相關(guān)專利申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)依據(jù)35u.s.c.§119(e)要求2014年8月20日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/039809的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)針對(duì)所有目的以引用的方式整體并入本文。背景抗凝血?jiǎng)┰谑袌?chǎng)上用于治療或預(yù)防具有形成血塊的傾向的患者的不期望的血栓形成的需要，所述患者例如具有凝血異常、限于不動(dòng)時(shí)期或經(jīng)歷醫(yī)學(xué)手術(shù)的那些患者。然而，抗凝血?jiǎng)┋煼ǖ囊环N主要限制是與治療有關(guān)的出血風(fēng)險(xiǎn)，和在過(guò)量用藥的情況下或如果需要緊急手術(shù)程序，快速地逆轉(zhuǎn)抗凝血?jiǎng)┗钚缘哪芰Φ南拗?。因此，極其需要針對(duì)所有形式的抗凝血?jiǎng)┋煼ǖ木唧w且有效解毒劑。當(dāng)口服遞送不切實(shí)際或需要立即治療活性時(shí)，通過(guò)注射遞送生物活性蛋白一般是所選遞送途徑。然而，如不良的長(zhǎng)期存儲(chǔ)、摩爾滲透壓濃度、溶解度和穩(wěn)定性的生物、化學(xué)和物理障礙使得通過(guò)注射至哺乳動(dòng)物遞送生物活性劑成問(wèn)題。凍干可解決長(zhǎng)期存儲(chǔ)問(wèn)題。然而，使用凍干也會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，如凍干物的不良溶解度和穩(wěn)定性。因此，需要針對(duì)抗凝血?jiǎng)┑慕舛緞┑母倪M(jìn)的可注射制劑，其為穩(wěn)定并且可溶性的。本公開滿足這些和其它需要。本文所提到的任何和所有出版物、專利、專利申請(qǐng)均由此以引用的方式整體并入。概述本公開提供xa因子(fxa)蛋白衍生物(稱作“r-解毒劑”)的凍干制劑。與野生型fxa蛋白相比，所述r-解毒劑具有g(shù)la結(jié)構(gòu)域的修飾和活性位點(diǎn)，保持fxa結(jié)合于fxa抑制劑的能力，但不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。所述r-解毒劑為兩鏈多肽(參見(jiàn)表3中的seqidno.3，其包括輕鏈(seqidno.4)和重鏈(seqidno.5)，用在所述輕鏈的半胱氨酸98(cys98)與所述重鏈的半胱氨酸108(cys108)之間的單個(gè)二硫鍵連接。也如同野生型fxa，所述r-解毒劑經(jīng)歷翻譯后修飾，導(dǎo)致某些氨基酸殘基的糖基化，例如所述輕鏈的ser56、ser72、ser76和thr82和所述重鏈的thr249，和在所述輕鏈的asp29處的經(jīng)過(guò)修飾的殘基(3r)-3-羥基asp。此外，除了鏈間二硫鍵以外，在所述輕鏈的半胱氨酸16與27、21與36、38與47、55與66、62與75、和77與90之間，并且在所述重鏈的半胱氨酸7與12、27與43、156與170、和181與209之間還形成鏈內(nèi)二硫鍵。已知所述r-解毒劑的兩鏈結(jié)構(gòu)和多種翻譯后修飾，本文中顯示提供具有可接受的摩爾滲透壓濃度的穩(wěn)定并且可溶性溶液的穩(wěn)定凍干制劑的開發(fā)提供了巨大挑戰(zhàn)。然而，出乎意料地，本發(fā)明人能夠得到平衡了蛋白溶解度、穩(wěn)定性、餅結(jié)構(gòu)和摩爾滲透壓濃度的溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供一種水性制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述制劑包含10mm至55mm精氨酸或8mm至35mm檸檬酸鹽、1％至3％蔗糖(w/v)、2％至8％甘露醇(w/v)和至少5mg/ml的兩鏈多肽，所述兩鏈多肽包括具有氨基酸序列seqidno.4的第一鏈、具有氨基酸序列seqidno.5的第二鏈和在seqidno.4的位置98處的第一半胱氨酸殘基(cys98)與在seqidno.5的位置108處的第二半胱氨酸殘基(cys108)之間的二硫鍵，其中所述制劑的ph為7.5至8。在一些方面，所述制劑包含40mm至50mm精氨酸、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少10mg/ml的所述多肽。在一些方面，所述制劑包含10mm至30mm檸檬酸鹽、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少10mg/ml的所述多肽。在一些方面，所述制劑包含40mm至50mm精氨酸、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少18、19或20mg/ml的所述多肽。在一些方面，所述制劑包含10mm至30mm檸檬酸鹽、1.5％至2.5％蔗糖(w/v)、4.5％至5.5％甘露醇(w/v)和至少10mg/ml的所述多肽。在一些方面，所述制劑包含約45mm精氨酸、約2％蔗糖(w/v)、約5％甘露醇(w/v)和約10mg/ml的兩鏈多肽，所述兩鏈多肽包括包含氨基酸序列seqidno.4的第一鏈、包含氨基酸序列seqidno.5的第二鏈和在seqidno.4的位置98處的第一半胱氨酸殘基(cys98)與在seqidno.5的位置108處的第二半胱氨酸殘基(cys108)之間的二硫鍵，其中所述制劑的ph為約7.8。一方面，所述制劑進(jìn)一步包括聚山梨醇酯80(0.01％w/v至0.02％w/v)和/或緩沖液。在一些方面，所述制劑包含約45mm精氨酸、約2％蔗糖(w/v)、約5％甘露醇(w/v)和約20mg/ml的兩鏈多肽，所述兩鏈多肽包括包含氨基酸序列seqidno.4的第一鏈、包含氨基酸序列seqidno.5的第二鏈和在seqidno.4的位置98處的第一半胱氨酸殘基(cys98)與在seqidno.5的位置108處的第二半胱氨酸殘基(cys108)之間的二硫鍵，其中所述制劑的ph為約7.8。一方面，所述制劑進(jìn)一步包括聚山梨醇酯80(0.01％w/v至0.02％w/v)和/或緩沖液。在一些方面，所述多肽包含經(jīng)過(guò)修飾以不同于天然氨基酸的氨基酸殘基。在一些方面，所述第一鏈的殘基asp29在asp29處修飾為(3r)-3-羥基asp。在一些方面，所述多肽至少包括針對(duì)所述第一和第二鏈中每一者的鏈內(nèi)二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，還提供一種制備兩鏈多肽的凍干制劑的方法，所述兩鏈多肽包括具有氨基酸序列seqidno.4的第一鏈、具有氨基酸序列seqidno.5的第二鏈和在seqidno.4的位置98處的第一半胱氨酸殘基(cys98)與在seqidno.5的位置108處的第二半胱氨酸殘基(cys108)之間的二硫鍵，所述方法包括凍干如上文所述的水性制劑。另一實(shí)施方案提供通過(guò)凍干本公開的水性制劑制備的凍干組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供一種凍干組合物，其包含至少10％(w/w)的兩鏈多肽和重量比率的范圍為(0.6-0.95):(1-3):(2-8)的精氨酸:蔗糖:甘露醇或替代地重量比率的范圍為(0.5-1.4):(1-3):(2-8)的l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇，所述兩鏈多肽包括具有氨基酸序列seqidno.4的第一鏈、具有氨基酸序列seqidno.5的第二鏈和在seqidno.4的位置98處的第一半胱氨酸殘基(cys98)與在seqidno.5的位置108處的第二半胱氨酸殘基(cys108)之間的二硫鍵。在一些方面，所述凍干組合物包含至少15％、16％、17％、18％或19％(w/w)的所述兩鏈多肽。在一些方面，所述l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)范圍內(nèi)。還提供一種凍干組合物，其包含至少10％(w/w)的兩鏈多肽和重量比率的范圍為(0.15-0.66):(1-3):(2-8)的檸檬酸鹽:蔗糖:甘露醇，所述兩鏈多肽包括具有氨基酸序列seqidno.4的第一鏈、具有氨基酸序列seqidno.5的第二鏈和在seqidno.4的位置98處的第一半胱氨酸殘基(cys98)與在seqidno.5的位置108處的第二半胱氨酸殘基(cys108)之間的二硫鍵。在一些方面，所述凍干組合物包含至少10％、15％、16％、17％、18％或19％(w/w)的所述兩鏈多肽。在一些方面，所述檸檬酸鹽:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.19-0.57):(1.5-2.5):(4.5-5.5)范圍內(nèi)。本公開的另一實(shí)施方案提供通過(guò)溶解本公開的凍干組合物制備的溶液。在一些方面，溶劑為水或生理鹽水。另一實(shí)施方案提供一種減少經(jīng)歷使用xa因子抑制劑的抗凝血?jiǎng)┋煼ǖ氖茉囌叩某鲅姆椒?，其包括向所述受試者施用有效量的本公開的溶液。在一些方面，所述xa因子抑制劑為阿哌沙班、利伐沙班或貝曲西班。另外，在一個(gè)實(shí)施方案中還提供一種水性制劑，其包括包含氨基酸序列seqidno.3或與seqidno.3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽、增溶劑、穩(wěn)定劑和結(jié)晶組分，其中所述制劑在凍干期間不崩塌。在一些方面，所述結(jié)晶組分為甘露醇。在一些方面，甘露醇以2％至8％(w/v)的濃度存在。在一些方面，所述增溶劑為精氨酸或檸檬酸鹽且所述穩(wěn)定劑為蔗糖。在一些方面，所述水性制劑進(jìn)一步包括表面活性劑和緩沖液。在一些實(shí)施方案中，提供通過(guò)凍干所述水性制劑制備的凍干組合物。附圖簡(jiǎn)述圖1a-f為示出所述r-解毒劑在不同條件(ph、增溶劑、離子強(qiáng)度)下的溶解度的圖。陰影條指示觀察到蛋白沉淀并且空心條指示未觀察到蛋白沉淀。圖2為針對(duì)10mmtris溶液的dsc熱流熱解曲線，其示出在1℃/min下的冷卻和在-32℃下針對(duì)tris的結(jié)晶放熱。圖3為在用95mm精氨酸冷卻10mmtris期間的dsc熱解曲線。無(wú)針對(duì)tris的結(jié)晶放熱。圖4為針對(duì)含有10mmtris、2％蔗糖和2％甘露醇的溶液的dsc熱解曲線，示出在大約-18℃下甘露醇的結(jié)晶。圖5為針對(duì)10mmtris、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇的溶液的dsc熱解曲線，示出在-42℃下蔗糖的tg’。溶液在-20℃下退火持續(xù)5小時(shí)。圖6為針對(duì)10mmtris、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇的溶液的dsc熱解曲線，示出在-20℃下持續(xù)5小時(shí)的退火步驟，無(wú)結(jié)晶放熱的跡象。圖7為針對(duì)10mm磷酸鈉溶液的dsc熱解曲線，示出在大約-10℃下針對(duì)磷酸鈉的結(jié)晶放熱。圖8為針對(duì)具有2％蔗糖和2％甘露醇的10mm磷酸鈉的dsc不可逆熱流熱解曲線，示出在大約-33℃下開始結(jié)晶放熱。圖9為針對(duì)10mm磷酸鈉、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇的dsc熱流熱解曲線，除了融冰吸熱以外未展示熱事件。圖10為針對(duì)10mmtris、10mm檸檬酸鹽、2％蔗糖和5％甘露醇的dsc熱流熱解曲線，示出在-25℃下大約24分鐘開始結(jié)晶放熱。圖11為針對(duì)10mmtris、20mm檸檬酸鹽、2％蔗糖和5％甘露醇的dsc熱流熱解曲線，示出在-25℃下大約30分鐘開始結(jié)晶放熱。圖12為與在t0下的凍干制劑相比，針對(duì)在5℃下存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)2周的tris和磷酸鹽溶液制劑的uv濃度數(shù)據(jù)。圖13為與在t0下的凍干制劑相比，針對(duì)在25℃下存儲(chǔ)長(zhǎng)達(dá)2周的tris和磷酸鹽溶液制劑的uv濃度數(shù)據(jù)。圖14為與在t0下的溶液制劑相比，針對(duì)在25℃下存儲(chǔ)的tris和磷酸鹽凍干制劑的uv濃度數(shù)據(jù)。圖15為針對(duì)10mmtris、9.5mm精氨酸、2％蔗糖、2％甘露醇和0.01％ps80制劑的dsc熱解曲線，示出在-22℃下70分鐘(退火的開始時(shí)間)時(shí)甘露醇開始結(jié)晶。圖16為針對(duì)10mmtris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、4％甘露醇和0.01％ps80制劑的dsc熱解曲線，示出在-25℃下30分鐘時(shí)甘露醇開始結(jié)晶。圖17為當(dāng)10mmtris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％ps80溶液在1℃/min下冷卻至-40oc時(shí)針對(duì)甘露醇的dsc結(jié)晶放熱曲線。圖18示出當(dāng)10mmtris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％ps80溶液在-25℃下退火時(shí)針對(duì)甘露醇的dsc結(jié)晶放熱曲線。大約23分鐘時(shí)開始結(jié)晶。詳述i.定義所有數(shù)字標(biāo)號(hào)(例如ph、溫度、時(shí)間、濃度和分子量，包括范圍)均為以0.1或10％的增量(+)或(-)變化的近似值。應(yīng)了解，盡管并非始終明確地陳述，所有數(shù)字標(biāo)號(hào)之前均有術(shù)語(yǔ)“約”。還應(yīng)了解，盡管并非始終明確地陳述，本文所述的試劑僅為示例性的并且其相等物為本領(lǐng)域中已知的。如本說(shuō)明書和權(quán)利要求書中所用，除非上下文另外清楚指示，否則單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”以及“所述(the)”包括多個(gè)提及物。例如，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的載體”包括多種藥學(xué)上可接受的載體，包括其混合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“包含(comprising)”意圖意指所述組合物和方法包括所陳述的要素，但不排除其它要素?！爸饕伞M成”當(dāng)用于定義組合物和方法時(shí)應(yīng)意指排除對(duì)用于預(yù)期用途的組合具有任何基本意義的其它要素。