專利名稱：：編碼透明質(zhì)酸合酶的核酸及其應(yīng)用方法編碼透明質(zhì)酸合酶的核酸及其應(yīng)用方法本申請是申請日為1999.4.1，申請?zhí)枮?9806942.6,發(fā)明名稱為"編碼透明質(zhì)酸合酶的核酸及其應(yīng)用方法"的中國專利申請的分案。相關(guān)申請的交叉引用本申請涉及1998年4月2日申請的美國臨時(shí)專利申請系列號60/080,414，發(fā)明名稱為"來自多殺巴斯德氏菌(Pa^/re〃amM/tocWa)的獨(dú)特透明質(zhì)酸合酶"，該文在此提及可供參考。本申請還是1998年10月26日申請的發(fā)明名稱為"透明質(zhì)酸合酶基因及其應(yīng)用"的美國專利申請系列號09/178,851的部分繼續(xù)申請，該文在此提及可供參考。本發(fā)明的背景1.本發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及來自多殺巴斯德氏菌(尸as/we〃aww/toc^a)的編碼透明質(zhì)酸合酶的DNA序列。尤其是，本發(fā)明涉及能夠被置于重組結(jié)構(gòu)之中從而能夠在異源宿主中表達(dá)透明質(zhì)酸合酶的、來自多殺巴斯德氏菌的編碼透明質(zhì)酸合酶的DNA序列。本發(fā)明還涉及利用來自多殺巴斯德氏菌的編碼透明質(zhì)酸合酶的DNA序列的方法，所述利用方法為(1)生產(chǎn)具有不同大小分布的透明質(zhì)酸聚合物；(2)生產(chǎn)摻有取代的或添加的基糖的透明質(zhì)酸聚合物；(3)開發(fā)新的動(dòng)物疫苗；和(4)開發(fā)新的檢測或鑒定動(dòng)物病原體的診斷檢測。-2.背景領(lǐng)域的簡要描述多糖透明質(zhì)酸("HA")或者稱透明質(zhì)酸(hyaluronan)是高等動(dòng)物的一種基本成分，它具有結(jié)構(gòu)上和識別上的功能。在哺乳動(dòng)物和鳥類中，HA在皮膚、關(guān)節(jié)滑液、和眼睛的玻璃體中大量存在。某些病原性細(xì)菌，S口，格蘭氏陽性菌的A組和C組鏈球菌屬和格蘭氏陰性菌的CarterA型多殺巴斯德氏菌，產(chǎn)生細(xì)胞外含有HA的被膜，該HA與在它們的脊椎動(dòng)物宿主中發(fā)現(xiàn)的HA分子具有相同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。這種"分子擬態(tài)"挫敗了對此被膜多糖產(chǎn)生強(qiáng)抗體反應(yīng)的企圖。相反，其他細(xì)菌產(chǎn)生的具有不同結(jié)構(gòu)的被膜多糖常常很快顯示抗原性。這種HA被膜還表現(xiàn)出能幫助病原體逃避宿主的防御，包括噬菌作用。歷史上，本領(lǐng)域的研究人員未能克隆或鑒定出巴斯德氏菌屬的透明質(zhì)酸合酶("HAS")。來自A組和C組鏈球菌屬的細(xì)菌HAS酶已被鑒定和克隆。來自化膿鏈球菌的HasA是第一個(gè)被徹底鑒定的HAS。這一整合膜蛋白利用了細(xì)胞內(nèi)的UDP-Glc和UDP-GlcNAc作為其底物。新生的HA鏈被排出細(xì)胞膜而形成細(xì)胞外被膜。一種非洲爪蟾屬的蛋白，DG42，也已被確定為一種HAS。幾種人和鼠的DG42同源物，被稱為HAS1、HAS2和HAS3，也已經(jīng)得到了鑒定。這些己經(jīng)被分子克隆的哺乳動(dòng)物的酶之間在氨基酸水平上具有相當(dāng)大的相似性，但是它們卻位于不同的染色體上。來自多殺巴斯德氏菌的獨(dú)特的HAS所具有的初級結(jié)構(gòu)，并不很地相似于先前克隆的來自鏈球菌、PBCV-1病毒或高等動(dòng)物的酶?，F(xiàn)已鑒定出一種帶有稱作A98R的ORF的病毒HAS，它與鏈球菌屬和脊椎動(dòng)物的酶具有28-30%的相同性。PBCV-1(Parameciumbursaria綠藻病毒)在剛剛感染與其綠藻相似的綠色海藻宿主之后就產(chǎn)生出真正的HA多糖。A98R是第一個(gè)被鑒定的能夠產(chǎn)生碳水化合物聚合物的由病毒編碼的酶。CarterA型多殺巴斯德氏菌，作為禽霍亂的病原體，導(dǎo)致了美國家禽產(chǎn)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。無被膜的多殺巴斯德氏菌突變體在對火雞靜脈注射之后并不在血液中大量生長，而帶有被膜的菌株則迅速繁殖并在1至2天內(nèi)導(dǎo)致死亡。天然產(chǎn)生的無被膜的突變體菌株比野生型的毒性低105倍，但是所有遺傳缺陷的特性在本發(fā)明公開的突變體(如下所述)之前還未有了解。巴斯德氏菌細(xì)菌性病原體導(dǎo)致了美國農(nóng)業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失。多殺巴斯德氏菌的細(xì)胞外被膜被認(rèn)為是主要的致病因素。A型被膜有多糖構(gòu)成，稱作HA，該多糖與宿主體內(nèi)正常的多糖相同，因而不為免疫系統(tǒng)察覺。這種"分子擬態(tài)"還干擾了宿主的防御，諸如噬菌作用和互補(bǔ)介導(dǎo)的溶菌作用。而且，HA不呈顯著的免疫原性，因?yàn)槠湟餅樗拗黧w內(nèi)的正常成分。由不同的多糖構(gòu)成的其他細(xì)菌的被膜卻通常成為免疫系統(tǒng)的主要標(biāo)靶。針對被膜引物產(chǎn)生的抗體常產(chǎn)生應(yīng)答以清除微生物并長期免疫。了解了對病原體毒性產(chǎn)生應(yīng)答的因子，這為如何聰明而有效地戰(zhàn)勝疾病提供了線索。A型多殺巴斯德氏菌中毒性因素之一就是非免疫原性HA的保護(hù)性護(hù)罩，它是宿主防御幾乎無法克服的屏障。少數(shù)菌株并不顯示出依賴HA被膜的保護(hù)，而是利用其它未知的因子來對抗宿主的機(jī)制?；蛘撸@些菌株可具有更小的被膜而無法被經(jīng)典的檢測所探査。對于雞特別是火雞，禽霍亂可以是毀滅性的。幾個(gè)至1000個(gè)帶有被膜的菌株就可以在24-48小時(shí)之內(nèi)殺死一只火雞。在北美禽霍亂是一種經(jīng)濟(jì)上極具危害性的疾病。1980年代后期進(jìn)行的研究顯示出了禽霍亂對火雞產(chǎn)業(yè)的影響(i)一個(gè)州每年損失$600，000，(ii)治療病禽的抗生素花費(fèi)了$0.40/只，(iii)禽霍亂導(dǎo)致的疾病占所有疾病的14.7-18%，并且(iv)花費(fèi)$0.12/只禽用于預(yù)防感染。某些A型多殺巴斯德氏菌菌株導(dǎo)致受感染家畜的肺損傷和航運(yùn)熱。從而引起的體重下降會導(dǎo)致飼養(yǎng)場的嚴(yán)重?fù)p失。牛菌株與禽霍亂的菌株有些差異，但這種宿主偏愛上的差異的分子基礎(chǔ)尚不清楚。豬肺炎中的一半也是由A型菌株導(dǎo)致的。對于D型多殺巴斯德氏菌最為了解的是它與萎縮性鼻炎的相關(guān)性，這是豬的高發(fā)疾病。D型被膜聚合物具有一種未知的結(jié)構(gòu)，顯示出幾種類型的粘多糖；它也同屬于含有HA的聚合物家族。這種病也可由博德特氏菌Bordetellabronchiseptica引起，但病況在兩種細(xì)菌都存在時(shí)更為嚴(yán)重。據(jù)估計(jì)F型導(dǎo)致了禽霍亂的大約10%。在此情況中，被膜聚合物不是HA，而是一種相關(guān)的稱作軟骨素的聚合物。近來，對禽類的疾病預(yù)防主要利用兩類物質(zhì)疫苗和抗生素，當(dāng)然還有嚴(yán)格的衛(wèi)生管理。第一種選擇的應(yīng)用是有限的，因?yàn)槠溲宸中秃芏喽呙缰荒苡行У貙拐麄€(gè)病原譜中有限的幾種亞型。殺死細(xì)胞的疫苗需通過實(shí)驗(yàn)室精細(xì)注射而配藥，獲得的保護(hù)效果并不高。因此，這一途徑通常用于種畜動(dòng)物。更為有效的活細(xì)胞疫苗可以通過供水來提供，但是這很難對上千只的家畜群均勻地進(jìn)行。此外，如果禽類受到其它的刺激或患疾病，活的"無毒"疫苗本身有時(shí)可引起疾病。這種無可預(yù)見性的最常見的原因是無毒的菌株從天然的突變體中獲得了未知的或未鑒定的基因。利用反復(fù)交替施用活的和死的疫苗的方法對禽類的保護(hù)只能對付某些血清型的威脅。第二種疾病預(yù)防的選擇是抗生素。將其用以亞治療劑量以預(yù)防感染或者對受感染家禽用以高劑量以治療禽霍亂。帶病家禽的百分比通過用藥治療可能下降，但是需要及時(shí)且大量的治療?？股氐倪t緩用藥或過早斷藥常常導(dǎo)致慢性禽霍亂和帶有膿腫或傷口的家禽，從而受到譴責(zé)和商業(yè)損失。再有，由于多殺巴斯德氏菌的抗性菌株不斷產(chǎn)生并且藥物花費(fèi)的高昂，這種解決辦法在長遠(yuǎn)角度上不具有吸引力。此外，F(xiàn)型多殺巴斯德氏菌導(dǎo)致了北美禽霍亂的5-10%。如果它作為未來主要的病原體出現(xiàn)的話，直接針對A型菌株的疫苗不可能完全對這種不同的被膜類型起到保護(hù)作用。在牛和豬產(chǎn)業(yè)中，還沒有獲得完全滿意的疫苗。預(yù)防性抗生素治療可用于防止體重下降，但是這種方法是昂貴的并且受到微生物抗性的影響。在本發(fā)明中，與生產(chǎn)保護(hù)性細(xì)菌HA被膜相關(guān)的酶已在基因/DNA水平上得以鑒定。對這些酶的鑒定將利于通過不傷害宿主HA生物合成的特異的抑制劑來阻斷病原體的被膜合成，從而達(dá)到對疾病的治療。例如，一種模擬用于生產(chǎn)HA的底物的藥物或者多殺巴斯德氏菌HA合酶停止生產(chǎn)細(xì)菌HA多糖的調(diào)控因子。從而阻斷被膜的形成。它是許多現(xiàn)有抗生素直接的類似物而對微生物和宿主具有不同的作用。這種方法是優(yōu)選的，因?yàn)槎鄽退沟率暇鶫A合酶和脊椎動(dòng)物的HA合酶在蛋白質(zhì)水平上很不相同。因此，很可能在反應(yīng)機(jī)制上或者底物結(jié)合位點(diǎn)上這些酶也是不同的。一旦揭去多殺巴斯德氏菌的保護(hù)性被膜護(hù)罩，它就成為宿主防御的明顯脆弱得多的標(biāo)靶。吞噬細(xì)胞易于吞噬和破壞無被膜的微生物。宿主的補(bǔ)體復(fù)合物抵達(dá)并破壞細(xì)菌敏感的外膜。針對新暴露的免疫原，諸如多殺巴斯德氏菌中決定體細(xì)胞血清型的脂多糖和表面蛋白，抗體更易產(chǎn)生。免疫應(yīng)答時(shí)這些抗體能夠隨后更好地結(jié)合無被膜的細(xì)胞。因此，接種疫苗獲得的免疫應(yīng)答更為有效和經(jīng)濟(jì)。抑制被膜藥物是對治療禽霍亂實(shí)質(zhì)性的擴(kuò)充。本發(fā)明以及A型多殺巴斯德氏菌的被膜生物合成的應(yīng)用有助于對其他被膜血清型的理解。