一種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應用，所述重組人透明質(zhì)酸酶采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-IgFc，用于粘膜或皮膚表面。所述人透明質(zhì)酸酶制劑可制成膜片劑、噴劑、洗劑、凍干粉噴霧劑等形式，用于美容營養(yǎng)物質(zhì)皮膚促滲、表面麻醉劑皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長因子粘膜皮膚促滲、降糖藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲等。
【專利說明】—種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種重組人透明質(zhì)酸酶、其生產(chǎn)純化方法、制劑及使用方法與應用。
【背景技術】
[0002]透明質(zhì)酸是真皮中主要的粘多糖形式，是由重復的二糖單元D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺組成的線性多糖。透明質(zhì)酸能夠保持超過自身重量500倍的水分，形成非常粘稠的溶液，填充在胞外基質(zhì)膠原蛋白纖維骨架之內(nèi)，影響胞外基質(zhì)的傳質(zhì)特征。胞外基質(zhì)是許多藥物進行皮下注射的主要障礙。膠原蛋白纖維構成的固態(tài)基架與嵌入富含透明質(zhì)酸的黏性凝膠，造成一定的傳質(zhì)阻力，限制了藥物代謝動力學以及能夠從同一位點進行皮下注射的液體體積，以及到達血管的速度和數(shù)量。透明質(zhì)酸酶是最有效的組織藥物滲透和藥物擴散劑，自然界中毒蛇昆蟲咬人都是利用透明質(zhì)酸酶快速促進毒物滲透和攻擊獵物。
[0003]透明質(zhì)酸酶是降解透明質(zhì)酸的酶家族，通過催化透明質(zhì)酸的水解，透明質(zhì)酸酶降低透明質(zhì)酸的黏度，可逆性地改變真皮的結構，由此提高組織的通透性。透明質(zhì)酸半衰期15-20h，在體內(nèi)更新時間短，皮膚能夠快速修復?；谕该髻|(zhì)酸酶的打通胞外基質(zhì)屏障給藥是一種新型高效給藥平臺。根據(jù)作用機理與降解產(chǎn)物的不同，可將透明質(zhì)酸酶分為三類。第一類包括β-D-乙酰-D-己糖胺酶，將高分子量底物降解成四糖作為主要的終產(chǎn)物。睪丸透明質(zhì)酸酶是這一種類的原型，它能夠催化轉(zhuǎn)糖基作用，因此，在水解HA的過程中也會形成六碳糖、二糖以及八碳糖。第二類，以水蛭透明質(zhì)酸酶為代表的透明質(zhì)酸酶。第三類，細菌透明質(zhì)酸酶，是裂解酶。
[0004]自1940s以來，動物組織中提取的含透明質(zhì)酸酶活性的擴散因子已作為促擴散劑用于臨床給藥。但是其應用范圍一直限定于緊急情況，主要是因為對成分不完全明確的酶制劑中其他雜質(zhì)成分的顧慮。動物組織提取透明質(zhì)酸酶制劑中有效成分小于1%，絕大部分為異源雜質(zhì)蛋白。
[0005]繼中性人透明質(zhì)酸酶基因發(fā)現(xiàn)之后(現(xiàn)專利已過期)，美國Hylozyme公司采用DNA來源的重組人源透明質(zhì)酸酶(PH20)取代動物源純化的透明質(zhì)酸酶，降低免疫原性、提升安全性，擴大應用范圍。重組人透明質(zhì)酸酶PH20有六個糖化點和五個二硫鍵，工業(yè)上難于高表達和生產(chǎn)，除美國Hylozyme公司采用基因拷貝擴增`技術和CHO細胞成功表達和生產(chǎn)了重組人透明質(zhì)酸酶PH20外，到目前為止還沒有其它報道使用非基因拷貝擴增技術和新型CHO細胞(CHO-S)成功表達和生產(chǎn)了糖化完整比活性和Hylozyme公司表達和生產(chǎn)的重組人透明質(zhì)酸酶PH20比活性相似的重組人透明質(zhì)酸酶PH20的案例。
[0006]重組人透明質(zhì)酸酶(PH20)半衰期短，已有人使用聚乙二醇化學偶聯(lián)PH20，生產(chǎn)了長效人透明質(zhì)酸酶，已用于人類臨床實驗治療腫瘤。
[0007]透明質(zhì)酸酶主要用于皮下輸液、眼周手術麻醉、化藥和生物藥促滲、尿路造影術中造影劑的吸收，其中和生物藥制成復方注射劑的藥物有胰島素、抗體和免疫球蛋白。
[0008]透明質(zhì)酸廣泛分布于皮膚、口腔、舌下粘膜、牙齦表面組織、鼻粘膜和腸道粘膜(如肛腸)等。由于舌下粘膜、牙齦表面組織、鼻粘膜和腸道粘膜上皮細胞沒有角化，有利于粘膜局部直接使用透明質(zhì)酸酶促進其他藥物(化藥、生物藥)的滲透。目前還沒有使用人透明質(zhì)酸酶膜片劑、噴劑或洗劑等促進面部美容營養(yǎng)品、麻醉藥、化藥、生物藥經(jīng)皮膚和粘膜(舌下粘膜、頰粘膜、軟腭粘膜、硬腭粘膜、牙齦粘膜)滲透的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的一個目的是提供一種促滲效果好的重組人透明質(zhì)酸酶。