因此，主要由如本文所定義的要素組成的組合物將不排除來(lái)自所述分離和純化方法的痕量污染物和藥學(xué)上可接受的載體，如磷酸鹽緩沖生理鹽水、防腐劑等。“由……組成”應(yīng)意指排除用于施用本公開的組合物的其它成分和主要方法步驟的超過(guò)痕量要素。由這些過(guò)渡術(shù)語(yǔ)中的每一種定義的實(shí)施方案均在本公開的范圍內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“蛋白”和“多肽”可互換使用并且以其最廣泛意義指代兩種或更多種亞單位氨基酸、氨基酸類似物或肽模擬物的化合物。所述亞單位可由肽鍵鍵聯(lián)。在另一實(shí)施方案中，所述亞單位可由例如酯、醚等其它鍵鍵聯(lián)。蛋白或肽必須含有至少兩種氨基酸并且關(guān)于可構(gòu)成蛋白或肽的序列的氨基酸的最大數(shù)目并無(wú)限制。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指代天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和d和l光學(xué)異構(gòu)體、氨基酸類似物和肽模擬物。天然存在氨基酸的單字母和三字母縮寫列于下文?！皒a因子”或“fxa”或“fxa蛋白”是在凝血途徑中的絲氨酸蛋白酶，其由非活性x因子(fx，seqidno.1，表1)產(chǎn)生。編碼人類x因子(“fx”)的核苷酸序列可以登錄號(hào)“nm_000504”發(fā)現(xiàn)于genbank中。在重鏈的前52個(gè)殘基催化裂解時(shí)，fx活化為fxa。fxa含有輕鏈和重鏈。所述輕鏈的前45個(gè)氨基酸殘基(seqidno.1的殘基1-45)被稱為gla結(jié)構(gòu)域，因?yàn)槠浜?1個(gè)翻譯后修飾的γ-羧基谷氨酸殘基(gla)。其還含有短的(6個(gè)氨基酸殘基)芳香族棧序列(seqidno.1的殘基40-45)。胰凝乳蛋白酶消化選擇性地去除1-44個(gè)殘基，產(chǎn)生無(wú)gla結(jié)構(gòu)域fxa。fxa的絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域位于c端重鏈處。fxa的重鏈與其它絲氨酸蛋白酶(如凝血酶、胰蛋白酶和活化蛋白c)高度同源?！霸鷉xa”或“野生型fxa”指代天然存在于血漿中或以其原始、未修飾形式分離的fxa，其具有活化凝血酶原的生物活性，因此促進(jìn)血塊形成。所述術(shù)語(yǔ)包括從組織樣品分離的天然存在多肽以及重組產(chǎn)生的fxa?！盎钚詅xa”指代具有活化凝血酶原的促凝血?jiǎng)┗钚缘膄xa。“活性fxa”可為保留促凝血?jiǎng)┗钚缘脑鷉xa或經(jīng)過(guò)修飾的fxa。如本文所用，“fxa衍生物”指代不與fxa競(jìng)爭(zhēng)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物并且具有減少的促凝血?jiǎng)┗虼呋钚曰虿痪哂兴龌钚裕⑶疫€結(jié)合和/或大體上中和如fxa抑制劑的抗凝血?jiǎng)┑慕?jīng)過(guò)修飾的fxa蛋白。在一些方面，fxa蛋白或fxa衍生物的“促凝血?jiǎng)┗钚浴贝敢吧突钚詅xa多肽攜帶的酶活性。fxa衍生物的實(shí)例提供于美國(guó)專利號(hào)8,153,590和pct公布wo2009/042962和wo2010/056765中，并且進(jìn)一步提供于本文中，如seqidno:2和3和其生物相等物。fxa多肽或其衍生物的“酶活性”指代所述多肽催化通過(guò)與底物直接相互作用而與所述底物進(jìn)行生物化學(xué)反應(yīng)的能力。seqidno:2相對(duì)于野生型fxa含有3種突變。第一種突變是fx的gla結(jié)構(gòu)域中6-39aa的缺失。第二種突變是用-rkr-置換活化肽序列143-194aa。這產(chǎn)生了連接輕鏈(seqidno:4)和重鏈(seqidno:5)的-rkrrkr-(seqidno:6)接頭。在分泌時(shí)，這種接頭裂解，從而產(chǎn)生兩鏈多肽seqidno:3(r-解毒劑)。第三種突變是活性位點(diǎn)殘基s379突變?yōu)閍la殘基。這種氨基酸取代分別對(duì)應(yīng)于seqidno:1和3的氨基酸296和290。術(shù)語(yǔ)“r-解毒劑”指代在所述接頭裂解后經(jīng)過(guò)加工的兩鏈多肽加工產(chǎn)物seqidno:2。其由seqidno:3表示。所述r-解毒劑公開于例如us8,153,590中，其內(nèi)容以引用的方式并入本公開中。所述r-解毒劑包括輕鏈(seqidno.4)和重鏈(seqidno.5)，用在所述輕鏈的半胱氨酸98(cys98)與所述重鏈的半胱氨酸108(cys108)之間的單個(gè)二硫鍵連接。如同野生型fxa，在某些生產(chǎn)批次中，所述r-解毒劑經(jīng)歷翻譯后修飾，導(dǎo)致某些氨基酸殘基的糖基化，例如所述輕鏈的ser56、ser72、ser76和thr82和所述重鏈的thr249，和在所述輕鏈的asp29處的經(jīng)過(guò)修飾的殘基(3r)-3-羥基asp。此外，除了鏈間二硫鍵以外，在所述輕鏈的半胱氨酸16與27、21與36、38與47、55與66、62與75、和77與90之間，并且在所述重鏈的半胱氨酸7與12、27與43、156與170、和181與209之間還可形成鏈內(nèi)二硫鍵。表1.非活性人類x因子的多肽序列(seqidno:1)表2.在去除-rkrrkr-(seqidno.6)接頭之前所述r-解毒劑的多肽序列(seqidno:2)表3.在去除-rkrrkr-(seqidno.6)接頭之后人類xa因子三倍突變體的多肽序列(seqidno:3)本公開還提供r-解毒劑的多種生物相等物(或其前體，由seqidno:2表示)，或替代地與seqidno:3具有某些序列同一性的多肽。一方面，所述生物相等物保留seqidno:3的結(jié)構(gòu)特征，即，經(jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)和缺失或經(jīng)過(guò)修飾的gla結(jié)構(gòu)域。另一方面，所述生物相等物保留seqidno:3的功能特征，即，不與fxa競(jìng)爭(zhēng)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物并且具有減少的促凝血?jiǎng)?例如，酶或催化)活性或不具有所述活性。術(shù)語(yǔ)“活性位點(diǎn)”指代酶或抗體中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的部分?！敖?jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)”是已經(jīng)在結(jié)構(gòu)上經(jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)以提供具有增加或降低的化學(xué)反應(yīng)性或特異性的活性位點(diǎn)?；钚晕稽c(diǎn)的實(shí)例包括但不限于人類x因子的催化結(jié)構(gòu)域(包含235-488個(gè)氨基酸殘基)，和人類xa因子的催化結(jié)構(gòu)域(包含195-448個(gè)氨基酸殘基)。經(jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)的實(shí)例包括但不限于人類xa因子的催化結(jié)構(gòu)域(包含seqidno:1中的195-448個(gè)氨基酸殘基)，在位置arg306、glu310、arg347、lys351、lys414或arg424處具有至少一個(gè)氨基酸取代?！敖M合物”意圖意指活性劑和另一惰性(例如，可檢測(cè)試劑或標(biāo)記)或活性化合物或組合物(如佐劑)的組合?！八幬锝M合物”意圖包括活性劑與惰性或活性載體的組合，從而產(chǎn)生適用于體外、體內(nèi)或離體診斷或治療用途的組合物。術(shù)語(yǔ)“凍干制劑”指代經(jīng)過(guò)冷凍干燥的包含所關(guān)注多肽的藥物制劑或組合物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“膨脹劑”指代向凍干制劑提供膨脹的成分。膨脹劑的實(shí)例包括而不限于甘露醇、海藻糖、乳糖、蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、葡萄糖、甘油、環(huán)糊精、葡聚糖、固體peg和其衍生物和混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的制劑任選地包括膨脹劑。如本文所用，“藥學(xué)上可接受的餅”指代在凍干后剩余的非崩塌固體藥物產(chǎn)物，其具有某些所需特征，例如藥學(xué)上可接受、長(zhǎng)期穩(wěn)定性、短復(fù)原時(shí)間、精致外觀和在復(fù)原時(shí)維持原始溶液的特征。藥學(xué)上可接受的餅可為固體、粉末或顆粒狀材料。藥學(xué)上可接受的餅也可含有以所述餅的重量計(jì)多達(dá)5％的水。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“凍干”或冷凍干燥指代過(guò)程，其中在產(chǎn)品經(jīng)過(guò)冷凍并且放置于真空下之后從所述產(chǎn)品去除水，從而使冰不通過(guò)液相直接地從固體改變?yōu)檎魵?。所述過(guò)程由三個(gè)獨(dú)立、獨(dú)特并且相互依賴的過(guò)程組成；冷凍、初始干燥(升華)和二次干燥(解吸附)。用于凍干本公開所用的多肽的方法描述于本文中并且為本領(lǐng)域中眾所周知的。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“緩沖液”表示藥學(xué)上可接受的賦形劑，其穩(wěn)定化藥物制劑的ph。合適緩沖液為本領(lǐng)域中眾所周知的并且可發(fā)現(xiàn)于文獻(xiàn)中。藥學(xué)上可接受的緩沖液包含但不限于tris緩沖液、精氨酸緩沖液、組氨酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、丁二酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液。與所用的緩沖液無(wú)關(guān)，ph可用本領(lǐng)域中已知的酸或堿調(diào)節(jié)，例如丁二酸、鹽酸、乙酸、磷酸、硫酸和檸檬酸、丁二酸鹽、檸檬酸鹽、tris堿、組氨酸、組氨酸hcl、氫氧化鈉和氫氧化鉀。合適緩沖液包括而不限于組氨酸緩沖液、2-嗎啉代乙烷磺酸(mes)、二甲胂酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丁二酸鹽和檸檬酸鹽。所述緩沖液的濃度可在約4mm與約60mm，或替代地約4mm至約40mm，或替代地約5mm至約25mm之間。“冷凍保護(hù)劑”為本領(lǐng)域中已知的并且包括而不限于例如蔗糖、海藻糖和甘油。一般使用在生物系統(tǒng)中展現(xiàn)低毒性的冷凍保護(hù)劑。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“張度劑”表示用于調(diào)節(jié)制劑的張度的藥學(xué)上可接受的試劑。等張性一般涉及相對(duì)于溶液，通常相對(duì)于人類血清的溶液的滲透壓。制劑可為張力減退的、等張的或張力亢進(jìn)的。一方面，所述制劑為等張的。等張制劑為液體或從固體形式(例如從凍干形式)復(fù)原的液體并且表示與一些其它與其進(jìn)行比較的溶液(如生理鹽溶液和血清)具有相同張度的溶液。合適等張劑包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、甘油和來(lái)自如本文所定義的氨基酸、糖的組的任何組分以及其組合。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”指代具有兩親結(jié)構(gòu)的藥學(xué)上可接受的有機(jī)物質(zhì)；即，其由具有相反溶解傾向的基團(tuán)構(gòu)成，一般為油溶性烴鏈和水溶性離子基團(tuán)。表面活性劑可視表面活性部分的電荷分類為陰離子性、陽(yáng)離子性和非離子性表面活性劑。表面活性劑通常用作用于多種藥物組合物和生物材料制劑的濕潤(rùn)劑、乳化劑、增溶劑和分散劑。在本文所述的藥物制劑的一些實(shí)施方案中，表面活性劑的量是描述為以重量/體積百分比表示的百分率(w/v％)。合適的藥學(xué)上可接受的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(tween)、聚氧乙烯烷基醚(brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，pluronic)或十二烷基硫酸鈉(sds)的組。聚氧乙烯山梨醇酐-脂肪酸酯包括聚山梨醇酯20(以商標(biāo)tween20tm出售)和聚山梨醇酯80(以商標(biāo)tween80tm出售)。聚乙烯-聚丙烯共聚物包括以名稱f68或泊洛沙姆188tm出售的那些。聚氧乙烯烷基醚包括以商標(biāo)brijtm出售的那些。烷基苯酚聚氧乙烯醚包括以商品名triton-x出售的那些?！皟龈杀Ｗo(hù)劑”指代在凍干(在高真空中快速冷凍并且干燥的過(guò)程)期間穩(wěn)定化蛋白的藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。凍干保護(hù)劑的實(shí)例包括而不限于蔗糖、海藻糖或甘露醇?！翱寡趸瘎敝复軌驕p慢或防止其它分子的氧化的分子。氧化是從物質(zhì)轉(zhuǎn)移電子至氧化劑的化學(xué)反應(yīng)。氧化反應(yīng)可產(chǎn)生自由基，所述自由基開始使蛋白治療劑不穩(wěn)定并且最終影響產(chǎn)物活性的鏈反應(yīng)?？寡趸瘎┩ㄟ^(guò)去除自由基中間物終止這些鏈反應(yīng)，并且通過(guò)氧化自身來(lái)抑制其它氧化反應(yīng)。因此，抗氧化劑通常為還原劑、螯合劑和氧清除劑，如檸檬酸鹽、edta、dpta、硫醇、抗壞血酸或多酚。抗氧化劑的非限制性實(shí)例包括抗壞血酸(aa，e300)、硫代硫酸鹽、甲硫氨酸、生育酚(e306)、沒(méi)食子酸丙酯(pg，e310)、叔丁基對(duì)苯二酚(tbhq)、丁基化羥基茴香醚(bha，e320)和丁基化羥基甲苯(bht，e321)?！胺栏瘎睘樘烊换蚝铣苫瘜W(xué)品，其添加至如食物、醫(yī)藥品、涂料、生物樣品、木材等產(chǎn)品中以防止因微生物生長(zhǎng)或因不期望的化學(xué)改變而降解。防腐劑添加劑可單獨(dú)或聯(lián)合其它防腐方法使用。防腐劑可為抗微生物防腐劑，其抑制細(xì)菌和真菌的生長(zhǎng)，或如氧清除劑的抗氧化劑，其抑制組分氧化。常見(jiàn)抗微生物防腐劑包括苯扎氯銨、苯甲酸、氯己啶(cholorohexidine)、甘油、苯酚、山梨酸鉀、硫柳汞、亞硫酸鹽(二氧化硫、亞硫酸氫鈉、亞硫酸氫鉀等)和edta二鈉。