DNA探針也已經(jīng)用于A型被膜基因以建立D型和F型所具有的相似的同源物。高分子量HA還具有廣泛的多種應(yīng)用-范圍從化妝品到眼外科。由于它高粘度的潛能和它的高度生物相容性，HA在眼外科中作為玻璃體液的替代品具有特殊的用途。HA還可通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射HA而用于治療賽馬的損傷性關(guān)節(jié)炎，用于作為潤滑劑的剃須沫，并且根據(jù)它的高粘度的物理化學(xué)特性以及長時(shí)間保濕的能力而用于各類化妝品。實(shí)際上，1997年8月美國食品和藥物管理局認(rèn)可了通過在受影響的關(guān)節(jié)中直接注射高分子HA而在治療嚴(yán)重關(guān)節(jié)炎中應(yīng)用高分子HA。通常，使用越高分子量的HA越好。這是因?yàn)镠A溶液的粘度隨著溶液中各個(gè)HA聚合物分子的平均分子量增大而增大。不幸的是，極高的分子量的HA，如高達(dá)107，通過現(xiàn)有的分離方法很難獲得。為了解決這些或其他困難，需要有新的方法和構(gòu)建物，能夠用以生產(chǎn)具有一種或多種改進(jìn)的特性，諸如更高純度或易于制備的HA。尤其是，需要開發(fā)出新的方法，從而生產(chǎn)大量的比現(xiàn)有商業(yè)化可獲得的HA具有更高的分子量和更純的HA。還需要能夠開發(fā)出新的方法，從而生產(chǎn)具有經(jīng)修飾了的大小分布的HA(HA^iJ以及具有經(jīng)修飾了的結(jié)構(gòu)的HA(HAAm。d)。因此，本發(fā)明在功能上鑒定了A型多殺巴斯德氏菌的涉及被膜生物合成的基因，確定了被膜作為毒性因子在禽霍亂中的作用，并獲得了涉及D型和F型被膜合成的同源基因。根據(jù)這些信息，利用"敲除"多殺巴斯德氏菌基因而不產(chǎn)生HAS，從而開發(fā)出疫苗。這些無被膜的無毒菌株能夠用作疫苗用于禽霍亂或航運(yùn)熱。本發(fā)明概述本發(fā)明涉及新的產(chǎn)生HA的HAS。利用各種分子生物學(xué)技術(shù)，在禽霍亂病原體A型多殺巴斯德氏菌中發(fā)現(xiàn)了新的HAS基因。這種來自多殺巴斯德氏菌的新的HAS被克隆，并在其他種的細(xì)菌中顯示出功能。因此，鑒定了HA的新的來源。通過與己破壞的缺陷型的同源重組，敲除了正常的微生物基因，從而還可將PmHAS的DNA序列用于產(chǎn)生多殺巴斯德氏菌的減毒疫苗菌株。此外，PmHAS的DNA序列還可用于產(chǎn)生診斷用細(xì)菌分型探針，用于檢測作為家禽、牛、羊和豬的農(nóng)牧業(yè)病原體的相關(guān)的多殺巴斯德氏菌。附圖的簡要描述圖1為多殺巴斯德氏菌的PmHAS和其他細(xì)菌的其他糖基轉(zhuǎn)移酶的部分序列的比對。圖1中PmHAS的序列是SEQIDNO:IO，圖1中Epsl的序列是SEQIDNO:ll，圖1中Cpsl4E的序列是SEQIDNO:12，圖1中LgtD的序列是SEQIDNO:13，圖1中SpHasA的序列是SEQIDNO:14，而圖1中共有序列是SEQIDNO:15。圖2為PmHAS的342-383位殘基(SEQIDNO:16)與哺乳動(dòng)物UDP-GalNAc:多肽GalNAc轉(zhuǎn)移酶的362-404位殘基(SEQIDNO:17)的序列比對。圖2中的共有序列是SEQIDNO:18。圖3是用PmHAS的UDP-糖類似物作的光親和標(biāo)記的放射性自顯影圖像。圖4是描述在PmHAS的各種Tn突變體中降低的或沒有了PmHAS的光親和標(biāo)記的放射性自顯影圖像。圖5顯示的光學(xué)顯微圖表明了在大腸桿菌重組體HA的產(chǎn)生。圖5A:帶有pPmHAS的大腸桿菌K5產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的被膜；圖5B:用鏈霉素HA裂解酶的處理后被膜從大腸桿菌K5細(xì)胞上被去除。圖6圖示了pPmHAS以及將其亞克隆進(jìn)表達(dá)載體的構(gòu)建過程。圖6A:HA合酶的開放閱讀框；圖6B:質(zhì)粒pKK223-3構(gòu)建圖。圖7描述了PmHAS活性的pH依賴性。圖8描述了HAS活性的金屬依賴性。圖9描述了HAS活性對UDP-GlcNAc濃度的依賴。圖10描述了HAS活性對UDP-GlcA濃度的依賴。圖11是對V應(yīng)和Km的Hanes-Woolf作圖估算。圖12是Tn突變體的Southern雜交作圖。圖13描述了用于對Tn破壞位點(diǎn)作序列分析的嵌合DNA模板。圖14是A型多殺巴斯德氏菌部分HA生物合成基因座位的圖解。圖15是用A型被膜基因探針對不同被膜類型的多殺巴斯德氏菌所作的Southern雜交。圖16是以各種A型引物對A型DNA和異源DNA進(jìn)行PCR的電泳圖譜。圖16A:利用相應(yīng)于kfaA同源基因的引物對；圖16B:利用相應(yīng)于HA合酶基因的引物對。圖17是A型(SEQIDNO:5)和F型(SEQIDNO:4)KfaA同系物和大腸桿菌(SEQIDNO:6)的KfaA的部分序列比較。圖18是野生型HAS基因和敲除突變的基因的圖解。圖19是對無被膜的敲除突變通過Southern雜交和PCR分析所作的分子生物學(xué)確認(rèn)。圖20A-E是A型和F型多殺巴斯德氏菌的序列比較。圖20A-E中的PmHAS序列是SEQIDNO:7;PmCS序列是SEQIDNO:8;而圖20A-E中的共有序列是SEQIDNO:9。圖21是天然的和重組的PmHAS蛋白的Western雜交。本發(fā)明的詳細(xì)描述在詳細(xì)對本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施方案進(jìn)行解釋之前，應(yīng)當(dāng)明白的是，本發(fā)明并不局限于下文所描述的或附圖所展示的各個(gè)部分的構(gòu)成與安排上的細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠具有其他的實(shí)施方案或者能夠以其他的方式實(shí)踐或操作。而且，還應(yīng)當(dāng)明白的是，本文所用的措辭和術(shù)語是出于描述的目的而不能被視為限制。本文中所用的術(shù)語"核酸區(qū)段"和"DNA區(qū)段"可以相互替換使用，它們是指從某一物種的總基因組DNA中分離出來的DNA分子。因而，本文中所用的"純化的"DNA或核酸區(qū)段是指，含有透明質(zhì)酸合酶("HAS")編碼序列的、并且從基因組DNA中，例如，整個(gè)多殺巴斯德氏菌或者例如哺乳動(dòng)物宿主基因組DNA，分離出來或純化出來的。包括在術(shù)語"DNA區(qū)段"之中的是DNA區(qū)段和這種區(qū)段的小區(qū)段，并且還包括重組載體，其中包括，例如，質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、病毒等等。類似地，含有分離的或純化的PmHAS基因的DNA區(qū)段是指，含有基本上從其他天然存在的基因或蛋白編碼序列中分離出來的HAS編碼序列的DNA區(qū)段。在此方面，出于簡單性考慮所用的術(shù)語"基因"是指功能性的蛋白、多肽或多肽編碼單位。正如本領(lǐng)域人員所應(yīng)當(dāng)明白的，這一功能性術(shù)語包括基因組序列、cDNA序列或它們的組合。"基本上與其他編碼序列分離的"是指，感興趣的基因，在此是PmHAS，構(gòu)成該DNA區(qū)段的編碼區(qū)域的顯著部分，并且該DNA區(qū)段不含有大部分的天然存在的編碼DNA，諸如大的染色體區(qū)段或其他的功能性基因或編碼區(qū)域。當(dāng)然，這是指最初分離的DNA區(qū)段，并不排除后來添加的、或者人為有意在該區(qū)段中放入的基因或編碼區(qū)域。根據(jù)應(yīng)用原核來源所帶來的某些優(yōu)點(diǎn)，我們應(yīng)當(dāng)很容易地意識到從原核生物多殺巴斯德氏菌中分離HAS基因的多種優(yōu)點(diǎn)。其中一個(gè)優(yōu)點(diǎn)就是，通常真核的酶可能需要重要的翻譯后修飾，而這只能在真核宿主中完成。這會限制獲得的真核HA合酶的應(yīng)用價(jià)值。而且，本領(lǐng)域普通的技術(shù)人員將會很容易地認(rèn)識到應(yīng)用原核基因時(shí)在時(shí)間和遺傳操作上的其他優(yōu)點(diǎn)。這些其他的優(yōu)點(diǎn)包括(a)原核基因由于其較小的基因組而易于分離，并因而降低了相應(yīng)的基因組文庫的篩選量，和(b)原核基因的編碼區(qū)域由于不含有內(nèi)含子而顯著小，因而易于操作。而且，如果PmHAS基因的產(chǎn)物(例如，酶)需要翻譯后修飾，這可以在該基因所來源的相似的原核細(xì)胞環(huán)境(宿主)中更好地完成。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA序列進(jìn)一步還包括能夠使該序列在所需的重組宿主中表達(dá)的基因調(diào)控區(qū)域。當(dāng)然，所用的調(diào)控區(qū)域的特性通常會根據(jù)所預(yù)定的特定用途(例如克隆宿主)而變化。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA區(qū)段和重組載體，其中含有編碼PmHAS基因的DNA序列，其氨基酸序列中含有SEQIDNO:l所確定的氨基酸序列。而且，在另一個(gè)特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA區(qū)段和重組載體，其中含有編碼一個(gè)基因的DNA序列，其氨基酸序列中含有HAS基因或DNA的氨基酸序列，尤其是相應(yīng)于多殺巴斯德氏菌的HAS的HAS基因或cDNA。例如，當(dāng)該DNA區(qū)段或載體編碼一個(gè)全長的HAS蛋白，或者它是為了用于表達(dá)HAS蛋白時(shí)，優(yōu)選的序列是基本上如SEQIDNO:l所示的序列。截短的PmHAS也屬于SEQIDNO:l所示的優(yōu)選序列的定義范圍之內(nèi)。例如，在C末端，大約270-272個(gè)氨基酸可以從序列上去除而仍然具有功能性的HAS。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，可以從PmHAS序列的任何一端進(jìn)行簡單的氨基酸去除。序列的截短形式只需要檢査HAS活性，從而確定該截短的序列是否還能夠產(chǎn)生HAS。具有HA合酶活性的核酸區(qū)段可以通過本文所描述的方法來分離。術(shù)語"基本上SEQIDNO:l所示的序列"是指，基本上與SEQIDNO:l—部分相符而相對地幾乎沒有氨基酸不相同于SEQIDNO:l所示的氨基酸，或者在生物學(xué)功能上等價(jià)于SEQIDNO:l所示的氨基酸。