制起點，例如質(zhì)粒、噬菌體或黏粒，另一個核酸區(qū)段可與其連接，以便引起所連接的區(qū)段的復(fù)制。某些克隆載體能夠在一種細(xì)胞類型(例如細(xì)菌)中復(fù)制，并在另一種細(xì)胞(例如真核細(xì)胞)中表達(dá)?？寺≥d體通常包含一個或更多個可用于選擇包含載體的細(xì)胞和/或用于插入目的核酸序列的一個或更多個多克隆位點的序列。術(shù)語“表達(dá)載體”是指被設(shè)計為使所插入的核酸序列在插入宿主細(xì)胞后表達(dá)的載體。將所插入的核酸序列置于與如上所述的調(diào)節(jié)區(qū)可操作地連接。通過本領(lǐng)域中公知的方法將載體引入宿主細(xì)胞中，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、deae葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、使用基因槍或dna載體轉(zhuǎn)運分子。本文中使用的“培養(yǎng)”意指在允許細(xì)胞生長或分裂或維持細(xì)胞處于活體狀態(tài)的體外條件下孵育細(xì)胞。本文中使用的“培養(yǎng)的細(xì)胞”意指在體外繁殖的細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“多肽”旨在包括單個/種“多肽”以及多個/種“多肽”，并且是指由通過酰胺鍵(也稱為肽鍵)線性連接的單體(氨基酸)構(gòu)成的分子。術(shù)語“多肽”是指兩個或更多個氨基酸的任何鏈，并且不是指特定長度的產(chǎn)物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白質(zhì)”、“氨基酸鏈”或用于指兩個或多個氨基酸的鏈的任何其他術(shù)語均包括在“多肽”的定義中，并且術(shù)語“多肽”可以用于代替這些術(shù)語中的任何一個或與這些術(shù)語中的任何術(shù)語互換。術(shù)語“多肽”還意指多肽的表達(dá)后修飾的產(chǎn)物，其包括但不限于糖基化、乙?；?、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)的衍生化、蛋白水解切割或通過非天然存在的氨基酸的修飾。多肽可以來源于天然生物來源或由重組技術(shù)產(chǎn)生，但不一定從指定的核酸序列翻譯。它可以以任何方式產(chǎn)生，包括通過化學(xué)合成?！胺蛛x的”多肽或其片段、變體或衍生物是指不在其天然環(huán)境中的多肽。不需要特別水平的純化。例如，可以簡單地從其本身或天然環(huán)境中取出分離的多肽。出于本發(fā)明的目的，重組產(chǎn)生的多肽和在宿主細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)被認(rèn)為是分離的，已經(jīng)通過任何合適的技術(shù)分離、分級或部分或基本純化的天然或重組多肽也是如此。本發(fā)明還包括多肽的片段或變體及其任意組合。當(dāng)提及本發(fā)明的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子時，術(shù)語“片段”或“變體”包括保留參考多肽的至少一些性質(zhì)的任何多肽。除了本文中別處討論的特異性抗體片段外，多肽片段包括蛋白水解片段以及缺失片段，但不包括天然存在的全長多肽(或成熟多肽)。本發(fā)明的多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域或結(jié)合分子的變體包括如上所述的片段，以及由于氨基酸替換、缺失或插入而具有改變的氨基酸序列的多肽。變體可以是天然或非天然存在的。非天然存在的變體可以使用本領(lǐng)域已知的誘變技術(shù)產(chǎn)生。變體多肽可包含保守或非保守氨基酸替換、缺失或添加。“保守性氨基酸替換”是其中氨基酸殘基被具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基替換的替換。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族在本領(lǐng)域中已經(jīng)定義，包括堿性側(cè)鏈(例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈(例如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈(例如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳族側(cè)鏈(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，如果多肽中的氨基酸被來自相同側(cè)鏈家族的另一個氨基酸替代，則認(rèn)為替換是保守的。在另一個實施方案中，氨基酸串可以保守地替換為在側(cè)鏈家族成員的順序和/或組成方面不同的結(jié)構(gòu)相似的串。如本領(lǐng)域已知的，通過比較一個多肽的氨基酸序列與第二多肽的序列來確定兩個多肽之間的“序列同一性”。當(dāng)在本文中討論時，任何特定多肽與另一種多肽是否具有至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一性可以用本領(lǐng)域已知的方法和計算機(jī)程序/軟件來確定，例如但不限于bestfit程序(wisconsin序列分析包，用于unix的第8版，geneticscomputergroup，universityresearchpark，575sciencedrive，madison，wi53711)。bestfit使用smith和waterman，advancesinappliedmathematics2：482-489(1981)的局部同源性算法來找到兩個序列之間的最佳同源性區(qū)段。當(dāng)使用bestfit或任何其他序列比對程序來確定特定序列是否例如與根據(jù)本發(fā)明的參考序列具有95％同一性時，當(dāng)然如此設(shè)置參數(shù)，使得可以在參考多肽序列的全長上計算同一性百分比，并且允許在參考序列中存在氨基酸總數(shù)的多至5％的同源性缺口。術(shù)語“gx-188變體”、“gx-188類似物”、“gx-188變體構(gòu)建體”、“gx-188類似物構(gòu)建體”或本文中使用的任何類似術(shù)語表示，在施用至少一個劑量的構(gòu)建體后，該構(gòu)建體在體內(nèi)誘導(dǎo)與在施用gx-188(圖1a或seqidno：9)后誘導(dǎo)之細(xì)胞免疫應(yīng)答類似的細(xì)胞免疫應(yīng)答。如果變體構(gòu)建體可以誘導(dǎo)與由gx-188誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答相同或更高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則細(xì)胞免疫應(yīng)答可以是相似的。在另一些實施方案中，如果變體構(gòu)建體誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答比由gx-188誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答高至少約0.9倍(例如90％)、約0.8倍、約0.7倍、約0.6倍、約0.5倍或約0.4倍，則細(xì)胞免疫應(yīng)答可以是相似的。在一個實施方案中，細(xì)胞免疫應(yīng)答是cd8t細(xì)胞應(yīng)答、cd4t細(xì)胞應(yīng)答、細(xì)胞因子分泌或其任意組合。在另一個實施方案中，細(xì)胞免疫應(yīng)答包含數(shù)目提高的多功能t細(xì)胞。在某些實施方案中，當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)測量時，多功能t細(xì)胞表現(xiàn)出選自ifn-γ、il-2、tnf-α、mip-β、cd107a/b及其任意組合的至少三種、至少四種或至少五種標(biāo)志物?！叭诤稀被颉扒逗稀狈肿影c第二氨基酸序列連接的第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列在自然界中不與所述第二氨基酸序列天然連接。通常存在于不同蛋白質(zhì)中的氨基酸序列可以在融合多肽中組合在一起，或者通常存在于相同蛋白質(zhì)中的氨基酸序列可以以融合多肽中的新排列進(jìn)行布置。例如通過化學(xué)合成或通過產(chǎn)生和翻譯其中肽區(qū)以期望的關(guān)系編碼的多核苷酸來產(chǎn)生融合蛋白。嵌合蛋白還可以包含通過共價、非肽鍵或非共價鍵與第一氨基酸序列締合的第二氨基酸序列。本文中使用的術(shù)語“分(split)”或任何類似術(shù)語是概念術(shù)語，并且是指將氨基酸序列在序列內(nèi)氨基酸的c末端處分割成兩個氨基酸序列。例如，hpv16的e6蛋白可以分割成兩部分，即n末端部分和c末端部分。當(dāng)hpv16的e6蛋白在氨基酸85處分割成兩部分時，n末端部分可以包含對應(yīng)于seqidno：2的第1位氨基酸至第85位氨基酸，而c末端部分可包含對應(yīng)于seqidno：2的第86至158位氨基酸。然而，術(shù)語“分”不限制n末端部分(即n末端部分的c末端)和c末端部分(c末端部分的n末端)的邊界與將蛋白質(zhì)分割成兩部分的精確的氨基酸位點。例如，在一個實施方案中，當(dāng)hpv16的e6蛋白在氨基酸85處分割成兩個部分時，n末端部分可包含對應(yīng)于seqidno：2的第1位氨基酸至第85位氨基酸，并且c末端部分可以包含對應(yīng)于seqidno：2的第71至158位氨基酸。第71至85位氨基酸可以是n末端部分與c末端部分之間的重疊序列。在另一個實施方案中，當(dāng)hpv16的e6蛋白在氨基酸70處分割成兩個部分時，n末端部分包含對應(yīng)于seqidno：2的第1位氨基酸至第70位氨基酸，而c末端部分包含對應(yīng)于seqidno：2的第71至158位氨基酸。在另一些實施方案中，n末端部分含有重疊序列，因此n末端部分可以包含對應(yīng)于seqidno：2的第1位氨基酸至第85位氨基酸，而c末端部分包含對應(yīng)于seqidno：2的第71至158位氨基酸。本發(fā)明的融合蛋白可以通過基于序列構(gòu)建融合蛋白并隨后合成地、重組地或通過本領(lǐng)域已知的任何其他方法制備編碼融合蛋白的核苷酸序列來產(chǎn)生。術(shù)語“癌癥”和“癌性的”是指或描述哺乳動物中的生理狀況，其中細(xì)胞群的特征在于不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長。癌癥的實例包括但不限于癌、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、肉瘤和白血病。這樣的癌癥的更特別的實例包括鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì)胞癌、腹膜癌、肝細(xì)胞癌、胃腸癌、胰腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和多種類型的頭頸癌?！澳[瘤”和“贅生物”是指由過度細(xì)胞生長或增殖(良性(非癌性)或惡性(癌性)(包括癌前病變)引起的任何組織塊。腫瘤可以是宮頸腫瘤。在一些具體實施方案中，宮頸腫瘤是良性腫瘤或惡性腫瘤。在某些實施方案中，宮頸腫瘤是鱗狀細(xì)胞癌(scc)、腺癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(net)、玻璃樣細(xì)胞癌、血管內(nèi)腺癌(vga)、非癌惡性腫瘤、黑素瘤、淋巴瘤或?qū)m頸上皮內(nèi)瘤變(cin)。在一些實施方案中，宮頸腫瘤是cin1、cin2、cin3或?qū)m頸癌。術(shù)語“癌細(xì)胞”、“腫瘤細(xì)胞”和語法等價形式是指來自于腫瘤或癌前病變的總細(xì)胞群，其包括非致瘤性細(xì)胞(包含大部分腫瘤細(xì)胞群體)和致瘤性干細(xì)胞(癌干細(xì)胞)。編碼本文中公開的融合蛋白的多核苷酸的“有效量”是足以進(jìn)行特定說明的目的的量?！坝行Я俊笨梢愿鶕?jù)所述目的憑經(jīng)驗和以常規(guī)方式確定。本文中使用的“治療有效量”是指在必需的劑量和時間段內(nèi)有效達(dá)到期望治療結(jié)果的量。治療結(jié)果可以是例如減輕癥狀、延長存活等。治療結(jié)果不需要是“治愈”。例如“治療”或“緩解”的術(shù)語是指治愈、減緩、減輕所診斷的病理性病癥或疾病的癥狀和/或停止其進(jìn)展的治療措施。因此，需要治療的對象包括已經(jīng)診斷患有或疑似患有所述疾病的對象。“對象”或“個體”或“動物”或“患者”或“哺乳動物”意指希望診斷、預(yù)后或治療的任何對象，特別是哺乳動物對象。哺乳動物對象包括但不限于：人、家畜、農(nóng)場動物、動物園動物、體育動物、寵物動物，例如狗、貓、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、馬、牛；靈長類動物，例如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科動物，例如狗和狼；貓科動物，例如貓、獅子和老虎；馬科動物，例如馬、驢和斑馬；熊，食用動物，如牛、豬和綿羊；有蹄類動物，例如鹿和長頸鹿；嚙齒動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠和豚鼠；等。在某些實施方案中，所述哺乳動物是人對象。ii.治療分子本發(fā)明涉及治療分子或所述治療分子在與人乳頭瘤病毒相關(guān)的疾病或病癥中的用途。如本文中別處所示，治療分子也可用作診斷劑。在一個方面，本發(fā)明治療分子通過以這樣的方式融合多于一種蛋白質(zhì)來構(gòu)建，使得每種蛋白質(zhì)分割成兩部分(n末端部分和c末端部分)，但仍包含每種蛋白質(zhì)的至少所有表位?？捎糜诒景l(fā)明的蛋白質(zhì)包含至少兩種蛋白質(zhì)、至少三種蛋白質(zhì)、至少四種蛋白質(zhì)或更多。在一個特定的實施方案中，治療分子包含至少四種蛋白質(zhì)或編碼所述蛋白質(zhì)的一種或更多種核苷酸序列。如果治療分子利用了四種蛋白質(zhì)，則治療分子包含其八個多肽部分或八個核苷酸序列。來自于四種蛋白質(zhì)(每種蛋白質(zhì)分割成兩部分)的八個部分可以以任何順序放置，從而使得蛋白質(zhì)不結(jié)合全長蛋白質(zhì)所結(jié)合的一種或更多種腫瘤抑制物或不與四種蛋白質(zhì)中的任一種形成二聚體。用于本發(fā)明的治療分子的四種蛋白質(zhì)可以是人乳頭瘤病毒16型(hpv16)的e6蛋白、人乳頭瘤病毒18型(hpv18)的e6蛋白和hpv16的e7蛋白和hpv18的e7蛋白。然而，來自hpv血清型的一種或更多種e6蛋白和一種或更多種e7蛋白的任何其他組合是可能的，例如對于高風(fēng)險血清型的hpv血清型16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68和82，對于低風(fēng)險血清型的hpv血清型6、11、40、42、43、44、54、61、72、73和81及其任意組合。因此，當(dāng)四種蛋白質(zhì)中的每一種被分割或切割成兩部分時，治療分子可包含hpv16的e6蛋白的n末端部分、hpv16的e6蛋白的c末端部分、hpv18的e6蛋白的n末端部分和hpv18的e6蛋白的c末端部分、hpv16的e7蛋白的n末端部分、hpv16的e7蛋白的c末端部分、hpv18的e7蛋白的n末端部分或其任意組合。在一個具體實施方案中，用于本發(fā)明的蛋白質(zhì)僅來自于hpv16和/或hpv18。ii.a.hpv16和hpv18的e6蛋白hpv16或hpv18的e6蛋白在細(xì)胞轉(zhuǎn)化的誘導(dǎo)和維持中起主要作用。e6蛋白主要通過刺激許多宿主細(xì)胞關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的破壞而作為癌蛋白發(fā)揮作用。e6蛋白與宿主e6-ap泛素-蛋白質(zhì)連接酶結(jié)合，并通過將其靶向26s蛋白酶體進(jìn)行降解來滅活腫瘤抑制物p53和p73。繼而，dna損傷和染色體不穩(wěn)定性提高，并導(dǎo)致細(xì)胞增殖和癌癥發(fā)生。hpv16和hpv18的天然存在的e6蛋白的許多序列已被報道。例如，hpv16和hpv18的e6蛋白的氨基酸序列分別被報道為genbank登錄號aal96630.1和abp99784.1。編碼hpv16和hpv18的e6蛋白的野生型核苷酸序列分別報道為genbank登錄號af486325.1和ef202153.1。其序列在表1中重現(xiàn)。表1.hpv16和hpv18的e6蛋白的序列如本文中使用的術(shù)語“hpv16或hpv18的e6蛋白”包括其任何天然存在的變體或功能變體。hpv16的e6蛋白的天然存在的變體的實例包括但不限于圖13a中列出的序列：genbank登錄號ags42365.1，ags42372.1，abo15571.1，ags42373.1，abk32509.1，ahz96692.1，aal01368.1，afs64243.1，ags42377.1，ags42352.1，aad33252.1，ags42313.1，ban15947.1，ack57853.1，np_041325.1，ags42269.1，aev66122.1，ags42267.1，acl12310.1，abo61749.1，aal01351.1，aav91676.1，ags42341.1，ags42314.1，ban15937.1，acs92692.1，aam29170.1，aaq10712.1，aal96621.1，aal96623.1，ags42353.1，ady75574.1，aal96604.1，aev66140.1，ack57870.1，acj66712.1，afs64227.1，aal96619.1，aal96620.1，abo61747.1，ack57855.1，adh94042.1，afs64252.1，aal96612.1，afs64257.1，aal96614.1，acj66716.1，ban15946.1，ady75573.1，ags42315.1，aaa91673.1，aaa91669.1，aaa91674.1，aaa91680.1，aaa91681.1，aaa91668.1，aaa91658.1，aaa91662.1，aaa91667.1，aaa91676.1，aaa91671.1，aaa91656.1，aaa91682.1，aaa91657.1，aaa91660.1，aaa91677.1，aaa91678.1，aaa91672.1，aaa91661.1aaa91664.1，aaa91675.1，aaa91665.1，aaa91663.1，aaa91659.1，aaa91654.1，aaa91666.1，aaa91679.1和aaa91655.1。在某些實施方案中，hpv16的e6蛋白包括一個或更多個選自以下的替換：d11e，e14d，r15p，r17i，r17t，r17g，l19v，h21q，h21d，h21e，d32n，d32e，i34r，i34l，i34t，l35v，e36q，v49l，r54w，i59v，r62k，n65s，a68g，d71e，i80v，y85h，v90l，p102l，i108f，i108x，e120d，k122r，q123e，r131t，1135m，q157l，及其任意組合。hpv18的h6蛋白的實例包括但不限于圖13b中列出的序列：genbank登錄號cab53096.1，agu90327.1，adc35660.1，ahz96677.1，abp99736.1，abp99704.1，ahz96678.1，agm34425.1，agm34424.1，和abp99784.1。在某些實施方案中，hpv16的e6蛋白包括一個或多個選自以下的替換：l14v，e43g，y80h，k129n，h133r，r144q，r153h，及其任意組合。ii.a.1.hpv16的e6蛋白在一個實施方案中，可用于融合蛋白的hpv16的e6蛋白不與p53結(jié)合或不與hpv16的e6蛋白形成二聚體。為了防止hpv16的e6蛋白與p53的結(jié)合，將e6蛋白分割成兩部分，即e6蛋白的n末端部分和e6蛋白的c末端部分，其中每個部分不包含一個或更多個e6相關(guān)蛋白結(jié)合位點。所得到的構(gòu)建體雖然包含e6蛋白的所有表位，但不包含完整的e6ap結(jié)合位點，因此不能與e6-ap形成復(fù)合物。在一個實施方案中，hpv16的e6蛋白的e6-ap結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：2的l35至y39、l57至r62、v69至y85、c87、y88、q98、y99、l107、r109、q114和r136。在另一個實施方案中，hpv16的e6蛋白的e6-ap結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：2的l35至r136。因此，在某些實施方案中，hpv16的e6蛋白的n末端部分具有從a到b的氨基酸序列(16e6na-b)，并且hpv16的e6蛋白的c末端部分具有c至d的氨基酸序列(16e6cc-d)，其中a是對應(yīng)于seqidno：2的第1或2位氨基酸，b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第35至135位氨基酸的氨基酸，c是選自對應(yīng)于seqidno：2的等于或高于第36位氨基酸的氨基酸和等于或低于第b+1位氨基酸的氨基酸，并且d是對應(yīng)于seqidno：2的第157或158位氨基酸。hpv16的e6蛋白可以在對應(yīng)于seqidno：2的氨基酸22leu、23cys、41lys、42gln、43gln、45leu、46arg、47arg、49val、50tyr、51asp、53ala、54phe、57leu、71asp、74leu、75lys、76phe、78ser、79lys、80ile、82glu、83tyr、84arg、85tyr、86tyr或99tyr處與p53相互作用。p53上相應(yīng)的相互作用位點可以包括p53的110arg、111leu112gly、113phe、114leu、115his、116ser、124cys、126tyr、128pro、131asn、142pro、144gln146trp、229cys和231thr。因此，在某些實施方案中，可以通過將e6蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：2的第22至98位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩部分而產(chǎn)生e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白通過防止與另一種e6蛋白的相互作用而不與hpv16的e6蛋白形成二聚體。e6蛋白降解p53需要與另一種e6蛋白形成二聚體。因此，通過破壞e6蛋白上的二聚體形成位點，則e6蛋白不再能降解p53。hpv16的e6蛋白通過在對應(yīng)于seqidno：2的q42、k72、f76和y77處直接相互作用而與另一種e6蛋白形成二聚體。在一個實施方案中，可以通過將e6蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：2的氨基酸42至76的氨基酸的c末端分割成兩個部分來產(chǎn)生hpv16的e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含hpv16的e6的n末端部分(16e6na-b)和hpv16的e6蛋白的c末端部分，其中a是對應(yīng)于seqidno：2的第1或2位氨基酸，b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第42至76位氨基酸的氨基酸，c是選自對應(yīng)于seqidno：2的等于或高于第43位氨基酸和等于或低于第b+1位氨基酸的氨基酸，并且d是對應(yīng)于seqidno：2的第157或158位氨基酸。為了使hpv16的e6蛋白與另一種e6蛋白形成二聚體，e6蛋白必須在其鋅指基序1中并入鋅。當(dāng)鋅指基序1不能并入鋅時，hpv16的e6蛋白不再能形成二聚體。特別地，鋅指基序1的四個半胱氨酸(其位于對應(yīng)于seqidno：2的第37、40、70和73位氨基酸)直接與鋅相互作用。在一個實施方案中，hpv16的e6蛋白的n-末端部分在鋅指基序1內(nèi)僅含有一個半胱氨酸、兩個半胱氨酸或三個半胱氨酸，而hpv16的e6蛋白的c端部分分別在鋅指基序1內(nèi)含有三個半胱氨酸、兩個半胱氨酸或一個半胱氨酸。在另一個實施方案中，可以通過將e6蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：2的第37至72位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩個部分而產(chǎn)生e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含hpv16的e6的n末端部分(16e6na-b)和hpv16的e6蛋白的c末端部分，其中a是對應(yīng)于seqidno：2的第1或2位氨基酸，b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第37至72位氨基酸的氨基酸，c是選自對應(yīng)于seqidno：2的等于或高于第38位氨基酸的氨基酸和等于或低于第b+1位氨基酸的氨基酸，并且d是對應(yīng)于seqidno：2的第157或158位氨基酸。