其它防腐劑包括常用于腸胃外蛋白的那些，如苯甲醇、苯酚、間甲酚、氯代丁醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“表面活性劑”意指降低兩種液體之間或液體與固體之間的表面張力(或界面張力)的化合物。表面活性劑可充當(dāng)洗滌劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑、起泡劑和分散劑。表面活性劑的實(shí)例包括聚山梨醇酯80、脂肪酸和磺酸烷酯；氯化芐乙氧銨，例如來(lái)自lonza,inc.(fairlawn,n.j.)的hyamine1622；聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，例如來(lái)自u(píng)niqema(wilmington,del)的tween系列；和天然表面活性劑，如?；悄懰徕c、1-棕櫚酰基-2-sn-甘油-3-磷酸膽堿、卵磷脂和其它磷脂。所述表面活性劑例如在產(chǎn)品的復(fù)原期間使凍干粒子的聚集減至最少。這些表面活性劑可占約0.001％至約5％w/v。ii.制劑如所提供，野生型fxa為兩鏈多肽。多種形式的fxa解毒劑也是如此，包括r-解毒劑(seqidno:3)，其包括輕鏈(seqidno.4)和重鏈(seqidno.5)，用在所述輕鏈的半胱氨酸98(cys98)與所述重鏈的半胱氨酸108(cys108)之間的單個(gè)二硫鍵連接。也如同野生型fxa，在細(xì)胞中表達(dá)的r-解毒劑經(jīng)歷翻譯后修飾，導(dǎo)致某些氨基酸殘基的糖基化，例如所述輕鏈的ser56、ser72、ser76和thr82和所述重鏈的thr249，和在所述輕鏈的asp29處的經(jīng)過(guò)修飾的殘基(3r)-3-羥基asp。此外，除了鏈間二硫鍵以外，在所述輕鏈的半胱氨酸16與27、21與36、38與47、55與66、62與75、和77與90之間，并且在所述重鏈的半胱氨酸7與12、27與43、156與170、和181與209之間還可形成一個(gè)或多個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵。已知所述fxa解毒劑的兩鏈結(jié)構(gòu)和多種翻譯后修飾，本文中顯示提供具有可接受的摩爾滲透壓濃度的穩(wěn)定并且可溶性溶液的穩(wěn)定凍干制劑的開發(fā)提供了巨大挑戰(zhàn)。使用所述r-解毒劑作為實(shí)例，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)示出需要高濃度的增溶劑來(lái)維持針對(duì)所述r-解毒劑的合理溶解度。具體說(shuō)來(lái)，實(shí)施例4中的溶解度研究示出檸檬酸鹽和精氨酸均顯著增加所述r-解毒劑的溶解度。此外，所述實(shí)施例示出當(dāng)精氨酸的濃度為95mm或至少10mm時(shí)，所述r-解毒劑可能保持可溶于溶液中。此外，在凍干過(guò)程期間，確定需要所述蛋白的溫度維持低于確定的崩塌溫度(約-40℃)以獲得可接受的凍干樣品(實(shí)施例6)。然而，維持所述低產(chǎn)品濃度在實(shí)踐中不可行。因此，數(shù)據(jù)證明需要結(jié)晶組分(例如，甘露醇)來(lái)充當(dāng)支架，所述支架可在冷凍干燥期間和之后維持非晶蛋白材料于適當(dāng)位置中。然而，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)高濃度精氨酸(例如，95mm)的存在防止了甘露醇的結(jié)晶(實(shí)施例7)。同時(shí)，甘露醇的存在增加了所述制劑中糖的總濃度，導(dǎo)致所述溶液的不可接受的摩爾滲透壓濃度(實(shí)施例7)。因此，開發(fā)用于所述r-解毒劑的合適凍干形成物關(guān)于作為增溶劑的精氨酸、作為結(jié)晶劑的甘露醇和作為穩(wěn)定劑的蔗糖的濃度具有相沖突的需求。所述需求是否可能獲得平衡以產(chǎn)生可接受的凍干形成物無(wú)論如何是不可預(yù)測(cè)的。然而，出乎意料地并且意外地，本發(fā)明人能夠得到平衡了蛋白溶解度、穩(wěn)定性、餅結(jié)構(gòu)和摩爾滲透壓濃度的溶液。更具體說(shuō)來(lái)，為了產(chǎn)生合適凍干形成物，實(shí)例r-解毒劑溶液包括約45mm精氨酸(10-55mm)、約2％蔗糖(1-3％)和約5％甘露醇(2-8％)。此外，所述溶液包括約10mmtris和0.01％-0.02％ps80連同所需量的r-解毒劑(例如，10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml或50mg/ml)，并且ph為約7.8。此外，盡管已知為用于治療蛋白的良好穩(wěn)定劑，檸檬酸鹽已經(jīng)示出具有抗凝血活性。參見(jiàn)例如wright等人,nephrology(carlton).2011年5月；16(4):396-402。因此，由于所述r-解毒劑意圖作為抗凝血?jiǎng)?fxa抑制劑)的解毒劑，檸檬酸鹽被認(rèn)為不適合與所述r-解毒劑一起使用。意外地，本文中發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽實(shí)際上不會(huì)體內(nèi)干擾所述r-解毒劑的活性。在適合用于凍干的溶液中，除了約2％蔗糖(1-3％)和約5％甘露醇(2-8％)以外，發(fā)現(xiàn)檸檬酸鹽的合適濃度為約10mm至約25mm。因此，當(dāng)所述溶液凍干時(shí)，其將形成干燥組合物，所述組合物包括在(0.5-1.4):(1-3):(2-8)范圍內(nèi)的l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇的重量比率。例如，如果在5mg/ml與50mg/ml之間的r-解毒劑用于所述溶液中，那么l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇:r-解毒劑的重量比率在(0.5-1.4):(1-3):(2-8):(0.5-5)范圍內(nèi)。相反地，當(dāng)所述凍干制劑溶解于水、生理鹽水或其它相似溶劑中時(shí)，其可提供具有約10-55mm精氨酸、約1-3％蔗糖和約2-8％甘露醇的溶液。同樣，當(dāng)使用檸檬酸鹽作為增溶劑的溶液凍干時(shí)，其將形成干燥組合物，所述組合物包括在(0.15-0.66):(1-3):(2-8)范圍內(nèi)的檸檬酸鹽:蔗糖:甘露醇的重量比率。例如，如果在5mg/ml與50mg/ml之間的r-解毒劑用于所述溶液中，那么l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇:r-解毒劑的重量比率在(0.15-0.66):(1-3):(2-8):(0.5-5)范圍內(nèi)。相反地，當(dāng)所述凍干制劑溶解于水、生理鹽水或其它相似溶劑中時(shí)，其可提供具有約8-35mm檸檬酸鹽、約1-3％蔗糖和約2-8％甘露醇的溶液。用所述r-解毒劑觀察到的結(jié)果可容易地外推至具有相似結(jié)構(gòu)的其它fxa解毒劑，包括r-解毒劑的生物相等物(或其前體，由seqidno:2表示)。一方面，所述生物相等物與seqidno:3具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。一方面，所述生物相等物包括兩條肽鏈，各鏈分別與seqidno:4或seqidno:5具有至少80％、85％、90％或95％序列同一性。一方面，所述生物相等物保留seqidno:3的結(jié)構(gòu)特征，即，經(jīng)過(guò)修飾的活性位點(diǎn)和缺失或經(jīng)過(guò)修飾的gla結(jié)構(gòu)域。另一方面，所述生物相等物保留seqidno:3的功能特征，即，不與fxa競(jìng)爭(zhēng)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物并且具有減少的促凝血?jiǎng)?例如，酶或催化)活性或不具有所述活性。另外，預(yù)期精氨酸可由另一增溶劑取代，甘露醇可由另一結(jié)晶劑取代，并且蔗糖可由另一穩(wěn)定劑取代，其中每一者的適當(dāng)實(shí)例可在本領(lǐng)域中獲得并且提供于本公開中。a.適用于凍干的多肽溶液在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供適用于凍干的水性制劑，所述制劑包括如此處所公開的fxa解毒劑或其生物相等物，連同增溶劑、穩(wěn)定劑(stabilizingagent)(或穩(wěn)定劑(stabilizer)和結(jié)晶劑。所述制劑可進(jìn)一步包括表面活性劑和/或緩沖液。在一些方面，這些試劑中的每一者的存在均防止fxa解毒劑在凍干期間崩塌，例如當(dāng)冷凍干燥溫度高于-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃或15℃，高達(dá)20℃或25℃時(shí)。本公開的一個(gè)實(shí)施方案提供可用于凍干的水性制劑。所述水性制劑包括fxa衍生物多肽，例如包含氨基酸序列seqidno.3或與seqidno.3具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的多肽。除了所述多肽以外，所述制劑進(jìn)一步包括增溶劑、穩(wěn)定劑和結(jié)晶組分。所述制劑在所需條件下不會(huì)在凍干期間崩塌。一方面，所需條件是在高于-40℃，或替代地高于-40℃、-30℃、-20℃、-10℃、0℃、5℃、10℃或15℃的溫度下冷凍干燥。另一方面，所需條件是在低于25℃，或替代地低于20℃、15℃、10℃或5℃的溫度下冷凍干燥。一方面，如與野生型fxa蛋白相比，所述fxa衍生物多肽具有g(shù)la結(jié)構(gòu)域的修飾和活性位點(diǎn)。一方面，所述fxa衍生物多肽保持fxa結(jié)合于fxa抑制劑的能力，但不會(huì)組裝成凝血酶原酶復(fù)合物。一方面，所述fxa衍生物多肽為具有氨基酸序列seqidno.3的兩鏈多肽，其包括輕鏈(seqidno.4)和重鏈(seqidno.5)，用在所述輕鏈的半胱氨酸98(cys98)與所述重鏈的半胱氨酸108(cys108)之間的單個(gè)二硫鍵連接。一方面，所述水性制劑包括至少5mg/ml的所述多肽。一方面，所述水性制劑包括至少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50mg/ml的所述多肽。在一些方面，結(jié)晶組分以適用于在冷凍干燥過(guò)程期間形成結(jié)晶基質(zhì)的濃度包括于所述制劑中。所述結(jié)晶基質(zhì)的制劑適用于防止崩塌，如實(shí)施例中所證明?！敖Y(jié)晶組分”指代在冷凍干燥過(guò)程期間在包括多肽的制劑中形成結(jié)晶基質(zhì)的分子。結(jié)晶組分的非限制性實(shí)例包括甘露醇和甘油。在一些方面，所述結(jié)晶組分為甘露醇(例如，結(jié)晶甘露醇)。一方面，所述水性制劑中所述結(jié)晶組分的濃度為至少1％(w/v)。一方面，所述水性制劑中所述結(jié)晶組分的濃度為至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％或4％(w/v)。一方面，所述水性制劑中所述結(jié)晶組分的濃度不高于8％，或替代地不高于7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％或4％(w/v)。一方面，所述水性制劑中所述結(jié)晶組分的濃度為約1％至約8％、或約2％至約6％、或約3％至約5.5％、或約4.5％至約5.5％、或約4.6％至約5.4％、或約4.7％至約5.3％、或約4.8％至約5.2％、或約4.9％至約5.1％、或約4％、4.5％或5％(w/v)。在一些方面，增溶劑包括于所述水性制劑中。術(shù)語(yǔ)“增溶劑”指代鹽、離子、碳水化合物、絡(luò)合劑、聚合物和其它化合物，其在存在于溶液中時(shí)增加所述溶液中另一分子(例如，活性成分)的溶解度。增溶劑的非限制性實(shí)例包括精氨酸和檸檬酸鹽。一方面，所述增溶劑為精氨酸。一方面，所述增溶劑為檸檬酸鹽。本文中證明所述增溶劑的存在適用于使所述fxa多肽保持在所述制劑中可溶并且穩(wěn)定。在一些方面，所述增溶劑(例如，精氨酸)的濃度為至少10mm，或替代地至少20mm、25mm、30mm、36mm或40mm。在一些方面，所述增溶劑(例如，精氨酸)的濃度不高于100mm、96mm、90mm、80mm、70mm、60mm或50mm。在一些方面，所述增溶劑的濃度為約10mm或20mm至約60mm、約10mm或20mm至約55mm、約35mm至約55mm、約40mm至約50mm、約41mm至約49mm、約42mm至約48mm、約43mm至約47mm、約44mm至約46mm、或約40mm、45mm或50mm。應(yīng)注意如本文所用，術(shù)語(yǔ)精氨酸指代所述氨基酸或其鹽(例如，精氨酸hcl)。精氨酸具有約174.2道爾頓的分子量并且精氨酸hcl(例如，l-精氨酸hcl)具有約210.7道爾頓的分子量。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述增溶劑為檸檬酸鹽或其鹽。所述檸檬酸鹽的鹽為檸檬酸鈉。一方面，所述檸檬酸鹽包含約1.0mm至約200.0mm的濃度。另一方面，所述檸檬酸鹽的濃度為約25mm。另一方面，所述檸檬酸鹽的濃度為約50mm。在另一實(shí)施方案中，所述檸檬酸鹽的濃度為約5mm、10mm或20mm。在另一實(shí)施方案中，所述檸檬酸鹽包含約0.05m至約0.2m的濃度。在一些方面，穩(wěn)定劑包括于所述水性制劑中。術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定劑”表示藥學(xué)上可接受的賦形劑，其保護(hù)活性成分(例如，fxa衍生物多肽)和/或所述制劑在制造、存儲(chǔ)和應(yīng)用期間免于化學(xué)和/或物理降解。穩(wěn)定劑的實(shí)例可包括蔗糖、精氨酸、檸檬酸鹽、甘露醇、海藻糖、甘油、氯化鈉、葡聚糖和葡萄糖。一方面，所述穩(wěn)定劑為蔗糖。一方面，所述水性制劑中所述穩(wěn)定劑(例如，蔗糖)的濃度為至少約0.5％(w/v)。一方面，所述水性制劑中所述穩(wěn)定劑(例如，蔗糖)的濃度為至少約0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％(w/v)。一方面，所述水性制劑中所述穩(wěn)定劑(例如，蔗糖)的濃度不大于約5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％或2％(w/v)。一方面，所述水性制劑中所述穩(wěn)定劑(例如，蔗糖)的濃度為約1％至約5％、或約1％至約4％、或約1％至約3％、或約1.5％至約2.5％、或約1.6％至約2.4％、或約1.7％至約2.3％、或約1.7％至約2.2％、或約1.9％至約2.1％、或約1％、1.5％、2％、2.5％或3％(w/v)。