術(shù)語"生物學(xué)功能等價(jià)"是本領(lǐng)域所很好理解的并且在本文中有進(jìn)一步的詳細(xì)定義的，即具有基本上SEQIDNO:l所示的序列的基因，并且該基因與原核生物產(chǎn)生HA或透明質(zhì)酸被膜的能力相關(guān)。本領(lǐng)域中有著許多實(shí)例，實(shí)踐者能夠?qū)σ粋€(gè)核酸區(qū)段進(jìn)行結(jié)構(gòu)上的改變(例如，編碼保守性的或半保守性的氨基酸置換)而仍然保留了它的酶學(xué)或功能活性。例如可以參見(1)Risler等，"結(jié)構(gòu)相關(guān)性蛋白中的氨基酸置換類型識別方法"分子生物學(xué)雜志，204:1019-1029(1988)[…"根據(jù)發(fā)現(xiàn)的氨基酸側(cè)鏈的可互換性，概括出來的只有四組；(i)He和Val;(ii)Leu和Met;(iii)Lys,Arg,和Gin;禾叩v)Tyr和Phe.]"(2)Niefind等，"主鏈折疊Anoles得出的用于蛋白質(zhì)建模和序列比對的氨基酸相似性系數(shù)"，分子生物學(xué)雜志，219:481-497(1991)[相似性參數(shù)可以用于設(shè)計(jì)氨基酸置換];和(3)Overington等，"環(huán)境特異性的氨基酸置換表"三級模板和蛋白質(zhì)折疊的預(yù)測"蛋白質(zhì)科學(xué)，1:216-226(1992)["對所觀察的置換從局部環(huán)境的功能上的類型的進(jìn)行的分析表明，具有明顯不同的類型…"可以進(jìn)行相容性變化。]這些參考文獻(xiàn)和數(shù)不清的其他文獻(xiàn)表明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，根據(jù)一個(gè)核酸序列可以進(jìn)行置換而改變該核酸序列卻不改變其功能。而且，經(jīng)置換核酸區(qū)段可以與其未作改變的母本具有高度的相同性并保持了其酶學(xué)活性，并且還無法與之雜交。本發(fā)明公開了編碼酶學(xué)活性的來自多殺巴斯德氏菌透明質(zhì)酸合酶的核酸區(qū)段-PmHAS。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，置換可以對SEQIDNO:2所列的PmHAS核酸區(qū)段進(jìn)行，而不偏離于本發(fā)明的范圍合權(quán)利要求的范圍之外。表A中列出了標(biāo)準(zhǔn)化的和可接受的功能上等價(jià)的氨基酸置換。表A<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是進(jìn)而定義為重組載體的、編碼基于SEQIDNO:l的蛋白的純化的核酸區(qū)段。本文中所用的術(shù)語"重組載體"是指，經(jīng)過修飾而含有編碼HA蛋白的核酸區(qū)段或其片段的載體。該重組載體可進(jìn)一步定義為一個(gè)含有有效相連于所說的HA編碼核酸序列的啟動(dòng)子表達(dá)載體。本發(fā)明的進(jìn)一步的優(yōu)選的實(shí)施方案是一個(gè)宿主細(xì)胞，它形成含有HAS基因的重組載體的重組體。該優(yōu)選的重組宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該重組細(xì)胞是真核細(xì)胞。本文中的術(shù)語"工程化的"或"重組的"細(xì)胞是指其中引入有重組基因，諸如編碼HAS的基因，的細(xì)胞。因而，重組細(xì)胞不同于天然存在的、不含有重組引入的基因的細(xì)胞。重組細(xì)胞因而是帶有人為引入的一個(gè)或多個(gè)基因的細(xì)胞。重組引入的基因可以是cDNA基因的形式，即基因組基因的拷貝，還可以包括位置上臨近于啟動(dòng)子的基因，而該啟動(dòng)子在天然情況下并不與該特定的引入基因相關(guān)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，HA合酶的編碼DNA區(qū)段進(jìn)一步還含有本領(lǐng)域所知的功能上作為復(fù)制起點(diǎn)的或稱"復(fù)制子"的DNA序列，它可以通過該特定的宿主使得鄰近的序列得以復(fù)制。這種起始點(diǎn)可用于在染色體外制備并復(fù)制連接有HA合酶DNA序列的嵌合區(qū)段或質(zhì)粒。在更為優(yōu)選的實(shí)例中，所用的起始點(diǎn)是能夠在適用于生物工程應(yīng)用的細(xì)菌宿主中復(fù)制的起始點(diǎn)。但是，出于克隆的DNA區(qū)段的多種用途考慮，可能需要變換或另外使用能被其他需要應(yīng)用的宿主細(xì)胞所識別的起始點(diǎn)(諸如穿梭載體)。其他的可以用于在多種高等生物中克隆或表達(dá)的復(fù)制起始點(diǎn)，諸如SV40，多瘤病毒，牛乳頭瘤病毒的起始點(diǎn)的分離和應(yīng)用是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所周知的。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明因而定義為含有HA合酶編碼基因以及連有適當(dāng)?shù)膹?fù)制起始點(diǎn)并在選定的調(diào)控區(qū)控制之下的、重組的轉(zhuǎn)化載體。因此，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，根據(jù)本發(fā)明，其他的方法也可用于獲得HAS基因或cDNA。例如，可以獲得聚合酶鏈反應(yīng)或RT-PCR產(chǎn)生的DNA片段，它含有來自多種來源的，包括Pasturellas的其他菌株或真核來源，諸如cDNA文庫，全長的基因或cDNA的互補(bǔ)序列。實(shí)際上任何分子克隆方法都可以用于產(chǎn)生基于本發(fā)明的DNA片段。因此，對用于DNA分離的特定方法的唯一的基本限制就是分離的核酸分子應(yīng)當(dāng)編碼生物學(xué)功能上等價(jià)的HA合酶。分離出DNA之后，將其與所選擇的載體連接。實(shí)際上任何克隆載體都可以用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的優(yōu)越性。通常應(yīng)用的載體包括用于原核生物的質(zhì)粒和噬菌體，甚至用于真核生物的病毒載體。實(shí)例包括pKK223-3,pSA3，重組入噬菌體，SV40，多瘤病毒，腺病毒，牛乳頭瘤病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。但是，據(jù)信但載體能夠在胚芽屬或桿菌屬和大腸桿菌屬中都能復(fù)制時(shí)，某些優(yōu)越性才能最大限度地實(shí)現(xiàn)。諸如這些載體，例如Dao和Ferretti的pSA3載體或者Trieu-Cuot等的pAT19載體，可以在易于操作的宿主如大腸桿菌中進(jìn)行克隆菌落的篩選，然后再轉(zhuǎn)回到食品級的胚芽屬或桿菌屬菌株中生產(chǎn)HA。這些都是良性的并且研究充分的用于某些食品和生物工程產(chǎn)品生產(chǎn)的生物。其中的優(yōu)點(diǎn)還有，可以通過基因劑量(例如，通過擴(kuò)增提供額外的HA合酶基因的拷貝)和/或融合另外的基因以增強(qiáng)HA前體的數(shù)量從而增大胚芽屬或桿菌屬的合成HA的能力。也可以通過形成額外的帶有HA合酶基因的拷貝，或擴(kuò)增，來增大細(xì)菌原有的合成HA的能力。這種擴(kuò)增可以獲得質(zhì)?？截悢?shù)多達(dá)10倍的增加，并因而增加HA合酶的拷貝數(shù)?？梢栽黾親A合酶基因拷貝數(shù)其他的方法還有在質(zhì)粒上插入多個(gè)拷貝的基因。其他的技術(shù)還包括在染色體DNA上整合HAS基因。這種額外的擴(kuò)增是尤為可行的，因?yàn)榧?xì)菌的HA合酶基因的大小較小。在某些情況下，將連接了染色體DNA的載體用于轉(zhuǎn)染用于克隆篩選目的的宿主諸如大腸桿菌，該載體能夠在所選宿主中表達(dá)插入的DNA。在某些其他實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及分離的DNA區(qū)段和重組載體，其序列上含有基本上如SEQIDNO:2所示的核酸序列。所用術(shù)語"基本上如SEQIDNO:2所示的"與上文中所描述的意義相同，是指基本上與SEQIDNO:2—部分相符，而相對地幾乎沒有密碼子不相同于SEQIDNO:2所示的密碼子，或者在生物學(xué)功能上等價(jià)于SEQIDNO:2所示的密碼子。術(shù)語"在生物學(xué)功能上等價(jià)的密碼子"是指編碼相同的氨基酸，諸如精氨酸或絲氨酸的六個(gè)密碼子，如表A所列，并且還指編碼在生物活性上相當(dāng)?shù)陌被?。?yīng)當(dāng)理解的是，氨基酸和核酸序列可以包括附加的殘基，而該序列基本上仍視如本發(fā)明公開的序列之一，諸如附加的N或C末端氨基酸或者5，或3，核酸序列，只要該序列符合上述的標(biāo)準(zhǔn)，包括在涉及蛋白表達(dá)和酶活性時(shí)仍保持了生物蛋白的活性。末端序列的添加尤其適用于核酸序列，例如，可以包括在編碼序列5，或3，端兩側(cè)的各種非編碼序列區(qū)域，或者包括所知的存在于基因中的各種內(nèi)部序列。而且同樣地，N或C末端氨基酸也可以去除殘基，而該序列基本上仍視如本發(fā)明公開的序列之一，只要該序列符合上述的標(biāo)準(zhǔn)。由于遺傳密碼的簡并性以及保守性和半保守性替換，一個(gè)具有在約40%和約80%之間；或者更為優(yōu)選地在約80%和約90%之間；或者更為優(yōu)選地在約90%和約99%之間的核苷酸與SEQIDNO:2所示的核苷酸相同的序列，就是"基本上如SEQIDNO:2所示"的序列?；旧吓cSEQIDNO:2所示相同的序列還可以在功能上定義為，能夠與含有SEQIDNO:2的互補(bǔ)序列在標(biāo)準(zhǔn)的或低嚴(yán)格性的條件下相雜交的序列。適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)的雜交條件為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所熟知的，并在本文中有清楚的描述。本文所用的術(shù)語"標(biāo)準(zhǔn)的雜交條件"是用于描述那些基本上互補(bǔ)的核酸片段都能形成標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick堿基對所處的條件。