在一些實施方案中，融合蛋白包含16e6na-b和16e6cc-d，其中對應(yīng)于seqidno：2，a是第1或2位氨基酸，d是第157或158位氨基酸，并且b和c如下：b是第35位氨基酸殘基，c是第36位氨基酸殘基；b是第36位氨基酸殘基，c是第36或37位氨基酸殘基；b是第37位氨基酸殘基，c是第36、37或38位氨基酸殘基；b是第38位氨基酸殘基，c是第36、37、38或39位氨基酸殘基；b是第39位氨基酸殘基，c是第36、37、38、39或40位氨基酸殘基；b是第40位氨基酸殘基，c是選自第36至41位氨基酸殘基的氨基酸；b是第41位氨基酸殘基，c是選自第36至42位氨基酸殘基的氨基酸；b是第42位氨基酸殘基，c是選自第36至43位氨基酸殘基的氨基酸；b是第43位氨基酸殘基，c是選自第36至44位氨基酸殘基的氨基酸；b是第44位氨基酸殘基，c是選自第36至45位氨基酸殘基的氨基酸；b是第45位氨基酸殘基，c是選自第36至46位氨基酸殘基的氨基酸；b是第46位氨基酸殘基，c是選自第36至47位氨基酸殘基的氨基酸；b是第47位氨基酸殘基，c是選自第36至48位氨基酸殘基的氨基酸；b是第48位氨基酸殘基，c是選自第36至49位氨基酸殘基的氨基酸；b是第49位氨基酸殘基，c是選自第36至50位氨基酸殘基的氨基酸；b是第50位氨基酸殘基，c是選自第36至51位氨基酸殘基的氨基酸；b是第51位氨基酸殘基，c是選自第36至52位氨基酸殘基的氨基酸；b是第52位氨基酸殘基，c是選自第36至53位氨基酸殘基的氨基酸；b是第53位氨基酸殘基，c是選自第36至54位氨基酸殘基的氨基酸；b是第54位氨基酸殘基，c是選自第36至55位氨基酸殘基的氨基酸；b是第55位氨基酸殘基，c是選自第36至56位氨基酸殘基的氨基酸；b是第56位氨基酸殘基，c是選自第36至57位氨基酸殘基的氨基酸；b是第57位氨基酸殘基，c是選自第36至58位氨基酸殘基的氨基酸；b是第58位氨基酸殘基，c是選自第36至59位氨基酸殘基的氨基酸；b是第59位氨基酸殘基，c是選自第36至60位氨基酸殘基的氨基酸；b是第60位氨基酸殘基，c是選自第36至61位氨基酸殘基的氨基酸；b是第61位氨基酸殘基，c是選自第36至62位氨基酸殘基的氨基酸；b是第62位氨基酸殘基，c是選自第36至63位氨基酸殘基的氨基酸；b是第63位氨基酸殘基，c是選自第36至64位氨基酸殘基的氨基酸；b是第64位氨基酸殘基，c是選自第36至65位氨基酸殘基的氨基酸；b是第65位氨基酸殘基，c是選自第36至66位氨基酸殘基的氨基酸；b是第66位氨基酸殘基，c是選自第36至67位氨基酸殘基的氨基酸；b是第67位氨基酸殘基，c是選自第36至68位氨基酸殘基的氨基酸；b是第68位氨基酸殘基，c是選自第36至69位氨基酸殘基的氨基酸；b是第69位氨基酸殘基，c是選自第36至70位氨基酸殘基的氨基酸；b是第70位氨基酸殘基，c是選自第36至71位氨基酸殘基的氨基酸；b是第71位氨基酸殘基，c是選自第36至72位氨基酸殘基的氨基酸；b是第72位氨基酸殘基，c是選自第36至73位氨基酸殘基的氨基酸；b是第73位氨基酸殘基，c是選自第36至74位氨基酸殘基的氨基酸；b是第74位氨基酸殘基，c是選自第36至75位氨基酸殘基的氨基酸；b是第75位氨基酸殘基，c是選自第36至76位氨基酸殘基的氨基酸；b是第76位氨基酸殘基，c是選自第36至77位氨基酸殘基的氨基酸；b是第77位氨基酸殘基，c是選自第36至78位氨基酸殘基的氨基酸；b是第78位氨基酸殘基，c是選自第36至79位氨基酸殘基的氨基酸；b是第79位氨基酸殘基，c是選自第36至80位氨基酸殘基的氨基酸；b是第80位氨基酸殘基，c是選自第36至81位氨基酸殘基的氨基酸；b是第81位氨基酸殘基，c是選自第36至82位氨基酸殘基的氨基酸；b是第82位氨基酸殘基，c是選自第36至83位氨基酸殘基的氨基酸；b是第83位氨基酸殘基，c是選自第36至84位氨基酸殘基的氨基酸；b是第84位氨基酸殘基，c是選自第36至85位氨基酸殘基的氨基酸；b是第85位氨基酸殘基，c是選自第36至86位氨基酸殘基的氨基酸；b是第86位氨基酸殘基，c是選自第36至87位氨基酸殘基的氨基酸；b是第87位氨基酸殘基，c是選自第36至88位氨基酸殘基的氨基酸；b是第88位氨基酸殘基，c是選自第36至89位氨基酸殘基的氨基酸；b是第89位氨基酸殘基，c是選自第36至90位氨基酸殘基的氨基酸；b是第90位氨基酸殘基，c是選自第36至91位氨基酸殘基的氨基酸；b是第91位氨基酸殘基，c是選自第36至92位氨基酸殘基的氨基酸；b是第92位氨基酸殘基，c是選自第36至93位氨基酸殘基的氨基酸；b是第93位氨基酸殘基，c是選自第36至94位氨基酸殘基的氨基酸；b是第94位氨基酸殘基，c是選自第36至95位氨基酸殘基的氨基酸；b是第95位氨基酸殘基，c是選自第36至96位氨基酸殘基的氨基酸；b是第96位氨基酸殘基，c是選自第36至97位氨基酸殘基的氨基酸；b是第97位氨基酸殘基，c是選自第36至98位氨基酸殘基的氨基酸；b是第98位氨基酸殘基，c是選自第36至99位氨基酸殘基的氨基酸；b是第99位氨基酸殘基，c是選自第36至100位氨基酸殘基的氨基酸；b是第100位氨基酸殘基，c是選自第36至101位氨基酸殘基的氨基酸；b是第101位氨基酸殘基，c是選自第36至102位氨基酸殘基的氨基酸；b是第102位氨基酸殘基，c是選自第36至103位氨基酸殘基的氨基酸；b是第103位氨基酸殘基，c是選自第36至104位氨基酸殘基的氨基酸；b是第104位氨基酸殘基，c是選自第36至105位氨基酸殘基的氨基酸；b是第105位氨基酸殘基，c是選自第36至106位氨基酸殘基的氨基酸；b是第106位氨基酸殘基，c是選自第36至107位氨基酸殘基的氨基酸；b是第107位氨基酸殘基，c是選自第36至108位氨基酸殘基的氨基酸；b是第108位氨基酸殘基，c是選自第36至109位氨基酸殘基的氨基酸；b是第109位氨基酸殘基，c是選自第36至110位氨基酸殘基的氨基酸；b是第110位氨基酸殘基，c是選自第36至111位氨基酸殘基的氨基酸；b是第111位氨基酸殘基，c是選自第36至112位氨基酸殘基的氨基酸；b是第112位氨基酸殘基，c是選自第36至113位氨基酸殘基的氨基酸；b是第113位氨基酸殘基，c是選自第36至114位氨基酸殘基的氨基酸；b是第114位氨基酸殘基，c是選自第36至115位氨基酸殘基的氨基酸；b是第115位氨基酸殘基，c是選自第36至116位氨基酸殘基的氨基酸；b是第116位氨基酸殘基，c是選自第36至117位氨基酸殘基的氨基酸；b是第117位氨基酸殘基，c是選自第36至118位氨基酸殘基的氨基酸；b是第118位氨基酸殘基，c是選自第36至119位氨基酸殘基的氨基酸；b是第119位氨基酸殘基，c是選自第36至120位氨基酸殘基的氨基酸；b是第120位氨基酸殘基，c是選自第36至121位氨基酸殘基的氨基酸；b是第121位氨基酸殘基，c是選自第36至122位氨基酸殘基的氨基酸；b是第122位氨基酸殘基，c是選自第36至123位氨基酸殘基的氨基酸；b是第123位氨基酸殘基，c是選自第36至124位氨基酸殘基的氨基酸；b是第124位氨基酸殘基，c是選自第36至125位氨基酸殘基的氨基酸；b是第125位氨基酸殘基，c是選自第36至126位氨基酸殘基的氨基酸；b是第126位氨基酸殘基，c是選自第36至127位氨基酸殘基的氨基酸；b是第127位氨基酸殘基，c是選自第36至128位氨基酸殘基的氨基酸；b是第128位氨基酸殘基，c是選自第36至129位氨基酸殘基的氨基酸；b是第129位氨基酸殘基，c是選自第36至130位氨基酸殘基的氨基酸；b是第130位氨基酸殘基，c是選自第36至131位氨基酸殘基的氨基酸；b是第131位氨基酸殘基，c是選自第36至132位氨基酸殘基的氨基酸；b是第132位氨基酸殘基，c是選自第36至133位氨基酸殘基的氨基酸；b是第133位氨基酸殘基，c是選自第36至134位氨基酸殘基的氨基酸；b是第134位氨基酸殘基，c是選自第36至135位氨基酸殘基的氨基酸；或者b是第135位氨基酸殘基，c是選自第36至136位氨基酸殘基的氨基酸。在某些實施方案中，當(dāng)hpv16的e6蛋白的n末端部分和hpv16的e6蛋白的c末端部分一起比對時，含有重疊序列。重疊序列可以是至少1個、5個、7個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、105個、110個、115個或120個氨基酸。雖然n末端部分或c末端部分可以含有重疊序列，然而，n末端部分或c末端部分都不包含完整的e6ap結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如對應(yīng)于seqidno：2的氨基酸35至136。復(fù)合物e6/e6-ap靶向幾種其他底物以通過包括宿主nfx1-91(人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase，htert)的阻遏物)的蛋白酶體進(jìn)行降解。所導(dǎo)致的htert的提高的表達(dá)阻止端粒長度的縮短，并導(dǎo)致細(xì)胞永生化。另一些細(xì)胞靶標(biāo)(包括bak、fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(fas-associateddeathdomain-containingprotein，fadd)和胱天蛋白酶原8)被e6/e6-ap降解，引起細(xì)胞凋亡的抑制。e6蛋白還通過與宿主irf3和tyk2相互作用來抑制免疫應(yīng)答。這些相互作用阻止irf3轉(zhuǎn)錄活性并抑制干擾素α引起的tyk2介導(dǎo)的jak-stat激活，導(dǎo)致對干擾素信號傳導(dǎo)途徑的抑制。因此，hpv16的e6蛋白可以分割成hpv16的e6蛋白的n末端部分和hpv16的e6蛋白的c末端部分，從而使得融合蛋白不能結(jié)合除p53之外的一種或更多種底物，例如htert、bak、fadd、胱天蛋白酶原8的阻遏物或不能與宿主irf3和tyk2相互作用。ii.a.2.hpv18的e6蛋白可用于融合蛋白的hpv18的e6蛋白不與p53結(jié)合或不與hpv18的e6蛋白形成二聚體。為了防止hpv18的e6蛋白與p53的結(jié)合，將e6蛋白分割成e6蛋白的n末端部分和e6蛋白的c末端部分兩部分，其中每個部分不包含一個或更多個e6相關(guān)蛋白結(jié)合位點。在一個實施方案中，hpv18的e6蛋白的e6-ap結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：4的i30至y34、l52至r57、a64至y80、s82、d83、l93、t94、l102、r104、q109和a131。在另一個實施方案中，hpv18的e6蛋白的e6-ap結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：4的i30至a131。因此，在某些實施方案中，hpv18的e6蛋白的n末端部分具有a至b的氨基酸序列(18e6ni-j)，并且hpv16的e6蛋白的c末端部分具有c至d的氨基酸序列(16e6ck-1)，其中i是對應(yīng)于seqidno：4的第1或2位氨基酸，j是選自對應(yīng)于seqidno：4的選自第30至130位氨基酸的氨基酸，k是選自對應(yīng)于seqidno：4等于或高于第31位氨基酸和等于或低于第j+1位氨基酸的氨基酸，并且i是對應(yīng)于seqidno：4的第157或158位氨基酸。hpv18的e6蛋白可以在對應(yīng)于seqidno：4的氨基酸17leu、18cys、36lys、44val、45phe、46glu、48ala、49phe、52leu、66his、69ile、70asp、71phe、73ser、74arg、75ile、77glu、78leu、79arg、80tyr或81tyr處與p53相互作用。p53上相應(yīng)的相互作用位點包括p53的110arg、111leu112gly、113phe、114leu、115his、116ser、124cys、126tyr、128pro、131asn、142pro、144gln、146trp、229cys和231thr。因此，在某些實施方案中，可以通過將e6蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：4的第17至80位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩部分來產(chǎn)生hpv18的e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白通過防止與另一種e6蛋白的相互作用而不與hpv18的e6蛋白形成二聚體。hpv18的e6蛋白通過在對應(yīng)于seqidno：4的t37、k67、f71和y72處直接相互作用而與另一種e6蛋白形成二聚體。因此，可以通過將hpv18的e6蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：4的第37至71位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩部分來產(chǎn)生hpv18的e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含hpv18的e6的n末端部分(18e6ni-j)和hpv18的e6蛋白的c末端部分(18e6ck-1)，其中i是對應(yīng)于seqidno：4的第1或2位氨基酸，j是選自對應(yīng)于seqidno：4的第37至71位氨基酸的氨基酸，k是選自對應(yīng)于seqidno：4的等于或高于氨基酸第38位氨基酸和等于或低于第j+1位氨基酸的氨基酸，并且l是對應(yīng)于seqidno：4的第157或158位氨基酸。為了使hpv18的e6蛋白與另一種e6蛋白形成二聚體以降解p53，e6蛋白必須在其鋅指基序1中并入鋅。因此，當(dāng)鋅指基序1無法并入鋅時，hpv18的e6蛋白不再能形成二聚體。特別地，鋅指基序1的四個半胱氨酸(其位于對應(yīng)于seqidno：4的第32、35、65和68位氨基酸)直接與鋅相互作用。在一個實施方案中，hpv18的e6蛋白的n-末端部分在鋅指基序1內(nèi)僅含有一個半胱氨酸、兩個半胱氨酸或三個半胱氨酸，而hpv18的e6蛋白的c端部分分別在鋅指基序1內(nèi)含有三個半胱氨酸、兩個半胱氨酸或一個半胱氨酸。在另一個實施方案中，可以通過將e6蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：4的第32至67位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩部分來產(chǎn)生hpv18的e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含hpv18的e6蛋白的n末端部分(18e6ni-j)和hpv18的e6蛋白的c末端部分，其中i是對應(yīng)于seqidno：4的第1或2位氨基酸，j是選自對應(yīng)于seqidno：4的第32至67位氨基酸的氨基酸，k是選自對應(yīng)于seqidno：4的等于或高于第33位氨基酸和等于或低于第j+1位氨基酸的氨基酸，并且l是對應(yīng)于seqidno：4的第157或158位氨基酸。在一些實施方案中，融合蛋白包含18e6ni-j和18e6ck-1，其中對應(yīng)于seqidno：4，i是第1或2位氨基酸，i是第157或158位氨基酸，j和k如下：j是第30位氨基酸殘基，k是第31位氨基酸殘基；j是第31位氨基酸殘基，k是第31或32位氨基酸殘基；j是第32位氨基酸殘基，k是第31、32或33位氨基酸殘基；j是第33位氨基酸殘基，k是第31、32、33或34位氨基酸殘基；j是第34位氨基酸殘基，k是第31、32、33、34或35位氨基酸殘基；j是第35位氨基酸殘基，k是選自第31至36位氨基酸殘基的氨基酸；j是第36位氨基酸殘基，k是選自第31至37位氨基酸殘基的氨基酸；j是第37位氨基酸殘基，k是選自第31至38位氨基酸殘基的氨基酸；j是第38位氨基酸殘基，k是選自第31至39位氨基酸殘基的氨基酸；j是第39位氨基酸殘基，k是選自第31至40位氨基酸殘基的氨基酸；j是第40位氨基酸殘基，k是選自第31至41位氨基酸殘基的氨基酸；j是第41位氨基酸殘基，k是選自第31至42位氨基酸殘基的氨基酸；j是第42位氨基酸殘基，k是選自第31至43位氨基酸殘基的氨基酸；j是第43位氨基酸殘基，k是選自第31至44位氨基酸殘基的氨基酸；j是第44位氨基酸殘基，k是選自第31至45位氨基酸殘基的氨基酸；j是第45位氨基酸殘基，k是選自第31至46位氨基酸殘基的氨基酸；j是第46位氨基酸殘基，k是選自第31至47位氨基酸殘基的氨基酸；j是第47位氨基酸殘基，k是選自第31至48位氨基酸殘基的氨基酸；j是第48位氨基酸殘基，k是選自第31至49位氨基酸殘基的氨基酸；j是第49位氨基酸殘基，k是選自第31至50位氨基酸殘基的氨基酸；j是第50位氨基酸殘基，k是選自第31至51位氨基酸殘基的氨基酸；j是第51位氨基酸殘基，k是選自第31至52位氨基酸殘基的氨基酸；j是第52位氨基酸殘基，k是選自第31至53位氨基酸殘基的氨基酸；j是第53位氨基酸殘基，k是選自第31至54位氨基酸殘基的氨基酸；j是第54位氨基酸殘基，k是選自第31至55位氨基酸殘基的氨基酸；j是第55位氨基酸殘基，k是選自第31至56位氨基酸殘基的氨基酸；j是第56位氨基酸殘基，k是選自第31至57位氨基酸殘基的氨基酸；j是第57位氨基酸殘基，k是選自第31至58位氨基酸殘基的氨基酸；j是第58位氨基酸殘基，k是選自第31至59位氨基酸殘基的氨基酸；j是第59位氨基酸殘基，k是選自第31至60位氨基酸殘基的氨基酸；j是第60位氨基酸殘基，k是選自第31至61位氨基酸殘基的氨基酸；j是第61位氨基酸殘基，k是選自第31至62位氨基酸殘基的氨基酸；j是第62位氨基酸殘基，k是選自第31至63位氨基酸殘基的氨基酸；j是第63位氨基酸殘基，k是選自第31至64位氨基酸殘基的氨基酸；j是第64位氨基酸殘基，k是選自第31至65位氨基酸殘基的氨基酸；j是第65位氨基酸殘基，k是選自第31至66位氨基酸殘基的氨基酸；j是第66位氨基酸殘基，k是選自第31至67位氨基酸殘基的氨基酸；j是第67位氨基酸殘基，k是選自第31至68位氨基酸殘基的氨基酸；j是第68位氨基酸殘基，k是選自第31至69位氨基酸殘基的氨基酸；j是第69位氨基酸殘基，k是選自第31至70位氨基酸殘基的氨基酸；j是第70位氨基酸殘基，k是選自第31至71位氨基酸殘基的氨基酸；j是第71位氨基酸殘基，k是選自第31至72位氨基酸殘基的氨基酸；j是第72位氨基酸殘基，k是選自第31至73位氨基酸殘基的氨基酸；j是第73位氨基酸殘基，k是選自第31至74位氨基酸殘基的氨基酸；j是第74位氨基酸殘基，k是選自第31至75位氨基酸殘基的氨基酸；j是第75位氨基酸殘基，k是選自第31至76位氨基酸殘基的氨基酸；j是第76位氨基酸殘基，k是選自第31至77位氨基酸殘基的氨基酸；j是第77位氨基酸殘基，k是選自第31至78位氨基酸殘基的氨基酸；j是第78位氨基酸殘基，k是選自第31至79位氨基酸殘基的氨基酸；j是第79位氨基酸殘基，k是選自第31至80位氨基酸殘基的氨基酸；j是第80位氨基酸殘基，k是選自第31至81位氨基酸殘基的氨基酸；j是第81位氨基酸殘基，k是選自第31至82位氨基酸殘基的氨基酸；j是第82位氨基酸殘基，k是選自第31至83位氨基酸殘基的氨基酸；j是第83位氨基酸殘基，k是選自第31至84位氨基酸殘基的氨基酸；j是第84位氨基酸殘基，k是選自第31至85位氨基酸殘基的氨基酸；j是第85位氨基酸殘基，k是選自第31至86位氨基酸殘基的氨基酸；j是第86位氨基酸殘基，k是選自第31至87位氨基酸殘基的氨基酸；j是第87位氨基酸殘基，k是選自第31至88位氨基酸殘基的氨基酸；j是第88位氨基酸殘基，k是選自第31至89位氨基酸殘基的氨基酸；j是第89位氨基酸殘基，k是選自第31至90位氨基酸殘基的氨基酸；j是第90位氨基酸殘基，k是選自第31至91位氨基酸殘基的氨基酸；j是第91位氨基酸殘基，k是選自第31至92的氨基酸位氨基酸殘基；j是第92位氨基酸殘基，k是選自第31至93位氨基酸殘基的氨基酸；j是第93位氨基酸殘基，k是選自第31至94位氨基酸殘基的氨基酸；j是第94位氨基酸殘基，k是選自第31至95位氨基酸殘基的氨基酸；j是第95位氨基酸殘基，k是選自第31至96位氨基酸殘基的氨基酸；j是第96位氨基酸殘基，k是選自第31至97位氨基酸殘基的氨基酸；j是第97位氨基酸殘基，k是選自第31至98位氨基酸殘基的氨基酸；j是第98位氨基酸殘基，k是選自第31至99位氨基酸殘基的氨基酸；j是第99位氨基酸殘基，k是選自第31至100位氨基酸殘基的氨基酸；j是第100位氨基酸殘基，k是選自第31至101位氨基酸殘基的氨基酸；j是第101位氨基酸殘基，k是選自第31至102位氨基酸殘基的氨基酸；j是第102位氨基酸殘基，k是選自第31至103位氨基酸殘基的氨基酸；j是第103位氨基酸殘基，k是選自第31至104位氨基酸殘基的氨基酸；j是第104位氨基酸殘基，k是選自第31至105位氨基酸殘基的氨基酸；j是第105位氨基酸殘基，k是選自第31至106位氨基酸殘基的氨基酸；j是第106位氨基酸殘基，k是選自第31至107位氨基酸殘基的氨基酸；j是第107位氨基酸殘基，k是選自第31至108位氨基酸殘基的氨基酸；j是第108位氨基酸殘基，k是選自第31至109位氨基酸殘基的氨基酸；j是第109位氨基酸殘基，k是選自第31至110位氨基酸殘基的氨基酸；j是第110位氨基酸殘基，k是選自第31至111位氨基酸殘基的氨基酸；j是第111位氨基酸殘基，k是選自第31至112位氨基酸殘基的氨基酸；j是第112位氨基酸殘基，k是選自第31至113位氨基酸殘基的氨基酸；j是第113位氨基酸殘基，k是選自第31至114位氨基酸殘基的氨基酸；j是第114位氨基酸殘基，k是選自第31至115位氨基酸殘基的氨基酸；j是第115位氨基酸殘基，k是選自第31至116位氨基酸殘基的氨基酸；j是第116位氨基酸殘基，k是選自第31至117位氨基酸殘基的氨基酸；j是第117位氨基酸殘基，k是選自第31至118位氨基酸殘基的氨基酸；j是第118位氨基酸殘基，k是選自第31至119位氨基酸殘基的氨基酸；j是第119位氨基酸殘基，k是選自第31至120位氨基酸殘基的氨基酸；j是第120位氨基酸殘基，k是選自第31至121位氨基酸殘基的氨基酸；j是第121位氨基酸殘基，k是選自第31至122位氨基酸殘基的氨基酸；j是第122位氨基酸殘基，k是選自第31至123位氨基酸殘基的氨基酸；j是第123位氨基酸殘基，k是選自第31至124位氨基酸殘基的氨基酸；j是第124位氨基酸殘基，k是選自第31至125位氨基酸殘基的氨基酸；j是第125位氨基酸殘基，k是選自第31至126位氨基酸殘基的氨基酸；j是第126位氨基酸殘基，k是選自第31至127位氨基酸殘基的氨基酸；j是第127位氨基酸殘基，k是選自第31至128位氨基酸殘基的氨基酸；j是第128位氨基酸殘基，k是選自第31至129位氨基酸殘基的氨基酸；j是第129位氨基酸殘基，k是選自第31至130位氨基酸殘基的氨基酸；或者j是第130位氨基酸殘基，k是選自第31至131位氨基酸殘基的氨基酸。在某些實施方案中，當(dāng)hpv18的e6蛋白的n末端部分和hpv18的e6蛋白的c末端部分一起比對時，含有重疊序列。重疊序列可以是hpv18的e6蛋白的至少1個、5個、7個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、105個、110個、115個或120個氨基酸。雖然n末端部分或c末端部分可以含有重疊序列，然而，n末端部分和c末端部分都不包含完整的e6ap結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如對應(yīng)于seqidno：4的第30至131位氨基酸。另外，hpv18的e6蛋白可以分割成hpv18的e6蛋白的n末端部分以及hpv18的e6蛋白的c末端部分，從而使得融合蛋白不能結(jié)合除p53之外的一種或更多種底物，例如htert、bak、fadd、胱天蛋白酶原8的阻遏物或不能與宿主irf3和tyk2相互作用。ii.b.hpv16和hpv18的e7蛋白hpv16或hpv18的e7蛋白具有轉(zhuǎn)化和反式激活活性。它破壞宿主視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白rb1/prb的功能，這是細(xì)胞周期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。hpv16或hpv18的e7蛋白誘導(dǎo)e2f1轉(zhuǎn)錄因子從rb1解組裝，隨后轉(zhuǎn)錄激活e2f1調(diào)節(jié)的s期基因。rb1阻滯細(xì)胞周期能力的失活對于由病毒感染誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化、不受控制的細(xì)胞生長和增殖是關(guān)鍵的。從g1到s期之進(jìn)展的刺激允許病毒高效地使用細(xì)胞dna復(fù)制機(jī)制來實現(xiàn)病毒基因組復(fù)制。hpv16或hpv18的e7蛋白干擾由hdac1和hdac2介導(dǎo)的組蛋白脫乙?；瑢?dǎo)致轉(zhuǎn)錄的激活。報道了hpv16和hpv18的天然存在的e7蛋白的許多序列。例如，hpv16和hpv18的e7蛋白的氨基酸序列分別作為genbank登錄號np_041326.1(seqidno：6)和abp99785.1(seqidno：8)報道。編碼hpv16和hpv18的e7蛋白的野生型核苷酸序列分別作為genbank登錄號nc_001526.2(seqidno：5)和ef202153.1(seqidno：7)報道。所述序列在表2中再現(xiàn)。表2.hpv16和hpv18的e7蛋白序列本文中使用的術(shù)語“hpv16或hpv18的e7蛋白”包括其任何天然存在的變體或功能變體。hpv16的e7蛋白的天然存在的變體的實例包括但不限于圖13c-d中列出的蛋白：genbank登錄號：aab70738.1，acn22555.1，abk32510.1，aal96649.1，abc54573.1，acn22554.1，aal96631.1，abk32512.1，acj66713.1，aal96650.1，abk32511.1，ady75576.1，aam03025.1，aal96634.1，aal66736.1，afu06654.1，afu06650.1，abl96585.1，adh94043.1，afu06662.1，aao15692.1，afu06676.1，afu06594.1，aaf13395.1，afj19516.1，afj19720.1，afj19712.1，ago04504.1，afj19770.1，afj19520.2，afj19778.1，abl96586.1，afj19694.1，afj19686.1，afj19774.1，afj19708.1，abl96587.1，afj19674.1，afj19704.1，ago04488.1，abl96591.1，afj19748.1，ago04498.1，ago04496.1，afj19684.1，afj19678.1，ago04484.1，afj19698.1，afj19776.1，afj19746.1，afj19726.1，afj19722.1，afj19752.1，afj19732.1，afj19762.1，afj19668.1，afj19664.1，afj19766.1，afj19756.1，afj19680.1，afj19772.1，afj19696.1，afj19690.1，ago04496.1，和acq90216.1。在某些實施方案中，hpv16的e7蛋白包括一個或更多個選自以下的替換：p6s，t7k，e10k，m12k，d14g，l15v，t20i，t20s，y23h，y23c，y23n，c24s，y25d，e26v，q27h，l28s，l28f，n29s，n29y，n29h，n29p，d30h，d30f，s31n，s31r，e33d，e34d，e34g，e35d，d36h，e37g，i38k，d39e，d39n，g40c，p41q，a42d，a42t，g43e，e46k，d48v，r49g，a50v，h51l，n53k，n53t，i54n，v55i，t56i，c58y，k60r，k60m，c61r，s63c，s63f，l65p，r66w，l67m，l67f，l67s，q70r，h73l，h73r，v74l，r77c，r77q，r77s，t78a，e80y，d81g，l82p，l82m，m84t，m84i，g85d，g85s，g85a，t86a，t86i，v90m，c91s，q96r，及其任意組合。hpv18的e7蛋白的實例包括但不限于genbank登錄號：agu90416.1，agu90384.1，cab53097.1，p06788.2，abp99745.1，cab53098.1，cab53099.1，adc35661.1，abp99785.1，和p06788.2.1。在一些實施方案中，hpv18的e7蛋白包括選自d10n、e20d、d24g、e35k、e73k、r84g、s92n、s92k及其任意組合的一個或更多個替換。ii.b.1.hpv16的e7蛋白在一個實施方案中，可用于融合蛋白的hpv16的e7蛋白不與prb結(jié)合或不與hpv16的e7蛋白形成二聚體。為了防止hpv16的e7蛋白與prb的結(jié)合，e7蛋白可以分割成兩部分：e7蛋白的n末端部分和e7蛋白的c末端部分，其中每個不包含一個或更多個prb結(jié)合位點，而當(dāng)比對時，n末端部分和c末端部分包含hpv16的e7蛋白的完整序列。