一種重組人透明質酸酶凍干制劑及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于制劑領域，涉及一種重組人透明質酸酶凍干制劑及其制備方法和應 用。
【背景技術】
[0002] 透明質酸(hyaluronic acid，HA)又稱糖醛酸、玻璃酸或玻尿酸，是由D-葡萄糖醛 酸及N-乙酰葡糖胺兩個雙糖單位重復連接組成的直鏈高分子糖胺多聚糖，廣泛地存在于脊 椎動物的結締組織、粘液組織、眼球之晶狀體及皮膚中，在胚胎、軟骨、滑液、玻璃體、臍帶、 雞冠等組織中尤為豐富。透明質酸是人體組織基質中分布最廣的一種酸性黏多糖，在體內 具有多種功能，如構成多種基質、限制水分及其它細胞外物質擴散的作用，調節(jié)滲透壓，調 控大分子物質轉運，在細胞周圍形成物理屏障等。由于透明質酸在體內通過形成網狀屏障 填充在胞外基質膠原蛋白纖維骨架之間，限制了藥物大分子物質的皮下擴散，降低藥物到 達血管的速度，且限制皮下注射的液體體積。
[0003] 透明質酸酶(115^1111'0111(^86，說386)，也稱玻璃酸酶，是一種能夠特異性水解透明 質酸、從而提高組織中液體滲透能力的蛋白內切酶，在體內廣泛分布于血清、腦和胎盤等組 織和體液中。通過斷裂葡糖胺的C1和葡萄糖醛酸C4間的葡糖酸鍵對透明質酸水解，暫時降 低細胞間質的粘度，促使皮下輸液、局部積貯的滲出液或血液加快擴散而利于吸收。
[0004] 透明質酸酶于1928年被發(fā)現，1940年研究確定命名，1948年即被FDA批準在美國上 市，作為擴散劑與其他藥物合用。2001年，FDA將透明質酸酶列為短缺藥品。2004年，FDA批準 了兩種透明質酸酶制劑一ISTA Pharmaceuticals公司的羊型透明質酸酶(Vitrase)和 Amphastar Pharmaceuticals公司的牛型透明質酸酶(Amphadase)。2005年底，FDA又批準了 2種新型透明質酸酶制劑的上市申請，即Pr imaPharm公司研制的純化牛睪丸透明質酸酶 (Hydase)和Halozyme制藥有限公司與百特(Baxter)公司共同研制的重組人透明質酸酶 (Hylenex)。在獲批的五種透明質酸酶中，僅有Hylenex為基因工程重組的人源性透明質酸 酶，其他四種均為動物來源的提取產品。由于眾所周知的原料來源問題及動物污染風險等 原因，三種動物來源的產品先后停產。目前市售產品僅剩下羊型透明質酸酶Vitrase和重組 人透明質酸酶Hylenex兩種。
[0005] 美國Halozyme公司的重組人透明質酸酶Hylenex是采用重組DNA技術在CH0細胞中 高效表達，高度純化后獲得的產品，具有純度高，免疫原性低等優(yōu)點，因此快速取代動物提 取的透明質酸酶而廣泛應用。臨床上透明質酸酶與其他注射藥物合用，增加后者的吸收和 分散，可用于皮下輸液，促進手術及創(chuàng)傷后局部水腫或血腫消散以及皮下尿道造影術之中 (改善造影劑硫酸鋇的再吸收）。透明質酸酶還常與局麻藥在眼科手術時合用，加快麻醉藥 的起效速度。此外，全球生物制藥巨頭如羅氏、強生等公司將重組人透明質酸酶Hylenex和 其旗下的數個全球銷量超過50億美金的抗體產品聯用于腫瘤治療，將昂貴的抗體給藥方式 由傳統(tǒng)的靜脈輸液替換為皮下注射，極大的簡化了腫瘤病人的治療方案，大幅降低病人和 醫(yī)療系統(tǒng)的費用支出。
[0006] 市場上廣泛使用的透明質酸酶是一種液體制劑，液體制劑有效成分為重組人透明 質酸酶，其余成分為每毫升8.5mg氯化鈉，1.4mg磷酸氫二鈉，lmg人血白蛋白，1.5mg L-甲硫 氨酸，0.2mg吐溫80，產品的貨架期為24個月。該制劑的缺點在于透明質酸酶在液體制劑中 活性穩(wěn)定性較差，運輸，倉儲，使用均不方便。更重要的為了維持酶的活性，液體制劑中使用 了人血白蛋白，人血白蛋白不僅成本高且來源于血漿，被病原體感染的風險高。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對現有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種重組人透明質酸酶凍干制劑及 其制備方法和應用。
[0008] 為達此目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0009] -方面，本發(fā)明提供一種重組人透明質酸酶凍干制劑，所述重組人透明質酸酶凍 干制劑以10000支計算，包含如下組分：
[0010] 重組人透明質酸酶 1400000~500000000IU 緩沖劑 5~1:0 g 冷凍保護剤 60~180 g 賦形劑 1節(jié)~3W g 酶活保護劑 5~12g 表面活性劑 0.3~5 g。
[0011] 在本發(fā)明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含重組人透明質酸 酶 1400000 ~500000000IU，例如 1400000IU、1500000IU、1800000IU、1700000IU、1800000IU、 1900000IU、2000000IU、3000000IU、5000000IU、8000000IU、10000000IU、50000000IU、 80000000IU、100000000IU、300000000IU或500000000IU。
[0012] 在本發(fā)明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含緩沖劑5~10g， 例如5g、5 · 3g、5 · 5g、5 · 8g、6g、6.3g、6 · 5g、6.8g、7g、7 · 2g、7 · 5g、7 · 8g、8g、8 · 3g、8.5g、8.8g、 9g、9.2g、9.5g、9.8gSl0g。