已知的各種因素可決定結(jié)合或雜交的特異性，諸如pm溫度、鹽濃度、試劑諸如甲酰胺和二甲基亞砜的存在、雜交片段的長度等等。當(dāng)互補(bǔ)的是雜交用的短的核酸片段，例如約14至100個(gè)核苷酸之間的片段，鹽和溫度的優(yōu)選的雜交條件包括有在1.2-1.8XHPB，于40-5(TC。自然，本發(fā)明還包括與SEQIDNO:2所示的序列互補(bǔ)的，或基本上互補(bǔ)的DNA片段。"互補(bǔ)的"核酸序列是那些能夠根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的Watson-Crick互補(bǔ)法則而形成堿基對的序列。本文所用的術(shù)語"互補(bǔ)序列"是指基本上互補(bǔ)的序列，它可以通過上述的核酸比較而確定，或者根據(jù)能夠與SEQIDNO:2所示的核酸片段雜交而確定。本發(fā)明的核酸區(qū)段，不論其本身的編碼序列有多長，多可以與其他的DNA序列相結(jié)合，諸如啟動(dòng)子、多聚腺苷?；盘枴⑻砑拥南拗泼肝稽c(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、表位標(biāo)記、多聚組氨酸區(qū)域、其他的編碼片段等等，從而其總體長度可能相當(dāng)可觀。因此應(yīng)當(dāng)考慮的是，幾乎任何長度的核酸片段都可以使用，而其總長度優(yōu)選地限制在易于重組DNA操作中制備和使用的范圍之內(nèi)。自然，還應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明并不限于SEQIDNO:l和2所示的特定的氨基酸和核酸序列。重組載體和分離的DNA片段因而可以分別不同地包括HAS編碼區(qū)域本身、在基本的編碼區(qū)域不帶有所需的改變和修飾的編碼區(qū)域、或者它們可以編碼并不含有HAS編碼區(qū)的較大的多肽，或編碼具有不同的氨基酸序列而在生物功能上等價(jià)的蛋白或多肽。本發(fā)明的DNA區(qū)段包括生物功能上等價(jià)于HAS的蛋白或多肽。這種序列的產(chǎn)生是由于在核酸序列和其編碼的蛋白質(zhì)中已知的天然存在的密碼子冗余且功能相當(dāng)性的結(jié)果。再有，功能上等價(jià)的蛋白或多肽可以通過應(yīng)用重組DNA技術(shù)而產(chǎn)生，可根據(jù)對所改變的氨基酸的特性的考慮而進(jìn)行操作，改變蛋白結(jié)構(gòu)。人為的改變可以通過應(yīng)用定點(diǎn)誘變的技術(shù)引入，如對酶活性或?qū)AS的抗原性加以改進(jìn)，或?qū)AS突變體的檢測加以改進(jìn)從而在分子水平上檢測HA合酶的活性。另外，HAS編碼序列的特定變化可產(chǎn)生具有經(jīng)改變的大小分布或結(jié)構(gòu)配置的HA。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解的是，HAS編碼序列可以經(jīng)過某種操作而產(chǎn)生改變了的透明質(zhì)酸合酶，從而能夠生產(chǎn)具有不同的聚合物大小和/或功能的透明質(zhì)酸。例如，HAS編碼序列可以經(jīng)過某種程度的改變從而該透明質(zhì)酸合酶具有改變了的糖底物特異性，因而該透明質(zhì)酸合酶能夠產(chǎn)生出新的、摻入了不同結(jié)構(gòu)的如以前并不被摻入的糖或糖的衍生物的透明質(zhì)酸類聚合物。這種新的被摻入的糖可以產(chǎn)生出經(jīng)修飾的具有不同的功能特性的透明質(zhì)酸，具有更小或更大的聚合物大小/分子量的透明質(zhì)酸，或者兩者兼具。正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解的，根據(jù)HAS編碼序列，就可以對該HAS編碼序列進(jìn)行改變和/或替換，從而獲得所需的特性上和/或大小上的修飾。本文所用的術(shù)語"經(jīng)修飾的結(jié)構(gòu)"是指含有并未在天然存在的HA多糖中被通常發(fā)現(xiàn)的糖或衍生物的透明質(zhì)酸聚合物。術(shù)語"經(jīng)修飾的大小分布"是指合成的透明質(zhì)酸分子的大小分布并未在天然的酶中被通常發(fā)現(xiàn)；經(jīng)改造的大小可以比正常的大得多或小得多。各種不同大小的透明質(zhì)酸產(chǎn)物可以應(yīng)用于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)領(lǐng)域，改變了結(jié)構(gòu)的酶可以與改變了大小的透明質(zhì)酸相結(jié)合。如果透明質(zhì)酸聚合物具有大約20個(gè)單糖而且可以大量生產(chǎn)，就可以在血管造影和創(chuàng)傷治療上具有非常巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值。小分子透明質(zhì)酸寡糖的另一個(gè)特殊應(yīng)用是在用于醫(yī)藥目的的重組人蛋白的穩(wěn)定性上。這種蛋白的主要問題在于它被從血液中清除而只有很短的半衰期。非常小的分子量的透明質(zhì)酸能夠很好地適合于這種角色而且是非免疫原性的和生物相容性的。與藥物或蛋白相結(jié)合的大分子量透明質(zhì)酸可以用于定位網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞系統(tǒng)，因?yàn)樗哂型该髻|(zhì)酸的內(nèi)吞作用受體。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明應(yīng)能夠理解的是，由多種方法可以用來對透明質(zhì)酸合酶所產(chǎn)生的透明質(zhì)酸聚合物的大小范圍進(jìn)行調(diào)節(jié)，以獲得不同的大小。首先，對產(chǎn)物大小的動(dòng)力學(xué)控制可以通過降低溫度，降低酶的所用時(shí)間和降低一種或兩種糖核苷底物的濃度來改變。降低任何這些或所有的變量都將會產(chǎn)生較低數(shù)量和較小分子量的透明質(zhì)酸產(chǎn)物。這類方法的不利之處在于產(chǎn)物的產(chǎn)量也會被降低，并且可能很難獲在各天或各個(gè)批次之間得重復(fù)性。第二，對該酶合成較大的透明質(zhì)酸產(chǎn)物的內(nèi)在能力的改變。對該蛋白的改變可以通過重組DNA技術(shù)來操作，包括替換、缺失和添加特異的氨基酸(或者甚至引入代謝過程中非蛋白質(zhì)類的氨基酸)這類改變可以獲得內(nèi)在的更慢的酶，它因而能獲得對透明質(zhì)酸大小比通過動(dòng)力學(xué)方法更具重復(fù)性的控制。最終的透明質(zhì)酸的大小分布由該酶的特殊性質(zhì)而確定，這基于序列中的特定的氨基酸。在鏈球菌的酶和真核的透明質(zhì)酸合酶之間具有20%的殘疾是完全保守的，在特定的位置上有一系列的氨基酸控制或極大地影響著該酶對透明質(zhì)酸聚合物的大小的作用。在這些殘基上的特異改變可以產(chǎn)生出經(jīng)修飾的HAS，它能生產(chǎn)具有經(jīng)修飾的大小分布的HA產(chǎn)物。對seHAS，spHAS，pmHAS,或cvHAS的遺傳操作上的改變，在透明質(zhì)酸被釋放之前就降低了該酶所能產(chǎn)生的透明質(zhì)酸的原有的大小，這種改變將對生產(chǎn)比天然酶更小的或可能更大的透明質(zhì)酸提供了很有效的方法。最后，較大分子量的透明質(zhì)酸可以用特異的透明質(zhì)酸酶降解而獲得較低分子量的透明質(zhì)酸。但是這種方法實(shí)際上非常難以獲得重復(fù)性，而且必須非常小心地重新純化透明質(zhì)酸以去除透明質(zhì)酸酶和不需要的消化產(chǎn)物。結(jié)構(gòu)上修飾的透明質(zhì)酸等同于通過改變所需HAS或spHAS上特定的氨基酸從而改變了透明質(zhì)酸產(chǎn)物的大小分布。UDP-GlcNAc的衍生物，其乙?；鶊F(tuán)缺失或被其他的化學(xué)應(yīng)用基團(tuán)所替代，它特別有用。強(qiáng)烈的底物特異性必須依賴于那保守的20%中特定的一系列氨基酸。這些殘基中的一個(gè)或多個(gè)特異的改變所產(chǎn)生出的功能性合酶與一個(gè)或多個(gè)底物的特異性相互作用比天然的酶更低。這種改變的酶因而可以利用其他的天然的或特殊的糖核苷來摻入所需的糖衍生物中，從而獲得不同的化學(xué)特性而用于下列目的(l)將特異藥物、蛋白、或毒素共價(jià)結(jié)合于該經(jīng)結(jié)構(gòu)修飾的透明質(zhì)酸，而用于一般或靶向藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)、放射學(xué)過程，等等；(2)將透明質(zhì)酸本身共價(jià)膠聯(lián)于其他的支持物上而形成凝膠，或其他的具有較強(qiáng)的物理特性的三維生物材料，和(3)將透明質(zhì)酸共價(jià)膠聯(lián)于一個(gè)表面而形成生物相容性的薄膜或單分子層。本發(fā)明涉及一種新的可產(chǎn)生HA的HAS。利用各種分子生物學(xué)技術(shù)，從禽霍亂病原體A型多殺巴斯德氏菌中發(fā)現(xiàn)了新的HAS的基因。來自多殺巴斯德氏菌的此新HAS或PmHAS已被克隆并在其他種的細(xì)菌中顯示出功能。此PmHAS蛋白可聚合真正的HA多糖。轉(zhuǎn)化有PmHAS的重組大腸桿菌產(chǎn)生的該碳水化合物可以被軟骨HA結(jié)合蛋白所識別并對HA裂解酶的消化敏感。在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員看來，這兩種試劑都被認(rèn)為是HA聚合物特異性的。而且，體外HA的合成對于UDP-GlcA禾BUDP-GlcNAc都需要。疊氮基-UDP-GlcA和疊氮基-UDP-GlcNAc都能夠特異性地光學(xué)摻入進(jìn)PmHAS，而疊氮基-UDP-Glc不能。正如在鏈球菌HasA和Xenopu的DG42情形一樣，PmHAS這一種多肽將兩種不同的糖基團(tuán)轉(zhuǎn)入到新生的HA鏈上。許多形成被膜的格蘭氏陰性菌，包括大腸桿菌，腦膜炎奈瑟氏球菌，和流感嗜血桿菌，擁有多組以操縱子形式調(diào)控的負(fù)責(zé)被膜生物合成的基因。這些操縱子含有多個(gè)基因，它們編碼(1)糖核苷前體合成所需的酶；(2)用于外多糖聚合的糖基轉(zhuǎn)移酶，和(3)用于多糖輸出的蛋白。