hpv16的e7蛋白上的prb結(jié)合位點包含e7蛋白的cr2結(jié)構(gòu)域和cr3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，hpv16的e7蛋白的prb結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：6的e18至d39、q44至p98或e18至p98。因此，在某些實施方案中，hpv16的e7蛋白的n末端部分具有從e到f的氨基酸序列(16e7ne-f)，并且hpv16的e7蛋白的c末端部分具有g(shù)至h的氨基酸序列(16e6cg-h)，其中e是對應(yīng)于seqidno：6的第1或2位氨基酸，f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至97位氨基酸的氨基酸，g是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第19位氨基酸的氨基酸和等于或低于第f+1位氨基酸的氨基酸，并且h是對應(yīng)于seqidno：6的第97或98位氨基酸。hpv16的e7蛋白可以在對應(yīng)于seqidno：6的氨基酸51his、52tyr、53asn、63ser、64thr、65leu、66arg、67leu、68cys、69val、70gln、80glu、82leu、83leu、87leu、89ile、90val、92pro、93ile、95ser、97lys或98pro處與prb相互作用。prb上的相應(yīng)相互作用位點包括prb的378val、379met、380asn、381thr、382ile、383gln、384gln、387met、388ile、390asn、497thr、498tyr、499ser、500arg、501ser、503ser和531val。因此，在某些實施方案中，可以通過將e7蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：6的第51至97位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩部分來產(chǎn)生e7蛋白的n末端部分和c末端部分。在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白通過防止與另一種e7蛋白的相互作用而不與hpv16的e7蛋白形成二聚體。hpv16的e7蛋白通過在α1螺旋(73hvdirtledllm84)(seqidno：16)、β2片層(64tlrlcvqs71)(seqidno：17)和/或β1片層(48drahynivtfc58)(seqidno：18)處直接與另一種e7蛋白相互作用來形成二聚體。因此，e6蛋白的n末端部分和c末端部分可分割成兩部分以破壞e7蛋白的α1螺旋、β2片層或β1片層。在一些實施方案中，通過在可破壞cr3結(jié)構(gòu)域的氨基酸處，即在選自對應(yīng)于seqidno：6的第44至97位氨基酸的氨基酸的c末端分割e7蛋白來產(chǎn)生e6蛋白的n末端部分和c末端部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含hpv16的e7蛋白的n末端部分(16e6ne-f)和hpv16的e7蛋白的c末端部分，其中e是對應(yīng)于seqidno：6的第1或2位氨基酸，f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第44至97位氨基酸的氨基酸，g是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第45位氨基酸的氨基酸和等于或低于第f+1位氨基酸的氨基酸，并且h是對應(yīng)于seqidno：6的第97或98位氨基酸。在一些實施方案中，融合蛋白包含16e7ne-f和16e7cg-h，其中對應(yīng)于seqidno：6，e為第1或2位氨基酸，h為第97或98位氨基酸，且f和g如下：f是第18位氨基酸殘基，g是第19位氨基酸殘基；f是第19位氨基酸殘基，g是第19或20位氨基酸殘基；f是第20位氨基酸殘基，g是第19、20或21位氨基酸殘基；f是第21位氨基酸殘基，g是第19、20、21或22位氨基酸殘基；f是第22位氨基酸殘基，g是第19、20、21、22或23位氨基酸殘基；f是第23位氨基酸殘基，g是選自第19至24位氨基酸殘基的氨基酸；f是第24位氨基酸殘基，g是選自第19至25位氨基酸殘基的氨基酸；f是第25位氨基酸殘基，g是選自第19至26位氨基酸殘基的氨基酸；f是第26位氨基酸殘基，g是選自第19至27位氨基酸殘基的氨基酸；f是第27位氨基酸殘基，g是選自第19至28位氨基酸殘基的氨基酸；f是第28位氨基酸殘基，g是選自第19至29位氨基酸殘基的氨基酸；f是第29位氨基酸殘基，g是選自第19至30位氨基酸殘基的氨基酸；f是第30位氨基酸殘基，g是選自第19至31位氨基酸殘基的氨基酸；f是第31位氨基酸殘基，g是選自第19至32位氨基酸殘基的氨基酸；f是第32位氨基酸殘基，g是選自第19至33位氨基酸殘基的氨基酸；f是第33位氨基酸殘基，g是選自第196至34位氨基酸殘基的氨基酸；f是第34位氨基酸殘基，g是選自第19至35位氨基酸殘基的氨基酸；f是第35位氨基酸殘基，g是選自第19至36位氨基酸殘基的氨基酸；f是第36位氨基酸殘基，g是選自第19至37位氨基酸殘基的氨基酸；f是第37位氨基酸殘基，g是選自第19至38位氨基酸殘基的氨基酸；f是第38位氨基酸殘基，g是選自第19至39位氨基酸殘基的氨基酸；f是第39位氨基酸殘基，g是選自第19至40位氨基酸殘基的氨基酸；f是第40位氨基酸殘基，g是選自第19至41位氨基酸殘基的氨基酸；f是第41位氨基酸殘基，g是選自第19至42位氨基酸殘基的氨基酸；f是第42位氨基酸殘基，g是選自第19至43位氨基酸殘基的氨基酸；f是第43位氨基酸殘基，g是選自第19至44位氨基酸殘基的氨基酸；f是第44位氨基酸殘基，g是選自第19至45位氨基酸殘基的氨基酸；f是第45位氨基酸殘基，g是選自第19至46位氨基酸殘基的氨基酸；f是第46位氨基酸殘基，g是選自第19至47位氨基酸殘基的氨基酸；f是第47位氨基酸殘基，g是選自第19至48位氨基酸殘基的氨基酸；f是第48位氨基酸殘基，g是選自第19至49位氨基酸殘基的氨基酸；f是第49位氨基酸殘基，g是選自第19至50位氨基酸殘基的氨基酸；f是第50位氨基酸殘基，g是選自第19至51位氨基酸殘基的氨基酸；f是第51位氨基酸殘基，g是選自第19至52位氨基酸殘基的氨基酸；f是第52位氨基酸殘基，g是選自第19至53位氨基酸殘基的氨基酸；f是第53位氨基酸殘基，g是選自第19至54位氨基酸殘基的氨基酸；f是第54位氨基酸殘基，g是選自第19至55位氨基酸殘基的氨基酸；f是第55位氨基酸殘基，g是選自第19至56位氨基酸殘基的氨基酸；f是第56位氨基酸殘基，g是選自第19至57位氨基酸殘基的氨基酸；f是第57位氨基酸殘基，g是選自第19至58位氨基酸殘基的氨基酸；f是第58位氨基酸殘基，g是選自第19至59位氨基酸殘基的氨基酸；f是第59位氨基酸殘基，g是選自第19至60位氨基酸殘基的氨基酸；f是第60位氨基酸殘基，g是選自第19至61位氨基酸殘基的氨基酸；f是第61位氨基酸殘基，g是選自第19至62位氨基酸殘基的氨基酸；f是第62位氨基酸殘基，g是選自第19至63位氨基酸殘基的氨基酸；f是第63位氨基酸殘基，g是選自第19至64位氨基酸殘基的氨基酸；f是第64位氨基酸殘基，g是選自第19至65位氨基酸殘基的氨基酸；f是第65位氨基酸殘基，g是選自第19至66位氨基酸殘基的氨基酸；f是第66位氨基酸殘基，g是選自第19至67位氨基酸殘基的氨基酸；f是第67位氨基酸殘基，g是選自第19至68位氨基酸殘基的氨基酸；f是第68位氨基酸殘基，g是選自第19至69位氨基酸殘基的氨基酸；f是第69位氨基酸殘基，g是選自第19至70位氨基酸殘基的氨基酸；f是第70位氨基酸殘基，g是選自第19至71位氨基酸殘基的氨基酸；f是第71位氨基酸殘基，g是選自第19至72位氨基酸殘基的氨基酸；f是第72位氨基酸殘基，g是選自第19至73位氨基酸殘基的氨基酸；f是第73位氨基酸殘基，g是選自第19至74位氨基酸殘基的氨基酸；f是第74位氨基酸殘基，g是選自第19至75位氨基酸殘基的氨基酸；f是第75位氨基酸殘基，g是選自第19至76位氨基酸殘基的氨基酸；f是第76位氨基酸殘基，g是選自第19至77位氨基酸殘基的氨基酸；f是第77位氨基酸殘基，g是選自第19至78位氨基酸殘基的氨基酸；f是第78位氨基酸殘基，g是選自第19至79位氨基酸殘基的氨基酸；f是第79位氨基酸殘基，g是選自第19至80位氨基酸殘基的氨基酸；f是第80位氨基酸殘基，g是選自第19至81位氨基酸殘基的氨基酸；f是第81位氨基酸殘基，g是選自第19至82位氨基酸殘基的氨基酸；f是第82位氨基酸殘基，g是選自第19至83位氨基酸殘基的氨基酸；f是第83位氨基酸殘基，g是選自第19至84位氨基酸殘基的氨基酸；f是第84位氨基酸殘基，g是選自第19至85位氨基酸殘基的氨基酸；f是第85位氨基酸殘基，g是選自第19至86位氨基酸殘基的氨基酸；f是第86位氨基酸殘基，g是選自第19至87位氨基酸殘基的氨基酸；f是第87位氨基酸殘基，g是選自第19至88位氨基酸殘基的氨基酸；f是第88位氨基酸殘基，g是選自第19至89位氨基酸殘基的氨基酸；f是第89位氨基酸殘基，g是選自第19至90位氨基酸殘基的氨基酸；f是第90位氨基酸殘基，g是選自第19至91位氨基酸殘基的氨基酸；f是第91位氨基酸殘基，g是選自第19至92位氨基酸殘基的氨基酸；f是第92位氨基酸殘基，g是選自第19至93位氨基酸殘基的氨基酸；f是第93位氨基酸殘基，g是選自第19至94位氨基酸殘基的氨基酸；f是第94位氨基酸殘基，g是選自第19至95位氨基酸殘基的氨基酸；f是第95位氨基酸殘基，g是選自第19至96位氨基酸殘基的氨基酸；f是第96位氨基酸殘基，g是選自第19至97位氨基酸殘基的氨基酸；或f是第97位氨基酸殘基，g是選自第19至98位氨基酸殘基的氨基酸。在某個實施方案中，當(dāng)hpv16的e7蛋白的n末端部分和hpv16的e7蛋白的c末端部分一起比對時，包含重疊序列。重疊序列可以是hpv16的e7蛋白的至少1、5、7、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80個氨基酸。雖然c末端部分的n末端部分可以含有重疊序列，然而，n末端部分和c末端部分都不包含完整的prb結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如對應(yīng)于seqidno：6的第18至98位氨基酸。ii.b.2.hpv18的e7蛋白在某些實施方案中，可用于融合蛋白的hpv18的e7蛋白不與prb結(jié)合或不與hpv18的e7蛋白形成二聚體。為了防止hpv18的e7蛋白與prb的結(jié)合，e7蛋白可分割成兩部分：e7蛋白的n末端部分和e7蛋白的c末端部分，其中每個部分不包含一個或更多個prb結(jié)合位點，而當(dāng)比對時，n末端部分和c末端部分包含hpv18的e7蛋白的完整序列。hpv18的e7蛋白上的prb結(jié)合位點包含e7蛋白的cr2結(jié)構(gòu)域和cr3結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，hpv18的e7蛋白的prb結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：8的i21至d42、q47至q105或i21至q105。因此，在某些實施方案中，hpv18的e7蛋白的n末端部分具有從m到n的氨基酸序列(16e7nm-n)，并且hpv18的e7蛋白的c末端部分具有從o到p的氨基酸序列(16e6co-p)，其中m是對應(yīng)于seqidno：8的第1或2位氨基酸，n是選自對應(yīng)于seqidno：8的第21至104位氨基酸的氨基酸，o是選自對應(yīng)于seqidno：8的等于或高于第22位氨基酸和等于或低于第n+1位氨基酸的氨基酸，并且p是對應(yīng)于seqidno：8的第104或105位氨基酸。hpv18的e7蛋白可以在對應(yīng)于seqidno：8的氨基酸58arg、59his、60thr、70ala、71arg、72ile、73glu、74leu、75val、76val、77glu、87gln、89leu、90phe、94leu、96phe、97val、99pro、100trp、102ala、104gln和105gln處與prb相互作用。prb上的相應(yīng)相互作用位點包括prb的378val、379met、380asn、381thr、382ile、383gln、384gln、387met、388ile、390asn、497thr、498tyr、499ser、500arg、501ser、503ser和531val.因此，在某些實施方案中，通過將e7蛋白在選自對應(yīng)于seqidno：8的第58至104位氨基酸的氨基酸的c末端分割成兩部分來產(chǎn)生hpv18的e7蛋白的n末端部分和c末端部分。在一些實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白通過防止與另一種e7蛋白的相互作用而不與hpv18的e7蛋白形成二聚體。hpv18的e7蛋白通過在α1螺旋(80addlrafqqlfl91)、β2片層(71rielvves78)和/或β1片層(55epqrhtmlcmc65)處與另一種e7蛋白直接相互作用來形成二聚體。因此，可以通過在破壞e7蛋白的α1螺旋、β2片層或β1片層的氨基酸處將e7蛋白分割成兩部分而產(chǎn)生e7蛋白的n末端部分和c末端部分。在一些實施方案中，通過在破壞cr3結(jié)構(gòu)域的氨基酸即在選自對應(yīng)于seqidno：8的第47至104位氨基酸的氨基酸的c末端分割e7蛋白來產(chǎn)生e7蛋白的n末端部分和c末端部分。在一個實施方案中，本發(fā)明的融合蛋白包含hpv18的e7蛋白的n末端部分(18e7nm-n)和hpv18的e7蛋白的c末端部分(18e7co-p)，其中m是對應(yīng)于seqidno：8的第1或2位氨基酸，n是選自對應(yīng)于seqidno：8的第21至104位氨基酸的氨基酸，o是選自對應(yīng)于seqidno：8的等于或高于第22位氨基酸和等于或低于第n+1位氨基酸的氨基酸，并且p是對應(yīng)于seqidno：8的第104或105位氨基酸。在一些實施方案中，融合蛋白包含18e7nm-n和18e7co-p，其中對應(yīng)于seqidno：8，m是第1或2位氨基酸，p是第104或105位氨基酸，n和o如下：n是第21位氨基酸殘基，o是第22位氨基酸殘基；n是第22位氨基酸殘基，o是第22或23位氨基酸殘基；n是第23位氨基酸殘基，o是第22、23或24位氨基酸殘基；n是第24位氨基酸殘基，o是第22、23、24或25位氨基酸殘基；n是第25位氨基酸殘基，o是第22、23、24、25或26位氨基酸殘基；n是第26位氨基酸殘基，o是選自第22至27位氨基酸殘基的氨基酸；n是第27位氨基酸殘基，o是選自第22至28位氨基酸殘基的氨基酸；n是第28位氨基酸殘基，o是選自第22至29位氨基酸殘基的氨基酸；n是第29位氨基酸殘基，o是選自第22至30位氨基酸殘基的氨基酸；n是第30位氨基酸殘基，o是選自第22至31位氨基酸殘基的氨基酸；n是第31位氨基酸殘基，o是選自第22至32位氨基酸殘基的氨基酸；n是第32位氨基酸殘基，o是選自第22至33位氨基酸殘基的氨基酸；n是第33位氨基酸殘基，o是選自第22至34位氨基酸殘基的氨基酸；n是第34位氨基酸殘基，o是選自第22至35位氨基酸殘基的氨基酸；n是第35位氨基酸殘基，o是選自第22至36位氨基酸殘基的氨基酸；n是第36位氨基酸殘基，o是選自第22至37位氨基酸殘基的氨基酸；n是第37位氨基酸殘基，o是選自第22至38位氨基酸殘基的氨基酸；n是第38位氨基酸殘基，o是選自第22至39位氨基酸殘基的氨基酸；n是第39位氨基酸殘基，o是選自第22至40位氨基酸殘基的氨基酸；n是第40位氨基酸殘基，o是選自第22至41位氨基酸殘基的氨基酸；n是第41位氨基酸殘基，o是選自第22至42位氨基酸殘基的氨基酸；n是第42位氨基酸殘基，o是選自第22至43位氨基酸殘基的氨基酸；n是第43位氨基酸殘基，o是選自第22至44位氨基酸殘基的氨基酸；n是第44位氨基酸殘基，o是選自第22至45位氨基酸殘基的氨基酸；n是第45位氨基酸殘基，o是選自第22至46位氨基酸殘基的氨基酸；n是第46位氨基酸殘基，o是選自第22至47位氨基酸殘基的氨基酸；n是第47位氨基酸殘基，o是選自第22至48位氨基酸殘基的氨基酸；n是第48位氨基酸殘基，o是選自第22至49位氨基酸殘基的氨基酸；n是第49位氨基酸殘基，o是選自第22至50位氨基酸殘基的氨基酸；n是第50位氨基酸殘基，o是選自第22至51位氨基酸殘基的氨基酸；n是第51位氨基酸殘基，o是選自第22至52位氨基酸殘基的氨基酸；n是第52位氨基酸殘基，o是選自第22至53位氨基酸殘基的氨基酸；n是第53位氨基酸殘基，o是選自第22至54位氨基酸殘基的氨基酸；n是第54位氨基酸殘基，o是選自第22至55位氨基酸殘基的氨基酸；n是第55位氨基酸殘基，o是選自第22至56位氨基酸殘基的氨基酸；n是第56位氨基酸殘基，o是選自第22至57位氨基酸殘基的氨基酸；n是第57位氨基酸殘基，o是選自第22至58位氨基酸殘基的氨基酸；n是第58位氨基酸殘基，o是選自第22至59位氨基酸殘基的氨基酸；n是第59位氨基酸殘基，o是選自第22至60位氨基酸殘基的氨基酸；n是第60位氨基酸殘基，o是選自第22至61位氨基酸殘基的氨基酸；n是第61位氨基酸殘基，o是選自第22至62位氨基酸殘基的氨基酸；n是第62位氨基酸殘基，o是選自第22至63位氨基酸殘基的氨基酸；n是第63位氨基酸殘基，o是選自第22至64位氨基酸殘基的氨基酸；n是第64位氨基酸殘基，o是選自第22至65位氨基酸殘基的氨基酸；n是第65位氨基酸殘基，o是選自第22至66位氨基酸殘基的氨基酸；n是第66位氨基酸殘基，o是選自第22至67位氨基酸殘基的氨基酸；n是第67位氨基酸殘基，o是選自第22至68位氨基酸殘基的氨基酸；n是第68位氨基酸殘基，o是選自第22至69位氨基酸殘基的氨基酸；n是第69位氨基酸殘基，o是選自第22至70位氨基酸殘基的氨基酸；n是第70位氨基酸殘基，o是選自第22至71位氨基酸殘基的氨基酸；n是第71位氨基酸殘基，o是選自第22至72位氨基酸殘基的氨基酸；n是第72位氨基酸殘基，o是選自第22至73位氨基酸殘基的氨基酸；n是第73位氨基酸殘基，o是選自第22至74位氨基酸殘基的氨基酸；n是第74位氨基酸殘基，o是選自第22至75位氨基酸殘基的氨基酸；n是第75位氨基酸殘基，o是選自第22至76位氨基酸殘基的氨基酸；n是第76位氨基酸殘基，o是選自第22至77位氨基酸殘基的氨基酸；n是第77位氨基酸殘基，o是選自第22至78位氨基酸殘基的氨基酸；n是第78位氨基酸殘基，o是選自第22至79位氨基酸殘基的氨基酸；n是第79位氨基酸殘基，o是選自第22至80位氨基酸殘基的氨基酸；n是第80位氨基酸殘基，o是選自第22至81位氨基酸殘基的氨基酸；n是第81位氨基酸殘基，o是選自第22至82位氨基酸殘基的氨基酸；n是第82位氨基酸殘基，o是選自第22至83位氨基酸殘基的氨基酸；n是第83位氨基酸殘基，o是選自第22至84位氨基酸殘基的氨基酸；n是第84位氨基酸殘基，o是選自第22至85位氨基酸殘基的氨基酸；n是第85位氨基酸殘基，o是選自第22至86位氨基酸殘基的氨基酸；n是第86位氨基酸殘基，o是選自第22至87位氨基酸殘基的氨基酸；n是第87位氨基酸殘基，o是選自第22至88位氨基酸殘基的氨基酸；n是第88位氨基酸殘基，o是選自第22至89位氨基酸殘基的氨基酸；n是第89位氨基酸殘基，o是選自第22至90位氨基酸殘基的氨基酸；n是第90位氨基酸殘基，o是選自第22至91位氨基酸殘基的氨基酸；n是第91位氨基酸殘基，o是選自第22至92位氨基酸殘基的氨基酸；n是第92位氨基酸殘基，o是選自第22至93位氨基酸殘基的氨基酸；n是第93位氨基酸殘基，o是選自第22至94位氨基酸殘基的氨基酸；n是第94位氨基酸殘基，o是選自第22至95位氨基酸殘基的氨基酸；n是第95位氨基酸殘基，o是選自第22至96位氨基酸殘基的氨基酸；n是第96位氨基酸殘基，o是選自第22至97位氨基酸殘基的氨基酸；n是第97位氨基酸殘基，o是選自第22至98位氨基酸殘基的氨基酸；n是第98位氨基酸殘基，o是選自第22至99位氨基酸殘基的氨基酸；n是第99位氨基酸殘基，o是選自第22至100位氨基酸殘基的氨基酸；n是第100位氨基酸殘基，o是選自第22至101位氨基酸殘基的氨基酸；n是第101位氨基酸殘基，o是選自第22至102位氨基酸殘基的氨基酸；n是第102位氨基酸殘基，o是選自第22至103位氨基酸殘基的氨基酸；n是第103位氨基酸殘基，o是選自第22至104位氨基酸殘基的氨基酸；n是第104位氨基酸殘基，o是選自第22至105位氨基酸殘基的氨基酸。在某些實施方案中，當(dāng)hpv18的e7蛋白的n末端部分和hpv18的e7蛋白的c末端部分一起比對時，含有重疊序列。重疊序列可以是hpv18的e7蛋白的至少1個、5個、7個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個或80個氨基酸。雖然n末端部分或c末端部分可以含有重疊序列，然而，n末端部分和c末端部分都不包含完整的prb結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如對應(yīng)于seqidno：8的第21至105位氨基酸。ii.c.融合蛋白在一個方面，本發(fā)明的治療分子是包含hpv16的e6蛋白、hpv18的e6蛋白、hpv16的e7蛋白和hpv18的e7蛋白的至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或至少8個部分的融合蛋白或編碼該融合蛋白的核苷酸序列，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在另一方面，本發(fā)明的治療分子包含多于一個氨基酸序列。例如，本發(fā)明的治療分子包含八個氨基酸序列或編碼八個氨基酸序列的八個核苷酸序列，其中所述8個氨基酸序列是hpv16的e6蛋白的n末端部分、hpv16的e6蛋白的c末端部分、hpv18的e6蛋白的n末端部分和hpv18的e6蛋白的c末端部分、hpv16的e7蛋白的n末端部分、hpv16的e7蛋白的c末端部分和hpv18的e7蛋白的n末端部分。在其他一些方面，本發(fā)明的治療分子包含(i)七個氨基酸序列或編碼七個氨基酸序列的七個核苷酸序列，其中七個氨基酸序列含有八個多肽部分；(ii)編碼六個氨基酸序列的六個氨基酸序列或六個核苷酸序列，其中所述六個氨基酸序列包含八個多肽部分；(iii)五個氨基酸序列或編碼五個氨基酸序列的五個核苷酸序列，其中所述五個氨基酸序列包含八個多肽部分；(iv)四個氨基酸序列或編碼四個氨基酸序列的四個核苷酸序列，其中四個氨基酸序列包含八個多肽部分；(v)編碼三個氨基酸序列的三個氨基酸序列或三個核苷酸序列，其中三個氨基酸序列包含八個多肽部分；(vi)編碼三個氨基酸序列的兩個氨基酸序列或三個核苷酸序列，其中所述兩個氨基酸序列包含八個多肽部分；或(vii)一個氨基酸序列或編碼所述氨基酸序列的核苷酸序列，其中所述一個氨基酸序列包含八個多肽部分，其中所述八個多肽部分是hpv16的e6蛋白的n末端部分，hpv16的e6蛋白的c末端部分、hpv18的e6蛋白的n末端部分、hpv18的e6蛋白的c末端部分、hpv16的e7蛋白的n末端部分、hpv16的e7蛋白的c末端部分和hpv18的e7蛋白的n末端部分。在一些實施方案中，融合蛋白包含至少四個、至少五個、至少六個、至少七個或八個氨基酸序列，其選自：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。融合蛋白還可以包含與hpv16的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e7蛋白和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的相同數(shù)目的表位，或比hpv16的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e6蛋白、hpv18的天然存在的e7蛋白和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的表位更多的表位。在另一些實施方案中，融合蛋白中的hpv16的e6蛋白的n末端部分、hpv16的e6蛋白的c末端部分、hpv18的e6蛋白的n末端部分和hpv18的e6蛋白的c末端部分各自不包含完整的e6相關(guān)蛋白(e6ap)結(jié)合位點。在另一些實施方案中，融合蛋白不包含完整的e6ap結(jié)合位點，所述結(jié)合位點包含對應(yīng)于seqidno：2(e6hpv16)的第35至136位氨基酸或?qū)?yīng)于seqidno：4(e6hpv18)的第30至131位氨基酸。例如，融合蛋白不包含對應(yīng)于seqidno：2的第35至136位氨基酸或?qū)?yīng)于seqidno：4的第30至131位氨基酸的連續(xù)序列。在另一些實施方案中，融合蛋白中的hpv16的e7蛋白的n末端部分、hpv16的e7蛋白的c末端部分、hpv18的e7蛋白的n末端部分和hpv18的e7蛋白的c末端部分各自不包含完整的cr2結(jié)構(gòu)域或完整的cr3結(jié)構(gòu)域或者包含cr2結(jié)構(gòu)域或cr3結(jié)構(gòu)域，但不同時包含兩者。在一些實施方案中，融合蛋白不包含對應(yīng)于seqidno：6的第18至98位氨基酸或?qū)?yīng)于seqidno：8(e7hpv18)的第21至105位氨基酸的連續(xù)序列。