在一些方面，所述水性制劑可進(jìn)一步包括表面活性劑、緩沖液、等張劑、冷凍保護(hù)劑、表面活性劑、凍干保護(hù)劑、防腐劑或其組合。在一些方面，所述水性制劑的ph為6或更高、或6.5或更高、或7或更高、或7.5或更高。在一些方面，所述ph不高于9、8.5或8。在一些方面，所述ph在6與9之間，在6.5與8.5之間，在7與8.5之間，在7.5與8.2之間，在7.6與8.1之間，在7.7與7.9之間，或?yàn)榧s7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8。一方面，所述水性制劑包括約45mm精氨酸、約2％蔗糖(w/v)、約5％甘露醇(w/v)和約10mg/ml的兩鏈r-解毒劑，其中所述制劑的ph為約7.8。一方面，所述水性制劑包括約45mm精氨酸、約2％蔗糖(w/v)、約5％甘露醇(w/v)和約20mg/ml的兩鏈r-解毒劑，其中所述制劑的ph為約7.8。一方面，所述水性制劑包括約45mm精氨酸、約2％蔗糖(w/v)、約5％甘露醇(w/v)和約40mg/ml的兩鏈r-解毒劑，其中所述制劑的ph為約7.8。一方面，所述水性制劑進(jìn)一步包括0.01％-0.02％(w/v)聚山梨醇酯80和緩沖液。b.凍干和凍干組合物在一些實(shí)施方案中還提供凍干本公開的水性制劑的方法。一方面，本公開提供如表8.2中所示例的保守凍干循環(huán)，其包括冷凍步驟、等溫步驟、退火步驟、初始干燥步驟和二次干燥步驟。另一方面，所述凍干循環(huán)包括如表6中所述的步驟。進(jìn)一步注意，一旦鑒別出適用于凍干的水溶液，凍干所述溶液的方法即可相應(yīng)地由本領(lǐng)域中已知的方法得到。一方面，在-40℃或更高的溫度下進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)或所有干燥步驟。一方面，所述干燥步驟是在-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃或0℃或更高，但不高于10℃、15℃、20℃或25℃的溫度下進(jìn)行。在一些方面，還提供通過(guò)凍干本公開的水性制劑制備的凍干組合物。基于所述水性制劑中各試劑的濃度，可容易地確定凍干組合物中所述試劑的相對(duì)含量。一方面，所述凍干組合物包括至少5％，或替代地至少10％、15％、20％、25％、30％或35％(w/w)的所述fxa衍生物多肽。此時(shí)，在其它主要成分中，例如，可有重量比率在(0.5-1.4):(1-3):(2-6)范圍內(nèi)的l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇。在一些方面，l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇的重量比率在(0.9-1):(1.5-2.5):(4.5-5.5)、或(0.91-0.99):(1.6-2.4):(4.6-5.4)、或(0.92-0.98):(1.7-2.3):(4.7-5.3)、(0.93-0.97):(1.8-2.2):(4.8-5.2)、或(0.94-0.96):(1.9-2.1):(4.9-5.1)范圍內(nèi)。在一些方面，所述凍干組合物進(jìn)一步包括表面活性劑和/或緩沖液的固體部分。另外，在一些方面，提供通過(guò)將本公開的凍干組合物溶解于溶劑中制備的溶液。在一些方面，溶劑為水或生理鹽水。一方面，溶劑為水。一方面，所述溶液包括至少5mg/ml或替代地至少10mg/ml的靶標(biāo)多肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供包含至少10％(w/w)的r-解毒劑和重量比率為約0.95:2:5的l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇的凍干組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供包含至少20％(w/w)的r-解毒劑和重量比率為約0.95:2:5的l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇的凍干組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開提供包含至少40％(w/w)的r-解毒劑和重量比率為約0.95:2:5的l-精氨酸hcl:蔗糖:甘露醇的凍干組合物。iii.使用所述制劑的方法本公開還涉及治療、預(yù)防或減少經(jīng)歷使用fxa抑制劑的抗凝血?jiǎng)┋煼ǖ氖茉囌叩某鲅闹委煼椒?，其包括向受試者施用有效量的溶解于合適溶劑中的凍干制劑。預(yù)期本公開的解毒劑或衍生物可為欲用于選擇性或緊急情形中的短持續(xù)時(shí)間藥物，其可安全地并且特異性地中和fxa抑制劑的常規(guī)抗凝血?jiǎng)┨匦远灰鹩泻Φ难簞?dòng)力學(xué)副作用或?qū)p傷的增生性血管反應(yīng)的惡化。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“治療(treating)”、“治療(treatment)”等在本文中用于意指獲得所需的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效應(yīng)。所述效應(yīng)就完全地或部分地預(yù)防病癥或其病征或癥狀來(lái)說(shuō)可為預(yù)防性的，和/或就病癥和/或可歸因于所述病癥的不良效應(yīng)的部分或完全治愈來(lái)說(shuō)可為治療性的?！爸委煛边€涵蓋哺乳動(dòng)物中病癥的任何治療，并且包括：(a)預(yù)防可易感染病癥但可能尚未診斷出患有所述病癥的受試者中出現(xiàn)病癥，例如預(yù)防具有抗凝血?jiǎng)┻^(guò)量用藥的患者中的出血；(b)抑制病癥，即阻止其發(fā)展，例如抑制出血；或(c)減輕或改善所述病癥，例如減少出血。如本文所用，“治療”進(jìn)一步包括與病理學(xué)相關(guān)的癥狀的全身性改善和/或癥狀發(fā)作的延遲?！爸委煛钡呐R床和亞臨床跡象將隨著病理學(xué)、個(gè)體和治療而變化。“施用”可以一個(gè)劑量在治療過(guò)程中連續(xù)地或間歇地實(shí)現(xiàn)。確定施用的最有效方式和劑量的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的并且將隨著用于療法的組合物、療法的目的、所治療的靶標(biāo)細(xì)胞和所治療的受試者而變化。單一或多次施用可以治療醫(yī)師所選擇的劑量水平和模式進(jìn)行。合適劑量制劑和施用所述試劑的方法為本領(lǐng)域中已知的。診斷或治療的“受試者”為細(xì)胞或哺乳動(dòng)物，包括人類。診斷或治療的非人類動(dòng)物受試者包括例如鼠科動(dòng)物(如大鼠、小鼠)、犬科動(dòng)物(如狗)、兔科動(dòng)物(如兔)、家畜、運(yùn)動(dòng)動(dòng)物和寵物。本公開的試劑和組合物可用于制造藥劑并且通過(guò)根據(jù)常規(guī)程序施用而用于治療人類和其它動(dòng)物，如藥物組合物中的活性成分。本公開的試劑可通過(guò)任何合適途徑，具體說(shuō)來(lái)通過(guò)腸胃外(包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮內(nèi))施用而施用于療法。還應(yīng)了解，優(yōu)選途徑將隨著接受者的狀態(tài)和年齡和所治療的疾病而變化。短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的聚合物”指代可結(jié)合于一種或多種此處所述的多肽的化合物的組。預(yù)期聚合物與所述多肽的結(jié)合能夠體內(nèi)和體外延長(zhǎng)所述多肽的半衰期。非限制性實(shí)例包括聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、纖維素衍生物、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、糖、多元醇和其混合物。“抗凝血?jiǎng)?anticoagulantagent/anticoagulant)”是抑制血塊形成的試劑。抗凝血?jiǎng)┑膶?shí)例包括但不限于凝血酶的特定抑制劑、ixa因子、xa因子、xia因子、xiia因子或viia因子、肝素和衍生物、維生素k拮抗劑和抗組織因子抗體。凝血酶的特定抑制劑的實(shí)例包括水蛭素、比伐盧定阿加曲班和來(lái)匹盧定肝素和衍生物的實(shí)例包括未分級(jí)肝素(ufh)、低分子量肝素(lmwh)，如依諾肝素達(dá)肝素和達(dá)那肝素和合成戊糖，如磺達(dá)肝素維生素k拮抗劑的實(shí)例包括華法林苯香豆素、醋硝香豆素氯茚二酮、雙香豆素、二苯茚酮、雙香豆乙酸乙酯(ethylbiscoumacetate)、苯丙香豆素、苯茚二酮和噻氯香豆素(tioclomarol)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗凝血?jiǎng)閤a因子的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗凝血?jiǎng)樨惽靼??！翱鼓獎(jiǎng)┋煼ā敝复┯糜诨颊咭灶A(yù)防不期望的血塊或血栓形成的治療方案?？鼓?jiǎng)┋煼ò谒龌颊咧幸赃m用于治療或預(yù)防不期望的血塊或血栓形成的劑量和方案施用一種、或兩種或更多種抗凝血?jiǎng)┗蚱渌噭┑慕M合。術(shù)語(yǔ)“xa因子抑制劑”或“xa因子的抑制劑”指代可體外和/或體內(nèi)直接地或間接地抑制凝血因子xa催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶的活性的化合物?！爸苯觴a因子抑制劑”直接地結(jié)合于fxa并且非限制性實(shí)例包括nap-5、rnapc2、組織因子途徑抑制劑(tfpi)、dx-dx-9065a(如例如herbert,j.m.等人,jpharmacolexpther.1996276(3):1030-8中所述)、ym-60828(如例如taniuchi,y.等人,thrombhaemost.199879(3):543-8中所述)、ym-150(如例如eriksson,b.i.等人,blood2005；106(11),摘要1865中所述)、阿哌沙班、利伐沙班、tak-442、pd-348292(如例如pipelineinsight:antithrombotics-reachingtheuntreatedprophylaxismarket,2007中所述)、奧米沙班、依杜沙班(如例如hylekem,curropininvestdrugs20078(9):778-783中所述)、ly517717(如例如agnelli,g.等人,j.thromb.haemost.20075(4):746-53中所述)、gsk913893、雷扎沙班、貝曲西班或其藥學(xué)上可接受的鹽和其組合。在一個(gè)特定方面，所述直接xa因子抑制劑為利伐沙班。在一些方面，直接fxa抑制劑為小分支化合物。fxa活性的“間接xa因子抑制劑”抑制由一種或多種其它因子介導(dǎo)。間接xa因子抑制劑的非限制性實(shí)例包括磺達(dá)肝素、依達(dá)肝素、生物素標(biāo)記的依達(dá)肝素、依諾肝素、法安明、亭扎肝素、低分子量肝素(“l(fā)mwh”)和其組合。在一個(gè)特定方面，所述間接xa因子抑制劑為依諾肝素。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述xa因子抑制劑是選自貝曲西班、利伐沙班、lmwh、dx-9065a、ym-60828、ym-150、pd-348292、奧米沙班、依杜沙班、ly517717、gsk913893、雷扎沙班、阿哌沙班和其組合。術(shù)語(yǔ)“貝曲西班”指代化合物“[2-({4-[(二甲基氨基)亞氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-n-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺”或其藥學(xué)上可接受的鹽?！癧2-({4-[(二甲基氨基)亞氨基甲基]苯基}羰基氨基)-5-甲氧基苯基]-n-(5-氯(2-吡啶基))甲酰胺”指代具有以下結(jié)構(gòu)的化合物：或其互變異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽。貝曲西班描述于美國(guó)專利號(hào)6,376,515和6,835,739和2006年11月7日提交的美國(guó)專利申請(qǐng)公布號(hào)2007/0112039中，其內(nèi)容以引用的方式并入本文中。已知貝曲西班為xa因子的特定抑制劑?！爸泻汀薄ⅰ澳孓D(zhuǎn)”或“抵消”fxa抑制劑的活性或相似短語(yǔ)指代抑制或阻斷fxa抑制劑的xa因子抑制或抗凝血?jiǎng)┕δ?。這些短語(yǔ)指代體外和/或體內(nèi)部分抑制或阻斷所述功能，以及抑制或阻斷大部分或所有fxa抑制劑活性?！坝行Я俊敝复阋哉T導(dǎo)所需生物和/或治療結(jié)果的衍生物的量。所述結(jié)果可為疾病的病征、癥狀或原因的減輕，或生物系統(tǒng)的任何其它所需改變。在本公開中，所述結(jié)果一般將涉及以下一者或多者：已經(jīng)施用于患者的fxa抑制劑的中和、所述fxa抑制劑的抗凝血?jiǎng)┗钚缘哪孓D(zhuǎn)、所述fxa抑制劑從血漿去除、止血的恢復(fù)和出血的減少或停止。有效量將視所用的特定解毒劑、已經(jīng)施用于受試者的特定fxa抑制劑、所述fxa抑制劑的給藥方案、所述解毒劑的施用時(shí)間安排、所治療的受試者和疾病狀態(tài)、所述受試者的重量和年齡、所述疾病狀態(tài)的嚴(yán)重程度、施用方式等變化，其均可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。在某些方面，施用所述溶液以遞送約10毫克(mg)至約2克(g)的量的所述fxa衍生物(例如，r-解毒劑)。所用的r-解毒劑的其它量包括約100mg至約1.5g；約200mg至約1g；和約400mg至約900mg。在一些方面，所用的r-解毒劑的量為約400mg或960mg。在一些方面，所用的r-解毒劑的量為約10mg至約100mg；約15mg至約95mg；和約20mg至約80mg。在另一實(shí)施方案中，所述溶液以中和量施用持續(xù)至少約30分鐘的時(shí)期，所述中和量為r-解毒劑的循環(huán)濃度與所述xa因子抑制劑的循環(huán)濃度的至少約1:1摩爾比率。在其它實(shí)施方案中，所述摩爾比率為約1:1或約2:1或約4:1。所述制劑在施用時(shí)中和所述xa因子抑制劑達(dá)至少約20％，或至少約50％，或至少約75％，或至少約90％，或至少約95％?？赏ㄟ^(guò)多種體外分析確定所述方法(即，xa因子抑制劑的抑制或逆轉(zhuǎn))是否實(shí)現(xiàn)，如凝血酶產(chǎn)生分析和臨床凝血分析(如aptt、pt和act)。