[0010]本發(fā)明的第二個目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶生產(chǎn)純化方法。
[0011]本發(fā)明的第三個目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶制劑。
[0012]本發(fā)明的第四個目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法。
[0013]本發(fā)明的第五個目的是提供一種重組人透明質(zhì)酸酶的應用。
[0014]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案:
[0015]一種重組人透明質(zhì)酸酶，用于粘膜或皮膚表面，采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ;其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示,所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0016]所述重組人透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)純化方法，使用富含GC基因表達載體pMH3、pMH4或PMH5載體、新型CHO-S細胞進行生產(chǎn)，再采用Q瓊脂糖離子交換層析_苯基瓊脂糖疏水相互作用層析-羥基磷灰石層析-SP瓊脂糖離子交換層析四步純化方法進行純化。
`[0017]一種重組人透明質(zhì)酸酶制劑，包含上述的重組人透明質(zhì)酸酶，所述制劑采用膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式，所述膜片劑是以吸水膜為承載基礎。
[0018]進一步地，包括150-1500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，5_15mM Na2HPO4,0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且 pH 值為5.5~7.5。
[0019]進一步地，包括500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，IOmM Na2HPO4,0.03%CaCl2,0.1%EDTA-Na2,145mM NaCl，0.1%HSA,且 pH 值為 5.5-7.5。
[0020]進一步地，所述液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式的制劑包括:胰島素20-160單位/ml、200-1000 單位 PH20 或 PH20-HAS 或 PH20_IgFc/ml。
[0021]進一步地，所述胰島素可替換為神經(jīng)生長因子或神經(jīng)保護肽NAP。
[0022]上述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，先使用重組人透明質(zhì)酸酶制劑促進皮膚或粘膜的滲透性，使其作為配合給藥的促滲劑，再針對皮膚或粘膜進行給藥，或者將藥物與所述制劑預先混合后再針對皮膚或粘膜使用。
[0023]上述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，將所述制劑噴入鼻腔粘膜。
[0024]一種重組人透明質(zhì)酸酶的應用，作為促滲劑配合給藥，用于粘膜或皮膚表面。
[0025]進一步地，所述重組人透明質(zhì)酸酶包括重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ;其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0026]進一步地，所述透明質(zhì)酸酶用于美容營養(yǎng)物質(zhì)的皮膚促滲、表面麻醉劑的皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的皮膚促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲。