在某些實施方案中，融合蛋白包含：(i)hpv16的e6蛋白的n末端部分，其包含具有與seqidno：2的n端的氨基酸序列(16e6na-b)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中a是選自對應(yīng)于seqidno：2的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第35至135位氨基酸殘基的氨基酸，(ii)hpv16的e6蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：2的c端序列(16e6cc-d)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中c是選自對應(yīng)于seqidno：2的等于或高于第36位氨基酸殘基和等于或低于第b+1位氨基酸的氨基酸殘基的氨基酸，并且d是選自對應(yīng)于seqidno：2的第157或158位氨基酸殘基的氨基酸，(iii)hpv18的e6蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：4的n末端序列(18e6ni-i)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中i是選自對應(yīng)于seqidno：4的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且j是選自對應(yīng)于seqidno：4的第30至130位氨基酸殘基的氨基酸，(iv)hpv18的e6蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：4的c末端序列(18e6ck-1)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中k是選自對應(yīng)于seqidno：4的等于或高于第31位氨基酸殘基和等于或低于第j+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且l是選自對應(yīng)于seqidno：4的第157或158位氨基酸殘基的氨基酸；(v)hpv16的e7蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：6的n末端序列(16e7ne-f)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中e是選自對應(yīng)于seqidno：6的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至97位氨基酸殘基的氨基酸；(vi)hpv16的e7蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：6的c末端序列(16e7cg-h)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中g(shù)是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第19位氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且h是選自對應(yīng)于seqidno：6的第97或98位氨基酸殘基的氨基酸；(vii)hpv18的e7蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：8的n末端序列(18e7nm-n)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中m是選自對應(yīng)于seqidno：8的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且n是選自對應(yīng)于seqidno：8的第21至104位氨基酸殘基的氨基酸，以及(viii)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：8的c末端序列(18e7co-p)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中o是選自對應(yīng)于seqidno：8的等于或高于第22位氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且l是選自對應(yīng)于seqidno：8的第104或105位氨基酸殘基的氨基酸，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或形成具有hpv16或hpv18的e6蛋白的二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白至少含有hpv16和hpv18的天然存在的e6蛋白以及hpv16和hpv18的天然存在的e7蛋白的所有表位。在另一些實施方案中，融合蛋白包含：(i)hpv16的e6蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：2的n末端序列(16e6na-b)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中a是選自對應(yīng)于seqidno：2的氨基酸殘基1或2的氨基酸，且b是選自對應(yīng)于seqidno：2的第35至39、57至62、69至85、87至88、98至99、107、109、114和135位氨基酸殘基的氨基酸，(ii)hpv16的e6蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：2的c端序列(16e6cc-d)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中c是選自對應(yīng)于seqidno：2的等于或高于第36位氨基酸殘基和等于或低于第b+1位氨基酸氨基酸殘基的氨基酸，并且d是選自對應(yīng)于seqidno：2的第157或158位氨基酸殘基的氨基酸，(iii)hpv18的e6蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：4的n末端序列(18e6ni-j)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中i是選自對應(yīng)于seqidno：4的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且j是選自對應(yīng)于seqidno：4的第30至34、52至57、64至80、82至83、93、94、102、104、109和130位氨基酸殘基的氨基酸，(iv)hpv18的e6蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：4的c末端序列(18e6ck-1)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中k是選自對應(yīng)于seqidno：4的等于或高于第31位氨基酸殘基和等于或低于第j+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且l是選自對應(yīng)于seqidno：4的第157或158位氨基酸殘基的氨基酸；(v)hpv16的e7蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：6的n末端序列(16e7ne-f)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中e是選自對應(yīng)于seqidno：6的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至39和44至97位氨基酸殘基的氨基酸；(vi)hpv16的e7蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：6的c末端序列(16e7cg-h)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中g(shù)是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第19位氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且h是選自對應(yīng)于seqidno：6的第97或98位氨基酸殘基的氨基酸；(vii)hpv18的e7蛋白的n末端部分，其包含與seqidno：8的n末端序列(18e7nm-n)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中m是選自對應(yīng)于seqidno：8的第1或2位氨基酸殘基的氨基酸，并且n是選自對應(yīng)于seqidno：8的第21至42和47至104位氨基酸殘基的氨基酸，以及(viii)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其包含與seqidno：8的c末端序列(18e7co-p)具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，其中o是選自對應(yīng)于seqidno：8的等于或高于第22位氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸，并且p是選自對應(yīng)于seqidno：8的第104或105位氨基酸殘基的氨基酸，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或形成具有hpv16或hpv18的e6蛋白的二聚體，其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白至少含有hpv16和hpv18的天然存在的e6蛋白以及hpv16和hpv18的天然存在的e7蛋白的所有表位。在另一些實施方案中，f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第18至39位的氨基酸殘基，并且g是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第19位氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸殘基的氨基酸，或其中f是選自對應(yīng)于seqidno：6的第44至97位氨基酸殘基的氨基酸殘基，并且g是選自對應(yīng)于seqidno：6的等于或高于第45位氨基酸殘基和等于或低于第f+1位氨基酸的氨基酸殘基的氨基酸。在另一些實施方案中，對應(yīng)于seqidno：8，n是選自第21至41位的氨基酸殘基，并且o是選自等于或高于第22位氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸，或其中n是選自第47至104位氨基酸殘基的氨基酸殘基，并且o是選自等于或高于第48位的氨基酸殘基和等于或低于第n+1位氨基酸殘基的氨基酸。在另一些實施方案中，融合蛋白不包含hpv16的天然存在的全長e6蛋白、hpv16的天然存在的全長e7蛋白、hpv18的天然存在的全長e6蛋白和hpv18的天然存在的全長e7蛋白。融合蛋白可以以任何順序包含蛋白質(zhì)的八個部分。八個部分的所有可能的組合包括33,600種可能性，這是本申請的一部分。在一些實施方案中，如此構(gòu)建融合蛋白，使得來自相同蛋白質(zhì)的n末端和c末端部分不直接彼此相鄰放置。在另一些實施方案中，如此構(gòu)建融合蛋白，使得來自相同hpv血清型的n末端或c末端部分彼此相鄰放置。在另一些實施方案中，將來自不同蛋白質(zhì)(相同的hpv血清型)的n末端部分彼此相鄰放置，并將來自不同蛋白質(zhì)(相同的hpv血清型)的c末端部分彼此相鄰放置。在某些實施方案中，融合蛋白從n末端到c末端包含：(i)16e6na-b-16e7ne-f-16e6cc-d-16e7cg-h-18e6ni-j-18e7nm-n-18e6ck-l-18e7co-p；(ii)18e6ni-j-18e7nm-n-18e6ck-l-18e7co-p-16e6na-b-16e7ne-f-16e6cc-d-16e7cg-h；(iii)16e7ne-f-16e6na-b-16e7cg-h-16e6cc-d-18e7nm-n-18e6ni-j-18e7co-p-18e6ck-l；(iv)18e7nm-n-18e6ni-j-18e7co-p-18e6ck-l-16e7ne-f-16e6na-b-16e7cg-h-16e6cc-d；(v)18e6ni-j-16e7ne-f-16e6cc-d-18e6ck-l-18e7nm-n-16e6na-b-18e7co-p-16e7cg-h；(vi)16e6na-b-18e6ni-j-18e7co-p-16e6cc-d-16e7ne-f-18e7nm-n-16e7cg-h-18e6ck-l；(vii)18e7nm-n-16e6na-b-18e7co-p-16e7cg-h-16e7ne-f-18e6ni-j-16e6cc-d-18e6ck-l；或(viii)16e7ne-f-18e6ni-j-16e7cg-h-18e7co-p-18e7nm-n-16e6na-b-18e6ck-l-16e6cc-d。在一些實施方案中，(-)是肽鍵。在某些實施方案中，(-)是一個或更多個氨基酸。在一個特別的實施方案中，融合蛋白包含：從n末端到c末端16e6na-b-16e7ne-f-16e6cc-d-16e7cg-h-18e6ni-j-18e7nm-n-18e6ck-l-18e7co-p，a是seqidno：2的第1位氨基酸殘基，b是seqidno：2的第85位氨基酸殘基，c使seqidno：2的第71位氨基酸殘基，d使seqidno：2的第158位氨基酸殘基，e是seqidno：6的第1位氨基酸殘基，f是seqidno：6的第65位氨基酸殘基，g是seqidno：6的第51位氨基酸殘基，h使seqidno：6的第98位氨基酸殘基，i是seqidno：4的第1位氨基酸殘基，j是seqidno：4的第85位氨基酸殘基，k是seqidno：4的第71位氨基酸殘基，l是seqidno：4的第158位氨基酸殘基，m是seqidno：8的第1位氨基酸殘基，n是seqidno：8的第65位氨基酸殘基，o是seqidno：8的第51位氨基酸殘基，且p是seqidno：8的第105位氨基酸殘基。在一些實施方案中，融合蛋白包含與seqidno：10具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。在另一些實施方案中，融合蛋白包含異源部分。異源部分可以是異源多肽或非多肽部分。異源多肽的實例包括但不限于信號肽、免疫增強(qiáng)子肽或增強(qiáng)融合蛋白性質(zhì)的任何其他肽。在一個實施方案中，與融合蛋白融合的信號肽包括但不限于組織纖溶酶原激活物(tpa)的信號肽、單純皰疹病毒糖蛋白d(hsvgd)的信號肽、生長激素的信號肽及其任意組合。在一個特別的實施方案中，與融合蛋白融合的信號肽包含與seqidno：14具有至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在另一個實施方案中，免疫增強(qiáng)子肽包括但不限于cd40配體、fms樣酪氨酸激酶-3配體(flt3l)、鞭毛蛋白、ox40或其任意組合。在一個具體實施方案中，免疫增強(qiáng)肽是flt3l。在另一個實施方案中，融合蛋白與免疫增強(qiáng)子肽融合，其包含與seqidno：12具有至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。2013年8月1日公開的us2013/0195905中的多核苷酸或融合蛋白的所有描述被通過引用整體并入本文。融合蛋白、信號肽和免疫增強(qiáng)肽的實例示于表3中。表3.融合蛋白和核苷酸序列ii.d.編碼融合蛋白的多核苷酸本發(fā)明的治療分子可以是本文中所述的一種或更多種蛋白質(zhì)分子或編碼該蛋白質(zhì)分子的多核苷酸序列。在一個方面，本發(fā)明的治療分子可以包括一個或更多個dna序列、rna序列或pna序列。在另一方面，編碼治療分子(例如，融合蛋白)的多核苷酸序列是密碼子優(yōu)化的。術(shù)語“密碼子優(yōu)化的”當(dāng)其指用于轉(zhuǎn)化多種宿主的核酸分子的基因或編碼區(qū)時，是指改變核酸分子的基因或編碼區(qū)中的密碼子，以反映宿主生物體的典型密碼子使用，而不改變由dna編碼的多肽。這樣的優(yōu)化包括用在該生物體的基因中更頻繁使用的一種或更多種密碼子替代至少一種或多于一種或顯著數(shù)目的密碼子。包含編碼任何多肽鏈之氨基酸的密碼子的核苷酸序列中的偏差允許在編碼基因的序列中的變異。由于每個密碼子由三個核苷酸組成，并且包含dna的核苷酸限于四種特異性堿基，所以存在64種可能的核苷酸組合，其中61種編碼氨基酸(其余的三種密碼子編碼終止翻譯的信號)。顯示哪些密碼子編碼哪些氨基酸的“遺傳密碼”在本文中再現(xiàn)為表4.結(jié)果，許多氨基酸由多于一種密碼子決定。例如，氨基酸丙氨酸和脯氨酸由四種三聯(lián)體編碼，絲氨酸和精氨酸由六種編碼，而色氨酸和甲硫氨酸僅由一種三聯(lián)體編碼。這種簡并性允許dna堿基組成在寬的范圍內(nèi)變化，而不改變由dna編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。表4.標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼許多生物體顯示出使用特定密碼子來編碼在生長的肽鏈中插入特定氨基酸的偏倚。密碼子偏好或密碼子偏倚(生物體之間密碼子使用的差異)由遺傳密碼的簡并性提供，并且在許多生物體中有良好的記載。密碼子偏倚通常與信使rna(mrna)的翻譯效率相關(guān)聯(lián)，其繼而被認(rèn)為尤其取決于被翻譯的密碼子的性質(zhì)和特定轉(zhuǎn)移rna(trna)分子的可用性。所選擇的trna在細(xì)胞中的優(yōu)勢一般是肽合成中最常使用的密碼子的反映。因此，基于密碼子優(yōu)化，可以定制基因以用于給定生物體中的最佳基因表達(dá)?？紤]到可用于多種動物、植物和微生物物種中的大量基因序列，已經(jīng)計算了密碼子使用的相對頻率。密碼子使用表可在例如可獲得自http：//www.kazusa.or.jp/codon/(訪問于2012年6月18日)的“密碼子使用數(shù)據(jù)庫”中獲得。見nakamura，y.，等nucl.acidsres.28：292(2000)。以優(yōu)化的頻率隨機(jī)分配密碼子以編碼給定的多肽序列可以通過計算每種氨基酸的密碼子頻率，然后隨機(jī)地將密碼子分配給多肽序列來手動完成。另外，可以使用多種算法和計算機(jī)軟件程序來計算最優(yōu)序列。在一個實施方案中，編碼治療分子(例如，融合蛋白)的核苷酸序列對于人表達(dá)是密碼子優(yōu)化的。在另一個實施方案中，編碼治療分子(例如，融合蛋白)的核苷酸序列對于原核或真核表達(dá)是密碼子優(yōu)化的。在另一些實施方案中，編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸序列包含hpv16的e6蛋白的n末端部分、hpv16的e6蛋白的c末端部分、hpv16的e7蛋白的n末端部分、hpv16的e7蛋白的c末端部分、hpv18的e6蛋白的n末端部分、hpv18的e6蛋白的c末端部分、hpv18的e7蛋白的n末端部分和hpv18的e7蛋白的c末端部分的密碼子優(yōu)化的序列，其在本文中別處描述。在一些實施方案中，所述多核苷酸包含與seqidno：9具有至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核苷酸序列。在另一些實施方案中，多核苷酸還包含編碼如上所述的異源部分(例如，異源多肽或非肽部分)的核苷酸序列。在一些實施方案中，異源多肽包含fms相關(guān)酪氨酸激酶3配體(“flt3l”)或其一部分、tpa的信號肽或兩者。在另一些實施方案中，異源多核苷酸是密碼子優(yōu)化的。在另一些實施方案中，編碼異源多肽的核苷酸序列編碼信號肽，其中所述核苷酸序列包含與seqidno：13具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。在另一些實施方案中，編碼異源多肽的核苷酸序列編碼免疫增強(qiáng)肽，其中所述核苷酸序列包含與seqidno：11具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。ii.d.1.轉(zhuǎn)錄控制序列在一些實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸分子有效地與至少一個轉(zhuǎn)錄控制序列連接。本文中使用的轉(zhuǎn)錄控制序列是任何調(diào)節(jié)性核苷酸序列，例如啟動子序列或啟動子-增強(qiáng)子組合，其有助于與其可操作地連接的編碼核酸的高效轉(zhuǎn)錄和翻譯?；虮磉_(dá)控制序列可以是例如哺乳動物或病毒啟動子，例如組成型或誘導(dǎo)型啟動子。組成型哺乳動物啟動子包括但不限于以下基因的啟動子：次黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(hprt)、腺苷脫氨酶、丙酮酸激酶、β-肌動蛋白啟動子和其他組成型啟動子。在真核細(xì)胞中組成型地起作用的示例性病毒啟動子包括例如來自巨細(xì)胞病毒(cmv)、猿猴病毒(例如sv40)、乳頭瘤病毒、腺病毒、人類免疫缺陷病毒(hiv)、勞斯肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、莫洛尼白血病病毒(moloneyleukemiavirus)的長末端重復(fù)序列(ltr)和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒的啟動子，以及單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動子。其他組成型啟動子是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。可用作本發(fā)明的基因表達(dá)序列的啟動子也包括誘導(dǎo)型啟動子。誘導(dǎo)型啟動子在誘導(dǎo)劑的存在下表達(dá)。例如，在某些金屬離子存在下，金屬硫蛋白啟動子被誘導(dǎo)以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。其他誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。一般而言，轉(zhuǎn)錄控制序列必要時應(yīng)包括分別涉及轉(zhuǎn)錄和翻譯起始的5’非轉(zhuǎn)錄和5’非翻譯序列，例如tata盒、加帽序列、caat序列等。尤其是，這樣的5’非轉(zhuǎn)錄序列將包括啟動子區(qū)，其包括用于可操作地連接的編碼核酸的轉(zhuǎn)錄控制的啟動子序列?；虮磉_(dá)序列任選地包含期望的增強(qiáng)子序列或上游激活子序列。ii.d.2.載體本發(fā)明還提供了包含編碼本發(fā)明的治療分子(例如，融合蛋白)的多核苷酸分子的載體。合適的載體包括表達(dá)載體、病毒載體和質(zhì)粒載體。本文中使用的表達(dá)載體是指當(dāng)引入適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中時含有用于被插入之編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元件的任何核酸構(gòu)建體，或者在rna病毒載體的情況下，是用于復(fù)制和翻譯的必要元件。表達(dá)載體可以包括質(zhì)粒、噬菌粒、病毒及其衍生物。本發(fā)明的表達(dá)載體將包括編碼本文中所述融合蛋白的優(yōu)化的多核苷酸。在一個實施方案中，融合蛋白的經(jīng)優(yōu)化編碼序列可操作地與表達(dá)控制序列相連接。如本文中使用的，當(dāng)兩個核酸序列以允許每個組分核酸序列保持其功能性的方式共價連接時，它們是可操作地連接的。當(dāng)它們以這種方式共價連接時，編碼序列和基因表達(dá)控制序列被認(rèn)為是可操作地連接的，以將編碼序列的表達(dá)或轉(zhuǎn)錄和/或翻譯置于基因表達(dá)控制序列的影響或控制下。如果在5’基因表達(dá)序列中啟動子的誘導(dǎo)導(dǎo)致編碼序列的轉(zhuǎn)錄并且如果兩個dna序列之間的連接的性質(zhì)不會(1)導(dǎo)致引入移碼突變、(2)干擾啟動子區(qū)指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的能力或(3)干擾相應(yīng)的rna轉(zhuǎn)錄物被翻譯成蛋白質(zhì)的能力，則稱兩條dna序列可操作地連接。因此，如果基因表達(dá)序列能夠?qū)崿F(xiàn)該編碼核酸序列的轉(zhuǎn)錄，使得所得的轉(zhuǎn)錄物翻譯成期望的蛋白質(zhì)或多肽，則基因表達(dá)序列將與編碼核酸序列可操作地連接。病毒載體包括但不限于來自以下病毒的核酸序列：逆轉(zhuǎn)錄病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒、哈維鼠肉瘤病毒、鼠乳腺腫瘤病毒和勞斯肉瘤病毒；腺病毒、腺相關(guān)病毒；sv40型病毒；多瘤病毒；eb病毒；乳頭瘤病毒；皰疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰質(zhì)炎病毒；和rna病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒。可以容易地使用本領(lǐng)域公知的其他載體。某些病毒載體基于非致細(xì)胞病變真核病毒，其中非必需基因已被目的基因替代。非細(xì)胞病變病毒包括逆轉(zhuǎn)錄病毒，其生命周期涉及將基因組病毒rna逆轉(zhuǎn)錄成dna，隨后將其原病毒整合到宿主細(xì)胞dna中。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被批準(zhǔn)用于人基因治療試驗。最有用的是那些復(fù)制缺陷型(即，能夠指導(dǎo)合成期望蛋白質(zhì)，但不能制造感染性顆粒)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。這樣的遺傳改變的逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體對于體內(nèi)基因的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)具有一般效用。用于產(chǎn)生復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒的標(biāo)準(zhǔn)方案(包括以下步驟：將外源遺傳物質(zhì)并入質(zhì)粒，用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，通過包裝細(xì)胞系產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒，從組織培養(yǎng)基中收集病毒顆粒，并用病毒顆粒感染靶細(xì)胞)提供于kriegler，m.，genetransferandexpression，alaboratorymanual，w.h.freemanco.，newyork(1990)和murry，e.j.，methodsinmolecularbiology，vol.7，humanapress，inc.，cliffton，n.j.(1991)。在一個實施方案中，所述病毒是腺相關(guān)病毒，一種雙鏈dna病毒。腺相關(guān)病毒可以被工程化為復(fù)制缺陷型，并且能夠感染廣泛的細(xì)胞類型和物種。它還具有例如熱和脂質(zhì)溶劑穩(wěn)定性、在包括造血細(xì)胞在內(nèi)的不同譜系的細(xì)胞中的高轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率、和缺乏重疊感染抑制，從而允許多系列轉(zhuǎn)導(dǎo)的優(yōu)點。據(jù)報道，腺相關(guān)病毒可以以位點特異性方式整合到人細(xì)胞dna中，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的插入基因表達(dá)特征的插入誘變和可變性的可能性最小化。此外，在沒有選擇壓力的情況下，已經(jīng)在組織培養(yǎng)中傳代野生型腺相關(guān)病毒感染超過100代，這意味著腺相關(guān)病毒基因組整合是相對穩(wěn)定的事件。腺相關(guān)病毒也可以以染色體外方式起作用。其他載體包括質(zhì)粒載體。質(zhì)粒載體已經(jīng)在本領(lǐng)域中廣泛描述，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。見例如sambrook等，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，coldspringharborlaboratorypress，1989。在最近幾年中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒載體特別有利于在體內(nèi)將基因遞送至細(xì)胞，因為它們不能在宿主基因組內(nèi)復(fù)制并整合入宿主基因組。