本公開的一方面涉及在經(jīng)歷使用fxa抑制劑的抗凝血?jiǎng)┋煼ǖ氖茉囌咧羞x擇性地結(jié)合和抑制外源施用的fxa抑制劑的方法，其包括向所述受試者施用有效量的所述凍干制劑的溶液。適用于這種療法的患者已經(jīng)經(jīng)歷先前抗凝血?jiǎng)┋煼ǎ?，其已?jīng)施用一種或多種抗凝血?jiǎng)?，如fxa的直接或間接抑制劑。在一些實(shí)施方案中，所述溶液在過(guò)量用藥的fxa抑制劑施用后或在手術(shù)前施用，所述手術(shù)可使受試者暴露于出血風(fēng)險(xiǎn)。所述受試者可為細(xì)胞或哺乳動(dòng)物，如人類。另一方面，本文所提供的方法在經(jīng)歷使用xa因子抑制劑的抗凝血?jiǎng)┋煼ǖ氖茉囌咧羞x擇性地結(jié)合和抑制外源施用的xa因子抑制劑，其包括向所述受試者施用所述凍干制劑的溶液。所述受試者可為細(xì)胞或哺乳動(dòng)物，如人類。將受益于溶解的本文所述的凍干制劑的施用和隨附方法的受試者包括正在經(jīng)歷或易感染臨床嚴(yán)重出血事件或臨床上顯著的非嚴(yán)重出血事件的那些。臨床嚴(yán)重出血事件的實(shí)例是選自由出血、出血至生命器官中、需要再手術(shù)或新治療程序的出血和具有相關(guān)的明顯出血的≥2.0的出血指數(shù)組成的組。(turpieagg等人,nejm,2001,344:619-625。)另外，所述受試者可正在經(jīng)歷或易感染非嚴(yán)重出血事件，所述非嚴(yán)重出血事件選自由以下組成的組：持續(xù)或復(fù)發(fā)并且大量或無(wú)介入的情況下將不停止的鼻出血，不會(huì)上升至需要治療程序的程度的直腸或尿道出血，在注射位點(diǎn)處或別處自發(fā)或伴隨輕微創(chuàng)傷出現(xiàn)的實(shí)質(zhì)血腫，與不需要引流的手術(shù)程序相關(guān)的超出一般的實(shí)質(zhì)失血，和需要意外輸血的出血。在一些實(shí)施方案中，溶解的凍干制劑在過(guò)量用藥的fxa抑制劑施用后或在手術(shù)前施用，所述手術(shù)可使受試者暴露于出血風(fēng)險(xiǎn)。在任何本文所述的方法中，應(yīng)了解即使并非始終明確地陳述，有效量的溶解的凍干制劑施用于所述受試者。所述量可由治療醫(yī)師憑經(jīng)驗(yàn)確定并且將隨著受試者的年齡、性別、重量和健康狀態(tài)變化。治療醫(yī)師將考慮的額外因素包括但不限于可能已經(jīng)施用的xa因子抑制劑的身份和/或量、所述凍干制劑將施用于所述受試者的方法或模式和所述患者的治療終點(diǎn)。考慮到這些變量，本領(lǐng)域技術(shù)人員將施用治療有效量至欲治療的受試者。實(shí)施例本公開進(jìn)一步通過(guò)參考以下實(shí)施例來(lái)理解，所述實(shí)施例意圖僅示例本公開。本公開的范圍不受所示例的實(shí)施方案限制，所述實(shí)施方案意圖僅說(shuō)明本公開的單一方面。在功能上相等的任何方法均在本公開的范圍內(nèi)。除本文所描述的那些修飾外，本領(lǐng)域技術(shù)人員由前述描述和附圖還將顯而易知本公開的多種修飾。所述修飾屬于隨附權(quán)利要求書的范圍。除非另外陳述，否則所有溫度均以攝氏度計(jì)。另外，在這些實(shí)施例中和別處，縮寫具有以下含義：hr＝小時(shí)inr＝國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比率iv＝靜脈內(nèi)kg＝千克m＝摩爾mg＝毫克mg/kg＝毫克/千克mg/ml＝毫克/毫升min＝分鐘ml＝毫升ppp＝貧血小板血漿prp＝富血小板血漿pt＝凝血酶原時(shí)間u/ml＝單位/毫升μl或ul＝微升μm＝微摩爾實(shí)施例1.制備r-解毒劑具有離子強(qiáng)度0.15(用nacl調(diào)節(jié))的檸檬酸鹽-磷酸鹽(20mm)緩沖液使用檸檬酸單水合物(fisher,pittsburgh,pa)和無(wú)水磷酸二鈉(sigma,st.louis,mo)制備并且ph使用6mhcl或6mnaoh進(jìn)行調(diào)節(jié)。無(wú)額外鹽的磷酸鹽(20mm)緩沖液通過(guò)將6.61g無(wú)水磷酸二鈉溶解于2.0lmili-q水中來(lái)制備并且ph調(diào)節(jié)至7.5。關(guān)于含有鹽(i＝0.15m)的磷酸鹽(20mm)緩沖液，14.8gnacl添加至上述磷酸鹽緩沖液中。除非另外注明，否則所有其它試劑均購(gòu)自sigma(st.louis,mo)。所述r-解毒劑(seqidno.3)的多肽以大約5mg/ml的濃度存儲(chǔ)于含有2％精氨酸的10mmtris(ph8.0)中的儲(chǔ)備溶液中。所述r-解毒劑的透析在4℃下使用透析盒3000mwco(pierce,rockford,il)針對(duì)具有所選ph值的檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液執(zhí)行。為了防止透析期間的聚集，所述儲(chǔ)備蛋白溶液在裝載至盒中之前用經(jīng)過(guò)過(guò)濾的透析緩沖液稀釋至0.5mg/ml。在透析后，所述r-解毒劑稀釋至0.3mg/ml并且蛋白濃度用uv吸光光譜法(a280)使用1.16ml·mg-1·cm-1的消光系數(shù)測(cè)量。通過(guò)這種方法產(chǎn)生的r-解毒劑用于以下實(shí)施例中。實(shí)施例2.針對(duì)穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)的差示掃描量熱法(dsc)使用microcalcapillary自動(dòng)dsc用溫度控制樣品裝載室執(zhí)行差示掃描量熱法(dsc)。以60℃/h的掃描速率和25分鐘預(yù)掃描平衡時(shí)期從6-100℃執(zhí)行熱勻變。適當(dāng)匹配緩沖液用于參考池，而匹配緩沖液中的典型樣品濃度為約0.6mg/ml。從所有樣品掃描中減去緩沖液對(duì)緩沖液參考物掃描并且熱解曲線在分析之前進(jìn)行濃度標(biāo)準(zhǔn)化。使用由microcal供應(yīng)的軟件處理數(shù)據(jù)。吸熱峰使用非雙態(tài)擬合函數(shù)擬合至單一峰，并且通過(guò)所述擬合函數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)變溫度(tm)值。開始溫度(t開始)值通過(guò)從低溫基線推導(dǎo)吸熱峰來(lái)確定。dls通常用于示出異源樣品中多個(gè)群體的存在。使用wyatt板式讀取器dls儀器，在20℃下在單組實(shí)驗(yàn)中測(cè)量在不同ph條件下的10-20μl蛋白溶液(0.3mg/ml)。所述樣品在3000rpm下離心持續(xù)5min以去除任何氣泡，并且獲得各20秒的5次掃描以產(chǎn)生平均樣品半徑。在ph5.0-7.5下，觀察到流體動(dòng)力學(xué)半徑為約3nm的單個(gè)群體。實(shí)施例3.鑒別穩(wěn)定劑來(lái)自實(shí)施例2的數(shù)據(jù)證明所述r-解毒劑在ph7.5下大體穩(wěn)定。因此，在ph7.5下在20mm磷酸鹽緩沖液中執(zhí)行賦形劑篩選研究。使用dynapro動(dòng)態(tài)光散射板式讀取器儀器(wyatttechnology,santabarbara,ca)測(cè)量所述蛋白的流體動(dòng)力學(xué)直徑。所述流體動(dòng)力學(xué)直徑通過(guò)stokes-einstein方程使用累積量方法(基于對(duì)數(shù)正態(tài)數(shù))由擴(kuò)散系數(shù)計(jì)算。所述測(cè)量用于評(píng)估所供應(yīng)的樣品的均質(zhì)性。首先使用spectramaxm3板式讀取器通過(guò)在60℃、ph7.5下用0.3mg/ml的蛋白在賦形劑存在或不存在下監(jiān)測(cè)蛋白聚集動(dòng)力學(xué)來(lái)鑒別潛在穩(wěn)定化賦形劑。來(lái)自公認(rèn)安全(gras)的賦形劑的文庫(kù)的32種賦形劑全部如表4.1中所列進(jìn)行測(cè)試。表4.1賦形劑列表和通過(guò)od350nm動(dòng)力學(xué)研究測(cè)試的濃度已確定在所測(cè)試的賦形劑中，蔗糖、山梨醇和檸檬酸鹽具有最大穩(wěn)定化效應(yīng)。賦形劑組合對(duì)蛋白穩(wěn)定性的影響的后續(xù)測(cè)試是基于如表4.2中所概述的這三種賦形劑。一式兩份運(yùn)行od350nm熔融并且如上文所述計(jì)算針對(duì)各制劑的δt值。基于表2中示出的δt值，鑒別出制劑3、4、5和6具有最大穩(wěn)定化效應(yīng)。表4.2所測(cè)試的賦形劑組合的列表和相應(yīng)的δt值和溶液摩爾滲透壓濃度。所述δt是在ph7.5下單獨(dú)蛋白與具有賦形劑的不同組合的蛋白的轉(zhuǎn)變溫度之間的差異。摩爾滲透壓濃度由一式三份測(cè)量求平均值并且δt由一式兩份測(cè)量求平均值。這些制劑中的治療蛋白的聚集特性進(jìn)一步在這些組合制劑中使用od350nm熔融方法在不具有nacl的20mm磷酸鹽緩沖液中在ph7.5下進(jìn)行研究。一般說(shuō)來(lái)，在不具有nacl的情況下聚集程度低得多。實(shí)際上，od350nm熔融最初從35-75℃運(yùn)行，并且由于未觀察到明顯聚集，所述熔融實(shí)驗(yàn)用相同樣品從75至100℃再運(yùn)行。因此，在75℃下在od350nm曲線中可觀察到斷裂，因?yàn)樵谶@一溫度下停留約10min。即使在勻變直至100℃之后，在制劑3、4、5和6中也未觀察到蛋白的明顯聚集。去除額外nacl的另一益處是與具有nacl的那些制劑相比，所述制劑的相應(yīng)摩爾滲透壓濃度低得多。實(shí)施例4.溶解度測(cè)試這一實(shí)施例測(cè)試了ph、溫度、穩(wěn)定劑(例如，檸檬酸鹽、精氨酸、甘氨酸和賴氨酸)和離子強(qiáng)度對(duì)所述r-解毒劑的溶解度的影響。材料和方法所用的材料是r-解毒劑(4.8mg/ml)于10mmtrisph8.0和2％精氨酸中的溶液。關(guān)于室溫(rt)下的溶解度，通過(guò)物理觀察持續(xù)至少1-2h來(lái)進(jìn)行測(cè)試。關(guān)于5℃下的溶解度，樣品在5℃下平衡過(guò)夜并且對(duì)所述樣品進(jìn)行物理觀察。另外，所述樣品在5℃下離心持續(xù)15min并且通過(guò)uva280nm分析上清液中的蛋白濃度(一式兩份稀釋)。作為對(duì)照，每日分析初始儲(chǔ)備溶液。當(dāng)觀察到蛋白沉淀時(shí)，由上清液濃度確定的溶解度被解釋為<xxmg/ml(相應(yīng)圖中的陰影條)。這是由于過(guò)量蛋白存在和具有接近緩沖液ph的pi的蛋白子群體的優(yōu)先沉淀。當(dāng)未觀察到蛋白沉淀時(shí)，由溶液濃度確定的溶解度被解釋為>xxmg/ml(圖中的空心條)。室溫下ph對(duì)溶解度的影響用不同ph(包括5.0、6.0、7.0和8.0)進(jìn)行測(cè)試。如圖1a中所示，所述r-解毒劑在ph8.0下具有最高溶解度(42.2mg/ml，無(wú)可見(jiàn)沉淀)。相比之下，溶解度在ph5.0、6.0和7.0下分別為3.5mg/ml(無(wú)沉淀)、12.3mg/ml(觀察到沉淀)和24.4mg/ml(觀察到沉淀)。表5.1列出在5℃下針對(duì)溶解度進(jìn)行測(cè)試的樣品。如所示，uf緩沖液由42mmmes、4mm磷酸鈉、833mmnacl、8mmtris和濃縮至約5mg/ml的58mm精氨酸構(gòu)成。表5.1在不同ph下用不同增溶劑(檸檬酸鹽或精氨酸)測(cè)試r-解毒劑溶解度的樣品在ph7.3下，10mm檸檬酸鹽略微改進(jìn)解毒劑5℃溶解度。無(wú)檸檬酸鹽或精氨酸的情況下，5℃溶解度具有以下等級(jí)次序：ph7.55>ph7.80>ph7.30(圖1b)。所述uf緩沖液(ph7.48)看來(lái)具有最佳溶解度(50mg/ml)，這可能由于在合適ph7.5下58mm精氨酸+833mmnacl的存在(圖1b)。表5.2列出用于測(cè)試在ph7.55下精氨酸對(duì)檸檬酸鹽的效應(yīng)的樣品。如圖1c中所示，在ph7.55下，檸檬酸鹽和精氨酸均顯著改進(jìn)r-解毒劑5℃溶解度。此外，看來(lái)在相同摩爾濃度下檸檬酸鹽比精氨酸更有效：–10mm檸檬酸鹽～50mm精氨酸>20mm精氨酸>10mm精氨酸。表5.2在ph7.55下在檸檬酸鹽和精氨酸中測(cè)試r-解毒劑溶解度的樣品精氨酸對(duì)檸檬酸鹽的效應(yīng)進(jìn)一步在ph7.8和8.0下使用表5.3中的樣品進(jìn)行測(cè)試。圖1d示出所述r-解毒劑在5℃下在ph8.0下比在ph7.8下略微更可溶。10mm檸檬酸鹽和20mm精氨酸在ph7.8和8.0下均改進(jìn)溶解度至至少15mg/ml。表5.3在ph7.8和8下在檸檬酸鹽和精氨酸中測(cè)試r-解毒劑溶解度的樣品精氨酸的效應(yīng)還在ph7.8下與甘氨酸和賴氨酸進(jìn)行比較(表5.4)并且結(jié)果在圖1e中示出。如圖中所示，甘氨酸和賴氨酸在5℃下對(duì)r-解毒劑溶解度不具有影響并且在5℃下在ph8.0對(duì)ph7.55下關(guān)于20mm精氨酸觀察到更強(qiáng)增溶效應(yīng)。表5.4在ph7.8下在甘氨酸、賴氨酸和精氨酸中測(cè)試r-解毒劑溶解度的樣品還測(cè)試離子強(qiáng)度對(duì)r-解毒劑的溶解度的影響(表5.5)。如圖1f中示出，在5℃下在精氨酸或檸檬酸鹽不存在下離子強(qiáng)度增加r-解毒劑溶解度，并且所述效應(yīng)看來(lái)在>0.10m的離子強(qiáng)度下突出。表5.5在ph7.8下在不同離子強(qiáng)度下測(cè)試r-解毒劑溶解度的樣品總之，這一實(shí)例證明在室溫下在如精氨酸和檸檬酸鹽的增溶劑不存在下，所述r-解毒劑在ph8.0下具有最高溶解度。在5℃下，ph8.0對(duì)于所述r-解毒劑最佳。此外，檸檬酸鹽和精氨酸均顯著改進(jìn)所述r-解毒劑的5℃溶解度。然而，甘氨酸和賴氨酸(其均增加針對(duì)所述r-解毒劑的tm)對(duì)溶解度無(wú)影響?？偟恼f(shuō)來(lái)，在5℃下所述r-解毒劑的最高溶解度是在ph7.8下用95mm精氨酸實(shí)現(xiàn)。10天后未觀察到沉淀。實(shí)施例5.初始凍干工藝所述凍干工藝是使用合理方法基于對(duì)凍干循環(huán)的不同階段中制劑組分的物理性質(zhì)的理解開發(fā)的。使用包括dsc和冷凍干燥顯微術(shù)(fdm)的熱表征方法來(lái)測(cè)量tg’(冷凍濃縮物的玻璃轉(zhuǎn)變溫度)和tc(初始干燥期間的崩塌溫度)。選擇表6中示出的循環(huán)用于凍干制劑的凍干。所述退火步驟允許甘露醇的結(jié)晶以確保產(chǎn)物溫度不會(huì)在初始干燥期間降至崩塌溫度之下。選擇初始干燥溫度以在初始干燥的合理持續(xù)時(shí)間內(nèi)避免餅崩塌。開發(fā)2步二次干燥條件以產(chǎn)生具有<1％的水分含量的凍干制劑。表6.