[0027]進一步地，所述美容營養(yǎng)物質(zhì)包括成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述麻醉劑包括利多卡因、復方利多卡因或丁卡因；所述皮膚病治療藥物包括維生素A酸、抗菌素、糖皮質(zhì)激素、抗菌素或消毒劑；所述生物安定藥包括褪黑色素或胰島素；所述生長因子包括生長激素、生長激素促釋放激素、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述降糖藥包括胰島素、Extendin-4、GLPl或Leptin ;所述心血管藥包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸異山梨酯或速效救心丸；所述中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)包括神經(jīng)保護肽NAP、神經(jīng)生長因子或胰島素；所述其他不同生物活性物質(zhì)和藥物包括鹽酸納洛酮、鹽酸阿撲嗎啡、睡眠康寧(腦部睡眠因子MT)、阿莫沙平、尼古丁、肝素、鹽酸丁丙諾非、復方丹參、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定(異丙腎上腺素)、鹽酸克倫特羅、干擾素、白介素2、腫瘤壞死因子、紅細胞生成素、白細胞生成素、心鈉素、生長抑素、降鈣素、甲狀旁腺激素、蜂皇漿、生長激素促釋放激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、ddAVP、金剛燒妝、阿昔洛韋、利托那韋或卻地那韋。
[0028]由于采用上述技術方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點:
[0029]本發(fā)明的重組人透明質(zhì)酸酶可制成膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑，在配合給藥中預先使用可促進皮膚、粘膜等的滲透性，增強皮膚、粘膜對美容營養(yǎng)物質(zhì)、表面麻醉劑、皮膚病治療藥物、生物安定藥、生長因子、降糖藥、心血管藥、中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)或其他不同生物活性物質(zhì)或藥物的吸收；也可以預先與特定藥物混合或制成復方制劑使用。
【具體實施方式】
[0030]本發(fā)明主要是利用富含GC動物細胞表達技術(W0/2008/091276)和動物細胞反應器(W02006/138143和W02007/142664)生產(chǎn)重`組人透明質(zhì)酸酶PH20、人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白(PH20-HSA)和人透明質(zhì)酸酶人免疫球白蛋IgG2Fc片段融合蛋白(PH20_IgFc)，制造重組人透明質(zhì)酸酶膜片劑、液體噴劑、洗劑和凍干粉噴霧劑等，用于美容營養(yǎng)物質(zhì)皮膚促滲、表面麻醉劑皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲等。
[0031]本發(fā)明的一種重組人透明質(zhì)酸酶，用于粘膜或皮膚表面，采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ;其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0032]所述重組人透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)純化方法，使用富含GC基因表達載體pMH3、pMH4或pMH5載體、新型CHO-S細胞進行生產(chǎn)，再采用Q瓊脂糖離子交換層析_苯基瓊脂糖疏水相互作用層析-羥基磷灰石層析-SP瓊脂糖離子交換層析四步純化方法進行純化。
[0033]包含上述重組人透明質(zhì)酸酶的制劑，可以采用膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式，膜片劑可以吸水膜為承載基礎，如紗布、無紡布等。
[0034]所述制劑包括150-1500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，5_15mM Na2HPO4,0.01-0.06%CaCl2，0.05-0.2%EDTA-Na2，100-200mM NaCl，0.05-0.2%HSA，且 pH 值為
5.5-7.5。優(yōu)選地，所述制劑包括500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，IOmM Na2HPO4,0.03%CaCl2,
0.1%EDTA-Na2,145mM NaCl，0.1%HSA，且pH值為5.5-7.5。使用時可以先使用重組人透明質(zhì)酸酶制劑促進皮膚或粘膜的滲透性，使其作為配合給藥的促滲劑，再針對皮膚或粘膜進行給藥，或者將藥物與所述制劑預先混合后再針對皮膚或粘膜使用。
[0035]液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式的制劑包括:胰島素20-160單位/ml、200_1000單位PH20或PH20-HAS或PH20_IgFc/ml。其中，胰島素可替換為神經(jīng)生長因子或神經(jīng)保護肽NAP。使用時將所述制劑噴入鼻腔粘膜即可。