然而，這些質(zhì)粒具有與宿主細(xì)胞相容的啟動子，可以從在質(zhì)粒內(nèi)可操作地編碼的基因中表達(dá)肽?？蓮纳虡I(yè)供應(yīng)商獲得的一些常用質(zhì)粒，包括pbr322、puc18、puc19、多種pcdna質(zhì)粒、prc/cmv、多種pcmv質(zhì)粒、psv40和pbluescript。特定質(zhì)粒的其他實例包括pcdna3.1，目錄號v79020；pcdna3.1/hygro，目錄號v87020；pcdna4/myc-his，目錄號v86320；和pbudce4.1，目錄號v53220，均來自invitrogen(carlsbad，ca)。其他質(zhì)粒是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員公知的。另外，可以使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)定制設(shè)計質(zhì)粒以去除和/或添加dna的特定片段。在一些實施方案中，編碼本發(fā)明融合蛋白的質(zhì)粒與seqidno：15具有至少約80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。ii.d.3.藥物組合物含有本發(fā)明的融合蛋白或本發(fā)明的分離的多核苷酸的組合物可以含有合適的藥學(xué)上可接受的載體。例如，它們可以含有賦形劑和/或助劑，其有助于將活性化合物加工成設(shè)計用于遞送至作用部位的制劑。藥物組合物可以配制成用于通過推注注射的腸胃外施用(即靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)或肌內(nèi))。用于注射的制劑可以以單位劑型存在，例如在安瓿或具有添加的防腐劑的多劑量容器中。組合物可以采取例如在油性或水性載劑中的混懸液、溶液或乳液的形式，并且含有配方劑，例如助懸劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘撸钚猿煞挚梢允欠勰┬问?，用于與合適的載體(例如無熱原水)構(gòu)建。用于胃腸外施用的合適制劑還包括水溶性形式的活性化合物的水溶液，例如水溶性鹽。此外，可以施用活性化合物的混懸液作為適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺腋?。合適的親脂性溶劑或載劑包括脂肪油，例如芝麻油或合成脂肪酸酯，例如油酸乙酯或甘油三酯。水性注射懸浮劑可以含有提高懸浮劑黏度的物質(zhì)，包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和葡聚糖。任選地，混懸劑也可以含有穩(wěn)定劑。脂質(zhì)體也可以用于包封本發(fā)明的分子以遞送到細(xì)胞或間質(zhì)空間中。示例性的藥學(xué)上可接受的載體是生理上相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑、水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等。在一些實施方案中，組合物包含等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇、山梨醇)或氯化鈉。在另一些實施方案中，組合物包含藥學(xué)上可接受的物質(zhì)，例如潤濕劑或少量輔助物質(zhì)，例如增強(qiáng)活性成分的保質(zhì)期或有效性的潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。本發(fā)明的組合物可以是多種形式，包括例如液體(例如可注射和可輸注溶液)、分散體、混懸劑、半固體和固體劑型。優(yōu)選的形式取決于施用方式和治療應(yīng)用。組合物可以配制成溶液、微乳液、分散體、脂質(zhì)體或適合于高藥物濃度的其他有序結(jié)構(gòu)。無菌可注射溶液可以通過將所需量的活性成分并入合適的溶劑中，根據(jù)需要與上面列舉的成分之一或組合，然后過濾滅菌來制備。一般而言，通過將活性成分并入含有堿性分散介質(zhì)和來自上面所列舉的那些所需的其他成分的無菌載劑中來制備分散體。在用于制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分加上來自先前無菌過濾的溶液的任何額外的期望成分的粉末。可以例如通過使用包衣例如卵磷脂，通過在分散體的情況下維持所需的粒度和通過使用表面活性劑來維持溶液的適當(dāng)?shù)牧鲃有??？勺⑸浣M合物的延長吸收可以通過在組合物中包括延遲吸收的試劑(例如單硬脂酸鹽和明膠)來實現(xiàn)?；钚猿煞挚梢杂冕尫趴刂浦苿┗蜓b置來配制。此類制劑和裝置的實例包括植入物、透皮貼劑和微囊化遞送系統(tǒng)。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸。制備此類制劑和裝置的方法是本領(lǐng)域已知的。見例如sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems，j.r.robinson編，marceldekker，inc.，newyork，1978?？勺⑸涞膬煨椭苿?depotformulation)可以通過在可生物降解的聚合物(例如聚丙交酯-聚乙交酯)中形成藥物的微囊化基質(zhì)來制備。根據(jù)藥物與聚合物的比例和所用聚合物的性質(zhì)，可以控制藥物釋放的速率。另一些示例性生物可降解聚合物是聚原酸酯和聚酸酐。儲庫型可注射制劑也可以通過將藥物包埋在脂質(zhì)體或微乳液中來制備。補(bǔ)充的活性化合物可以并入組合物中。在一個實施方案中，將本發(fā)明的融合蛋白或編碼蛋白質(zhì)的多核苷酸與另一種hpv治療劑一起配制。在一個實施方案中，將編碼融合蛋白的多核苷酸以注射用儲存溶液配制(0.2mg/ml氯化鉀，1.44mg/ml無水磷酸二氫鈉，0.24mg/ml無水結(jié)晶磷酸二氫鉀和8mg/ml氯化鈉，ph7.5～7.9)?？梢哉{(diào)整劑量方案以提供最佳的期望反應(yīng)。例如，可以施用單次推注，可以隨時間施用幾個分開的劑量，或者可以按照治療情況的緊急性所指示的那樣按比例降低或提高劑量。有利的是以劑量單位形式配制腸胃外組合物以便于施用和劑量的均勻性。見例如remington’spharmaceuticalsciences(mackpub.co.，easton，pa.1980)。合適的藥物載體的非限制性實例也描述于e.w.martin的remington’spharmaceuticalsciences。賦形劑的一些實例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、甘油單硬脂酸酯、滑石、氯化鈉、脫脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。組合物還可以含有ph緩沖試劑和潤濕劑或乳化劑。對于經(jīng)口施用，藥物組合物可以采取通過常規(guī)方式制備的片劑或膠囊劑的形式。組合物也可以制備為液體，例如糖漿或混懸液。所述液體可以包括助懸劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂肪)、乳化劑(卵磷脂或阿拉伯膠)、非水性載劑(例如杏仁油、油性酯、乙醇或分餾的植物油)和防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯或丙酯或者山梨酸)。制劑還可以包括矯味劑、著色劑和甜味劑?；蛘?，組合物可以作為干產(chǎn)品存在，用于與水或其他合適的載劑配制。對于含服施用，根據(jù)常規(guī)方案，組合物可以采取片劑或錠劑的形式。對于通過吸入給藥，用于根據(jù)本發(fā)明之用途的化合物方便地以具有或不具有賦形劑的霧化氣霧劑的形式或以來自加壓包裝或霧化器的氣霧劑噴霧的形式遞送，并任選地具有拋射劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，可以通過提供閥門來遞送計量的量來確定劑量單位。可以配制用于吸入器或吹入器中的例如明膠的膠囊和藥筒，其含有化合物和合適的粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。藥物組合物還可以配制成栓劑或保留灌腸劑(retentionenema)以用于直腸給藥，例如其含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可豆脂或其他甘油酯。在一個實施方案中，藥物組合物包含融合蛋白、編碼融合蛋白的優(yōu)化的多核苷酸、包含多核苷酸的載體或包含載體的宿主細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體。在一些實施方案中，通過選自表面施用、眼內(nèi)施用、腸胃外施用、鞘內(nèi)施用、硬膜下施用和經(jīng)口施用的途徑施用組合物。腸胃外施用可以是靜脈內(nèi)或皮下施用。在某些實施方案中，將藥物組合物配制成用于電穿孔。iii.診斷和治療方法本發(fā)明涉及鑒定本文中所述的治療分子的應(yīng)答者和無應(yīng)答者的方法。本發(fā)明還涉及鑒定將對本發(fā)明的治療分子更好應(yīng)答的患者群體的方法或改善本發(fā)明的治療分子的治療方案的方法。在一個實施方案中，本申請涉及用于鑒定不需要摘除宮頸腫瘤之手術(shù)的對象的方法，其包括向?qū)ο笫┯糜行Я康娜绫疚闹兴龅闹委煼肿?例如，編碼融合蛋白的多核苷酸)，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答。本文中使用的術(shù)語“細(xì)胞免疫應(yīng)答”或“細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答”旨在包括這樣的免疫應(yīng)答：其不涉及抗體(體液免疫)，而是涉及吞噬細(xì)胞、抗原特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(t細(xì)胞)的活化以及響應(yīng)于抗原的多種細(xì)胞因子的釋放。細(xì)胞免疫通過如下方式保護(hù)身體：(i)活化抗原特異性細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞，其能夠誘導(dǎo)在其表面上展示外來抗原的表位的體細(xì)胞的凋亡，例如病毒感染的細(xì)胞、具有細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的細(xì)胞和展示腫瘤抗原的癌細(xì)胞；(ii)活化巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，使它們能夠破壞病原體；或(iii)刺激細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，其影響其他細(xì)胞參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答和固有免疫應(yīng)答的功能。當(dāng)在宿主中建立病毒感染時，啟動一系列活化細(xì)胞介導(dǎo)之免疫應(yīng)答的分子和細(xì)胞信號。除了動員局部樹突細(xì)胞之外，這些信號包括產(chǎn)生干擾素、其他細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)。樹突細(xì)胞被認(rèn)為提供了致敏初始cd4和cd8t細(xì)胞的關(guān)鍵細(xì)胞連接。tcr對于初始t細(xì)胞與樹突細(xì)胞呈遞的病毒肽mhc復(fù)合物的接合導(dǎo)致t細(xì)胞的隔離(sequestration)，并發(fā)動抗病毒t細(xì)胞應(yīng)答。病毒特異性t細(xì)胞的隨后的增殖和分化也與炎性介質(zhì)例如干擾素和其他危險信號相結(jié)合地發(fā)生(zajaca.j.和harringtonl.e.，encyclopediaofvirology3(3)：70-77，2008)。因為cd8t細(xì)胞產(chǎn)生炎性介質(zhì)以及細(xì)胞毒效應(yīng)分子的能力，它們是強(qiáng)大的抗病毒效應(yīng)細(xì)胞。因為它們殺死病毒感染的靶細(xì)胞的能力，cd8t細(xì)胞通常被稱為細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞(cytotoxictlymphocyte，ctl)。隨著效應(yīng)t細(xì)胞在與展示合適的肽-mhc復(fù)合物的病毒感染的靶細(xì)胞接合后變得活化，這些殺傷功能通過t細(xì)胞隨后釋放穿孔素和顆粒酶分子而被觸發(fā)，其確保破壞被感染的細(xì)胞。除了直接殺傷被感染的細(xì)胞之外，cd8t細(xì)胞還產(chǎn)生一系列細(xì)胞因子和趨化因子(例如ifn-γ和tnf-α)，其可以幫助清除病毒感染而不引起被感染細(xì)胞的死亡(zajaca.j.和harringtonl.e.，encyclopediaofvirology3(3)：70-77，2008)。cd4t細(xì)胞也是細(xì)胞介導(dǎo)的針對病毒感染的免疫應(yīng)答的關(guān)鍵組成，因為它們通過ifn-γ產(chǎn)生，并且在一些情況下通過誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞的裂解，能夠直接產(chǎn)生抗病毒功能。在mhcii類的情況中，識別抗原后，在cd4t細(xì)胞內(nèi)啟動信號事件級聯(lián)，其導(dǎo)致活化、增殖和分化成效應(yīng)cd4+t細(xì)胞，其基于它們的細(xì)胞因子產(chǎn)生譜被分割成兩個極化子集。t輔助細(xì)胞1(thelper1，th1)細(xì)胞主要產(chǎn)生ifn-γ，并且對于針對多種病毒感染和細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的感染的免疫反應(yīng)至關(guān)重要。這種效應(yīng)細(xì)胞亞類通常與抗病毒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)。相反，t輔助2(th2)細(xì)胞主要分泌與抗體的產(chǎn)生和體液免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子il-4、il-5和il-13。cd4t細(xì)胞亞群的定義已擴(kuò)展超過th1和th2細(xì)胞，其中調(diào)節(jié)性cd4t細(xì)胞(其分泌il-10)的獨特群體以及產(chǎn)生il-17的“th17”細(xì)胞(其分泌il-17a)的重要性變得明顯(zajaca.j.和harringtonl.e.，encyclopediaofvirology3(3)：70-77，2008)。在一些實施方案中，本文中所述的方法還包括測量施用后對象的細(xì)胞免疫應(yīng)答的提高。在某些實施方案中，本文中所述的方法還包括指導(dǎo)護(hù)理提供者測量施用后對象的細(xì)胞免疫應(yīng)答的提高。本文中使用的術(shù)語“護(hù)理提供者”是指與活的對象(例如人類患者)直接相互作用和/或施用治療分子的個體或機(jī)構(gòu)。護(hù)理提供者的非限制性實例包括醫(yī)生、護(hù)士、技術(shù)人員、治療師、藥劑師、咨詢輔導(dǎo)員、替代醫(yī)學(xué)從業(yè)者、醫(yī)療設(shè)施、醫(yī)生辦公室、醫(yī)院、急診室、診所、緊急護(hù)理中心、替代醫(yī)療診所/設(shè)施，和提供一般和/或?qū)ｉT處理、評估、維護(hù)、治療、藥物治療的任何其他實體，和/或與患者的健康狀況的所有或任何部分相關(guān)的建議，包括但不限于一般醫(yī)療、專門醫(yī)療、手術(shù)和/或任何其他類型的處理、評估、維護(hù)、治療、藥物治療和/或建議。本文中使用的術(shù)語“指導(dǎo)護(hù)理提供者”包括口頭指導(dǎo)護(hù)理提供者，或者通過使用書面命令指導(dǎo)護(hù)理提供者，或以上兩者。在一些實施方案中，本申請涉及在不進(jìn)行手術(shù)的情況下治療宮頸腫瘤的方法，其包括施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸，其中所述對象在施用后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，其中所述細(xì)胞免疫應(yīng)答在施用后提高為至少約2倍，并且其中在不進(jìn)行手術(shù)的情況下從所述對象中摘除所述宮頸腫瘤。本文中使用的術(shù)語“提高的細(xì)胞應(yīng)答”是指在施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸后提高為至少約2倍提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答、提高的cd4t細(xì)胞應(yīng)答、提高的細(xì)胞因子分泌或其任意組合。例如，與在接種前的常見th1效應(yīng)細(xì)胞因子(例如ifn-γ、il-2和tnf-α)的基線產(chǎn)生相比，以編碼融合蛋白的多核苷酸(例如，hpve6/e7dna治療性疫苗(gx-188))進(jìn)行至少一次免疫接種(即施用至少一個劑量)后，常見th1效應(yīng)細(xì)胞因子(例如ifn-γ、il-2和tnf-α或其任意組合)的產(chǎn)生/表達(dá)提高。在一些實施方案中，提高的cd4t細(xì)胞應(yīng)答包括提高的ifn-γ+cd4細(xì)胞。在一些具體實施方案中，提高的cd4t細(xì)胞應(yīng)答是ifn-γ+cd4細(xì)胞數(shù)目提高為至少約1.5、2.0、2.5、3.0、3.5或4.0倍。在某些實施方案中，提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括ifn-γ、il-2、tnf-α、mip-β、cd107a/b或其任意組合的提高的表達(dá)。在一些實施方案中，提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括提高的cd38+ki67+cd8t細(xì)胞。在一些具體實施方案中，提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答是至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍或至少約25倍的cd38+ki67+cd8t細(xì)胞數(shù)目的提高。在某些實施方案中，通過流式細(xì)胞術(shù)測量提高的cd8t細(xì)胞應(yīng)答。在一些具體的實施方案中，相對于施用前的水平，ifn-γ表達(dá)提高為至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少45倍、至少50倍。在一些實施方案中，相對于施用前的水平，il-2表達(dá)提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在一些具體實施方案中，相對于施用前水平，tnf-α表達(dá)提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍或至少約25倍。在某些實施方案中，提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答包括提高的hpv16和hpv18e6和e7特異性ifn-γ應(yīng)答。在一些實施方案中，通過ifn-γelispot測定來測量ifn-γ應(yīng)答。在某些實施方案中，提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答是多功能t細(xì)胞的數(shù)目提高。本文中使用的術(shù)語“多功能t細(xì)胞”是指顯示細(xì)胞裂解活性、增殖能力和效應(yīng)分子分泌提高的多功能hpv特異性cd8t細(xì)胞。在一些實施方案中，多功能t細(xì)胞顯示至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種或至少七種標(biāo)志物。在某些實施方案中，多功能t細(xì)胞分泌至少ifn-γ和il-2以及至少一種另外的標(biāo)志物。在一些具體實施方案中，當(dāng)通過流式細(xì)胞術(shù)測量時，多功能t細(xì)胞表現(xiàn)出選自ifn-γ、il-2、tnf-α、mip-β和cd107a/b的至少三種、至少四種或至少五種標(biāo)志物。在一些實施方案中，本申請涉及本文中所述的方法，其中所述多功能t細(xì)胞的數(shù)目比施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸之前多功能t細(xì)胞的數(shù)目提高了至少約5％、至少約6％、至少約7％、至少約8％、至少約9％、至少約10％、至少約15％、至少約20％或至少約30％。在一些實施方案中，本申請涉及在有此需要的對象中提高全身性hpv特異性多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包括施用編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸，其中所述多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括ifn-γ、il-2、tnf-α或其任意組合的提高的表達(dá)。在一些具體實施方案中，施用包含至少兩個劑量或三個劑量。在某些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定在施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(b)確定所述對象適于手術(shù)以摘除宮頸腫瘤。本文中使用的術(shù)語“確定對象適于手術(shù)以摘除宮頸腫瘤”是指提供與患者的健康狀況的所有或任何部分相關(guān)的一般和/或?qū)ｉT的評估，和/或建議，以斷定患者需要進(jìn)行手術(shù)以摘除宮頸腫瘤。在一些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定在施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(b)指導(dǎo)護(hù)理提供者對該對象進(jìn)行手術(shù)以摘除宮頸腫瘤。在某些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸，(b)鑒定在施用融合蛋白后不表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，和(c)確定所述對象適于手術(shù)以摘除宮頸腫瘤。在某些實施方案中，本申請涉及在有此需要的對象群體中治療宮頸腫瘤的方法，其包括向所述對象群體施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸，其中每個對象均攜帶人白細(xì)胞抗原(hla)-a02。在一些實施方案中，本申請涉及在有此需要的對象中治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)鑒定攜帶hla-a02的對象，和(b)向所述對象施用編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸。在某些實施方案中，本申請涉及改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括向?qū)ο笕后w施用編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸，其中每個對象均攜帶人白細(xì)胞抗原(hla)-a02。在一些實施方案中，本申請涉及改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括(a)鑒定攜帶hla-a02的對象，和(b)向所述對象施用編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸。在某些實施方案中，本申請涉及改善宮頸腫瘤治療的方法，其包括(a)提供從有此需要的對象獲得的血液樣品以鑒定hla類型，和(b)向攜帶hla-a02的對象施用編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸。hla-a是由hla-a基因座編碼的一組人白細(xì)胞抗原(hla)，所述hla-a基因座位于人染色體6p21.3(hlanomenclature@hla.alleles.org-anthonynolanresearchinstitute.2013年11月10日。檢索于2013年12月8日)。hla是對人特異的主要組織相容性復(fù)合體(mhc)。hla-a是三種主要類型的人mhci類細(xì)胞表面受體之一。另外幾種是hla-b和hla-c。截至2013年12月，已有編碼1740種活性蛋白和117種無效蛋白的2432個已知的hla-a等位基因(allelesearchtool-europeanmolecularbiologylaboratory.2013。檢索于2013年12月20日)。(hla)-a02是hla-a血清型組內(nèi)的人白細(xì)胞抗原血清型。(hla)-a02也稱為hla-a＊02(a＊02)、hla-a2、hla-a02和hla-a＊2。在某些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量的編碼融合蛋白的多核苷酸，和(b)進(jìn)一步將第二劑量的多核苷酸施用于在施用第一劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象。在某些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量的編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸，(b)測量施用后的細(xì)胞免疫應(yīng)答，和(c)對在施用所述第一劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象施用第二劑量的多核苷酸。在一些實施方案中，本文中所述的方法還包括在施用第二劑量后測量細(xì)胞免疫應(yīng)答。在某些實施方案中，本文中所述的方法包括施用第三劑量的本文中所述的多核苷酸。在一些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量和第二劑量的編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸，和(b)對于在施用所述第一劑量或所述第二劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答的對象，進(jìn)一步向所述對象施用第三劑量的多核苷酸。在某些實施方案中，本申請涉及治療宮頸腫瘤的方法，其包括(a)向有此需要的對象施用第一劑量和第二劑量的編碼本文中所述融合蛋白的多核苷酸，(b)在施用第一劑量或第二劑量后測量細(xì)胞免疫應(yīng)答，和(c)如果對象在施用第一或第二劑量后表現(xiàn)出提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則向所述對象施用第三劑量的多核苷酸。