凍干循環(huán)實(shí)施例6.無(wú)結(jié)晶組分的情況下的凍干實(shí)驗(yàn)/研究設(shè)計(jì)制備十種不同制劑以測(cè)試緩沖液組成、ph、穩(wěn)定劑和藥物濃度對(duì)所述r-解毒劑的溶解度和穩(wěn)定性的影響(表7)。所述直接使用tris或磷酸鹽緩沖液在ph7.8和8.2下制備。溶液使用離心過(guò)濾濃縮至10mg/ml和25mg/ml。在tris或磷酸鹽緩沖液中制備的濃縮溶液的樣品針對(duì)短期穩(wěn)定性放置于2-8℃和25℃下持續(xù)2周。同時(shí)，各溶液的樣品用于冷凍/解凍研究并且檢查沉淀和聚集。用于冷凍/解凍研究的樣品由2mli型玻璃管瓶中的0.5ml各制劑組成。所述0.5ml樣品在冷凍前并且在各冷凍/解凍循環(huán)后進(jìn)行目視檢查。各樣品放置于-80℃下持續(xù)大約2小時(shí)，在室溫下解凍持續(xù)大約15至30分鐘，目視檢查持續(xù)大約1-2分鐘，并且返回-80℃冷凍器。在第3冷凍循環(huán)后取出各制劑的250l樣品并且提交至實(shí)驗(yàn)室供分析用。剩余溶液經(jīng)受2個(gè)額外冷凍循環(huán)并且接著提交至實(shí)驗(yàn)室供分析用。所有剩余溶液均使用保守循環(huán)冷凍為0.25ml樣品并且所述樣品針對(duì)加速穩(wěn)定性放置于25℃和40℃下。使用無(wú)聚山梨醇酯溶液制備兩種額外制劑以在保護(hù)劑不存在下測(cè)試?yán)鋬?解凍和凍干對(duì)所述分子的影響(表7中的制劑5和6)。保存所述溶液的樣品并且使用已調(diào)制的dsc和冷凍干燥顯微術(shù)用于熱表征。表7.制劑編號(hào)、組分、濃度和ph值編號(hào)組分濃度ph1a10mmtris、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％10mg/ml7.81b10mmtris、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％25mg/ml7.82a10mmtris、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％10mg/ml8.22b10mmtris、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％25mg/ml8.23a10mm磷酸、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％10mg/ml7.83b10mm磷酸、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％25mg/ml7.84a10mm磷酸、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％10mg/ml8.24b10mm磷酸、4％蔗糖、95mm精氨酸、ps800.01％25mg/ml8.2510mmtris、95mm精氨酸25mg/ml7.8610mm磷酸、95mm精氨酸25mg/ml7.8所述制劑使用以3mg/ml、3.3mg/ml和4.8mg/ml供應(yīng)的具有和不具有聚山梨醇酯80(ps80)的散裝原料藥制備。制劑5和6首先使用各制劑的19ml散裝藥物溶液制備。所述散裝體積放置于具有10k膜的透析盒中并且所述盒放置于2l10mmtris或10mm磷酸鈉緩沖液(ph7.8)中。所述溶液透析大約2小時(shí)，透析溶液用另外2l新鮮緩沖溶液置換并且再透析持續(xù)至少2小時(shí)。所述溶液從各盒中取出并且放置于amiconultraultracel10k離心濾管中。所述溶液以3/4速度離心持續(xù)大約30分鐘。剩余溶液從所述離心管中取出并且添加95mm精氨酸，隨后調(diào)節(jié)濃縮溶液的ph和體積。使用相同程序來(lái)制備制劑1a至4a和1b至4b。使用具有3mg/ml的散裝溶液制備的制劑使用13.5ml散裝材料來(lái)制備10mg/ml溶液并且使用33.5ml散裝材料來(lái)制備25mg/ml溶液。使用4.8mg/ml的散裝溶液的制劑使用8.4ml散裝材料來(lái)制備10mg/ml溶液并且使用20.9ml散裝材料來(lái)制備25mg/ml溶液。最終體積的樣品溶液所需濃度的蔗糖和精氨酸在濃縮所述溶液之后添加至所述散裝溶液中并且接著調(diào)節(jié)所述溶液至適當(dāng)ph和最終體積。ps80加入至最終樣品溶液中以使用1％ps80溶液產(chǎn)生0.01％濃度。所述溶液通過(guò)0.22μm針筒過(guò)濾器過(guò)濾并且接著分至小瓶中。2ml小瓶各自填充250l溶液并且使用以下條件凍干。1.在1℃/min下冷卻至-40℃2.在-40℃下保持1小時(shí)，接著在100毫托下起始真空3.在0.5℃/min下勻變至-35℃并且保持直至皮拉尼壓力計(jì)測(cè)量匹配100毫托的電容壓力計(jì)測(cè)量并且產(chǎn)物溫度達(dá)到擱板溫度。4.在0.5℃/min下勻變至20℃并且保持直至皮拉尼壓力計(jì)測(cè)量匹配100毫托的電容壓力計(jì)測(cè)量并且產(chǎn)物溫度達(dá)到擱板溫度。在凍干后安置塞子并且對(duì)小瓶蓋帽。樣品提交用于初始時(shí)間點(diǎn)(t0)測(cè)試并且剩余小瓶針對(duì)穩(wěn)定性放置。已調(diào)制的差示掃描量熱法(dsc)使用已調(diào)制并且標(biāo)準(zhǔn)dsc檢查溶液樣品的熱性為。通過(guò)將12l溶液放置于t0盤中來(lái)檢查樣品并且進(jìn)行密封。所述溶液在1℃/min下冷卻至-40℃并且等溫保持5分鐘。所述樣品的溫度在0.5℃/min下勻變至10℃，其中每120秒調(diào)節(jié)1℃。使用退火步驟檢查一些樣品。那些樣品通過(guò)在1℃/min下冷卻至-40℃，等溫保持5min，在1至5℃/min下使溫度勻變至-15℃或-20℃并且等溫保持至少60分鐘。所述樣品的溫度在5℃/min下恢復(fù)-40℃，等溫保持5min，并且在0.5℃/min下勻變，其中每120秒調(diào)節(jié)1℃。冷凍干燥顯微術(shù)使用冷凍干燥顯微術(shù)通過(guò)將2至4l溶液放置于冷凍干燥顯微鏡鏡臺(tái)中的2個(gè)蓋玻片之間來(lái)檢查樣品。所述樣品在1℃/min下冷卻至-40℃或更低并且等溫保持2min。在100微米處起始真空并且使用安裝于偏振光顯微鏡上的攝影機(jī)目視檢查所述樣品。所述樣品在這一溫度下冷凍干燥直至干燥材料可見(jiàn)并且拍照。其后，所述樣品的溫度以2℃增量增加并且在各溫度下保持以觀察冷凍干燥的樣品。所述樣品的溫度增加直至觀察到完全崩塌。分析方法a.通過(guò)uv-vis得到的濃度使用nanodrop2000分光光度計(jì)(thermoscientific)測(cè)量所述溶液的濃度。通過(guò)將2l溶液放置于測(cè)試平臺(tái)上并且在280nm范圍內(nèi)掃描來(lái)進(jìn)行掃描。b.ph使用型號(hào)為920a的orionph計(jì)測(cè)量溶液的ph。使用購(gòu)自thermoscientific的預(yù)制緩沖溶液在ph7至ph10范圍內(nèi)校準(zhǔn)所述計(jì)/探針。c.sec-hplc使用agilent1100系列hplc執(zhí)行尺寸排阻hplc分析。在0.1m磷酸鈉、0.75m精氨酸鹽酸鹽(ph7.4)中制備的流動(dòng)相用于分離。所用的分析柱為ymc-packdiol-200，300×4.6mm，5μm平均粒徑。使用參考材料的六次重復(fù)注射驗(yàn)證包括所述柱在內(nèi)的hplc系統(tǒng)的適用性并且針對(duì)主要蛋白峰評(píng)估保留時(shí)間、面積和百分比面積。另外，使用凝膠過(guò)濾標(biāo)準(zhǔn)物來(lái)評(píng)估所述柱的分離能力。使用制劑緩沖液將樣品稀釋至1mg/ml的蛋白并且注射以獲得每次注射50μg蛋白的柱負(fù)荷。d.rp-hplc使用agilent1100系列hplc執(zhí)行反相hplc分析。所述方法使用利用在hplc級(jí)水中的0.1％三氟乙酸和乙腈中的0.08％三氟乙酸中制備的流動(dòng)相的分離梯度。所用的分析柱為vydacc18柱，150×4.6mm，5μm平均粒徑。使用參考材料的六次重復(fù)注射驗(yàn)證包括所述柱在內(nèi)的hplc系統(tǒng)的適用性并且針對(duì)主要蛋白峰評(píng)估保留時(shí)間、面積和百分比面積。使用制劑緩沖液將樣品稀釋至1mg/ml的蛋白并且注射以獲得25μg蛋白/注射的柱負(fù)荷。e.iex使用agilent1100系列hplc執(zhí)行離子交換hplc分析。所述方法使用利用在20mm磷酸鈉(ph6.5)和20mm磷酸鈉、1m氯化鈉(ph6.5)中制備的流動(dòng)相的梯度。所用的分析柱為dionexpropacwcx-10，250×4mm。使用參考材料的六次重復(fù)注射驗(yàn)證包括所述柱在內(nèi)的hplc系統(tǒng)的適用性并且針對(duì)標(biāo)記為峰#2的峰評(píng)估保留時(shí)間、面積和百分比面積。使用制劑緩沖液將樣品稀釋至1mg/ml的蛋白并且注射以獲得每次注射50μg蛋白的柱負(fù)荷。結(jié)果：使用保守循環(huán)凍干所述溶液樣品的子集并且針對(duì)穩(wěn)定劑放置于25℃和40℃下持續(xù)2個(gè)月。所述凍干循環(huán)由于低填充體積在大約20小時(shí)內(nèi)完成。所有凍干的餅看來(lái)均為可接受的，除了制劑2a，其可能歸因于過(guò)濾器撕裂。一般說(shuō)來(lái)，使用sec和rp獲得的數(shù)據(jù)看來(lái)區(qū)別所述制劑之間的差異。這表明所述方法為穩(wěn)定性指示并且可用于比較樣品。數(shù)據(jù)支持所述r-解毒劑的穩(wěn)定性受ph影響。數(shù)據(jù)證明在ph7.8下制備的制劑的穩(wěn)定劑由于在ph8.2下制備的制劑的穩(wěn)定性。關(guān)于存儲(chǔ)于40℃下的樣品，尤其如此。這一研究包括針對(duì)所述r-解毒劑的穩(wěn)定性比較緩沖液類型。所述緩沖液包括在ph7.8和8.2下制備的tris和磷酸鹽。數(shù)據(jù)表明緩沖液類型不會(huì)影響所述r-解毒劑的穩(wěn)定性并且穩(wěn)定性的差異主要為ph的函數(shù)。所述研究中的兩種制劑(制劑5和6)不使用蔗糖和聚山梨醇酯80制備。蔗糖用作凍干保護(hù)劑并且聚山梨醇酯80用于防止蛋白由于與小瓶的壁的相互作用和在冷凍步驟期間與冰的相互作用而聚集。不使用保護(hù)劑制備的制劑展現(xiàn)百分比聚集物的增加，如在40℃下存儲(chǔ)1個(gè)月之后通過(guò)sec所確定。數(shù)據(jù)支持所述制劑中對(duì)賦形劑的需要以改進(jìn)所述蛋白的穩(wěn)定性。所述穩(wěn)定性研究還支持凍干樣品比作為溶液制備的制劑更穩(wěn)定。所述溶液樣品的比較證明了當(dāng)存儲(chǔ)于5℃下時(shí)所述溶液樣品的穩(wěn)定性優(yōu)于當(dāng)存儲(chǔ)于更高溫度下時(shí)。用于所述穩(wěn)定性研究的樣品使用每個(gè)2ml小瓶0.25ml來(lái)制備。僅當(dāng)存在不充足固體來(lái)支撐樣品2a中的餅時(shí)，觀察到崩塌。所有其它樣品看來(lái)均為可接受的，然而當(dāng)使用所述低填充體積時(shí)確定餅收縮的程度是不可行的。與所述穩(wěn)定性研究并行地進(jìn)行熱表征研究以確定在滿量程下凍干所述制劑的可行性。使用已調(diào)制的dsc檢查制劑5和6。兩種制劑均含有大約25mg/ml的所述r-解毒劑和95mm精氨酸hcl，但制劑5用10mmtris制備并且制劑6用10mm磷酸鹽制備。當(dāng)使用總熱流、不可逆熱流或可逆熱流觀察時(shí)，在加溫勻變期間未觀察到熱事件?？偀崃鳠峤馇€將示出動(dòng)力學(xué)相關(guān)事件和非動(dòng)力學(xué)相關(guān)事件。不可逆熱流熱解曲線將示出動(dòng)力學(xué)相關(guān)事件(如結(jié)晶)并且可逆熱流熱解曲線將示出非動(dòng)力學(xué)相關(guān)事件(如玻璃轉(zhuǎn)變)?？捎^察到的事件的缺乏可表明所述組分的濃度過(guò)低而無(wú)法產(chǎn)生具有充足強(qiáng)度的信號(hào)。進(jìn)行冷凍干燥顯微術(shù)實(shí)驗(yàn)以確定崩塌溫度是否將匹配關(guān)于使用mdsc確定的tg’所觀察到的結(jié)果。預(yù)期所有樣品的熱行為相似，因?yàn)槠渚哂性谙嗨茲舛认碌南嗤x形劑。用大約25mg/ml的r-解毒劑濃度制備制劑5和6并且其均含有95mm精氨酸(ph7.8)。所述制劑之間的唯一差異為緩沖液。制劑5含有10mmtris并且制劑6含有10mm磷酸鹽。制劑5展現(xiàn)在-40℃下崩塌并且制劑6展現(xiàn)在-39℃下崩塌。數(shù)據(jù)支持所述產(chǎn)物的溫度需要維持在確定的崩塌溫度之下以獲得可接受的凍干樣品。維持所述低產(chǎn)物溫度在實(shí)驗(yàn)室或滿量程凍干器中不可行。盡管針對(duì)所述凍干制劑的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)看來(lái)是可接受的，熱表征數(shù)據(jù)證明所述制劑由于低崩塌溫度而無(wú)法經(jīng)受按比例擴(kuò)大。使用mdsc和冷凍干燥顯微術(shù)獲得的熱表征表明所述制劑在冷凍和干燥后保持非晶形并且組分的組合導(dǎo)致低崩塌溫度。產(chǎn)生可經(jīng)受按比例擴(kuò)大的制劑的唯一方式是添加結(jié)晶組分以充當(dāng)支架，所述支架可在冷凍干燥期間和之后維持非晶材料于適當(dāng)位置中。添加至藥物制劑中的最常見(jiàn)結(jié)晶組分是甘露醇。所有進(jìn)一步制劑和工藝開發(fā)工作研究了不同濃度的甘露醇的添加。含有甘露醇的制劑的開發(fā)和針對(duì)所述制劑的穩(wěn)定性研究描述于獨(dú)立開發(fā)報(bào)告中。結(jié)論檢查緩沖液類型、ph、穩(wěn)定劑和蛋白濃度對(duì)呈溶液和凍干制劑形式的所述r-解毒劑的穩(wěn)定性的影響。溶液樣品存儲(chǔ)于5℃和25℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2周并且凍干樣品存儲(chǔ)于25℃和40℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。以2ml小瓶中的0.25ml形式凍干的制劑在2個(gè)月后展現(xiàn)可接受的穩(wěn)定性。然而，熱表征實(shí)驗(yàn)證明所有制劑具有-37℃或更低的崩塌溫度并且不可經(jīng)受按比例擴(kuò)大。數(shù)據(jù)表明所述制劑中需要結(jié)晶組分以防止崩塌并且允許在較高溫度下凍干。實(shí)施例7.緩沖液類型和甘露醇對(duì)所述制劑的熱行為和穩(wěn)定性的影響。來(lái)自實(shí)施例6的數(shù)據(jù)表明所述r-解毒劑制劑中需要結(jié)晶組分以防止冷凍干燥期間的崩塌。