A型多殺巴斯德氏菌的HA被膜操縱子含有(1)KfaA類似物，(2)HA和酶，和(3)推測的UDP-Glc脫氫酶。多殺巴斯德氏菌的無被膜突變體H和L中的Tn916因子并不直接地整合于HAS基因，而是定位于KfaA的同源基因。由于PmHAS存在于至少幾個(gè)產(chǎn)生多糖所必需的基因位點(diǎn)上，任何一個(gè)這些被膜基因的傷害或缺損都可影響到巴斯德氏菌中HA的產(chǎn)生和被膜的形成。因此，通過破壞鄰近的基因可以獲得疫苗。例如，如果UDP-Glc脫氫酶被去除或被破壞，就不再有HA合酶的前體而不能合成HA。而且，如果Kfa或其他轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因被破壞，那么微生物就不能制造出表面HA。因此，在天然巴斯德氏菌微生物中HA合酶的產(chǎn)物，例如HA被膜，可以通過(a)破壞前體的形成，或(b)破壞聚合機(jī)制，或(c)破壞轉(zhuǎn)移機(jī)制而被終止。正如本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所能預(yù)計(jì)的，在氨基酸水平上，PmHAS與其他克隆的HAS并不相似。兩個(gè)可能的基序，PmHAS上位于第477-480位殘基的DGS(S/T)(SEQIDNO:19)和位于第527-529位殘基的DGS存在于HasA中。另一個(gè)相似的含有DGS的基序在PmHAS的第196-198位殘基被重復(fù)發(fā)現(xiàn)。第一個(gè)基序的DG和DSD在所有HAS中是保守的。但是，在所有以前克隆的HAS發(fā)現(xiàn)的幾個(gè)絕對保守的基序((S/G)GPLXXY(SEQIDNO:20),GDDRXLTN(SEQIDNO:21)，和LXQQXRWXKS(Y/F/W)RE(SEQIDNO:22)在PmHAS中不存在。然而，不同的細(xì)菌糖基轉(zhuǎn)移酶的比對在多殺巴斯德氏菌的HA蛋白的中央部分更為接近。這些酶已經(jīng)表現(xiàn)出或預(yù)計(jì)能夠轉(zhuǎn)移GlcNAc，半乳糖，或GalNAc基團(tuán)，它們大約為PmHAS大小的三分之一，并且它們氨基酸末端序列都與PmHAS多肽中部，第430-540位殘基的序列相對。PmHAS前420個(gè)殘基的部分表現(xiàn)出與哺乳動(dòng)物的UDP-GlcNAc:多肽GalNAc-轉(zhuǎn)移酶的部分之間的相似性。這些發(fā)現(xiàn)可反映出PmHAS中的一個(gè)可能的結(jié)構(gòu)域。PmHAS中后面的大約340個(gè)殘基不與序列數(shù)據(jù)庫中的其他條目明顯相似。因此，多殺巴斯德氏菌的HAS是獨(dú)特的并且極有可能是一個(gè)完全新類型HAS的原形。PmHAS大約兩倍于鏈球菌、病毒或脊椎動(dòng)物的HAS—分別為972對417-588個(gè)殘基。而且，PmHAS和其他已知的HAS疏水性作圖不相似。利用TMPRED程序，該程序?qū)τ诒绢I(lǐng)域的普通技術(shù)^員是易于了解的并是可以在互聯(lián)網(wǎng)上獲得的，預(yù)測出PmHAS只具有兩個(gè)候選的跨膜螺旋(中心位于第170和510位殘基)，而且該蛋白的兩個(gè)末端都可能定位在細(xì)胞質(zhì)中。在拓?fù)鋵W(xué)上，這些推測暗示三分之一的這個(gè)多殺巴斯德氏菌多肽(大約340個(gè)殘基)位于細(xì)胞質(zhì)之外。另一方面，其他的HAS類型預(yù)測出了不同的拓?fù)湫?。鏈球菌HAS的報(bào)告酶融合分析確定了在該酶中存在有不同的拓?fù)渑帕?，包?i)接近氨基酸末端的兩個(gè)跨膜螺旋，(ii)一個(gè)推測的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和(iii)在蛋白的羧基端那一半的三個(gè)膜相關(guān)的區(qū)域。膜相關(guān)的區(qū)域之間的連接環(huán)相當(dāng)短(4-10個(gè)殘基)；因此，該多肽鏈的絕大部分可能不是暴露在細(xì)胞外的。下列詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)步驟和對結(jié)果的討論，進(jìn)一步確定本發(fā)明涉及一個(gè)新的且獨(dú)特的PmHAS。1.PmHAS的分子克隆首次完成了Tn916插入誘變和探針的產(chǎn)生。Tn916用于破壞并標(biāo)記多殺巴斯德氏菌的HA生物合成位點(diǎn)。Tn因子位于一個(gè)非復(fù)制的質(zhì)粒上，通過電轉(zhuǎn)將pAM150引入野生型形成被膜的多殺巴斯德氏菌菌株(ATCC號15742)中。斜射光目測檢驗(yàn)初步篩選變化的菌落形態(tài)。野生型菌株形成較大的粘液狀("濕的"外觀)菌落而呈現(xiàn)出彩色(紅色和綠色)。選出較小的"干的"不帶彩色的菌落并劃出。利用墨水染色和顯微鏡進(jìn)行第二次篩選確定的被膜形成狀態(tài)。突變體染色體上Tn因子的位置通過Southern分析作圖。通過標(biāo)記的染色體DNA直接雙脫氧序列分析，獲得來自幾個(gè)獨(dú)立篩選的突變體中被Tn破壞的位點(diǎn)的序列。簡單地說，用Hhal消化突變體染色體DNA，產(chǎn)生的嵌合的DNA片段，其中含有12kb的Tn916因子部分和多殺巴斯德氏菌的DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳純化。該嵌合片段作為模板，利用33P終止物和Tn916右臂末端引物(5，-gaccttgataaagtgtgataagtcc-3，(SEQIDNO:23))進(jìn)行循環(huán)測序反應(yīng)。將序列數(shù)據(jù)用于設(shè)計(jì)PCR引物。利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的BoehringerMamheim制造的HighPrime系統(tǒng)，將凝膠純化的PCR-產(chǎn)物用地高辛標(biāo)記。下一步是分離功能性HAS位點(diǎn)。利用BamHI酶切的Stratagene生產(chǎn)的入Zap表達(dá)載體系統(tǒng)，獲得Sau3A部分酶切野生型DNA的入文庫。用地高辛標(biāo)記的PCR-產(chǎn)物進(jìn)行雜交來篩選噬菌斑。用單獨(dú)純化的陽性入克隆和ExAssist輔助噬菌體來共轉(zhuǎn)染大腸桿菌XLI-BlueMRF，以產(chǎn)生噬菌細(xì)胞。將獲得的噬菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化大腸桿菌XLOLR細(xì)胞以恢復(fù)質(zhì)粒。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)適合于HA多糖生產(chǎn)的宿主大腸桿菌K5(菌株Bi8337-41)中，該菌株生產(chǎn)UDP-GlcA，這是HA生物合成所需的底物，而在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室菌株中都沒發(fā)現(xiàn)有顯著水平的表達(dá)。另外，K5擁有許多其他的對于被膜多糖在大腸桿菌中轉(zhuǎn)運(yùn)所需的基因。用于表達(dá)研究的另一種宿主是大腸桿菌EV5，它是產(chǎn)生多聚唾液酸被膜的kl菌株的無被膜衍生物并擁有所有和K5同樣的普通被膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，但是它不具有高水平的UDP-Glc脫氫酶。帶有候選質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化子在完全培養(yǎng)基中生長，如先前所述對培養(yǎng)物檢測HA多糖的生產(chǎn)，此外將細(xì)胞用8M尿素，0.01%SDS在95。C下抽提2分鐘。HA檢測試劑由PharmaciaBiotech公司生產(chǎn)，它是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，使用了特異的HA結(jié)合蛋白來檢測大于或等于0.1昭/ml濃度的HA。對多次確定的HA水平進(jìn)行平均。對細(xì)菌培養(yǎng)物中的HA濃度對不同的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，細(xì)胞數(shù)通過測量A,值計(jì)算的，獲得的數(shù)據(jù)表示為l|ag/ml/A6o。的細(xì)菌。一種帶有5.8kb的插入的質(zhì)粒，pPm7A，使得大腸桿菌K5具有了生產(chǎn)HA的能力；只帶有載體的細(xì)胞不能產(chǎn)生HA。一種pPm7A的截短的衍生物pPmA6e，它含有大約3.3kb的插入，能夠在轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌K5中之后指導(dǎo)HA的生物合成。因此，相應(yīng)于pPmA6e的pPm7A質(zhì)粒的兩條鏈的序列被確定。發(fā)現(xiàn)了一個(gè)單一的完全的972個(gè)殘基的ORF，被稱作PmHAS，如SEQIDNO:l所示。其相應(yīng)的核酸序列如如SEQIDNO:2所示。然后進(jìn)行了重組體多殺巴斯德氏菌的HAS的表達(dá)。利用Taq聚合酶和相應(yīng)于推倒的氨基和羧基末端附近的引物(大寫的密碼子有義鏈，5,-gcgaattcaaaggacagaaaATGAAcACATTATCACAA-3，(SEQIDNO:24),和反義鏈，5，-gggaattctgcagttaTAGAGTTATACTATTAATAATGAAC-3，(SEQIDNO:25);起始和終止密碼子分別為粗體字)，通過13個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增出pPm7A插入中的PmHASORF。密碼子2被改變了(T—C)以增加蛋白在大腸桿菌中的產(chǎn)量。該引物還含有EcoRI和Pstl限制位點(diǎn)(斜體小寫字母)以利于往表達(dá)質(zhì)粒pKK223-3中的克隆(tac啟動(dòng)子；Pharmacia)。將獲得的重組體，pPmHAS，轉(zhuǎn)化大腸桿菌SURE細(xì)胞(Stratagene)，并將該菌株用作體外檢測HAS的膜制備物的來源。將對數(shù)期培養(yǎng)物(LB培養(yǎng)基，30°C)用0.5mM的異丙基硫代半乳糖苷誘導(dǎo)3小時(shí)，然后收獲。