根據(jù)本文中所述的方法，編碼本文中所述的融合蛋白的多核苷酸可以以特定劑量施用。例如，在一些實施方案中，第一劑量為至少約0.5mg、至少約1mg、至少約1.5mg、至少約2mg、至少約2.5mg、至少約3mg、至少約3.5mg、至少約4mg、至少約4.5mg或至少約5mg。在某些實施方案中，第一劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg，并且第二劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg。在某些實施方案中，第二劑量為至少約0.5mg、至少約1mg、至少約1.5mg、至少約2mg、至少約2.5mg、至少約3mg、至少約3.5mg、至少約4mg、至少約4.5mg或至少約5mg。在某些實施方案中，第三劑量為至少約0.5mg、至少約1mg、至少約1.5mg、至少約2mg、至少約2.5mg、至少約3mg、至少約3.5mg、至少約4mg、至少約4.5mg或至少約5mg。在一些實施方案中，第三劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg。在一些實施方案中，第二劑量在第一劑量后至少約1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周施用。在某些實施方案中，第三劑量在第二劑量后至少約1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、13周、14周或15周施用。本發(fā)明的一些實施方案包括在有此需要的對象中誘導(dǎo)全身hpv特異性多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答的方法，其包括施用編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或不與hpv16和hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合并且不與hpv16和hpv18的e7蛋白形成二聚體，并且其中所述多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答包括ifn-γ和il-2以及至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種任選標(biāo)志物的表達(dá)提高。在另一些實施方案中，所述任選的標(biāo)志物是tnf-α。在另外的一些實施方案中，所述方法的施用包括至少兩個劑量或三個劑量。在另一些實施方案中，ifn-γ表達(dá)相對于施用前的水平提高為至少5倍、至少約10倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍。在另一些實施方案中，il-2表達(dá)相對于施用前的水平提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍或至少約15倍。在另一些實施方案中，tnf-α表達(dá)相對于施用前的水平提高為至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約21倍、至少約22倍、至少約23倍、至少約24倍或至少約25倍。在另一些實施方案中，所述施用不提高il-4和il17a表達(dá)。在某些實施方案中，出于診斷方法的目的的治療分子包括其他類型的hpv疫苗。例如，可用于所述方法的hpv疫苗的實例包括但不限于。iv.藥盒本發(fā)明還包括藥盒，其包含含有治療分子的藥物組合物和使用所述組合物的說明書。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及如果在施用有效量的藥物組合物后細(xì)胞免疫應(yīng)答沒有提高則進(jìn)行手術(shù)以摘除宮頸腫瘤的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在另一個實施方案中，藥盒包含含有編碼融合蛋白的多核苷酸的藥物組合物，以及向在施用初始量的多核苷酸后顯示提高數(shù)目的多功能t細(xì)胞的對象施用有效量的藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在另一些實施方案中，藥盒包含含有編碼融合蛋白的多核苷酸的藥物組合物，以及向在施用初始量的多核苷酸后顯示提高數(shù)目的多功能t細(xì)胞的對象施用有效量的藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在一個實施方案中，多功能t細(xì)胞分泌ifn-γ和il-2。在一些實施方案中，包含藥物組合物的藥盒，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸和向攜帶hla-a02的對象施用有效量的藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在另一些實施方案中，藥盒包含有效量的治療分子，其為至少1mg、2mg、3mg、4mg、5mg或6mg。在一些實施方案中，藥盒包含藥物組合物，其包含編碼融合蛋白的多核苷酸以及如果向?qū)ο笫┯玫膯蝿┝炕騼蓜┝康乃幬锝M合物不顯示提高的細(xì)胞免疫應(yīng)答，則中斷進(jìn)一步施用所述藥物組合物的說明書，其中所述融合蛋白包含三個或更多個選自以下的氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體。在某些實施方案中，單一劑量為至少約0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg或5mg。在另一些實施方案中，兩個劑量包含第一劑量和第二劑量，其中第一劑量為至少約0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg或5mg，并且第二劑量為至少約0.5mg、1mg、1.5mg、2mg、2.5mg、3mg、3.5mg、4mg、4.5mg或5mg。在另一些實施方案中，第一劑量和第二劑量相同。在另一些實施方案中，第一劑量和第二劑量不同。在某些實施方案中，藥盒中的第一劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg，并且藥盒中的第二劑量為約1mg至約5mg、約2mg至約4mg、約1mg至約4mg、約1mg至約10mg、約1mg至約9mg、約1mg至約8mg、約1mg至約7mg、約1mg至約6mg。在一個特定的實施方案中，藥盒中的第一劑量為約1mg至4mg，藥盒中的第二劑量為約1mg至約4mg。在一些實施方案中，第一劑量為約1mg并且第二劑量為約1mg。在另一些實施方案中，第一劑量為約2mg并且第二劑量為約2mg。在另一些實施方案中，第一劑量為約4mg并且第二劑量為約4mg。v.制備方法本發(fā)明還涉及制備用于治療與人乳頭瘤病毒相關(guān)的疾病或病癥的治療分子的方法。特別地，治療分子被構(gòu)建為含有來自hpv的幾種蛋白質(zhì)的所有表位，但不包含p53結(jié)合結(jié)構(gòu)域和prb結(jié)合結(jié)構(gòu)域或不與來自hpv的蛋白質(zhì)形成二聚體。本發(fā)明的一個實施方案包括制備編碼融合蛋白的多核苷酸的方法，其有效治療或預(yù)防由人乳頭瘤病毒感染引起的宮頸腫瘤，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含選自以下的至少三個氨基酸序列：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中所述融合蛋白不與p53結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e6蛋白形成二聚體，并且其中所述融合蛋白不與prb結(jié)合或者不與hpv16或hpv18的e7蛋白形成二聚體，以及(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在另一個實施方案中，融合蛋白不包含完整的e6相關(guān)蛋白(ap)結(jié)合位點。在另一些實施方案中，融合蛋白包含hpv16和hpv17的天然存在的e6蛋白與hpv16和hpv17的天然存在的e7蛋白中所包含的至少所有免疫原性的表位。本發(fā)明的一些實施方案包括去除融合蛋白中的p53結(jié)合位點和prb結(jié)合位點的方法，所述融合蛋白包含hpv16的e6蛋白的序列、hpv16的e7蛋白的序列、hpv18的e6蛋白的序列和hpv18的e7蛋白的序列，同時還包含hpv16的天然存在的e6蛋白、hpv16的天然存在的e7蛋白、hpv18的天然存在的e6蛋白和hpv18的天然存在的e7蛋白中所包含的至少所有免疫原性表位，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼融合蛋白的多核苷酸，所述融合蛋白包含：(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中(a)hpv16的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：2的第35至135位氨基酸的c末端分割成hpv16的e6蛋白的n末端部分(16e6na-b)和hpv16的e6蛋白的c末端部分(16e6cc-d)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv16的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(b)hpv16的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：6的第18至97位氨基酸的c末端分割成hpv16的e7蛋白的n末端部分(16e7ne-f)和hpv16的e7蛋白的c末端部分(16e7g-h)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv16的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(c)hpv18的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：6的第30至130位氨基酸的c末端分割成hpv18的e6蛋白的n末端部分(18e6ni-j)和hpv18的e6蛋白的c末端部分(18e6nk-l)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv18的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；和(d)hpv18的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：8的第21至104位氨基酸的c末端分割成hpv18的e7蛋白的n末端部分(18e7nm-n)和hpv18的e7蛋白的c末端部分(18e7co-p)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv18的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列；和(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在某些實施方案中，(a)中hpv16的e6蛋白的重疊序列包含至少一個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少三個氨基酸、至少四個氨基酸、至少五個氨基酸、至少10個氨基酸、至少15個氨基酸或至少20個氨基酸；(b)中hpv16的e7蛋白的重疊序列包含至少一個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少兩個氨基酸、至少三個氨基酸、至少四個氨基酸、至少五個氨基酸、至少10個氨基酸、至少15個氨基酸或至少20個氨基酸；(c)中hpv18的e6蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；或(d)中hpv18的e7蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸，其中所述重疊序列足以添加或補(bǔ)充由于e6蛋白或e7蛋白切割成n末端部分和c末端部分而被破壞或缺失的任何表位。在另一些實施方案中，提供了防止在融合蛋白中形成hpv16和/或hpv18的e6蛋白和/或hpv16和/或hpv18的e7蛋白的二聚體的方法，所述融合蛋白包含hpv16的e6蛋白的序列、hpv16的e7蛋白的序列、hpv18的e6蛋白的序列和hpv18的e7蛋白的序列，同時還包含hpv16的e6蛋白、hpv16的e7蛋白、hpv18的e6蛋白和hpv18的e7蛋白的所有免疫原性表位，所述方法包括(i)構(gòu)建編碼包含以下的融合蛋白的多核苷酸，(1)hpv16的e6蛋白的n末端部分，(2)hpv16的e6蛋白的c末端部分，(3)hpv16的e7蛋白的n末端部分，(4)hpv16的e7蛋白的c末端部分，(5)hpv18的e6蛋白的n末端部分，(6)hpv18的e6蛋白的c末端部分，(7)hpv18的e7蛋白的n末端部分，和(8)hpv18的e7蛋白的c末端部分，其中(a)hpv16的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：2的第37至72位氨基酸的c末端分割成hpv16的e6蛋白的n末端部分(16e6na-b)和hpv16的e6蛋白的c末端部分(16e6cc-d)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv16的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(b)hpv16的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：6的第44至97位氨基酸的c末端分割成hpv16的e7蛋白的n末端部分(16e7ne-f)和hpv16的e7蛋白的c末端部分(16e7g-h)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv16的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列；(c)hpv18的e6蛋白在對應(yīng)于seqidno：4的第32至67位氨基酸的c末端分割成hpv18的e6蛋白的n末端部分(18e6ni-j)和hpv18的e6蛋白的c末端部分(18e6nk-l)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv18的e6蛋白的所有序列和任選的重疊序列；和(d)hpv18的e7蛋白在對應(yīng)于seqidno：8的氨基酸47至104的c末端分割成hpv18的e7蛋白的n末端部分(18e7nm-n)和hpv18的e7蛋白的c末端部分(18e7co-p)，當(dāng)將其在一起比對時包含hpv18的e7蛋白的所有序列和任選的重疊序列；和(ii)將所述多核苷酸轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中。在另一些實施方案中，(a)中hpv16的e6蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；(b)中hpv16的e7蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；(c)中hpv18的e6蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸；或(d)中hpv18的e7蛋白的重疊序列包含至少1、2、5、10、15、20、25、30、35或40個氨基酸。在一些實施方案中，制備編碼融合蛋白的多核苷酸的方法可以產(chǎn)生本文中所述的任何治療分子。在另一些實施方案中，所述方法產(chǎn)生本文中所述的任何多核苷酸，但不包括seqidno：9。v.a.1.宿主細(xì)胞本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的多核苷酸分子的宿主細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”應(yīng)廣義地用于指將dna引入受體宿主細(xì)胞，其改變基因型并因此導(dǎo)致受體細(xì)胞的改變。“宿主細(xì)胞”是指已使用重組dna技術(shù)構(gòu)建并編碼至少一個異源基因的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞優(yōu)選地是哺乳動物來源的；最優(yōu)選人或小鼠來源的。本領(lǐng)域技術(shù)人員具有優(yōu)先確定最適合于其目的的特定宿主細(xì)胞系的能力。示例性宿主細(xì)胞系包括但不限于cho、capti、dg44和duxb11(中國倉鼠卵巢系，dhfr-)、hela(人宮頸癌)、cvi(猴腎系)、cos(帶有sv40t抗原的cvi衍生物)、r1610(中國倉鼠成纖維細(xì)胞)、balbc/3t3(小鼠成纖維細(xì)胞)、hak(倉鼠腎系)、sp2/o(小鼠骨髓瘤)、p3x63-ag3.653(小鼠骨髓瘤)、bfa-1c1bpt(牛內(nèi)皮細(xì)胞)、raji(人淋巴細(xì)胞)、、ns0、cap、bhk21和hek293(人腎)。宿主細(xì)胞系通常可從商業(yè)服務(wù)、美國組織培養(yǎng)物保藏中心或從公開的文獻(xiàn)獲得。將本發(fā)明的分離的核酸分子引入宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種技術(shù)完成。這些包括但不限于轉(zhuǎn)染(包括電泳和電穿孔)、原生質(zhì)體融合、磷酸鈣沉淀、具有包膜dna的細(xì)胞融合、顯微注射和用完整病毒感染。見ridgway，a.a.g.“mammalianexpressionvectors”24章2，470-472頁，vectors，rodriguezanddenhardt，編(butterworths，boston，mass.1988)。最優(yōu)選地，通過電穿孔將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主中。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞在適于產(chǎn)生輕鏈和重鏈的條件下培養(yǎng)，并測定重鏈和/或輕鏈蛋白質(zhì)合成。示例性測定技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)、放射免疫測定(radioimmunoassay，ria)或熒光激活細(xì)胞分選儀分析(flourescence-activatedcellsorteranalysis，facs)、免疫組織化學(xué)等。在某些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子通過電穿孔施用于對象。體內(nèi)電穿孔(electroporation，ep)是通過共同施用小的局部電場顯著提高dna疫苗的免疫原性，以提高注射的dna的轉(zhuǎn)染效率和免疫細(xì)胞(例如樹突細(xì)胞、t和b淋巴細(xì)胞)向免疫接種部位募集的技術(shù)。動物中的動物研究已經(jīng)顯示，體內(nèi)ep提高了編碼許多抗原的dna疫苗的免疫原性。在人中，體內(nèi)ep已經(jīng)成功地將化療劑直接遞送至腫瘤。最近，已經(jīng)通過ep向癌癥患者施用編碼腫瘤抗原的dna疫苗作為潛在免疫治療(vasan等，plosone6(5)：1-10，2011)。包含本發(fā)明的分離的核酸分子的宿主細(xì)胞在合適的生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)。本文中使用的術(shù)語“合適的生長培養(yǎng)基”是指含有細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物的培養(yǎng)基。細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物可包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質(zhì)和生長因子。任選地，培養(yǎng)基可以包含一種或更多種選擇因子。任選地，培養(yǎng)基可以含有小牛血清或胎牛血清(fcs)。在一個實施方案中，培養(yǎng)基基本上不含igg。生長培養(yǎng)基通常通過例如藥物選擇或必需營養(yǎng)物的缺乏來選擇含有dna構(gòu)建體的細(xì)胞，所述必需營養(yǎng)物由在dna構(gòu)建體上或與dna構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染的選擇性標(biāo)志補(bǔ)充。培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞一般在市售的含血清或無血清培養(yǎng)基(例如mem、dmem、dmem/f12)中培養(yǎng)。在一個實施方案中，培養(yǎng)基是cdopticho(invitrogen，carlsbad，ca.)。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基是cd17(invitrogen，carlsbad，ca.)。選擇適合于所用的特定細(xì)胞系的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的水平內(nèi)。v.a.2.多肽的制備本發(fā)明還提供了多核苷酸分子或由多核苷酸分子編碼的多肽。對于重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)，將本發(fā)明的編碼融合蛋白的多核苷酸序列插入合適的表達(dá)載體，即含有用于插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體，或在rna病毒載體的情況下，含有用于復(fù)制和翻譯的必要元件的載體。將本發(fā)明的多核苷酸序列以合適的閱讀框插入載體中。然后將表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到將表達(dá)多肽的合適的靶細(xì)胞中。本領(lǐng)域中已知的轉(zhuǎn)染技術(shù)包括但不限于磷酸鈣沉淀(wigler等1978，cell14：725)和電穿孔(neumann等1982，embo，j.1：841)。多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用于在真核細(xì)胞中表達(dá)本文中所述的融合蛋白。在一個實施方案中，真核細(xì)胞是動物細(xì)胞，包括哺乳動物細(xì)胞(例如，hek293細(xì)胞、capti、、cho、bhk、cos、hela細(xì)胞)。本發(fā)明的融合蛋白可以在轉(zhuǎn)基因動物(例如嚙齒動物、山羊、綿羊、豬或牛)中合成。術(shù)語“轉(zhuǎn)基因動物”是指已將外源基因并入其基因組中的非人動物。因為該基因存在于種系組織中，所以它會從親代傳遞給后代。將外源基因引入單細(xì)胞胚胎(brinster等1985，proc.natl.acad.sci.usa82：4438)。產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法是本領(lǐng)域已知的，包括產(chǎn)生免疫球蛋白分子的轉(zhuǎn)基因(wagner等1981，proc.natl.acad.sci.usa78：6376；mcknight等1983，cell34：335；brinster等1983，nature306：332；ritchie等1984，nature312：517；baldassarre等2003，theriogenology59：831；robl等2003，theriogenology59：107；malassagne等2003，xenotransplantation10(3)：267)。表達(dá)載體可以編碼允許容易地純化或鑒定重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的標(biāo)簽。實例包括但不限于載體pur278(ruther等，1983，emboj.2：1791)，其中本文中所述的融合蛋白編碼序列可以與lacz編碼區(qū)一起經(jīng)框內(nèi)連接到載體中，使得產(chǎn)生雜合蛋白質(zhì)；pgex載體可用于表達(dá)具有谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶(glutathiones-transferase，gst)標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)通常是可溶的，并且可以容易地通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上并隨后在游離谷胱甘肽存在下洗脫，以從細(xì)胞中純化。載體包括用于在純化后容易地除去標(biāo)簽的切割位點(例如precissionprotease(pharmacia，peapack，n.j.))。為了本發(fā)明的目的，可以使用許多表達(dá)載體系統(tǒng)。這些表達(dá)載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體dna的組成部分而可復(fù)制。表達(dá)載體可以包括表達(dá)控制序列，其包括但不限于啟動子(例如天然相關(guān)或異源啟動子)、增強(qiáng)子、信號序列、剪接信號、增強(qiáng)子元件和轉(zhuǎn)錄終止序列。優(yōu)選地，表達(dá)控制序列是在能夠轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染真核宿主細(xì)胞的載體中的真核啟動子系統(tǒng)。表達(dá)載體還可以利用來自于動物病毒(例如牛乳頭瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒(rsv、mmtv或momlv)、巨細(xì)胞病毒(cmv)或sv40病毒)的dna元件。其他載體涉及使用具有內(nèi)部核糖體結(jié)合位點的多順反子系統(tǒng)。通常來說，表達(dá)載體含有選擇標(biāo)記(例如氨芐青霉素抗性、潮霉素抗性、四環(huán)素抗性或新霉素抗性)以允許檢測用期望dna序列轉(zhuǎn)化的那些細(xì)胞(見例如itakura等，美國專利4,704,362)。已經(jīng)將dna整合到其染色體中的細(xì)胞可以通過引入允許選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的一種或更多種標(biāo)志物來選擇。標(biāo)志物可以為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)型、殺生物劑抗性(例如抗生素)或?qū)χ亟饘?例如銅)的抗性。選擇性標(biāo)志基因可以直接連接到待表達(dá)的dna序列，或通過共轉(zhuǎn)化導(dǎo)入相同的細(xì)胞中。