[0036]上述重組人透明質(zhì)酸酶的應用，作為促滲劑配合給藥，用于粘膜或皮膚表面。可用于美容營養(yǎng)物質(zhì)的皮膚促滲、表面麻醉劑的皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的皮膚促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲。
[0037]其中，所述美容營養(yǎng)物質(zhì)包括成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述麻醉劑包括利多卡因、復方利多卡因或丁卡因；所述皮膚病治療藥物包括維生素A酸、抗菌素、糖皮質(zhì)激素、抗菌素或消毒劑；所述生物安定藥包括褪黑色素或胰島素；所述生長因子包括生長激素、生長激素促釋放激素、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、膠原或透明質(zhì)酸；所述降糖藥包括胰島素、Extendin-4、GLPl或L印tin ;所述心血管藥包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸異山梨酯或速效救心丸；所述中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)包括神經(jīng)保護肽NAP、神經(jīng)生長因子或胰島素；所述其他不同生物活性物質(zhì)和藥物包括鹽酸納洛酮、鹽酸阿撲嗎啡、睡眠康寧(腦部睡眠因子MT)、阿莫沙平、尼古丁、肝素、鹽酸丁丙諾非、復方丹參、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定(異丙腎上腺素)、鹽酸克倫特羅、干擾素、白介素2、腫瘤壞死因子、紅細胞生成素、白細胞生成素、心鈉素、生長抑素、降鈣素、甲狀旁腺激素、蜂皇漿、生長激`素促釋放激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、ddAVP、金剛烷肽、阿昔洛韋、利托那韋或卻地那韋等。
[0038]以下結合優(yōu)選實施例進行說明，應當理解此處所描述的優(yōu)選實施例僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。由于人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白(PH20-HSA)，以及人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白(PH20-1gFc)的生產(chǎn)原理、方法及應用與重組人透明質(zhì)酸酶(PH20)相同或類似，因此以下實施例中僅以PH20為例進行具體說明。
[0039]實施例1
[0040]目的:重組人透明質(zhì)酸酶PH20的基因構建、表達、免疫學檢測、活性檢測和反應器生產(chǎn)。
[0041]研究背景:重組人透明質(zhì)酸酶PH20有六個糖化點和五個二硫鍵，工業(yè)上難于高表達和生產(chǎn)。除美國Hylozyme公司采用基因拷貝擴增技術成功表達和生產(chǎn)了重組人透明質(zhì)酸酶PH20外，到目前為止還沒有其它報道使用非基因拷貝擴增技術和新型CHO細胞(CHO-S)成功表達和生產(chǎn)了糖化完整比活性和Hylozyme公司表達和生產(chǎn)的重組人透明質(zhì)酸酶PH20比活性相似的重組人透明質(zhì)酸酶PH20的案例。
[0042]本發(fā)明利用我們有自主知識產(chǎn)權的非基因拷貝擴增技術，即富含GC動物細胞表達技術(W0/2008/091276)和動物細胞反應器(W02006/138143和W02007/142664)技術，使用新型CHO細胞(CHO-S)生產(chǎn)出高質(zhì)量可商業(yè)化的重組人透明質(zhì)酸酶PH20。[0043]方法:通過PCR的方法將表達PH20氨基酸順序(SEQ ID N0.1)的結構基因(SEQ IDN0.4)合成，并構建到富含GC的動物細胞表達載體pMH3、pMH4、pMH5 (SEQ ID N0.5、6、7)中，小量制備這幾種表達質(zhì)粒后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染到無血清懸浮培養(yǎng)的新型CHO細胞(CHO-S)中。通過G418師選，用槍頭手動挑取穩(wěn)定克隆到96孔板中。當細胞匯合度大于50%時，更換無血清新鮮培養(yǎng)基；3_6小時后，收集培養(yǎng)基樣品，通過檢測透明質(zhì)酸酶生物活性，選出表達量最高的克隆多個。在40ml搖瓶懸浮流加培養(yǎng)13天，活性單位呈增長趨勢，最高收液培養(yǎng)液中活性單位為2000U/ml。繼續(xù)在尖底小搖瓶內(nèi)進行無血清培養(yǎng)和做傳代穩(wěn)定性研究；選出傳代穩(wěn)定的克隆在5L激流式反應器內(nèi)進行擴增。PH20在AP20SC (5L)反應器上的大規(guī)模培養(yǎng)工藝開發(fā):接種密度:2X 106個cells/ml ;參數(shù)工藝:T:生長期37°C，表達期34°C ；DO:5-10%PH:6.8-7.2 ;生長期培養(yǎng)基:B001，流加培養(yǎng)基:F001+糖；培養(yǎng)進入表達期后，每天調(diào)一次PH至6.8，然后關閉加堿泵；培養(yǎng)周期16天，最高活性為3522U/ml。