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌K5;對獲得的菌株通過光學(xué)顯微鏡和浮力密度離心來檢測被膜的存在。K5細(xì)菌的培養(yǎng)物不用常規(guī)的方法誘導(dǎo)，因?yàn)楫惐虼肴樘擒盏奶砑硬粫@著地增加LB或合成培養(yǎng)基中HA的水平。然后進(jìn)行天然的多殺巴斯德氏菌的HAS的光親和標(biāo)記。放射性標(biāo)記的UDP糖類似物，卩2p]疊氮基-UDP-GlcA(3mCi/nMo1)和pP]疊氮基-UDP-GlcNAc(2.5mCi/|iMol)按照文獻(xiàn)和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的方法制備并純化。來自多殺巴斯德氏菌野生型的膜制備物于50rnMTris,20mMMgCl2，pH7中與另一探針(終濃度20|liM)一起冰上溫育30分鐘，然后用紫外光照射(254nm，90秒)。將蛋白用5%三氯乙酸沉淀，再進(jìn)行SDS-PAGE分析。如果省略照射步驟則無放射性標(biāo)記摻入。為了進(jìn)行特異性對照，將10倍摩爾數(shù)過量的正常的UDP糖與探針和膜共同溫育。再另一對照中還使用了^P]疊氮基-UDP-GlcA(3mCi/|iMol)。對幾個(gè)回合的誘變所產(chǎn)生的大約8X104的含有Tn的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落形態(tài)差異的掃描。通過墨水光譜分析，來自小的無色菌落(n=4)的細(xì)胞未檢測到被膜(無被膜)，而來自中等大小的有色菌落的細(xì)胞(n=8)顯示出具有野生型(微囊體)直徑的約10-25%的被膜。無被膜的兩個(gè)突變體，記作H和L，它具有作圖于相同的HindIII或BstXI基因組片段的Tn因子，它以103的比率回復(fù)突變?yōu)橐吧途湫螒B(tài)。經(jīng)Southern分析，各個(gè)回復(fù)突變體中的Tn因子從原位置上切離并重新插入到新的不同的位點(diǎn)上；另一方面，所有無被膜的亞克隆在原位置上保留了Tn因子。在來自突變體H細(xì)胞的膜制備物中未檢測出明顯的HAS活性；而從野生型細(xì)胞中獲得了基本的HAS活性(分別為小于或等于0.7對120pmol轉(zhuǎn)移GlcA/mg蛋白/小時(shí))。這些發(fā)現(xiàn)提示突變體H和L中的Tn因子實(shí)際上導(dǎo)致了HA生物合稱位點(diǎn)的被破壞。為了獲得兩種無被膜突變體之間的聯(lián)系，利用突變體H的破壞位點(diǎn)的序列所設(shè)計(jì)的引物，PmHF(5，-CTCCAGCTGTAAATTAGAGATAAAG-3，(SEQIDNO:26))和相應(yīng)于Tn916左端的引物，TnL2(5，-GCACATAGAATAAGGCTTTACGAGC-3，)，將突變體L的染色體作為模板進(jìn)行了PCR。獲得了特異的大約lkb的PCR產(chǎn)物；另外，如果替換了PmHR(PmHF的反向互補(bǔ)物)或Tn916的右臂引物，則不能形成PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物用作雜交探針獲得了多殺巴斯德氏菌的HAS的功能性拷貝。篩選了大約104個(gè)噬菌斑后獲得了六個(gè)雜交陽性的噬菌斑，將這些噬菌斑轉(zhuǎn)成質(zhì)粒。發(fā)現(xiàn)一個(gè)質(zhì)粒，pPm7A，能夠?qū)е翶5體內(nèi)產(chǎn)生HA(20pgHA/ml/Ae。。細(xì)菌)。帶有對照質(zhì)粒的大腸桿菌K5不產(chǎn)生HA(小于或等于0.05^igHA/ml/A600)大腸桿菌XLOLR或EV5細(xì)胞(缺少UDP-Glc脫氫酶活性)不產(chǎn)生HA，即使它們含有pPm7A質(zhì)粒(小于或等于0.05iigHA/ml/A6。q)。這些遺傳學(xué)證據(jù)表明pPm7A的插入并不編碼功能性UDP-Glc脫氫酶。一個(gè)截短的pPm7A質(zhì)粒的衍生物，pPmA6e，它帶有能夠指導(dǎo)HA生物合成的最小的插入，含有單一的完整的ORF，編碼一個(gè)如SEQIDNO:l所示的972個(gè)殘基的蛋白。在SEQIDNO:l中沒有明顯的啟動(dòng)子，但有一個(gè)粗體字標(biāo)記的推測的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，其中心在-10至-7，由TMPRED預(yù)測的兩個(gè)推測的跨模區(qū)域用下劃線標(biāo)出(第162-182和503-522位殘基)。SEQIDNO:l的PmHAS是鏈球菌HasA的兩倍。該蛋白是來自多殺巴斯德氏菌的HA合酶，PmHASd推導(dǎo)的Mr為111，923，計(jì)算出的等電點(diǎn)為6.84。SEQIDNO:2是PmHAS的核苷酸序列。將此PmHAS用BLASTP搜索蛋白序列數(shù)據(jù)庫查詢。PmHAS的中間部分(殘基436-536)與來自廣泛的各屬的，包括鏈球菌屬，弧菌屬，奈瑟氏菌屬，和葡萄球菌屬，細(xì)菌的糖基轉(zhuǎn)移酶最具同源性，它們形成外多糖或脂多糖的碳水化合物部分(最低概率，1(T22-10"°，如圖1所示，圖1圖示了多殺巴斯德氏菌與其他的糖基轉(zhuǎn)移酶之間的比對。MULTALIN比對表明PmHAS的中間部分(殘基436-536)與各種產(chǎn)生其他外多糖(嗜熱鏈球菌的Epsl;14型肺炎鏈球菌的Cpsl4J)或脂多糖的碳水化合物半族的酶的氨基末端最為相似。只有少數(shù)可能的實(shí)例列在圖1中?；撴溓蚓腍asA(殘基61-168)與該列出的PmHAS區(qū)域具有有限的相似性。最值得注意的序列相似性是DGSTD(SEQIDNO:28)和DXDD(SEQIDNO:29)基序。意外地，PmHAS與鏈球菌，病毒，或脊椎動(dòng)物的HAS沒有顯著的全局相似性，具有的最小總概率為0.33。只有鏈球菌的HasA中一個(gè)較短的區(qū)域與PmHAS以可信的程度相對應(yīng)，如圖1所示。PmHAS前半部分的一小片段也與哺乳動(dòng)物的UDP-GlcNAc:多肽GalNAc-轉(zhuǎn)移酶的部分相似，該酶啟動(dòng)粘液素類型蛋白的糖基化，具有的最小總概率大約為IO.3，如圖2。圖2所示PmHAS的第342-383位殘基與哺乳動(dòng)物的UDP-GlcNAc:多肽GalNAc-轉(zhuǎn)移酶的第362-404位殘基最為相似。對于圖1和圖2，相同的殘疾用粗體字和下劃線標(biāo)出，一致性的符號為！，I或V;存，N，D,E或Q中的任何一個(gè)。。/。,F或Y。整個(gè)序列上的酸性殘基是非常保守的。PmHAS部分ORF(27個(gè)殘基)的下游與幾種來自細(xì)菌的，包括大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、和肺炎鏈球菌的UDP-Glc脫氫酶的氨基末端非常相似(67-74%的相同性)。在原有的pPm7A克隆上的嚴(yán)重截短將預(yù)計(jì)會導(dǎo)致脫氫酶活性的完全喪失。PmHAS的其他的ORJF(623個(gè)殘基)的上游與大腸桿菌K5KfaA蛋白非常同源，最小總概率為l(T52，該蛋白據(jù)推測與被膜多糖向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。PmHAS預(yù)測的972個(gè)殘基大小(112kDa)通過光親和標(biāo)記來自多殺巴斯德氏菌野生型的膜制備物而確證。將兩種PP]疊氮基-UDP-GlcA和pP]疊氮基-UDP-GlcNAc探針以UV依賴的方法摻入到大約110kDa的蛋白中。圖3是以UDP糖類似物標(biāo)記的pmHAS的光親和性。pP]疊氮基-UDP-GlcA禾UpP]疊氮基-UDP-GlcNAc與從野生性多殺巴斯德氏菌分離出的膜制備物(45pg的蛋白)一起溫育并用UV光照射。10%的SDS-PAGE凝膠放射性自顯影如圖3所示。兩種探針以UV依賴的方法光標(biāo)記了大約110kDA的蛋白("一"泳道)。為了確定光摻入的特異性，將一個(gè)平行樣品同樣處理，而在其反映混合物中含有10倍過量的非標(biāo)記競爭物(分別為UDP-GlcNAc或-UDP-GlcA;標(biāo)記為"+"泳道)。與"一"泳道相比，該條帶的強(qiáng)度下降了。標(biāo)準(zhǔn)以kDa標(biāo)出。用相應(yīng)的非標(biāo)記的天然的UDP-糖前體的競爭降低了探針光摻入的程度。在平行實(shí)驗(yàn)中，pP]疊氮基-UDP-Glc，正常的HA前體的類似物，不標(biāo)記該110kDa的蛋白。而且，來自Tn突變體的膜制備物在該蛋白沒有或者只有極低數(shù)量的疊氮基-UDP-GlcA光摻入。如圖4所示，來自野生型的膜制備物(60pg的蛋白)(W)或者各種無被膜的Tn突變體(A，G,或H)被用pP]疊氮基-UDP-GlcA光標(biāo)記。約110kDa蛋白的附近的放射性自顯影如圖4所示。在A和G樣品中未見到光摻入。H樣品中的程度的光摻入是由于該突變體中發(fā)現(xiàn)的低比率的回復(fù)突變。在W樣品中光親和標(biāo)記的蛋白的大小非常符合對克隆的PmHAS的ORF所預(yù)測的Mf。來自含有pPmHAS質(zhì)粒的大腸桿菌SURE細(xì)胞的膜，但非來自只帶有pKK223-3載體的細(xì)胞的樣品，當(dāng)提供了兩種UDP-GlcNAc和UDP-GlcA時(shí)，體外合成了HA(分別為25對小于或等于1.5pMolGlcA轉(zhuǎn)移/mg蛋白/小時(shí))。如果UDP-GlcNAc空缺或者二價(jià)金屬離子被EDTA螯合，則未發(fā)現(xiàn)["C]-GlcA的摻入。來自重組體HAS的HAS活性與獲得自野生型多殺巴斯德氏菌膜的酶相似，因?yàn)镸n2+比Mg^能高IO倍地刺激活性。利用標(biāo)記的結(jié)合HA蛋白，通過放射測量試驗(yàn)還檢測了重組大腸桿菌培養(yǎng)物中HA多糖的存在。帶有pPmHAS的大腸桿菌K5產(chǎn)生了460|iigHA/mg/A咖。只帶有pKK223-3載體的K5細(xì)胞未產(chǎn)生HA(低于或等于o.05pgHA/mg/A6Q。)。作為對比，生長于相同的培養(yǎng)基中的野生型P.multoceda產(chǎn)生I，IOO嗎HA/mg/A6(K)。帶有pPmHAS的大腸桿菌K5產(chǎn)生了如此高水平的HA，以至于它變得能夠形成被膜。如圖5A所示，墨水染色的重組大腸桿菌的顯微照片(1000倍放大)表明，帶有pPmHAS的大腸桿菌K5產(chǎn)生了實(shí)質(zhì)性的被膜，表現(xiàn)為在細(xì)胞周圍的白色暈輪。