[0013] 在本發(fā)明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含冷凍保護劑60~ 180gJ^|^n60g、65g、70g、80g、90g、100g、110g、120g、130g、140g、150g、160g、170gSl80g。
[0014] 在本發(fā)明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含賦形劑180~ 300gjl^ni80g、185g、190g、195g、200g、210g、220g、230g、240g、250g、260g、270g、280g、 290g或300g。
[0015] 在本發(fā)明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含酶活保護劑5~ 12gj|^n5g、6g、7g、8g、9g、10g、llgSl2g。
[0016] 在本發(fā)明的重組人透明質酸酶凍干制劑中，以10000支計算，包含表面活性劑0.3 ~5gjl^n0.3g、0.4g、0.5g、0.7g、0.9g、lg、1.3g、1.5g、1.8g、2g、2.2g、2.5g、2.8gS3g。
[0017] 優(yōu)選地，在本發(fā)明中，所述重組人透明質酸酶通過CH0表達的細胞上清液純化得 到。
[0018] 優(yōu)選地，所述重組人透明質酸酶純度>95%，比活大于100000IU/mg。
[0019] 在本發(fā)明中，所述緩沖劑為磷酸鹽緩沖液。
[0020] 優(yōu)選地，所述冷凍保護劑為蔗糖、海藻糖、麥芽糖或乳糖中的任意一種或至少兩種 的組合，優(yōu)選為蔗糖和/或海藻糖。
[0021 ]優(yōu)選地，所述賦形劑為甘露醇和/或甘氨酸，優(yōu)選為甘露醇。
[0022]優(yōu)選地，所述酶活保護劑為氯化鈉、氯化鈣或乙二胺四乙酸二鈉中的任意一種或 至少兩種的組合，優(yōu)選為氯化鈣和乙二胺四乙酸二鈉的組合。
[0023] 優(yōu)選地，以10000支計算，所述重組人透明質酸酶凍干制劑中氯化鈣的含量為1.2-2.48，例如1.28、1.38、1.58、1.78、1.98、28、2.18、2.28、2.38或2.4 8，乙二胺四乙酸二鈉含 量為 4.8_6.0gj|^n4.8g、4.9g、5g、5.2g、5.4g、5.6g、5.8g、5.9gS6g。
[0024] 優(yōu)選地，所述表面活性劑為聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80或Triton X-100中的任 意一種或至少兩種的組合，優(yōu)選為聚山梨醇酯20和/或聚山梨醇酯80。
[0025] 優(yōu)選地，所述凍干制劑用注射用水溶解后，用于皮下或者靜脈注射。
[0026] 另一方面，本發(fā)明提供了如第一方面所述的重組人透明質酸酶凍干制劑的制備方 法，所述方法包括以下步驟：
[0027] A、重組人透明質酸酶、緩沖劑、冷凍保護劑、賦形劑、酶活保護劑和表面活性劑加 入至水中混合均勻，制備得到重組人透明質酸酶液體制劑；
[0028] B、將步驟A得到的重組人透明質酸酶液體制劑進行分裝，分裝后的制劑冷凍干燥 得到重組人透明質酸酶凍干制劑。
[0029]優(yōu)選地，所述冷凍干燥過程為：
[0030] (1)在-2Γ ~-8Γ環(huán)境下，例如在-2Γ、-3 Γ、-4Γ、-5Γ、-6Γ、-7Γ或-8Γ，預凍 0.5~lhj|^n0.5h、0.6h、0.7h、0.8h、0.9hSlh;
[0031] (2)在-35Γ ~_4(TC 環(huán)境下，例如在 _35。(：、-36。(：、-37。(：、-38。(：、-39。(：或-40。(：，預 凍2 ~4h，例如 2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8h、3h、3.3h、3.5h、3.7h、3.9hS4h;
[0032] (3)在-15Γ ~-3(TC，例如-20Γ、-2Γ(：、-22Γ、-23Γ、-24Γ、-25Γ、-26Γ、-27 °C、-28°C、-29°C或-3CTC，10~20mbar環(huán)境下，例如lOmbar、1 lmbar、12mbar、13mbar、 14mbar、15mbar、16mbar、17mbar、18mbar、19mbar 或 20mbar，干燥 15~25h，例如 15h、16h、 17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24hS25h;
[0033] (4)在-5Γ ~1(TC，例如-5Γ、-4Γ、-3Γ、-2Γ、-Γ(：、(Τ(：、Γ(：、2Γ、3Γ、4Γ、5Γ、 6°C、7°C、8°C、9°C或 10°C，10~20mbar環(huán)境下，例如lOmbar、1 lmbar、12mbar、13mbar、 14mbar、15mbar、16mbar、17mbar、18mbar、19mbar 或 20mbar，干燥0 · 5 ~3h，例如0 · 5h、0 · 7h、 0.9h、lh、1.3h、1.5h、1.8h、2h、2.2h、2.4h、2.6h、2.8hS3h;
[0034] (5)在15Γ ~3(TC，例如15Γ、16Γ、17Γ、18Γ、1%~、20Γ、22Γ、24Γ、26Γ、28 °C、29°C或3CTC，10~20mbar環(huán)境下，例如lOmbar、llmbar、12mbar、13mbar、14mbar、15mbar、 1611^&1'、1711^&1'、1811^&1'、1911^&1'或2〇11^&1'，干燥5~15]1，例如5]1、6]1、7]1、8]1、9]1、1〇]1、11]1、 12h、13h、14h或15h。
[0035] 另一方面，本發(fā)明提供了所述重組人透明質酸酶凍干制劑在制備促進手術及創(chuàng)傷 后局部水腫或血腫消散、促進局麻藥的浸潤、減輕注射部位的疼痛或者加速皮下注射或