更一般地，一旦制備了編碼多肽的載體或dna序列，就可以將表達(dá)載體引入合適的宿主細(xì)胞中。也就是說，宿主細(xì)胞可以被轉(zhuǎn)化。如上所述，將質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種技術(shù)來實現(xiàn)。在從重組宿主分離多肽的過程的描述中，除非另有明確說明，術(shù)語“細(xì)胞”和“細(xì)胞培養(yǎng)物”可互換使用以表示多肽來源。換句話說，從“細(xì)胞”回收多肽可以意指從旋轉(zhuǎn)下的全細(xì)胞，或從包含培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中回收。編碼本發(fā)明多肽的基因也可以在非哺乳動物細(xì)胞(例如細(xì)菌或酵母或植物細(xì)胞)中增殖以提高基因數(shù)目。在這方面，應(yīng)當(dāng)理解，多種單細(xì)胞非哺乳動物微生物(例如細(xì)菌)也可以被轉(zhuǎn)化；即能夠在培養(yǎng)物或發(fā)酵中培養(yǎng)的那些。對轉(zhuǎn)化敏感的細(xì)菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(escherichiacoli)或沙門菌(salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(bacillaceae)，例如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)；肺炎球菌(pneumococcus)；鏈球菌(streptococcus)和流感嗜血桿菌(haemophilusinfluenzae)。還應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)在細(xì)菌中表達(dá)時，多肽通常成為包涵體的一部分。多肽必須被分離、純化，然后裝配成功能分子。或者，本發(fā)明的優(yōu)化的核苷酸序列可以并入轉(zhuǎn)基因中以引入轉(zhuǎn)基因動物的基因組中，隨后在轉(zhuǎn)基因動物的乳中表達(dá)(見例如deboer等，us5,741,957，rosen，us5,304,489，和meade等，us5,849,992)。合適的轉(zhuǎn)基因包括與來自乳腺特異性基因(例如酪蛋白或β乳球蛋白)的啟動子和增強(qiáng)子可操作地連接的多肽的編碼序列。體外生產(chǎn)允許按比例擴(kuò)大以產(chǎn)生大量的期望多肽或多核苷酸。實施例實施例1hpve6/e7dna治療性疫苗(gx-188)如本文中所述的pgx-188治療性hpvdna疫苗(gx-188)含有編碼與flt3l的胞外結(jié)構(gòu)域融合的hpv血清型16和18(hpv16和hpv18)的e6和e7蛋白以及tpa信號序列的質(zhì)粒dna。(圖1a)。將合成的經(jīng)密碼子優(yōu)化的e6或e7基因片段化成具有小重疊序列(編碼16個氨基酸)的兩部分(c末端和n末端區(qū)域)，并如圖1a所示進(jìn)行混編。將包括tpa、flt3l和混編的e6/e7基因的融合dna序列插入pgx27載體(parkk.s.，等，vaccine.29：5481-5487，2011)中以產(chǎn)生pgx27-tfe6e7。在cgmp條件下在大腸桿菌dh5α中產(chǎn)生gx-188dna疫苗。用僅pgx27對照載體、用插入了野生型e6或e7基因的pgx27或gx-188轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時，制備細(xì)胞裂解物，并通過免疫印跡分析蛋白質(zhì)表達(dá)。細(xì)胞的核和細(xì)胞質(zhì)部分如下制備：用冰冷的磷酸緩沖鹽水(pbs)洗滌細(xì)胞一次，并以3,000rpm收集5分鐘。將細(xì)胞重懸于緩沖液a(10mmhepes，ph7.9，10mmkcl，0.2mmedta，1mmdtt，0.25mmpmsf和蛋白酶抑制劑混合物)中。在冰上孵育5分鐘后，添加np-40至終濃度為0.25％。將混合物在高速下渦旋10秒。通過在13,000rpm離心30秒收集提取物。收集上清液作為細(xì)胞質(zhì)提取物。將沉淀重懸于緩沖液b(20mmhepes，ph7.9，420mmnacl，2mmedta，1mmdtt，0.25mmpmsf和pic)中，然后在輕輕攪拌下在4℃下孵育30分鐘。將混合物以13,000rpm離心15分鐘，并收集上清液作為核提取物。對于全細(xì)胞蛋白裂解物，將細(xì)胞重懸浮于裂解緩沖液(20mmhepes，ph7.4，150mmnacl，5mmedta，10％甘油，0.5％tritonx-100，1mmdtt，1mmpmsf，1mmnaf，1mmna3vo4和pic)中。使用以下抗體：購自santacruzbiotechnology，inc.的抗hpv16e6(n-17)、抗hpv16e7(ed17)、抗p53(fl-393)、抗prb(c-15)和購自abcam的抗核纖層蛋白b1和抗β微管蛋白抗體。包含flt3l和tpa的目的是分別促進(jìn)融合蛋白的抗原呈遞和向分泌途徑的運輸。tpa的活性是明顯的，因為gx-188誘導(dǎo)的e6/e7融合蛋白僅在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)室中檢出，而在沒有tpa的相同載體中表達(dá)的e7蛋白在細(xì)胞質(zhì)和核區(qū)室中都被發(fā)現(xiàn)，如圖2a所示。進(jìn)行基因混編以防止融合蛋白的e6和e7區(qū)域的同源二聚化，這對于它們結(jié)合和降解p53和prb腫瘤抑制蛋白是至關(guān)重要的(zanierk.，等，structure.20：604-617，2012；liux.，等，thejournalofbiologicalchemistry.281：578-586，2006)。雖然由gx-188dna疫苗產(chǎn)生的e6/e7融合蛋白不能降解p53和prb蛋白，但野生型e6和e7蛋白分別誘導(dǎo)其降解，如圖2b和2c所示。研究設(shè)計和患者該1期臨床研究作為開放標(biāo)簽、單中心、劑量遞增研究在韓國首爾的cheilgeneralhospital&women’shealthcarecenter進(jìn)行。主要終點是評價宮頸上皮內(nèi)瘤變3(cin3)患者的安全性和耐受性。次要終點包括如本文中所述通過ifn-γelispot測量的hpve6-和e7-特異性t細(xì)胞免疫應(yīng)答的全身性誘導(dǎo)，以及宮頸處涉及的損傷和hpv感染狀態(tài)的變化。在研究中招募年齡為20至50歲的具有組織學(xué)和病毒學(xué)證實的hpv16-或hpv18-相關(guān)的cin3的女性。通過陰道鏡引導(dǎo)的活檢確認(rèn)cin3，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)確定hpv16或hpv18陽性。排除了具有乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒或人類免疫缺陷病毒感染、包括心律失常的異常心電圖(electrocardiography，ecg)、嚴(yán)重不良藥物事件史或嚴(yán)重變應(yīng)性疾病的對象。妊娠或計劃妊娠的女性沒有被招募在研究中。疫苗接種由一系列三次疫苗注射組成，在0、4和12周時肌內(nèi)交替施用于三角肌。遵循標(biāo)準(zhǔn)的3+3劑量遞增方案，并測試1mg、2mg和4mg的劑量水平。在最高劑量下，將4mg的gx-188分割成2mg+2mg并注射到左和右三角肌中。對于肌內(nèi)注射器，使用ep裝置(trigrid遞送系統(tǒng)，ichormedicalsystems，inc.)以促進(jìn)dna被攝取進(jìn)入細(xì)胞中。根據(jù)本研究的包括和排除標(biāo)準(zhǔn)，招募了11個經(jīng)篩選的僅患有cin3的患者中的9個(表1)。在試驗開始前2周的篩選訪視(vs)時間點，通過多種方法檢查所篩選的患者，包括陰道鏡檢查、細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)和hpv型試驗。包括陰道鏡檢查、組織學(xué)、宮頸內(nèi)細(xì)胞學(xué)和hpv基因分型測試的評估由當(dāng)?shù)貙嶒炇以谠囼灥攸c進(jìn)行。根據(jù)cheilgeneralhospital&women’shealthcarecenter的標(biāo)準(zhǔn)化方法或內(nèi)部方案進(jìn)行評估。在gx-188疫苗接種后第20和36周使用病毒學(xué)和組織學(xué)結(jié)果評價對治療的應(yīng)答。組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)評價。為了進(jìn)行組織學(xué)評價，在篩選期間和在第20和36周進(jìn)行的兩次隨訪中獲取活檢樣品。用10％甲醛固定樣品，用蘇木精和伊紅(h&e)對4-5μm切片染色。在陰道鏡檢查期間使用細(xì)胞刷(cytyccorp.，boxborough，ma)收集宮頸內(nèi)樣品。除了組織學(xué)以外，還使用該宮頸內(nèi)細(xì)胞學(xué)測試來評估gx-188疫苗接種。來自組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)分析的數(shù)據(jù)由至少兩個病理學(xué)家獨立地評審并且結(jié)果在與所有病理學(xué)家和研究者的會議討論后確認(rèn)。病毒學(xué)應(yīng)答的pcr。進(jìn)行hpv分型以確定對象是否被hpv16和/或hpv18感染。通過使用拭子型裝置從宮頸收集樣品，并使用基因組dna提取試劑盒(bioneercom.seoul，韓國)提取總dna。通過多重pcr系統(tǒng)使用ivdce標(biāo)記的hpv4aace篩選試劑盒(seegeneinc.，seoul，韓國)根據(jù)制造商的方案進(jìn)行hpv檢測和基因分型。hpv4aace篩選試劑盒可同時鑒定hpv16、hpv18、其他高危型(常見高危型：26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73和/或82)、hpv6和hpv11型。使用自動multina儀器(shimadzuco.，tokyo，日本)分析pcr產(chǎn)物。使用具有實時pcr的cheilhpvdna芯片在宮頸細(xì)胞中雙重檢查hpvdna基因分型以補(bǔ)償如先前所述的hpv基因型的準(zhǔn)確性(hahn，h.s.，等，europeanjournalofobstetrics，gynecology，andreproductivebiology169：202-206，2013)。通過雜合擴(kuò)增隨后對hla-a和-b的完整外顯子2、3進(jìn)行測序來進(jìn)行hla的基于序列的分型(sequence-basedtyping，sbt)。將引物以內(nèi)部方法用于基因座特異性擴(kuò)增。pcr應(yīng)用后，進(jìn)行pcr產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳以評估數(shù)目和質(zhì)量。使用abiprismbigdye終止子試劑盒(appliedbiosystems，ca，美國)和自動化abi377dna測序儀(appliedbiosystems，ca，美國)進(jìn)行循環(huán)測序反應(yīng)。使用sbt分析程序(conexiogenomics，assignsbtv3.5.1)分析這些數(shù)據(jù)。gx-188疫苗在9位患者中的7位(78％)中實現(xiàn)完全應(yīng)答。在7位應(yīng)答者中，攜帶人白細(xì)胞抗原(hla)-a＊02的6位患者表現(xiàn)出高多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答以及cin3的完全消退(表5)。所有參與的對象通過電穿孔接受3次gx-188dna疫苗的注射，在第一次注射后4和12周給予最后2次注射(圖1b)。對所有對象在2天、4天、8天和16周間隔內(nèi)完成總共6次治療訪視(vt)和隨訪(vf)，沒有任何退出(圖1b)。表5.患者的基線特征在所有訪視期間記錄總共49例不良事件(adverseevent，ae)。23例ae(包括濕疹、瘀斑、陰道瘙癢、嗜睡、厭食和頭暈)被確定與疫苗接種無關(guān)。記錄到19例ae(包括寒戰(zhàn)、注射部位疼痛、腫脹和感覺遲鈍)與gx-188疫苗接種相關(guān)(表2)。雖然其余的7例ae(包括頭痛、鼻炎和疲勞)的原因是未知的，但它們被認(rèn)為可能與gx-188疫苗接種相關(guān)。在更高的劑量下gx-188疫苗相關(guān)ae的發(fā)生率變得更頻繁(對于1mg組群為3例，對于2mg組群為9例，對于4mg組群為14例)，這大概是由于注射量的提高導(dǎo)致的(對于1mg群組為0.5ml，對于2mg群組為1ml，對于4mg群組為2ml)。然而，所有這些ae被認(rèn)為是輕度的(1級)并且所有患者在gx-188疫苗接種后3天內(nèi)完全恢復(fù)。由于在任何給定劑量下均未觀察到嚴(yán)重的ae和實驗室異常(表6和表7)，因此將gx-188的劑量從1mg升高至2mg，然后升至4mg(每個劑量3位患者)而沒有根據(jù)該臨床試驗方案的3+3劑量遞增設(shè)計在每個劑量水平登記另外3位對象。表6.在臨床研究期間由meddra系統(tǒng)器官2類(systemorgan2class，soc)分類的不良藥物反應(yīng)a數(shù)據(jù)表示為多個對象和多個發(fā)病率([])所有不良事件可能與dna疫苗加電穿孔相關(guān)，或未知(疲勞、鼻炎、頭痛)。事件的ctcae等級為1(輕度)，并且所有事件在注射后3天內(nèi)完全恢復(fù)。表7.血液學(xué)測試匯總數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d.。由于據(jù)報道施用flt3l蛋白可以提高白細(xì)胞(whitebloodcell，wbc)(maraskovsky，e.，等，blood96：878-884，2000；evans，t.g.，等，vaccine21：322-329，2002)的頻率，因此在血液中測量wbc的數(shù)目和flt3l的水平。未觀察到wbc數(shù)目的變化(表6)，這可能是由于gx-188疫苗接種后血液中flt3l水平幾乎沒有上調(diào)(表8)。表8.血液中flt3l濃度的變化數(shù)據(jù)表示為平均值±s.d.(pgml-1)。為了確定本文中所述方法的免疫學(xué)安全性，研究了ep增強(qiáng)的gx-188dna疫苗的遞送是否產(chǎn)生已知與自身免疫病相關(guān)的抗flt3l和抗dna抗體(saade，f.和petrovsky，n.，expertreviewofvaccines11：189-209，2012)。使用flt3lelisa試劑盒(dfk00，r&dsystems)根據(jù)制造商的說明書測量血液中flt3l的水平。簡言之，將血漿樣品和標(biāo)準(zhǔn)品添加到用對人flt3l特異的單克隆抗體包被的微孔板中。在洗去任何未結(jié)合的物質(zhì)后，向孔中添加對人flt-3配體特異的酶聯(lián)多克隆抗體。洗滌以除去任何未結(jié)合的抗體-酶試劑后，將底物溶液添加至孔中。通過添加2n硫酸終止顯色，并使用微板讀數(shù)器(moleculardevices，spectramaxplus384)測量顏色的強(qiáng)度。通過使用能夠產(chǎn)生log/log曲線擬合的計算機(jī)軟件(softmaxprosoftware，v5.4.1)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算血液中flt3l的水平(pg每ml)。數(shù)據(jù)表示為一式三份樣品的平均值±s.d.。通過elisa(chorusdsdna-g，diesse，意大利)測定抗dsdna抗體的水平。簡言之，將血漿(50μl)添加到用純化的人dna包被的微孔板中，然后在洗滌后，用與辣根過氧化物酶綴合的抗人igg抗體進(jìn)行孵育。除去未結(jié)合的綴合物，并添加tmb底物。為了檢查結(jié)果的有效性，使用試劑盒提供的對照樣品。如果對照樣品的信號具有超出可接受范圍的值，則應(yīng)重復(fù)校準(zhǔn)。校準(zhǔn)范圍為10.0-150.0iuml-1。測試樣品可以如下解釋：當(dāng)結(jié)果為＞30.0iuml-1時為陽性，當(dāng)結(jié)果為＜20.0iuml-1時為陰性，對于20.0至30.0iuml-1的所有值都是存疑的。在存疑結(jié)果的情況下，應(yīng)重復(fù)測試。診斷靈敏度、交叉反應(yīng)、特異性和測試的精確度在試劑盒手冊中描述。檢測限為10iuml-1。與對照血清(數(shù)據(jù)未顯示)相比，疫苗接種后抗flt3l抗體水平?jīng)]有被顯著誘導(dǎo)，并且cin3患者血液中針對dna的抗體水平低于檢測限(表9)，這與從沒有ep的dna疫苗免疫的對象獲得的先前結(jié)果相當(dāng)(le，t.p.，等，vaccine18：1893-1901，2000；yang，s.h.，等，genetherapy13：1110-1117，2006)。總之，這些結(jié)果表明，ep和遺傳佐劑的并入在dna疫苗的臨床試驗中是相對可容忍的，并且非常類似于在施用不含ep的基礎(chǔ)dna疫苗時觀察到的安全性特征。表9.在對象中抗dsdna抗體的不可檢出水平檢測限，10iuml-1實施例2gx-188疫苗接種對細(xì)胞免疫的作用為了研究gx-188誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，通過用覆蓋hpv16或hpv18e6和e7蛋白的全長的重疊肽的混合物刺激患者的外周血單個核細(xì)胞(pbmc)來確實hpv特異性ifn-γ分泌性t細(xì)胞的數(shù)目。在gx-188疫苗接種之前的vs時間(-2周)，接種期間的vt2(2周)和vt4時間點(8周)，和接種后的在vf1(20周)和vf2時間點(36周)進(jìn)行ifn-γelispot測定。在37℃，5％co2下，用optmizerttmctstm培養(yǎng)基(lifetechnologies)使冷凍保存和解凍的pbmc適應(yīng)超過6小時，隨后用2μgml-1的四個不同庫的hpv16和hpv18e6或e7衍生肽(具有10個氨基酸重疊的20聚體)刺激pbmc持續(xù)48小時(每孔2×105個細(xì)胞)。分別將植物凝集素(pha)和僅培養(yǎng)基用作陽性和陰性對照。刺激后，根據(jù)制造商的說明書(bdbioscience)使指示分泌ifn-γ的細(xì)胞的斑點顯色。用自動化分析儀(cellulartechnologyltd.)分析斑點的數(shù)目。通過從實驗孔中的平均斑點數(shù)減去僅培養(yǎng)基對照中的平均斑點數(shù)來計算hpv特異性應(yīng)答，其表示為sfc/106個pbmc(urbani，s.等，jexpmed.，201(5)：675-80，2005)。該測定一式三份進(jìn)行，并且斑點的背景數(shù)為5.7±2.2(平均值±s.d.)。當(dāng)抗原孔的平均數(shù)減去背景時，比培養(yǎng)基對照高3倍或大于55個sfc/106個pbmc，則抗原特異性t細(xì)胞應(yīng)答被認(rèn)為是陽性的(barnes，e.等，scitranslmed.4(115)：115ra1，2012；streeck，h.等，natprotoc.，4(4)：461-9，2009)。此外，將分析后疫苗誘導(dǎo)的應(yīng)答定義為與疫苗接種前的結(jié)果相比，疫苗接種后t細(xì)胞頻率提高為至少3倍(devosvansteenwijk，p.j.等，cancerimmunolimmunother.，61(9)：1485-92，2012)。在一個患者(a03)中檢測到相對高的預(yù)先存在的ifn-γelispot應(yīng)答，而其他8個患者在疫苗接種前顯示弱的預(yù)先存在的hpv特異性細(xì)胞免疫?；谏鲜鰳?biāo)準(zhǔn)，與圖3a-3i所示的接種前的背景水平相比，所有對象表現(xiàn)出疫苗誘導(dǎo)的e6-和e7-特異性ifn-γelispot應(yīng)答的顯著提高。9位患者中的兩位(a06和a08)甚至在單次免疫接種(vt2)后產(chǎn)生顯著增強(qiáng)的ifn-γ應(yīng)答，且另外4位患者在兩次疫苗接種后(vt4)表現(xiàn)出這樣的升高的應(yīng)答。1mg劑量組(圖3a和3d)中的兩個患者(a01和a03)在3次gx-188疫苗注射(vf1)后顯示提高的ifn-γ反應(yīng)，這表明疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答在gx-188疫苗接種期間在所有患者中逐漸更強(qiáng)。特別地，患者a08(圖3h)顯示最高量級的ifn-γelispot應(yīng)答，其具有每106個pbmc的高達(dá)3,500個斑點形成單位(spotformingunit，sfu)的反應(yīng)性。在所有患者中，針對e6抗原的t細(xì)胞應(yīng)答可能比針對e7抗原的t細(xì)胞反應(yīng)更強(qiáng)烈，如圖3a-3i中所示(在vf1，針對e6為69％至89％vs.針對e7為11％至31％)。記憶性t細(xì)胞的建立通常在免疫接種后約4周開始形成，通常是疫苗的保護(hù)功效的不可或缺因素之一(wherry，e.j.和ahmed，r.，journalofvirology78：5535-5545，2004；kaech，s.m.，等，naturereviewsimmunology2：251-262，2002)。在最后一次疫苗接種后24周(vf2)，在9位患者中的8位中觀察到相對高水平的ifn-γelispot應(yīng)答，當(dāng)與接種疫苗后8周(vf1)時的反應(yīng)相比，所述水平對于一位患者(a03)降低，對于三位患者(a01、a06和a09)相當(dāng)，并且對于四位患者(a02，a05，a07和a08)提高(圖3b、3e、3g和3h)?？偟膩碚f，該發(fā)現(xiàn)表明gx-188疫苗接種誘導(dǎo)的e6/e7特異性記憶t細(xì)胞應(yīng)答可以在最后一次接種后保持至少24周。為了確定通過elispot測定測量的對e6/e7抗原的ifn-γ應(yīng)答是否主要由t細(xì)胞產(chǎn)生并且確定哪個t細(xì)胞子集發(fā)揮主要作用，在疫苗接種前和疫苗接種后時間點(vs和vf1)對ifn-γ進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色(ics)測定。具體而言，將在gx-188疫苗接種之前(vs)和之后(vf1)收獲的患者的冷凍保存和解凍的pbmc重懸浮于optimizertmctstm中，并在37℃，5％co2下靜息超過6小時。將pbmc一式兩份平板接種，并在1μg/ml的α-cd28(l293，bdbioscience)和α-cd49d(l25，bdbioscience)的存在下用濃度為2μg/ml的一個庫中的hpv16e6和e7肽的組合混合物(15聚體，8個氨基酸重疊)、α-cd3mab(陽性對照)或單獨的培養(yǎng)基(陰性對照)刺激13小時。在初始刺激后90分鐘添加分泌抑制劑(莫能菌素(monensin)/布雷菲德菌素a(brefeldina)，bdbioscience)。刺激后，用pbs洗滌細(xì)胞以用于隨后的免疫染色和多色流式細(xì)胞術(shù)分析。用于細(xì)胞染色的抗體為cd19-apccy7(hib19，biolegend)、cd4-percpcy5.5(rpa-t4，biolegend)、cd8-pecy7(rpa-t8，bdbioscience)、cd3-bv605(brightviolet605)(ucht1，biolegend)、cd3-bv500(ucht1，bdhorizon)、活/死-apccy7(lifetechnologies)、mip-1β-pe(d21-1351，bdbioscience)、ifn-γ-apc(4s.b3，biolegend)、tnf-α-bv421(mab11，biolegend)、il-2-bv711(5344.111，bdhorizon)、cd107a-fitc(h4a3，bdbioscience)和cd107b-fitc(h4b4，bdbioscience)。facs分析通過fortessa流式細(xì)胞儀(bdbioscience)完成，并使用flowjo軟件(treestar)分析數(shù)據(jù)。將布爾設(shè)門用于確定從cd8t細(xì)胞同時產(chǎn)生細(xì)胞因子。用spice進(jìn)行多功能性分析(roederer，m.等，cytometrya.，79(2)：167-74，2011)。陽性應(yīng)答定義為相比于僅培養(yǎng)基對照，細(xì)胞因子產(chǎn)生性t細(xì)胞的百分比為至少兩倍，并且應(yīng)答應(yīng)當(dāng)可見為與非產(chǎn)生性細(xì)胞相分離的清楚可分辨的細(xì)胞因子產(chǎn)生性細(xì)胞群體。疫苗誘導(dǎo)的應(yīng)答定義為基線樣品(接種前)的抗原特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生性t細(xì)胞的百分比提高為至少3倍(welters，m.j.等，clincancerres.，1；14(1)：178-87，2008)。如圖4a-4e所示，用gx-188疫苗接種導(dǎo)致所有9位患者中hpv16特異性ifn-γ+cd4t細(xì)胞應(yīng)答提高(圖4b和4c)，而在9位患者中的8位中ifn-γ+cd8t細(xì)胞應(yīng)答增強(qiáng)，除了患者a04以外(圖4d和4e)。因此，除一位患者外，gx-188疫苗引起hpv16特異性cd4和cd8t細(xì)胞的激活。由于持續(xù)性hpv感染損害t輔助(th)1型細(xì)胞對hpv的應(yīng)答，導(dǎo)致宮頸癌進(jìn)展(deligeoroglou，e.，等，infectiousdiseasesinobstetricsandgynecology2013：540850，2013；bais，a.g.，等，journalofclinicalpathology58：1096-1100，2005；clerici，m.，等，journalofthenationalcancerinstitute89：245-250，1997；peghini，b.c.，等，humanimmunology73：920-926，2012)，因此研究了gx-188dna疫苗是否可以驅(qū)動hpv特異性cd4t細(xì)胞分化為th1效應(yīng)細(xì)胞。將冷凍保存和解凍的pbmc(每孔2×105)重懸于optimizertmctstm中，并在37℃，5％co2下靜息超過6小時，并隨后將pbmc一式兩份地平板接種，并在96孔板中，在含有10％fbs、100uml-1青霉素和100μgml-1鏈霉素的rpmi1640中以濃度為2μgml-1的一個庫中的hpv16e6和e7肽的組合混合物(15聚體，8個氨基酸重疊)或僅作為陰性對照的培養(yǎng)基刺激。