[0044]結果:(1)重組人透明質(zhì)酸酶PH20在新型CHO細胞(CHO-S)中成功表達，westernblot結果表明篩選到重組人透明質(zhì)酸酶PH20穩(wěn)定高表達克隆所產(chǎn)生的條帶分子量大小正確；(2)高表達克隆在尖底小搖瓶內(nèi)進行無血清培養(yǎng)和做傳代穩(wěn)定；(3)穩(wěn)定的高表達克隆在5L激流式反應器內(nèi)進行流加培養(yǎng)擴增，各批次豐收液中透明質(zhì)酸酶活性達到1800-3500活性單位/毫升，達到了工業(yè)化生產(chǎn)水平。
[0045]結論:使用富含GC的動物細胞表達載體pMH3、4、5，重組人透明質(zhì)酸酶PH20在新型CHO細胞(CHO-S)中成功表達，各批次豐收液中透明質(zhì)酸酶活性達到1800-3500活性單位/毫升，即每毫升培養(yǎng)液可以生產(chǎn)150單位的注射用重組人透明質(zhì)酸酶5-10支，滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求。
[0046]實施例2
[0047]目的:重組人透明質(zhì)酸酶PH20的分離純化。
[0048]方法:發(fā)酵液前處理:將所得5`L激流式反應器所得發(fā)酵液使用固液分離裝置(離心機、膜包、中空纖維柱、套筒等)獲得上清，在IOmM Tris pH7.5中切向流透析，然后通過Q瓊脂糖離子交換層析、苯基瓊脂糖疏水相互作用層析、羥基磷灰石層析和SP瓊脂糖離子交換層析，純化人重組透明質(zhì)酸酶。
[0049]層析:用IOmM Tris+50mM NaCl pH7.5緩沖液沖洗10個柱體積，將人重組透明質(zhì)酸酶結合到Q瓊脂糖柱上，再用含有400mM NaCL的同樣的緩沖液洗脫。將洗脫峰用2M硫酸銨稀釋至最終濃度為500mM，并流穿通過苯基瓊脂糖柱。補加IOmM K3PO4至IOmM，pH7.4，流穿通過羥基磷灰石柱。將上一步收集流穿液以切向流設備緩沖液置換除鹽，電導為5ms/cm, pH5.4，再用含有140mM NaCl的同樣緩沖液洗脫。
[0050]將用20mM His+100mM NaCl pH7.0濃縮換液上述洗脫峰至濃度為lmg/ml，置于-20
度保存。
[0051]結果:通過SDS-PAGE電泳顯示其純度大于95% ;通過分子篩HPLC檢測顯示其純度為99% ;蛋白總收率約為40% ；
[0052]結論:重組人透明質(zhì)酸酶PH20經(jīng)分離純化后，純度符合要求；每毫克重組人透明質(zhì)酸酶活性13-16萬單位，內(nèi)毒素遠低于國家藥監(jiān)局要求。
[0053]實施例3
[0054]目的:重組人透明質(zhì)酸酶PH20的活性和穩(wěn)定性研究[0055]方法:重組人透明質(zhì)酸酶PH20液體制劑配方和穩(wěn)定性研究方法如下:
[0056]制劑配方:1500IUPH20+10mM Na2HP04+0.03%CaC12+0.l%EDTA-Na2+145mMNaCl+0.1%HSA pH5.5-7.5
[0057]穩(wěn)定性研究:將500U/ml PH20過濾后的溶液分裝至2ml安培瓶中，將25瓶溶液置于37 °C，濕度為75 土 5%的加速試驗培養(yǎng)箱中。分別在第O、7、14、21、28、35、42天取樣，按照2010版藥典附錄玻璃酸酶活性檢測。
[0058]結果:
[0059]表1、重組人透明質(zhì)酸酶PH20穩(wěn)定性研究
[0060]
【權利要求】
1.一種重組人透明質(zhì)酸酶，其特征在于，用于粘膜或皮膚表面，采用重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ； 其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組人透明質(zhì)酸酶的生產(chǎn)純化方法，其特征在于，使用富含GC基因表達載體pMH3、pMH4或pMH5載體、新型CHO-S細胞進行生產(chǎn)，再采用Q瓊脂糖離子交換層析-苯基瓊脂糖疏水相互作用層析-羥基磷灰石層析-SP瓊脂糖離子交換層析四步純化方法進行純化。
3.—種重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，包含權利要求1所述的重組人透明質(zhì)酸酶，所述制劑采用膜片劑、洗劑、液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式，所述膜片劑是以吸水膜為承載基礎。