該重組菌株的被膜的半徑大約0.2-0.5pm(假定細(xì)菌細(xì)胞寬度為0.5pm)。該被膜可以通過用綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶或鏈霉菌HA裂解酶處理而去除。如圖5B所示，通過簡單的用鏈霉素HA裂解酶的處理，被膜從大腸桿菌K5(pPmHAS)細(xì)胞上被去除了。因此，PmHAS可指導(dǎo)HA多糖的聚合作用。通過光學(xué)顯微鏡觀察，天然的K5宿主菌株和含有pKK233-3載體的轉(zhuǎn)化子都沒有易于觀察到的被膜。帶有pPmHAS的K5細(xì)胞還可以通過浮力密度離心來確定形成了被膜。該重組細(xì)胞浮于58%的Percoll墊層上，而載體對照細(xì)胞或經(jīng)透明質(zhì)酸酶處理的重組細(xì)胞則穿過Percoll層沉淀。大腸桿菌K5中的pPmHAS是第一個(gè)以HAS產(chǎn)生重組HA的生產(chǎn)系統(tǒng)；其他優(yōu)化的載體和/或宿主可能會獲得更高的產(chǎn)量，這些其他優(yōu)化的載體和/或宿主也是本文所考慮應(yīng)用的。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明，就能夠優(yōu)化這種載體和/或宿主。2.PmHAS的酶學(xué)特性利用牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)，通過考馬斯染料結(jié)合試驗(yàn)來確定蛋白。多殺巴斯德氏菌野生型(ATCC15742)，是一種高毒性的火雞菌株，它形成非常粘的菌落，37'C保存在有氧條件下。該菌株的無被膜突變體，記作TnA，它形成較小的，，干的，，菌落，它是通過本文新描述的Tn916插入誘變的方法而產(chǎn)生的。對從帶有含hasA重組質(zhì)粒的大腸桿菌中生產(chǎn)HA合酶的方法加以修改，從而制備多殺巴斯德氏菌總膜。將細(xì)胞強(qiáng)烈震蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期(0.4-0.8A,)，然后加入綿羊睪丸透明質(zhì)酸酶(SigmaV型，20單位/mL終濃度)以去除被膜。40分鐘之后將細(xì)胞在冰上冷卻并離心(2000gl5分鐘)收集。將細(xì)胞用PBS重新懸浮并離心，洗滌兩次，并將沉淀儲存于-8(TC。所有下列個(gè)步驟都在冰上操作，除非另有說明。以1/400原培養(yǎng)物體積的比例用含有蛋白酶抑制劑抑肽素亮肽素的20%的蔗糖和30mMTris,pH8.0重新懸浮細(xì)胞。用溶菌酶消化(加入1/10懸浮液體積的含有0.1MEDTAd的4mg/ml的酶，溫育40分鐘)，然后由超聲波破損(功率設(shè)置3，30秒開/停的三個(gè)循環(huán)；帶有微探頭的HeatSystemsW-380)使細(xì)胞裂解。在超聲波步驟之前，在混合物中加入硫乙醇鈉(O.lmM終濃度)，然后加入苯甲基硫酰氟化物。在所有操作中，PBS都含有同樣濃度的新鮮配制的硫乙醇鈉。將裂解物用DNase和RNase(分別l昭/ml，4°〇下10分鐘)并將細(xì)胞碎片通過低速離心(10000g，l小時(shí))去除。上清組份用PBS稀釋六倍并將膜組份通過超離(100000g，1小時(shí))收集。將沉淀反復(fù)懸浮于含有10mMgCl2的PBS中洗滌兩次，然后超離。為了獲得用于金屬特異性研究的膜制品，在洗滌步驟中省去MgCl2而用0.2mMEDTA替代。按l-3mg/ml蛋白的濃度，用50mMTris,pH7禾Q0.1mM硫乙醇鈉懸浮膜制備物，儲存于-8(TC。將來自糖核苷前體UDP-["C]GlcA(0.27Ci/mmo1，ICN)的放射性標(biāo)記的衍生物摻入高分子產(chǎn)物中，從而對HA合酶活性進(jìn)行常規(guī)的檢測。各種試驗(yàn)緩沖液，圖中圖例所標(biāo)出的，還含有0.03mMDTT。在反應(yīng)混合物中加入膜并于37"C溫育以起始反應(yīng)(100終體積)。2小時(shí)后加入SDS(2%終體積)以終止反應(yīng)。為了進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，通過下行紙色譜法(Whatman3M，65:35的乙醇/1M醋酸銨，pH5.5)分離產(chǎn)物與前體。在液閃計(jì)數(shù)之前，紙色譜起始點(diǎn)的HA多糖用水洗脫。進(jìn)行該試驗(yàn)通常的條件是不多于5%的前體被有限數(shù)量的酶所消耗。確定真正的HA中的摻入的對照試驗(yàn)包括，所需的第二種糖核苷前體空缺或者用來自鏈霉菌Streptomyceshyalurolyticus的特異的透明質(zhì)酸酶進(jìn)行消化。用SephacrylS-200(Pharmacia)的以PBS進(jìn)行凝膠過濾層析，以確定優(yōu)化條件下體外形成的放射性標(biāo)記的聚合物的分子量。這些樣品的處理同紙色譜一樣，只是在終止之后，將其于95。C加熱2分鐘并在上柱之前通過離心(15000g7分鐘)來澄清。用EDTA(0.2mM)螯合試驗(yàn)混合物存在的任何金屬離子，以確定HAS活性的金屬依賴性。多種二價(jià)金屬離子包括Mg，Mn,Cu，Co，和Ni以它們的氯化物形式進(jìn)行了測試。在保持另一個(gè)放射性前體的恒定且飽和濃度下，滴定一種糖核苷濃度，從而計(jì)算底物的K^值。為此研究，使用了UDP-卩H]GlcNAc(30Ci/mmol,NEN)以及UDP-["C]GlcA前體。多殺巴斯德氏菌細(xì)胞產(chǎn)生了易于觀察的細(xì)胞外HA被膜，并且由于鏈球菌的HasA是一個(gè)跨膜蛋白，因而對禽霍亂病原體的膜制備物進(jìn)行了檢測。在早期的試驗(yàn)中，如果在類似于測量鏈球菌HAS的活性時(shí)所用的條件下，檢測HA中UDP-GlcNAc依賴的UDP-["C]GlcA的摻入，只用超聲波破碎獲得的粗的膜制備物只有很低的水平(大約0.2pmol的GlcA轉(zhuǎn)移(pg蛋白)"lr1)。來自帶有重組hasA質(zhì)粒的大腸桿菌的酶起初也難于分離。與這些結(jié)果相對應(yīng)，用類似的方法從鏈球菌中可獲得很容易檢測得到的數(shù)量。另一種制備方法在蛋白酶抑制劑存在下利用冰預(yù)冷的溶菌酶處理并結(jié)合超聲波破碎，可以從兩種格蘭氏陰性菌種獲，HAS活性的基本回收。利用此方法可以從野生型多殺巴斯德氏菌的粗膜中常規(guī)地獲得5-10pmo1的GLcA轉(zhuǎn)移(嗎蛋白)"h-1的特異活性。在不存在UDP-GlcNAc時(shí)，實(shí)際上沒有摻入到高分子物質(zhì)中的UDP-[14C]GlcA的放射性(為利用兩種糖前體的相同試驗(yàn)的1%以下)。提供了兩種糖核苷前體條件下，從物被膜的突變體TnA中制備的膜不具有可檢測得到的HAS活性。用SephacrylS-200進(jìn)行的凝膠過濾層析分析表明，主要的14C標(biāo)記的體外合成的產(chǎn)物的分子量為〉-8X104Da，因?yàn)樵撐镔|(zhì)在外水體積中被洗脫；該值相應(yīng)于HA的分子至少由400各單體構(gòu)成。該產(chǎn)物還對鏈霉菌的透明質(zhì)酸酶消化敏感，但對鏈霉蛋白酶具有抗性。HAS試驗(yàn)的參數(shù)可以變化，以利于多殺巴斯德氏菌獲得多糖種最大的UDP-糖的摻入。鏈球菌HasA需要Mg2+，因此在多殺巴斯德氏菌膜的起始試驗(yàn)中含有該金屬離子。多殺巴斯德氏菌的HAS在Tris類的緩沖液中在pH6.5至8.6下具有相對的活性，最佳為pH7，如圖7所示，它描述了多殺巴斯德氏菌的HAS活性對pH的依賴性。膜催化的HA多糖中["C]GlcA的摻入在各種pH值(50mMTris/2-(N-(嗎啉)乙磺酸，bis-Tris/HCl,或Tris/HCl;未發(fā)現(xiàn)大的緩沖離子特異性作用)的緩沖反應(yīng)中進(jìn)行測量。溫育的混合物中還含有20mMMgCl2，120|iMUDP-GlcA(4.5X104dpm/試驗(yàn))，禾Q300pMUDP-GlcNAc。試驗(yàn)中所用的最佳緩沖液pH7Tris的摻入被設(shè)為100%的活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在中性附近具有較寬的pH適用范圍。在中性pH下的至少1小時(shí)內(nèi)HAS的活性與溫育時(shí)間呈線性關(guān)系。在含有50mM，pH7，Tris20mMMgCl2的反應(yīng)中加入了lOOmMNaCl，降低了大約50%的糖摻入，因而多殺巴斯德氏菌的酶在高離子強(qiáng)度下表現(xiàn)出較低的活性。多殺巴斯德氏菌的HAS活性對離子強(qiáng)度的特異性在pH7,圖8中進(jìn)行了測定。圖8描述了HAS活性對離子強(qiáng)度的依賴性。增加Mg(圓圈)或Mn(方形)離子的條件下測定了HA的產(chǎn)量。將用0.2mMEDTA預(yù)洗的膜(46嗎蛋白)在含有金屬離子的50mM,pH7，Tris，120|aMUDP-GlcA(4.5X104dpm/試驗(yàn))，和300|iMUDP-GlcNAc的混合物中溫育1小時(shí)。不含有金屬離子的背景(22dpm)從每個(gè)點(diǎn)上減去。Mn比Mg更有效。在存在EDTA而無離子的條件下，為檢測到放射性前體摻入多糖(<0.5%的最大信號)。在低離子濃度的測試的金屬中(Mg，Mn，Co,Cu,Ni)Mr^給出了最高的摻入率。Mg^在高出IO倍的濃度下給出相當(dāng)于Mr^+的大約50%的作用。10mM的0)2+或N產(chǎn)支持了低水平的活性(分別為lmMMr^+的試驗(yàn)的20M或9n/。)，而提供了10mM的012+的膜沒有活性。實(shí)際上，混合了10mM的Cu"和20mMMg2+的膜制備物幾乎不發(fā)生多糖中標(biāo)記物的慘入(<0.8%Mg的單獨(dú)使用的值)。在M^+存在下多殺巴斯德氏菌的HAS執(zhí)行了起始特性。該酶對其糖核苷前體的結(jié)合親和性通過測量表現(xiàn)的km值來確定。在多糖中摻入的["C]GlcA或卩H]GlcNAc分別在各種濃度的UDP-GlcA或UDP-GlcNAc下進(jìn)行監(jiān)測，分別見圖9和10。圖9描述了HAS活性對UDP-GlcNAc的濃度依賴性。在含有50mM,pH7，Tris,20mMMgC12，禾卩800pMUDP畫GlcA(1.4X105dpm的"C)的緩沖液中，將膜(20i!g蛋白)與增加濃度的UDP-GlcNAc一起溫育1小時(shí)。背景的放射性(相同的試驗(yàn)但不加入U(xiǎn)DP-GlcNAc)從每個(gè)點(diǎn)上減去。