這一實(shí)施例檢查了甘露醇和精氨酸濃度對(duì)所述制劑的熱行為和凍干的餅外觀的影響。在降低精氨酸的濃度的情況下研究含有2％至4％甘露醇的制劑。精氨酸防止甘露醇的結(jié)晶，除非濃度為47.5mm或更低。研究發(fā)現(xiàn)含有10mmtris、10mg/mlr-解毒劑、45mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％聚山梨醇酯80的制劑產(chǎn)生具有可接受的外觀和物理和化學(xué)穩(wěn)定性的凍干的餅。凍干研究提供數(shù)據(jù)來(lái)支持在-25℃下退火持續(xù)3小時(shí)之后使用-25℃的初始干燥擱板溫度。兩步二次干燥工藝產(chǎn)生具有小于1％的殘留水分值的餅。實(shí)驗(yàn)/研究設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)研究以并行地檢查所述制劑的熱行為并且比較使用保守循環(huán)凍干的制劑的化學(xué)穩(wěn)定性。初始制劑用95mm精氨酸、2％蔗糖、2％甘露醇和10mmtris或10mm磷酸鹽緩沖液(ph7.8)制備。所述制劑還含有10或25mg/ml的活性成分(表8.1)。表8.1在ph7.8下用甘露醇制備的初始制劑。解凍的藥物溶液的等分試樣放置于具有3k截留分子量(mwco)膜的透析盒中。所述盒放置于含有具有精氨酸、蔗糖和甘露醇的tris或磷酸鹽的緩沖溶液中。含有所述藥物溶液的各盒放置于2l緩沖溶液中并且透析持續(xù)4小時(shí)。所述緩沖溶液在2小時(shí)后更新并且所述溶液在2-8℃下再透析持續(xù)4小時(shí)或過(guò)夜。所述溶液使用具有18g針的bd針筒從所述透析盒取出并且放置于具有3kmwco膜的離心濾管中。所述管在大約3000rpm下離心持續(xù)20至30分鐘并且使用nanodrop2000分光光度計(jì)檢查所述溶液的濃度。溶液濃縮至大于10mg/ml或25mg/ml并且使用適當(dāng)緩沖溶液稀釋至適當(dāng)濃度并且使用1％聚山梨醇酯80溶液將聚山梨醇酯濃度調(diào)節(jié)至0.01％。所述溶液通過(guò)0.22μm針筒過(guò)濾器過(guò)濾并且以每個(gè)小瓶0.25ml和0.8ml填充至3ml玻璃管瓶中。所述溶液使用保守循環(huán)(表8.2)冷凍干燥并且針對(duì)穩(wěn)定性放置于25℃和40℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。表8.2用于含甘露醇制劑的保守凍干循環(huán)。步驟詳情冷凍以1℃/min勻變至-40℃等溫保持120min退火以1℃/min勻變至-25℃，保持180min初始干燥-30℃，保持直至皮拉尼(pirani)＝cm二次干燥以0.5℃/min勻變至40℃，保持直至皮拉尼＝cm在冷凍干燥之前各溶液的樣品保存供使用dsc和fdm進(jìn)行熱分析。使用不具有蛋白的情況下制備的緩沖溶液完成額外熱分析和凍干循環(huán)開發(fā)研究。進(jìn)行所述實(shí)驗(yàn)以確定所述制劑中所需的精氨酸的最小濃度以使蛋白穩(wěn)定化而不干擾甘露醇的結(jié)晶。由客戶進(jìn)行溶解度研究以確定使蛋白穩(wěn)定化所需的精氨酸的最小濃度。1通過(guò)baxter進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以測(cè)試精氨酸和甘露醇濃度對(duì)熱行為、凍干循環(huán)條件和餅外觀的影響。所述緩沖溶液含有具有2％蔗糖的10mmtris(ph7.8)。精氨酸濃度從95mm至9.5mm變化并且甘露醇濃度在2％與5％之間變化?；跓嵝袨?、餅外觀和短期加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)鑒別良好的制劑候選物。針對(duì)進(jìn)一步開發(fā)所提出的制劑含有10-25mg/mlr-解毒劑、10mmtris(ph7.8)、45mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％聚山梨醇酯80。早期研究使用每個(gè)3ml小瓶0.2ml至1ml。使用25mg/ml的藥物濃度進(jìn)行使用低精氨酸制劑的初始穩(wěn)定性研究并且使用保守循環(huán)凍干。樣品針對(duì)穩(wěn)定性放置于25℃和40℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月。為確認(rèn)所述過(guò)程所進(jìn)行的循環(huán)使用以每個(gè)小瓶5ml填充至10ml小瓶中的藥物溶液。相同小瓶和填充體積用于在二次干燥研究期間研究水分含量的效應(yīng)。使用藥物溶液制備用于這些研究的制劑，所述藥物溶液使用實(shí)驗(yàn)室規(guī)模切向流過(guò)濾(tff)單元更換為適當(dāng)緩沖液。所述tff單元配備有用于所述溶液的容納容器，所述容納容器連接至具有管的切向流過(guò)濾器。使所述容器填充藥物溶液，更換為適當(dāng)緩沖液，并且通過(guò)經(jīng)過(guò)10kdamwco膜過(guò)濾而濃縮至10至25mg/ml。添加足量的1％聚山梨醇酯80(ps80)以產(chǎn)生0.01％ps80濃度。最終溶液通過(guò)0.22μm針筒過(guò)濾器或真空過(guò)濾系統(tǒng)過(guò)濾。所述凍干循環(huán)檢查工藝參數(shù)，如冷卻勻變速率和在初始與二次干燥之間的勻變速率以及在退火和初始干燥期間的擱板溫度。通過(guò)在二次干燥開始時(shí)并且在40℃下4、8和10小時(shí)之后取出樣品來(lái)進(jìn)行殘留水分研究。通過(guò)在40℃下8小時(shí)之后并且在50℃下1和2小時(shí)之后取出樣品來(lái)進(jìn)行二次研究。使用karlfischer分析來(lái)測(cè)試所述樣品的殘留水分并且當(dāng)殘留水分的值達(dá)到穩(wěn)定時(shí)期時(shí)，認(rèn)為干燥完全。通過(guò)在二次干燥期間對(duì)應(yīng)于特定殘留水分值的時(shí)間取出樣品來(lái)測(cè)試殘留水分對(duì)所述制劑的穩(wěn)定性的影響。所述樣品針對(duì)穩(wěn)定性放置于40℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月并且在50℃下持續(xù)1周。針對(duì)所提出的含有10mg/mlr-解毒劑、10mmtris、45mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％聚山梨醇酯80(ph7.8)的藥物產(chǎn)物制劑創(chuàng)建凍干循環(huán)設(shè)計(jì)空間。所述制劑使用每個(gè)小瓶5ml溶液填充至10ml玻璃管瓶中。所述設(shè)計(jì)空間的開發(fā)需要知道與所述制劑的崩塌溫度和所述小瓶的傳熱系數(shù)組合的設(shè)備能力。所述小瓶的傳熱系數(shù)使用用于所述產(chǎn)物的精確玻璃管瓶、用水填充所述小瓶并且使用預(yù)期用于干燥所述產(chǎn)物的擱板溫度使冰升華來(lái)確定。在室壓力從大約25毫托變化為大約400毫托的情況下收集產(chǎn)物溫度和質(zhì)量流數(shù)據(jù)。在各壓力下使用可調(diào)諧二極管激光吸收光譜法(tdlas)收集質(zhì)量流數(shù)據(jù)并且使用隨壓力而變的質(zhì)量流率的改變來(lái)計(jì)算所述小瓶的傳熱系數(shù)。結(jié)果：1.差示掃描量熱法(dsc)制備各緩沖液組分的個(gè)別溶液并且使用dsc進(jìn)行測(cè)試以確定各組分對(duì)緩沖液制劑的熱行為的影響。一般地，所述制劑的熱行為由以最高濃度存在的組分指示。熱行為的改變可在添加其它賦形劑或所述藥物的情況下發(fā)生。例如，鹽的添加可降低所述制劑中的非晶材料的tg’。所提出的藥物制劑含有甘露醇。甘露醇作為賦形劑添加至凍干制劑中以充當(dāng)結(jié)晶膨脹劑。當(dāng)最初在溶液中冷凍時(shí)，甘露醇為非晶形。在冷凍期間一般包括退火步驟以促進(jìn)甘露醇的結(jié)晶，使得其可提供用于餅的結(jié)構(gòu)。制劑中的其它賦形劑和/或活性成分可防止或延遲甘露醇的結(jié)晶。這一部分中討論的研究調(diào)查了tris、磷酸鹽和精氨酸對(duì)甘露醇的結(jié)晶和所述溶液的熱行為的影響。在ph7.8下制備的10mmtris溶液使用dsc在1℃/min下冷卻至-50℃(圖2)。熱解曲線示出在大約-20℃下開始冰的結(jié)晶放熱，隨后在-32℃下開始的tris的結(jié)晶放熱。當(dāng)95mm精氨酸包括于所述制劑中時(shí)，結(jié)晶放熱不再存在(圖3)。在這一研究的溫度范圍內(nèi)除冰的熔融吸熱以外未觀察到熱事件。當(dāng)10mmtris、95mm精氨酸制劑含有4％蔗糖時(shí)，觀察到具有大約-42℃的中點(diǎn)的tg’。單獨(dú)蔗糖的tg’的中點(diǎn)一般為約-33℃。所述研究證明了tris/精氨酸混合物降低蔗糖的tg’。具有低于-40℃的tg’的溶液并非凍干的良好候選物。在初始干燥期間難以維持所述低產(chǎn)物溫度。如甘露醇的結(jié)晶組分的添加可提供結(jié)構(gòu)并且改進(jìn)凍干機(jī)會(huì)，只要甘露醇在初始干燥開始之前結(jié)晶即可。甘露醇以2％w/v添加至所述制劑中并且蔗糖濃度降低至2％，使得所述制劑中的總糖含量維持于4％下。用10mmtris、2％蔗糖和2％甘露醇制備的溶液證明了甘露醇在大約-20℃下開始結(jié)晶(圖4)。當(dāng)95mm精氨酸添加至所述溶液中時(shí)，防止甘露醇的結(jié)晶(圖5)。即使當(dāng)冷凍溶液在-20℃下退火持續(xù)長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)之時(shí)，甘露醇也不結(jié)晶(圖6)。關(guān)于用10mm磷酸鈉制備的溶液進(jìn)行相同熱分析的集合以測(cè)試緩沖液對(duì)所述制劑的熱行為的影響。當(dāng)制備為10mm溶液(ph7.8)時(shí)，磷酸鈉在冷卻步驟期間結(jié)晶(圖7)。10mm磷酸鈉與95mm精氨酸和4％蔗糖的混合物展現(xiàn)具有大約-38℃的中點(diǎn)的tg’。與tris溶液相似，含有蔗糖和甘露醇的磷酸鹽溶液展現(xiàn)甘露醇的結(jié)晶放熱(圖8)。當(dāng)95mm精氨酸添加至所述混合物中時(shí)，未觀察到結(jié)晶放熱(圖9)。與用tris制備的制劑相似，即使當(dāng)磷酸鹽制劑在-20℃下退火持續(xù)5小時(shí)之時(shí)，也未觀察到結(jié)晶放熱。所述研究證明了95mm精氨酸添加至含有tris或磷酸鹽的制劑中將急劇降低蔗糖的tg’并且將防止甘露醇的結(jié)晶。數(shù)據(jù)證明制劑的改變是必需的以便促進(jìn)甘露醇的結(jié)晶供成功凍干的餅用。在進(jìn)行這一研究時(shí)，數(shù)據(jù)表明需要95mm精氨酸或10mm至20mm檸檬酸鹽來(lái)維持所述蛋白的溶解度。因此，使用含有具有2％蔗糖和5％甘露醇的10mmtris中的10mm或20mm檸檬酸鹽的溶液進(jìn)行研究，所述溶液作為所述制劑中的精氨酸的替代物。增加甘露醇濃度并且降低蔗糖濃度以增加甘露醇結(jié)晶的可能性。使用2％蔗糖和5％甘露醇連同精氨酸的研究稍后描述于這一報(bào)告中。含有檸檬酸鹽的溶液在-25℃下退火。在-25℃下在10mm檸檬酸鹽中24分鐘時(shí)開始觀察到結(jié)晶放熱(圖10)并且在-25℃下在20mm檸檬酸鹽中30分鐘時(shí)開始觀察到結(jié)晶放熱(圖11)。2.冷凍干燥顯微術(shù)(fdm)使用fdm檢查用10mm磷酸鹽或10mmtris和10mg/mlr-解毒劑、95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇在ph7.8下制備的制劑。用所述tris制劑進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)示出當(dāng)在-25℃下退火持續(xù)長(zhǎng)達(dá)3小時(shí)之時(shí)，所述制劑在大約-34℃下開始崩塌。含有10mm磷酸鹽的制劑具有較高的崩塌溫度。在-32℃下觀察到一致干燥層并且在-30℃下觀察到崩塌開始。fdm數(shù)據(jù)表明兩種制劑均可使用可經(jīng)受常規(guī)生產(chǎn)的條件凍干。這與使用dsc獲得的數(shù)據(jù)不相關(guān)。使用fdm進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)利用了與溫度控制鏡臺(tái)直接接觸的兩個(gè)蓋玻片之間溶液的薄層。這些條件表明干燥的簡(jiǎn)易性并且因此無(wú)法與dsc數(shù)據(jù)相關(guān)，假定其相關(guān)性的后續(xù)測(cè)試依賴于所述dsc數(shù)據(jù)。3.凍干和穩(wěn)定性用10mg/ml和25mg/mlr-解毒劑和95mm精氨酸、2％蔗糖和2％甘露醇在ph7.8下制備的磷酸鹽和tris制劑以溶液和凍干樣品形式檢查穩(wěn)定性。各溶液以每個(gè)小瓶0.20ml填充至3ml小瓶中。一部分樣品存儲(chǔ)于5℃和25℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2周并且另一部分樣品使用保守循環(huán)凍干并且針對(duì)穩(wěn)定性放置于25℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月并且在40℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月。所述樣品在-25℃下退火持續(xù)1小時(shí)，接著在-30℃下凍干。還使用具有20℃擱板溫度的保守條件進(jìn)行二次干燥。使用保守、非常規(guī)循環(huán)，因?yàn)殛P(guān)于所述蛋白的溫度敏感性所知甚少。所述凍干循環(huán)在大約21小時(shí)內(nèi)完成。所述小瓶用塞子密封，接著從凍干器中取出，蓋帽，并且針對(duì)穩(wěn)定性進(jìn)行放置。凍干的餅看來(lái)是可接受的，其中無(wú)崩塌跡象，并且用純水快速地復(fù)原。并行地進(jìn)行使用不具有所述藥物的相同制劑的第二研究以確保甘露醇的結(jié)晶(如果發(fā)生的話)不會(huì)引起小瓶的破裂。安慰劑制劑以各10ml溶液填充至20ml小瓶中。一個(gè)完整托盤的小瓶在1℃/min下冷卻至-40℃，等溫保持120分鐘，并且接著在1℃/min下勻變至-25℃持續(xù)3小時(shí)的退火。小瓶的第二集合冷卻至-25℃，等溫保持3小時(shí)，冷卻至-35℃并且接著轉(zhuǎn)移至含有所述完整托盤的小瓶的干燥器中。所有小瓶均在-30℃下凍干并且在25℃下干燥供二次干燥用。在含有兩種制劑的小瓶中觀察到崩塌。