4.根據(jù)權利要求3所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，包括150-1500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，5-15mM Na2HPO4,0.01-0.06%CaCl2,0.05-0.2%EDTA-Na2,100-200mMNaCl，0.05-0.2%HSA，且 pH 值為 5.5-7.5。
5.根據(jù)權利要求4所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，包括500IU/ml的重組人透明質(zhì)酸酶，IOmM Na2HPO4,0.03%CaCl2,0.1%EDTA-Na2,145mM NaCl，0.1%HSA,且 pH 值為5.5~7.5。
6.根據(jù)權利要求3所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，所述液體噴劑或凍干粉噴霧劑形式的制劑包括:胰島素20-160單位/ml、200-1000單位PH20或PH20-HAS或PH20-1gFc/ml。
7.根據(jù)權利要求6所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑，其特征在于，所述胰島素可替換為神經(jīng)生長因子或神經(jīng)保護肽NAP。
8.根據(jù)權利要求3-5任一項所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，其特征在于，先使用重組人透明質(zhì)酸酶制劑促進皮膚或粘膜的滲透性，使其作為配合給藥的促滲劑，再針對皮膚或粘膜進行給藥，或者將藥物與所述制劑預先混合后再針對皮膚或粘膜使用。
9.根據(jù)權利要求6或7所述的重組人透明質(zhì)酸酶制劑的使用方法，其特征在于，將所述制劑噴入鼻腔粘膜。
10.一種重組人透明質(zhì)酸酶的應用，其特征在于，作為促滲劑配合給藥，用于粘膜或皮膚表面。
11.根據(jù)權利要求10所述的重組人透明質(zhì)酸酶的應用，其特征在于，所述重組人透明質(zhì)酸酶包括重組人透明質(zhì)酸酶PH20或人透明質(zhì)酸酶人白蛋白融合蛋白PH20-HSA或人透明質(zhì)酸酶人免疫球蛋白IgG2Fc片段融合蛋白PH20-1gFc ； 其中，所述PH20的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，所述PH20-HSA的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，所述PH20-1gFc的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
12.根據(jù)權利要求10或11所述的重組人透明質(zhì)酸酶的應用，其特征在于，所述透明質(zhì)酸酶用于美容營養(yǎng)物質(zhì)的皮膚促滲、表面麻醉劑的皮膚粘膜促滲、皮膚病治療藥物的皮膚促滲、生物安定藥粘膜促滲、生長因子粘膜促滲、降糖藥粘膜促滲、心血管藥粘膜促滲、中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)粘膜鼻腔促滲，或其他不同生物活性物質(zhì)和藥物的皮膚或粘膜促滲。
13.根據(jù)權利要求12所述的重組人透明質(zhì)酸酶的應用，其特征在于，所述美容營養(yǎng)物質(zhì)包括成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子、膠原或透明質(zhì)酸； 所述麻醉劑包括利多卡因、復方利多卡因或丁卡因； 所述皮膚病治療藥物包括維生素A酸、抗菌素、糖皮質(zhì)激素、抗菌素或消毒劑； 所述生物安定藥包括褪黑色素或胰島素； 所述生長因子包括生長激素、生長激素促釋放激素、胰島素樣生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、膠原或透明質(zhì)酸； 所述降糖藥包括胰島素、Extendin-4、GLPl或Leptin ； 所述心血管藥包括硝酸甘油、硝苯地平、硝酸異山梨酯或速效救心丸；` 所述中樞神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì)包括神經(jīng)保護肽NAP、神經(jīng)生長因子或胰島素； 所述其他不同生物活性物質(zhì)和藥物包括鹽酸納洛酮、鹽酸阿撲嗎啡、睡眠康寧(腦部睡眠因子MT)、阿莫沙平、尼古丁、肝素、鹽酸丁丙諾非、復方丹參、硝苯吡啶、唑吡坦、喘息定(異丙腎上腺素)、鹽酸克倫特羅、干擾素、白介素2、腫瘤壞死因子、紅細胞生成素、白細胞生成素、心鈉素、生長抑素、降鈣素、甲狀旁腺激素、蜂皇漿、生長激素促釋放激素、催產(chǎn)素、抗利尿激素、ddAVP、金剛烷肽、阿昔洛韋、利托那韋或茚地那韋。
【文檔編號】A61K47/30GK103468662SQ201310454955
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月29日 優(yōu)先權日:2013年9月29日
【發(fā)明者】惠覓宙 申請人:惠覓宙