刺激后48小時收集培養(yǎng)物上清液，并通過th1/th2/th17細(xì)胞計數(shù)珠陣列(cba)試劑盒(bdbiosciences)對細(xì)胞因子進(jìn)行定量。根據(jù)制造商的說明，建議的檢測限為2.5至5pgml-1(il-2、il-4、il-10、tnf-α和ifn-γ)或19pgml-1(il-17a)，并將截斷值設(shè)定為5pgml-1，因為如圖12所示，每種細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線在5pgml-1的濃度開始顯示出線性。陽性抗原特異性反應(yīng)定義為高于截斷值的細(xì)胞因子濃度，并且＞2×培養(yǎng)基對照的濃度(welters，m.j.等，clincancerres.，1；14(1)：178-87，2008)。疫苗誘導(dǎo)的應(yīng)答定義為相對于基線樣品提高為至少3倍的抗原特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生(welters，m.j.等，clincancerres.，1；14(1)：178-87，2008)。在用e6/e7肽刺激后，疫苗接種前常見的th1效應(yīng)細(xì)胞因子(例如ifn-γ、il-2和tnf-α)的基線產(chǎn)生顯著低。然而，在大多數(shù)患者中這些細(xì)胞因子的量在接種后顯著提高(對于ifn-γ、il-2和tnf-α的中值分別為49.9、13和22.9倍提高)，分別如圖5a-c中所示。與ifn-γelispot和ics數(shù)據(jù)一致，a08患者還顯示出th1細(xì)胞因子產(chǎn)生的最大提高。鑒于il-2產(chǎn)生水平在功能性記憶t細(xì)胞分化期間逐漸提高(wherry，e.j.，等，natureimmunology4：225-234，2003)，il-2產(chǎn)生的這種實質(zhì)性提高可以表明在gx-188疫苗接種后高效地產(chǎn)生hpv特異性記憶性t細(xì)胞。另一方面，通過疫苗接種，th2(il-4和il-10)(分別為圖5d-e)和th17(il-17a)(圖5f)細(xì)胞因子沒有顯著提高，盡管患者a04在免疫抑制性細(xì)胞因子il-10的產(chǎn)生中具有略微提高的水平。綜合以上ifn-γelispot和ics分析，這些結(jié)果表明gx-188疫苗接種導(dǎo)致誘導(dǎo)強(qiáng)烈的th1極化的hpv特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答。實施例3gx-188疫苗誘導(dǎo)的多功能cd8t細(xì)胞在持續(xù)性病毒感染期間，病毒特異性cd8t細(xì)胞變得對病毒抗原無應(yīng)答并顯示效應(yīng)子功能的進(jìn)行性喪失(wherry，e.j.，journalofvirology77：4911-4927，2003；wherry，e.j.，等，immunity27：670-684，2007)。為了確定gx-188疫苗接種是否誘導(dǎo)hpv特異性cd8t細(xì)胞功能性的多個方面，hpv特異性cd8t細(xì)胞共產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞因子的能力，因此評估了ifn-γ、il-2、tnf-α和mip-1β。類似于通過ics獲得的ifn-γ的結(jié)果(圖4a-4e)，相比于疫苗接種前(vs)，在疫苗接種后(vf1)除a04外，9位患者中的8位顯示出共產(chǎn)生ifn-γ和il-2、tnf-α或mip-1β的hpv特異性cd8t細(xì)胞的比例提高(圖6a-c和圖7b-d)。病毒特異性cd8t細(xì)胞的細(xì)胞裂解活性是評價抵抗病毒感染的疫苗效力的另一個主要指標(biāo)(pantaleo，g.和harari，a.，naturereviewsimmunology6：417-423，2006；seder，r.a.，naturereviewsimmunology8：247-258，2008)。由于cd107a/b的表達(dá)僅見于通過細(xì)胞毒性t細(xì)胞的脫顆粒期間(betts，m.r.，等，journalofimmunologicalmethods281：65-78，2003)，因此還評價了hpv特異性cd8t細(xì)胞同時產(chǎn)生ifn-γ和上調(diào)cd107a/b表達(dá)的能力。如圖6d和圖7e所示，疫苗接種后，除a04之外的所有患者中，ifn-γ+cd107a/b+cd8t細(xì)胞的頻率逐步升高。為了確定在這8個患者中通過疫苗接種誘導(dǎo)的hpv16特異性cd8t細(xì)胞的多功能性，使用布爾設(shè)門同時評估ifn-γ、il-2、tnf-α、mip-1β和cd107a/b?；颊遖08表現(xiàn)出最高的多功能譜，其中87.6％的hpv16特異性cd8t細(xì)胞至少為三陽性，其中15％具有全部5種功能(圖6e-f)。在其他6位患者(a01、a02、a03、a05、a06和a07)中，7.8％至46.3％的hpv特異性cd8t細(xì)胞具有3種或更多功能(圖6f)。然而，來自患者a09的hpv16特異性cd8t細(xì)胞不是多功能的(圖6f)?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，在大多數(shù)患者中，gx-188接種可以誘導(dǎo)具有多種多功能譜的抗原特異性cd8t細(xì)胞。已知抗原刺激后應(yīng)答性t細(xì)胞的最佳擴(kuò)增對于通過治療性疫苗接種提供有效的保護(hù)性免疫是必需的(wherry，e.j.，journalofvirology77：4911-4927，2003；wherry，e.j.，等，journalofvirology79：8960-8968，2005)。因此，通過測量ki67和cd38表達(dá)的水平來檢查疫苗接種前(vs)和后(vf1)對hpv16e6/e7肽應(yīng)答的cd8t細(xì)胞的激活誘導(dǎo)的增殖，其分別用作增殖和激活的標(biāo)志物(gerdes，j.，等，journalofimmunology133：1710-1715，1984；sandoval-montes，c.，和santos-argumedo，l.，journalofleukocytebiology77：513-521，2005)。ki-67被證明是用于離體測量抗原特異性細(xì)胞增殖的有效工具，并且可以用作標(biāo)準(zhǔn)增殖測定(例如羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(carboxyfluoresceinsuccinimidylester，cfse)標(biāo)記和5-溴-2-脫氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine，brdu)并入)的替代方法(soares，a.等，jimmunolmethods.，362(1-2)：43-50，2010；shedlock，d.j.等，cytometrya.，77(3)：275-84，2010)。使用optmizertmctstm培養(yǎng)基(lifetechnologies)在37℃，5％co2下將冷凍保存和解凍的pbmc(每孔1×106個細(xì)胞)適應(yīng)超過6小時。將pbmc一式兩份地平板接種，并在含有10％fbs、100uml-1青霉素和100μgml-1鏈霉素的rpmi1640中，用濃度為2μgml-1的一個庫的hpv16e6和e7肽的組合混合物(15聚物，具有8個氨基酸重疊)刺激5天。將α-cd3mab和單獨的培養(yǎng)基分別作為陽性和陰性對照。3天后，用100μl新鮮r10培養(yǎng)基替換細(xì)胞培養(yǎng)物。在培養(yǎng)結(jié)束時，用pbs洗滌細(xì)胞以用于隨后的免疫染色和多色流式細(xì)胞術(shù)分析。細(xì)胞用cd19-fitc、cd4-percpcy5.5、cd8-pecy7、cd38-bv421(hit2，bdbioscience)、cd3-bv605、ki-67-pe(b56，bdbioscience)和活/死apccy7染色。比培養(yǎng)基對照高至少3倍的應(yīng)答被認(rèn)為是陽性的。疫苗誘導(dǎo)的應(yīng)答被定義為相比于基線樣品的抗原特異性增殖性cd8t細(xì)胞以百分比計至少提高3倍。盡管一個患者(a01)顯示相對高的預(yù)先存在的疫苗接種前水平(vs)，但是其余患者顯示低水平的ki67+cd38+cd8t細(xì)胞，如圖8所示。在疫苗接種后，所有患者在hpv特異性cd8t細(xì)胞的增殖活性方面均表現(xiàn)出有意義的改善。根據(jù)如圖6所示的功能性cd8t細(xì)胞應(yīng)答的模式，2位患者(a04和a09)在增殖性cd8t細(xì)胞群方面僅顯示輕微提高，而其他7位患者顯示ki67+cd38+cd8t細(xì)胞群體的大得多的提高，其提高的范圍為3.1至21.2倍。本文中，來自未刺激細(xì)胞的ki67表達(dá)的背景水平相當(dāng)?shù)?0.011±0.015％)，并因此肽刺激的ki67+cd38+cd8t細(xì)胞可被認(rèn)為是抗原特異性增殖性cd8t細(xì)胞，如圖8所示?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，cin3患者中的gx-188疫苗接種顯著增強(qiáng)了hpv特異性cd8t細(xì)胞的擴(kuò)增和多功能性。實施例4gx-188疫苗接種后針對e7和e6蛋白的抗體應(yīng)答的測量通過終點稀釋酶聯(lián)免疫吸附測定(elisa)評價血漿樣品對于e6和e7的總igg抗體應(yīng)答。具體而言，收集血漿樣品并在-70℃冷凍。進(jìn)行結(jié)合elisa以測量由gx-188疫苗接種誘導(dǎo)的抗hpv16/18e6或e7抗體應(yīng)答。通過用hpv16/hpv18e6或e7蛋白(1μgml-1)包被96孔酶免疫測定板(thermoscientifictm)來測定抗體的終點滴度(重組hpv16e6、hpv16e7和hpv18e7購自proteinxlab；重組hpv18e6購自mybiosource)。在室溫下用pbs，5％脫脂乳封閉平板1小時。將測試血漿在含有5％脫脂乳和0.1％吐溫20的pbs中連續(xù)稀釋，并一式三份添加至板孔。在室溫下孵育1小時后，通過將板與hrp綴合的山羊抗人igg抗體(bethyl，a80-104p)孵育1小時來檢測e6-或e7-特異性抗體。在最后一次洗滌(tablet，fluka)后，用tmb底物(surmodics)檢測特異性結(jié)合。用0.5nh2so4(sigma-aldrich)終止反應(yīng)，并在微板讀數(shù)器(moleculardevices，spectramaxplus384)中在450nm讀取吸光度。負(fù)截斷(negativecut-off，nco)值定義為12個健康對照血漿(biochemed)的平均光密度加上1.645xs.d.(mire-sluis，a.r.等，jimmunolmethods.，289(1-2)：1-16，2004)。如果樣品的平均光密度大于nco值，則認(rèn)為其陽性(hpv16e6為0.173，hpv16e7為0.213，hpv18e6為0.214，并且hpv18e7為0.227)。為了說明樣品與板的非特異性結(jié)合，在用不相關(guān)蛋白epo-brp(edqm，批次3，ph.eur.參考標(biāo)準(zhǔn))包被的孔中測試每種血漿。如圖9a-9l所示，所有患者在基線(vs)時對e6和e7蛋白均檢測不到或幾乎檢測不到igg滴度，表明沒有有意義的預(yù)先存在的e6和e7特異性igg抗體應(yīng)答。有趣的是，在疫苗接種后的任何劑量群組中，e6的抗體滴度都完全沒有產(chǎn)生或加強(qiáng)。在用范圍為1∶8至1∶256的抗體滴度(圖9a-9l)疫苗接種后，九位患者中的三位(a05、a07和a09)產(chǎn)生弱的抗e7抗體應(yīng)答。值得注意的是，針對e7抗原的t細(xì)胞應(yīng)答低于針對e6抗原的t細(xì)胞應(yīng)答，并且針對e7蛋白的可測量的抗體滴度與pbmc中針對e7抗原的cd8t細(xì)胞應(yīng)答不相關(guān)。實施例5gx-188疫苗接種對hpv感染和病變的作用通過評價患者在其36周的臨床試驗期間的hpv感染狀態(tài)，以及其高度子宮頸病變的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)變化來確定gx-188誘導(dǎo)的臨床應(yīng)答(表10和圖1b)。根據(jù)陰道鏡檢查導(dǎo)向的活檢標(biāo)本的組織學(xué)評價，在基線處(vs)，所有9位患者患有伴有嚴(yán)重不典型增生(a01、a02、a05、a06、a07和a08)或原位癌(a03、a04和a09)的cin3(表5和10)。在最后一次疫苗接種后8周(vf1)，9位患者中有6位(每個組群中有2位患者(來自1mg組群的a01和a03，來自2mg組群的a05和a06，來自4mg組群的a07和a08)沒有病變)，這表明應(yīng)答的劑量獨立性可能是由于1mg的飽和劑量引起的(表10)。基于在第12周(vt4)第二次免疫接種后的細(xì)胞學(xué)分析，這些應(yīng)答者患者中的三個(a03、a06和a08)對于上皮內(nèi)損傷是陰性的；而另外3位患者(a01、a05和a07)在第20周(vf1)第三次疫苗接種后顯示此類應(yīng)答，并且最后一位應(yīng)答患者(a02)在36周試驗結(jié)束時(vf2)清除病變。值得注意的是，6個早期應(yīng)答者中沒有一個在試驗的剩余持續(xù)時間期間顯示任何復(fù)發(fā)性宮頸不典型增生。在2位無應(yīng)答者的情況下，患者a04在第24周通過宮頸錐切術(shù)(cervicalconization)治療，而根據(jù)患者的要求，對患者a09在沒有手術(shù)的情況下進(jìn)行監(jiān)測，直到研究結(jié)束，并且在cin3方面保持穩(wěn)定，而未發(fā)展成侵襲性癌。疫苗接種前(vs)和試驗結(jié)束時(vf2)的陰道鏡檢查、細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)圖像分析更清楚地證明了應(yīng)答者和無應(yīng)答者之間對gx-188的臨床反應(yīng)的差異，如圖10中來自代表性應(yīng)答者a05和無應(yīng)答者a09患者的照片所示。在宮頸的陰道鏡檢查評價中，患者a05在疫苗接種后顯示致密醋酸白色上皮細(xì)胞的顯著降低和轉(zhuǎn)化區(qū)中的粗糙點的消失，而患者a09在子宮頸中仍然具有致密病變，如圖10a所示。宮頸細(xì)胞學(xué)測試表明，gx-188疫苗接種誘導(dǎo)患者a05中具有蛛形細(xì)胞質(zhì)過程和常染色體核的高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-gradesquamousintraepitheliallesion，hsil)的正?；?，但在患者a09中細(xì)胞學(xué)外觀沒有變化，如圖10b所示。在組織學(xué)特征中，疫苗接種后在患者a05中，活檢顯示具有明顯的核變異的cin3的異常厚上皮回歸到?jīng)]有非典型上皮的正常鱗狀上皮，但是其仍然存在于患者a09中，如圖10c所示。在試驗開始時，在所有9位對象的病變中鑒定出hpv16，并且發(fā)現(xiàn)一位患者(a05)還與hpv18共感染。在第12周(vt4)，4位患者(a01、a03、a06和a08)和患者a05分別顯示hpv16和hpv18病毒的清除(表10)，表明在第二次免疫接種后病毒清除。在第20周(vf1)，在9位患者中的6例(a01、a03、a05、a06、a07和a08)中清除了宮頸病變中的hpvdna，并且另一位患者(a02)在第36周(vf2)清除了病毒。由于這7位患者也以相同的動力學(xué)清除了它們的損傷，所以在臨床和病毒學(xué)應(yīng)答之間存在完美的相關(guān)性(表10)。除了hpv16和hpv18以外，發(fā)現(xiàn)兩位患者(a06和a07)在基線(vs)時還與其他高風(fēng)險常見類型的hpv共感染。一位患者(a05)在試驗中間(vt4)感染了常見的hpv類型。與a07患者相反，a05和a06患者分別在vf2和vt4清除共感染的常見類型的hpv，這可能是由于消除hpv16感染的上皮內(nèi)瘤細(xì)胞引起的旁鄰(bystander)效應(yīng)。這些病毒清除的另一個原因是通過疫苗接種后產(chǎn)生的hpv16e6/e7特異性cd8t細(xì)胞的交叉反應(yīng)性，因為在hpv16或hpv18和其他高風(fēng)險型株之間的e6和e7氨基酸序列中存在約50-60％的同源性。值得注意的是，在早期時間點(vt4)清除其病變和hpv感染的3位患者(a03、a06和a08)迅速顯示相對高量級的hpv特異性多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答(表10，圖6和8)。此外，具有有意義的多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答的其他4位患者(a01、a02、a05和a07)在第20周(vf1)時或在試驗結(jié)束時(在第36周時的vf2)在第三次疫苗接種后顯示其病變和hpv感染的完全消退(表10，圖6和8)。相比之下，2位無應(yīng)答者患者(a04和a09)幾乎沒有多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答。當(dāng)將來自患者的個體數(shù)據(jù)分組為無應(yīng)答者(a04和a09)和應(yīng)答者(a01、a02、a03、a05、a06、a07和a08)以產(chǎn)生3個或更多功能的多功能譜時，多功能t細(xì)胞應(yīng)答的誘導(dǎo)和臨床結(jié)果之間的相關(guān)性是顯而易見的(圖11)。因此，本文中提供的結(jié)果表明gx-188疫苗的臨床效力與全身性hpv特異性多功能cd8t細(xì)胞應(yīng)答的程度密切相關(guān)?？傮w而言，gx-188疫苗接種導(dǎo)致78％的臨床和病毒學(xué)上有意義的完全應(yīng)答率(9位患者中的7位)(表10)。表10.通過電穿孔用gx-188dna疫苗免疫接種期間和之后的病毒學(xué)和臨床應(yīng)答ahpv檢測的pcr結(jié)果(陰性，hpv16和18兩者均陰性；16，hpv16陽性；常見，其他高危hpv26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、56、58、59、66、68、73和/或82陽性)b未完成。a04患者在第24周通過宮頸錐切術(shù)治療ca07患者由于她的個人情況，在第42周而不是第36周進(jìn)行了訪視和陰道鏡檢查和宮頸活檢的檢查。cin3；宮頸上皮內(nèi)瘤變iii級，asc-h；非典型鱗狀細(xì)胞-不能排除高度鱗狀上皮內(nèi)病變，asc-us；未確定意義的非典型鱗狀細(xì)胞，hsil；高度鱗狀上皮內(nèi)病變，nil；無上皮內(nèi)病變本文中使用的統(tǒng)計分析：使用(v9.1)軟件進(jìn)行安全性、藥效動力學(xué)和藥代動力學(xué)結(jié)果的描述性統(tǒng)計。使用prism5.0軟件(graphpad)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)和雙尾配對t檢驗(student’sttest)以分析所有定量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性。實施例6gx-188變體的構(gòu)建及其免疫原性已經(jīng)如所述構(gòu)建了gx-188構(gòu)建體的許多變體。構(gòu)建的gx-188變體包括c-1、c-2、d-1、d-2、e-1和e-2。參見圖14。一些構(gòu)建體(c-1和c-2)在e6或e7蛋白部分中含有一個或更多個突變或替換(即，c-1的16e6n中的h21q和16e6c中的y85h和v90l，以及c-2的16e7n中的m12k和n29s以及16e7c中的r77s和g85s)；一些構(gòu)建體(d-1和d-2)含有較短或較長的重疊序列(即，分別為0+0+0+0和86+42+15+15)；并且一些構(gòu)建體(e-1和e2)含有e6和e7蛋白部分的不同抗原混編順序(分別為ncncncnc和ccnnccnn)。突變/替換變體(c-1和c-2)基于如圖13a-13d所示的天然存在的突變和/或替換。為了從gx-188構(gòu)建變體，以化學(xué)方法合成在其末端帶有bstxi(5’)和alei(3’)限制性位點的每個含有替換/突變、重疊序列中的變異和抗原混編的變化的基因片段，以有助于插入到gx-188中。用bstxi和alei限制酶消化gx-188和c-1、c-2、d-1、d-2、e-1和e-2片段，然后連接以分別產(chǎn)生c-1、c-2、d-1、d-2、e-1和e-2的各質(zhì)粒。特別地，對于c-1構(gòu)建體，分別將hpv16e6的組氨酸(h)21、酪氨酸(y)85和纈氨酸(v)90替換為谷氨酰胺(q)、組氨酸(h)和亮氨酸(l)。包含編碼c-1構(gòu)建體的核苷酸序列的整個質(zhì)粒序列顯示為seqidno：105。c-1構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno：106。對于c-2構(gòu)建體，hpv16e7的甲硫氨酸(m)12被賴氨酸(k)替換，并且hpv16e7的天冬酰胺(n)29、精氨酸(r)77和甘氨酸(g)85被絲氨酸(s)替換。包含編碼c-2構(gòu)建體的核苷酸序列的整個質(zhì)粒序列顯示為seqidno：107。c-2構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno：108。d-1構(gòu)建體含有hpv16e6的第1至78位氨基酸、hpv16e7的第1至58位氨基酸、hpv16e6的第79至158位氨基酸、hpv16e7的第59至98位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至65位、hpv18e6的第71位至第158位和hpv18e7的第51位至105位。包含編碼d1構(gòu)建體的核苷酸序列的整個質(zhì)粒序列顯示為seqidno：109。d-1構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno：110。d-2構(gòu)建體含有hpv16e6的第1至130位氨基酸、hpv16e7的第1至85位氨基酸、hpv16e6的第45至158位氨基酸和hpv16e7的第44至98位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至65位、hpv18e6的第71位至第158位和hpv18e7的第51位至105位。包含編碼d-2構(gòu)建體的核苷酸序列的整個質(zhì)粒序列顯示為seqidno：111。d-2構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno：112。e-1構(gòu)建體從n末端到c末端含有：hpv16e6的第1至85位氨基酸、hpv16e7的第51至98位氨基酸、hpv16e7的第1至65位氨基酸、hpv16e6的第71至158位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至65位、hpv18e6的第71位至第158位和hpv18e7的第51位至105位。包含編碼e-1構(gòu)建體的核苷酸序列的整個質(zhì)粒序列顯示為seqidno：113。e-1構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno：114。e-2構(gòu)建體從n末端到c末端含有：hpv16e6的第71至158位氨基酸、hpv16e7的第51至98位氨基酸、hpv16e6的第1至85位氨基酸、hpv16e6的第1至第65位氨基酸、hpv18e6的第1至85位氨基酸、hpv18e7的第1至65位、hpv18e6的第71位至第158位和hpv18e7的第51位至105位。包含編碼e-2構(gòu)建體的核苷酸序列的整個質(zhì)粒序列顯示為seqidno：115。e-2構(gòu)建體的氨基酸序列顯示為seqidno：116。為了研究由gx-188和gx-188變體誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答，用8μggx-188和gx-188變體質(zhì)粒dna以電穿孔遞送，對小鼠進(jìn)行一次或兩次接種。圖15總結(jié)了每種構(gòu)建體的疫苗接種程序。在每次疫苗接種后2周對接種的小鼠進(jìn)行分析。進(jìn)行ifn-γelispot測定以測量疫苗誘導(dǎo)的t細(xì)胞應(yīng)答。在單細(xì)胞水平制備脾細(xì)胞，并用2μgml-1的四種不同的肽庫刺激24小時，如實施例2所述。將伴刀豆球蛋白a(cona)和僅培養(yǎng)基分別用作陽性和陰性對照。刺激后，根據(jù)制造商的說明書(bdbioscience)產(chǎn)生斑點形成細(xì)胞(sfc)。通過從存在刺激物的斑點數(shù)中減去不存在刺激物時誘導(dǎo)的斑點的平均數(shù)來計算應(yīng)答細(xì)胞的數(shù)目。應(yīng)答細(xì)胞的數(shù)目表示為sfc/106個脾細(xì)胞。與模擬載體疫苗接種的小鼠相比，用疫苗變體免疫接種的小鼠在單次和多次疫苗接種時顯示出顯著提高的ifn-γelispot應(yīng)答(參見圖16a和16b)。大多數(shù)gx-188變體在多次接種后表現(xiàn)出與gx-188相當(dāng)?shù)膇fn-γelispot應(yīng)答。這些結(jié)果表明疫苗gx-188變體也可以在疫苗接種后誘導(dǎo)足夠的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，例如ifn-γelispot應(yīng)答。尤其是，盡管在e1和e2的單次接種(抗原混編)后ifn-γelispot應(yīng)答最低，但疫苗誘導(dǎo)的t細(xì)胞應(yīng)答在加強(qiáng)免疫接種后增強(qiáng)，并且與其他gx-188變體相當(dāng)。該結(jié)果表明，替換/突變和抗原混編將保留誘導(dǎo)經(jīng)疫苗誘導(dǎo)的針對多次疫苗接種的t細(xì)胞應(yīng)答的能力。本公開內(nèi)容不限于所描述的旨在作為本公開內(nèi)容的各個方面的單一說明的具體實施方案的范圍，并且功能上等同的任何組合物或方法均在本公開內(nèi)容的范圍內(nèi)。實際上，除了本文中所示和所述的那些之外，本公開的多種修改對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，通過前面的描述和附圖，將變得顯而易見。這樣的修改旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本說明書中提及的所有出版物和專利申請通過引用并入本文，其程度如同每個單獨的出版物或?qū)＠暾埍痪唧w地和單獨地指明通過引用并入。本申請要求于2014年8月15日提交的美國臨時申請no.62/038,134和于2014年8月19日提交的美國臨時申請no.62/039,270的權(quán)益，其通過引用整體并入本文。當(dāng)前第1頁12當(dāng)前第1頁12