這表明甘露醇不結(jié)晶并且支持在熱分析期間使用dsc作出的結(jié)論：精氨酸防止甘露醇的結(jié)晶。因此，未來(lái)實(shí)驗(yàn)依賴于dsc和凍干數(shù)據(jù)(假定其與制劑開發(fā)的相關(guān)性)，而非fdm結(jié)果。下一實(shí)施例中描述的研究聚焦于精氨酸的減少和其對(duì)所述蛋白的溶解度和甘露醇的結(jié)晶的影響。用上述95mm精氨酸制備的磷酸鹽和tris制劑針對(duì)穩(wěn)定性加以保持以提供初始數(shù)據(jù)。當(dāng)存儲(chǔ)于5℃和25℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2周時(shí)在溶液樣品中未觀察到濃度損失并且在t0處液體與凍干樣品之間并無(wú)濃度差異(圖12和13)。同樣，在存儲(chǔ)于25℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)3個(gè)月(圖14)或在40℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2個(gè)月的任何凍干制劑中均未觀察到濃度損失。sec數(shù)據(jù)示出當(dāng)溶液制劑存儲(chǔ)于5℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2周時(shí)主峰并無(wú)損失。當(dāng)存儲(chǔ)于25℃下持續(xù)長(zhǎng)達(dá)2周時(shí)，百分比主峰在10mg/ml樣品中降低超過(guò)1％并且在25mg/ml樣品中降低超過(guò)3％。因此，盡管所述制劑的化學(xué)穩(wěn)定性看來(lái)是可接受的，由于凍干期間的不良物理穩(wěn)定性而必需所述制劑的改變。不良物理穩(wěn)定性由關(guān)于安慰劑制劑所觀察到的崩塌的餅證明。來(lái)自dsc實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)表明降低精氨酸濃度和增加甘露醇濃度應(yīng)促進(jìn)甘露醇的結(jié)晶并且改進(jìn)凍干的餅的物理穩(wěn)定性。實(shí)施例8.精氨酸和甘露醇濃度對(duì)凍干樣品的熱行為和外觀的影響進(jìn)行這一實(shí)施例以調(diào)查在使用安慰劑制劑時(shí)精氨酸濃度和甘露醇濃度對(duì)熱行為和餅外觀的影響。所述研究聚焦于用tris緩沖液制備的安慰劑制劑。選擇tris緩沖液是因?yàn)樗怯糜谥苽渖⒀b藥物溶液的緩沖液并且因?yàn)橛胻ris和磷酸鈉制備的樣品的化學(xué)穩(wěn)定性無(wú)差異。以下研究檢查使用9.5mm至95mm的精氨酸濃度范圍和2％至5％的甘露醇濃度范圍。1.熱分析所述熱分析實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是確定促進(jìn)甘露醇的結(jié)晶而不會(huì)大體上增加所述制劑中的固體濃度的精氨酸和甘露醇濃度。高濃度的固體可增加凍干期間對(duì)質(zhì)量轉(zhuǎn)移的抵抗并且產(chǎn)生過(guò)長(zhǎng)的凍干循環(huán)。精氨酸濃度在10mmtris、2％蔗糖、2％甘露醇和0.01％ps80制劑中降低，同時(shí)保持甘露醇濃度恒定。制劑在-15℃至-25℃下退火持續(xù)長(zhǎng)達(dá)5小時(shí)以促進(jìn)結(jié)晶。僅當(dāng)精氨酸濃度降低至9.5mm并且退火溫度為-22℃或更高時(shí)才觀察到甘露醇的結(jié)晶。甘露醇的結(jié)晶在-22℃下在退火開始時(shí)開始(圖15)。當(dāng)所述濃度增加至4％并且精氨酸濃度從95mm降低至47.5mm時(shí)，在-25℃下退火30分鐘之后甘露醇開始結(jié)晶(圖16)。調(diào)查較低退火溫度，因?yàn)楫?dāng)退火發(fā)生于較高溫度下時(shí)觀察到凍干的餅的外觀改變。外觀改變包括當(dāng)在-15℃下進(jìn)行退火時(shí)發(fā)生的餅收縮。當(dāng)精氨酸濃度大于47.5mm時(shí)，甘露醇(當(dāng)所述制劑中使用2％濃度時(shí))的結(jié)晶延遲或受到阻止?？砂ㄓ谒鲋苿┲卸挥绊懜事洞冀Y(jié)晶的最大精氨酸濃度為47.5mm。這一陳述使用凍干實(shí)驗(yàn)得到確認(rèn)，所述凍干實(shí)驗(yàn)使用具有2％甘露醇和47.5mm、71mm或85.5mm精氨酸的安慰劑制劑進(jìn)行。用47.5mm精氨酸制備的樣品是藥學(xué)上可接受的，但用更多精氨酸制備的樣品展現(xiàn)崩塌。增加甘露醇濃度可增加結(jié)晶的可能性。當(dāng)精氨酸濃度大于47.5mm時(shí)，當(dāng)甘露醇濃度增加至4％和5％時(shí)需要冷凍溶液的退火以促進(jìn)結(jié)晶。甘露醇在含有5％甘露醇和47.5mm精氨酸的制劑中容易地結(jié)晶。含有10mmtris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和0.01％ps80的制劑在1℃/min下緩慢地冷卻至-40℃(圖17)。當(dāng)所述制劑在1℃/min下冷卻時(shí)，在冷卻步驟期間觀察到甘露醇的結(jié)晶放熱。所述制劑的樣品快速地冷卻(比10℃/min更快冷卻)至-40℃并且接著在-25℃下退火(圖18)。當(dāng)所述溶液在-25℃下退火時(shí)，23分鐘后甘露醇結(jié)晶。所述實(shí)驗(yàn)證明了甘露醇將容易地在所述制劑中結(jié)晶，只要精氨酸濃度低于47.5mm。熱分析數(shù)據(jù)支持如果精氨酸濃度為47.5mm或更低，那么在4％或更大濃度下的甘露醇將容易地在凍干工藝期間在合理時(shí)間范圍內(nèi)結(jié)晶。2.凍干與熱分析實(shí)驗(yàn)并行地進(jìn)行凍干研究。用10mmtris、9.5mm至23.75mm精氨酸、2％蔗糖和2％至4％甘露醇、或具有47.5mm精氨酸并且具有或不具有4％蔗糖的10mmtris制備安慰劑溶液。還包括含有10mmtris、47.5mm精氨酸、2％蔗糖和5％甘露醇的制劑。所述溶液使用每個(gè)小瓶3ml溶液填充至20ml小瓶中。使用保守、非常規(guī)凍干循環(huán)來(lái)確定是否可能產(chǎn)生可接受的餅。所述樣品在1℃/min下冷卻至-20℃，退火持續(xù)3小時(shí)，在1℃/min下冷卻至-40℃，并且保持2小時(shí)。在100毫托下起始真空并且擱板溫度在0.5℃/min下勻變至-30℃。樣品保持在-30℃下直至皮拉尼壓力計(jì)值匹配電容壓力計(jì)(cm)值并且接著在0.5℃/min下推進(jìn)至25℃下的二次干燥。當(dāng)皮拉尼壓力計(jì)值匹配cm值時(shí)，二次干燥完成。初始干燥在大約30小時(shí)后完成并且二次干燥僅需要幾個(gè)小時(shí)。用單獨(dú)tris和精氨酸制備的樣品展現(xiàn)完全崩塌并且包括4％蔗糖的那些樣品展現(xiàn)餅收縮。所有含有47.5mm精氨酸或更少精氨酸和2％至5％甘露醇的制劑均呈可接受的餅出現(xiàn)。包括用以測(cè)試使用10ml填充體積時(shí)在冷卻勻變期間退火的效應(yīng)的研究。所述研究使用由10mmtris、2％蔗糖和23.75mm和47.5mm精氨酸、和2％至5％甘露醇制備的樣品。所述溶液在1℃/min下冷卻至-25℃，保持3小時(shí)，在100毫托下起始真空，并且擱板溫度在0.5℃/min下增加至-20℃。所述樣品在-20℃下干燥并且擱板加溫至25℃供二次干燥用。所有樣品均看來(lái)是可接受的，無(wú)崩塌跡象。使用相同制劑來(lái)檢查冷卻速度對(duì)凍干的餅的外觀的影響。樣品的一個(gè)集合在1℃/min下冷卻至-25℃并且退火持續(xù)3小時(shí)。樣品的第二集合在5℃/min下冷卻至-25℃并且退火持續(xù)3小時(shí)。所述樣品的集合組合于單一干燥器中并且在-30℃下凍干供初始干燥用，隨后在25℃下凍干供二次干燥用。所有樣品均看來(lái)是可接受的，無(wú)崩塌跡象。數(shù)據(jù)支持在1℃/min與5℃/min之間的冷卻速率不影響所述樣品的外觀。由客戶進(jìn)行的溶解度研究支持如果精氨酸濃度在7.5至8.2的ph范圍內(nèi)為36mm或更大，那么所述蛋白將保持可溶于溶液中。已決定使用含有45mm精氨酸的溶液，因?yàn)槠鋵⒋_保所述蛋白的完全溶解，同時(shí)還充分低于將防止甘露醇的結(jié)晶的濃度。選擇甘露醇濃度為5％以確保其在所述循環(huán)期間容易地結(jié)晶。因此，最佳制劑候選物為10mmtris、10mg/ml或25mg/mlr-解毒劑、45mm精氨酸、2％蔗糖、5％甘露醇和在ph7.8下制備的0.01％ps80。用安慰劑溶液完成的凍干研究證明了當(dāng)精氨酸濃度為47.5mm或更低并且具有2％甘露醇或更多甘露醇時(shí)可能產(chǎn)生可接受的餅。所述溶液使用高達(dá)-20℃的擱板溫度凍干，無(wú)崩塌跡象。樣品在冷卻步驟期間或在-40℃下的冷凍步驟之后在-20℃下退火持續(xù)3小時(shí)，對(duì)餅的外觀無(wú)影響。保守和常規(guī)方法是首先在-40℃下冷凍樣品，隨后在初始干燥下進(jìn)行退火步驟。選擇這種方法用于所述凍干循環(huán)。初始干燥在-20℃下的退火步驟之后進(jìn)行，隨后在0.5℃/min下增加擱板溫度至25℃供二次干燥用。后續(xù)凍干開發(fā)研究聚焦于適當(dāng)二次干燥擱板溫度和持續(xù)時(shí)間。開發(fā)所述凍干制劑的目標(biāo)包括(1)至少10mg/ml的蛋白濃度；(2)改進(jìn)在2-8℃下的穩(wěn)定性；(3)≤5min的復(fù)原時(shí)間；和(4)穩(wěn)固凍干工藝。執(zhí)行數(shù)輪制劑篩選以評(píng)估個(gè)別變量對(duì)蛋白穩(wěn)定性(呈凍干的餅形式和呈溶液形式)和5℃下的溶解度的影響。在制劑篩選期間使用保守凍干循環(huán)。平行地執(zhí)行凍干工藝開發(fā)。所述測(cè)試證明了就蛋白濃度來(lái)說(shuō)，在室溫下2天后，高濃度(例如25mg/ml)溶液不如較低濃度溶液(例如10mg/ml)穩(wěn)定(即，通過(guò)sec獲得的總聚集物和通過(guò)rp-hplc獲得的β峰％的較大增加)。針對(duì)r-解毒劑穩(wěn)定性(凍干產(chǎn)物和呈溶液形式)的最佳ph經(jīng)過(guò)確認(rèn)為ph7.80±0.3。在其它穩(wěn)定組分(即，蔗糖和精氨酸)存在下在tris與磷酸鹽緩沖液之間未觀察到穩(wěn)定性的顯著差異。就穩(wěn)定劑類型和濃度來(lái)說(shuō)，2％和4％w/w蔗糖均提供良好穩(wěn)定效應(yīng)。需要≥36mm的精氨酸濃度以維持所述r-解毒劑在5℃、ph7.80±0.3下≥50mg/ml的溶解度。在≥4％w/w的濃度下的結(jié)晶組分(膨脹劑)甘露醇(在10mmtris、2％w/w蔗糖、45mm精氨酸存在下)是重要的以避免初始干燥期間的餅崩塌。此外，少量聚山梨醇酯80的存在是至關(guān)重要的以確保在剪切條件(在室溫下的振蕩)下r-解毒劑在溶液中的穩(wěn)定性。下文所示的組合物示例了用于凍干的合適溶液。表8.3用于注射50mg/小瓶的r-解毒劑的組合物21在凍干期間去除。2待用4.70ml無(wú)菌注射用水(swfi)復(fù)原。所述凍干制劑改進(jìn)r-解毒劑藥物產(chǎn)物的穩(wěn)定性并且可存儲(chǔ)于2-8℃下。下表比較了冷凍的液體藥物產(chǎn)物和復(fù)原的凍干的藥物產(chǎn)物的組合物。提供100mg/小瓶和400mg/小瓶的凍干的藥物產(chǎn)物的組合物和示例性復(fù)原組合物的實(shí)例。表8.4r-解毒劑冷凍液體藥物產(chǎn)物的制劑，用于注射，3mg/ml成分每個(gè)小瓶的量量(mg/ml)r-解毒劑30mg3mg/mltris12.1mg1.21mg/ml(10mm)l-精氨酸鹽酸鹽200mg20.0mg/ml(95mm)蔗糖400mg40.0mg/ml(4％w/w)聚山梨醇酯801.0mg0.1mg/ml(0.01％w/w)注射用水適量至10g鹽酸溶液，1n適量至ph＝7.8氫氧化鈉溶液，1n適量至ph＝7.8ph7.8±0.37.8±0.3表8.5r-解毒劑凍干的藥物產(chǎn)物的制劑，用于注射，50mg/小瓶表8.6r-解毒劑凍干的藥物產(chǎn)物的制劑，用于注射，100mg/小瓶表8.7r-解毒劑凍干的藥物產(chǎn)物的制劑，用于注射，400mg/小瓶對(duì)兩種不同制劑執(zhí)行冷凍干燥顯微術(shù)。大約0.15ml溶液分配至玻璃槽中，所述玻璃槽放置于溫度控制冷凍干燥鏡臺(tái)上。熱電偶放置于所述槽的底部和中心上以監(jiān)測(cè)樣品溫度。液體以0.5℃/min的速率冷卻至-50℃，在-20℃下退火持續(xù)1小時(shí)，并且再冷凍至-50℃。對(duì)所述室抽真空并且以0.5℃/min的速率加熱。基于這一崩塌溫度，造成低于所述崩塌溫度的產(chǎn)物溫度的冷凍干燥溫度和壓力的組合將產(chǎn)生無(wú)崩塌的餅。例如，在100毫托下高達(dá)20℃的產(chǎn)物溫度可能用于產(chǎn)生無(wú)崩塌的餅。在用swfi復(fù)原用于注射的r-解毒劑之后，50mg/小瓶為ph7.8，具有約480mosm/kg的摩爾滲透壓濃度。因此，復(fù)原dp是靜脈內(nèi)施用可接受的。r-解毒劑bds在10mmtris(ph7.8±0.3)、4％蔗糖、95mm精氨酸中以3.0mg/ml配制并且在-60℃或更冷溫度下冷凍存儲(chǔ)。用于注射的r-解毒劑的制造由3mg/mlr-解毒劑bds的解凍和匯集、針對(duì)制劑緩沖液(10mmtris、2％蔗糖、5％甘露醇、45ml精氨酸hcl，ph7.8)超濾/透濾至10mg/ml的最終濃度、加入聚山梨醇酯80至0.01％w/w、無(wú)菌填充、凍干、塞塞子、蓋帽和在用于注射的r-解毒劑容器蓋系統(tǒng)中貼標(biāo)簽組成。用于注射的r-解毒劑制造工藝?yán)昧酸槍?duì)其它無(wú)菌液體藥物產(chǎn)物的生產(chǎn)開發(fā)的程序。用于產(chǎn)生用于注射的r-解毒劑的滅菌方法為0.2μm過(guò)濾。所述r-解毒劑為熱不穩(wěn)定的；因此，0.2μm過(guò)濾是制造用于注射的無(wú)菌r-解毒劑的最適當(dāng)方式。所述凍干工藝是使用合理方法基于對(duì)凍干循環(huán)的不同階段中制劑組分的物理性質(zhì)的理解開發(fā)的。使用包括差示掃描量熱法(dsc)和冷凍干燥顯微術(shù)(fdm)的熱表征方法來(lái)測(cè)量tg’(冷凍濃縮物的玻璃轉(zhuǎn)變溫度)和tc(初始干燥期間的崩塌溫度)。選擇下表中示出的循環(huán)用于原型批次j7128的凍干。所述退火步驟允許甘露醇的結(jié)晶以確保產(chǎn)物溫度不會(huì)在初始干燥期間降至崩塌溫度之下。選擇初始干燥溫度以在初始干燥的合理持續(xù)時(shí)間內(nèi)避免餅崩塌。開發(fā)2步二次干燥條件以產(chǎn)生具有<1％的水分含量的凍干dp(參見(jiàn)例如表6)。當(dāng)前第1頁(yè)12