滴定中HA中最高的特異性摻入率(平均大約780dpm/小時(shí))確定為V^x,作為標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為100%。圖10描述了HAS活性對UDP-GlcA的濃度依賴性。與圖9描述的試驗(yàn)向平行，在相同的通用緩沖液和試驗(yàn)條件下，增加數(shù)量的UDP-GlcA與lmMUDP-GlcNAc(2.7X105dpm的3H)—起溫育。背景的放射性(不加入U(xiǎn)DP-GlcNAc的試驗(yàn))從每個(gè)點(diǎn)上減去。數(shù)據(jù)同9中一樣給出。在V^x時(shí)的特異摻入平均大約730dpm/小時(shí)。對圖11所示滴定數(shù)據(jù)利用Hanes-Woolf作圖([S]/V對[S])測定出在含有Mg2+的緩沖液中，表現(xiàn)的km值為UDP-GlcA的20^M和UDP-GlcNAc的75iiM。圖11描述了Hanes-Woolf作圖計(jì)算的VMAX和KM。用以產(chǎn)生圖9(方形)和圖10(圓圈)的特異摻入的數(shù)據(jù)以[syvx寸[s]作圖。平行的斜線代表1/VMAX，表明糖核苷前體的最大速率時(shí)相等的。X軸截距表示-KM，獲得的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的km值分別為75和20)aM。兩種糖的Vgx值是相同的，因?yàn)樾甭氏嗤Ρ萂g試驗(yàn)的結(jié)果，UDP-GlcNAc的KM值增加了25-50%，達(dá)~105，且VMAX值在Mn存在時(shí)增加了2-3倍。這些值列于表I中。表I<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>如前所述，病原體多殺巴斯德氏菌和S.pyogenes的HA被膜是攻擊宿主防御的毒素因子。來自任何細(xì)菌來源的HA合酶都利用UDP-糖，但是它們略有在pH和金屬離子依賴性和KM值方面的不同的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。兩種酶都在pH7時(shí)最具活性，但是PmHAS在堿性pH方面，至少達(dá)pH8.6時(shí)表現(xiàn)的功能性更好。在另一方面，spHAS據(jù)報(bào)道在略酸性的pH下表現(xiàn)為更具活性而在pH7.4時(shí)相對不具活性。多殺巴斯德氏菌的酶在體外試驗(yàn)條件下利用Mn"比Mg^更有效率。PmHAS結(jié)合UDP-糖比鏈球菌HasA更為緊密。測量出的粗膜中PmHAS對于兩種底物的KM值比鏈球菌膜上的HAS所獲得的數(shù)值低2-3倍。3.將PmHAS用于免疫接種PmHAS的DNA序列還可以用于生產(chǎn)潛在的減毒疫苗多殺巴斯德氏菌菌株，這可以利用已破壞的基因通過同源重組，經(jīng)過敲除正常的微生物基因而完成。此外，PmHAS的DNA序列還可以用來產(chǎn)生診斷細(xì)菌類型的探針，診斷作為家禽，牛，羊和豬的病原體的相關(guān)的多殺巴斯德氏菌類型。至少有5種不同類型的細(xì)菌病原體多殺巴斯德氏菌，它們帶有不同的被膜抗原。由A型菌株引發(fā)的禽霍亂或鳥類出血性敗血病在家禽業(yè)中是廣泛傳播的具有經(jīng)濟(jì)危害性的疾病。禽霍亂的急性爆發(fā)常常只有當(dāng)家禽突然衰竭時(shí)才被發(fā)現(xiàn)，而這種癥狀通常在死亡前幾個(gè)小時(shí)才表現(xiàn)出來。雖然對多殺巴斯德氏菌毒性的分子機(jī)制知之甚少，但是看來病原體的毒性菌株具有多糖被膜，而它們的菌落在瓊脂糖平板上表現(xiàn)出粘液狀或"濕的"形態(tài)。白細(xì)胞很難吞噬和滅活這些細(xì)菌，而補(bǔ)體復(fù)合物無法結(jié)合該細(xì)菌膜以導(dǎo)致其裂解。CarterA型的多殺巴斯德氏菌導(dǎo)致了可能90-95%的禽霍亂，其主要的被膜成分是多糖HA，而HA并不觸動(dòng)幾乎所有動(dòng)物王國成員的免疫應(yīng)答。即使發(fā)生了免疫應(yīng)答，也還會由于禽類的自身免疫反應(yīng)而產(chǎn)生問題。A型的多殺巴斯德氏菌菌株還明顯導(dǎo)致了豬和牛的呼吸型出血性敗血病和牛的航運(yùn)熱。兩種其他的多殺巴斯德氏菌被膜類型，D型和F型，被研究的很少，但是它們是北美流行的病原體。F型可以從5-10%的禽霍亂中分離出來。D型還能導(dǎo)致牛、羊、和豬的肺炎。對從這些家畜的肺部創(chuàng)口的分離物的分析，其被膜類型中25-40。/。是D型，其余的是A型。另外，D型菌株還與豬的萎縮性鼻炎密切相關(guān)。D型和F型菌株的被膜由不同的具有未知結(jié)構(gòu)的多糖所構(gòu)成，但是它們看來與脊椎動(dòng)物體內(nèi)普遍存在的分子軟骨素相類似。軟骨素總的骨架結(jié)構(gòu)，重復(fù)的(P1，4)GlcA(P1,3)GlcNAc單位，與HA非常相似。因而并不奇怪，D型和F型多糖缺乏免疫原性。通常，由于先前的感染(或免疫接種)獲得的針對細(xì)菌表面成分的抗體，對于白細(xì)胞在吞噬作用中結(jié)合細(xì)菌十分重要的物質(zhì)；這一特征常使免疫應(yīng)答在抵抗疾病過程中極為有效。因此，由非免疫原性的聚合物構(gòu)成的被膜，諸如HA或軟骨素類的糖，阻斷了宿主防御中所有過程?；撴溓蚓侨说牟≡w，也利用HA被膜作為分子"模擬物"以保護(hù)其本身不受宿主防御的攻擊。無被膜的化膿鏈球菌突變體不能在血液中存活并且在小鼠中比野生型的毒性低100倍。許多毒性的大腸桿菌菌株擁有由其他模擬宿主分子的多糖構(gòu)成的被膜而幫助細(xì)胞躲避免疫系統(tǒng)。所有這些病原體細(xì)菌的被膜都是進(jìn)化選擇的產(chǎn)物，為了抵抗疾病它們必須被克服。先前的調(diào)查集中在多殺巴斯德氏菌的被膜和其在毒性中的作用上。對于A型家禽菌株，研究了野生型的形成被膜的細(xì)菌和各種無被膜形式，測試了它們在分離的宿主防御(白細(xì)胞和補(bǔ)體)攻擊下的存活能力或者導(dǎo)致活禽感染和死亡的能力。無被膜的細(xì)菌通常是(a)自發(fā)產(chǎn)生的突變體；(b)化學(xué)誘變的突變體；或者(c)用透明質(zhì)酸酶，一種特異的降解HA的酶，處理的野生型細(xì)菌。總之，被膜缺陷型A型細(xì)菌很容易被體外分離的宿主防御殺死。火雞的血清可殺死突變體和Haase處理的細(xì)胞，而野生型細(xì)胞卻繼續(xù)繁殖。還涉及補(bǔ)體系統(tǒng)，因?yàn)樵谂c細(xì)菌一起溫育之前加熱或者用鈣螯合劑處理血清，殺菌能力都會丟失。形成被膜的野生型細(xì)胞消耗或降低了血清中的補(bǔ)體水平而不被滅活，這表明該復(fù)合物與細(xì)胞結(jié)合但并不裂解它?；痣u巨噬細(xì)胞和嗜異細(xì)胞比對于野生型細(xì)胞更愛吞噬無被膜的變異體和Haase處理的細(xì)胞。在活體動(dòng)物試驗(yàn)中，通過LD5。(例如，對50%的被測動(dòng)物的致死劑量)的確定，自發(fā)的突變體比相應(yīng)的野生型父本菌株具有低103-105倍的毒性。這種極大的差異表明了被膜在A型菌株的發(fā)病機(jī)制中的重要作用。在活的火雞中該細(xì)菌的命運(yùn)也依賴于被膜的形成；只有野生型細(xì)胞才能在活體內(nèi)生存。注射后15-20小時(shí)，在血液中發(fā)現(xiàn)的野生型細(xì)胞濃度比不形成被膜的突變體高105倍。HA被膜的另一種功能是支撐并形成菌落。脊椎動(dòng)物體內(nèi)的某些細(xì)胞在其表面具有特異的HA結(jié)合蛋白；細(xì)菌可能可以通過這種蛋白/HA的相互作用而結(jié)合宿主。同樣，D型和F型多殺巴斯德氏菌的被膜也表現(xiàn)為毒性因子，它使得細(xì)菌對吞噬作用產(chǎn)生抗性。當(dāng)用軟骨素酶處理D型和F型細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌失去了它們的被膜而更易于被體外吞噬。而且，這些聚合物不具有強(qiáng)免疫原性。體內(nèi)測試中，形成被膜的D型菌株在豬中產(chǎn)生了更為嚴(yán)重的鼻損傷，并且在小鼠中比不形成被膜的變異體具有更低的LD5。(分別為102對10^個(gè)細(xì)胞)。在上述的對A型和D型突變體的研究中，其缺陷的遺傳學(xué)特征并不清楚，并且還沒有簡單的方法可以對該突變作圖。特別是化學(xué)誘變，很可能在一個(gè)所給的"突變體"中有著多個(gè)突變。而且，在"無被膜的"突變體中并不表明HA的生產(chǎn)被徹底根除了；無法通過菌落形態(tài)、光學(xué)顯微鏡或者化學(xué)測試檢測出的薄型被膜可能仍然存在。需要更為靈敏的輻射測量和浮力密度試驗(yàn)檢測很小的被膜。利用這些新方法已經(jīng)確認(rèn)，在幾種毒性試驗(yàn)中被報(bào)道為無被膜的菌株，實(shí)際上具有非常薄的HA被膜。因此，重要的是確定真正無被膜菌株的效果。涉及多殺巴斯德氏菌的被膜生產(chǎn)的基因在歷史上并不為人所知。在另一種相關(guān)屬中的細(xì)菌，流感嗜血桿菌，的被膜基因座位上的幾個(gè)基因曾被作圖并測序，但是對該生物合成裝置的分子細(xì)節(jié)并不清楚。即使在大腸桿菌這一研究深入的格蘭氏陰性菌中，每一個(gè)推測的基因產(chǎn)物的確切功能也并為完全了解，雖然其被膜形成的位點(diǎn)己經(jīng)被徹底作圖并且也已經(jīng)從多種被膜類型中獲得了DNA序列。化膿鏈球菌的HA生物合成位點(diǎn)的克隆和測序已有報(bào)道。該微生物與多殺巴斯德氏菌一樣，利用HA被膜來躲避人的防御系統(tǒng)。該HA操縱子含有三個(gè)基因，串聯(lián)排列在大約4kb的DNA上。第一個(gè)基因，hasA，編碼45.1kDa的HA合酶，聚合兩種糖核苷前體，UDP-GlcA和UDP-GlcNAc，形成HA多糖。第二個(gè)基因，hasB，編碼45.5kDa的UDP-葡萄糖脫氫酶，轉(zhuǎn)化UDP-葡萄糖(UDP-Glc)形成UDP-GlcA用于HA的生物合成。第三個(gè)基因，hasC，編碼一個(gè)34kDa的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶，使UTP和葡萄糖-l-磷酸形成UDP-Glc。還有一個(gè)輔助性的酶，用于形成被膜生物合成所需的UDP-糖。另一個(gè)位于染色體其他位點(diǎn)的"看家基因"細(xì)菌正常的代謝途徑提供UDP-Glc。由于作用與細(xì)胞壁的合成，UDP-GlcNAc存在于所有的真細(xì)菌之中。因此，HA合酶和脫氫酶是異源細(xì)菌中需要用于指導(dǎo)HA多糖合成的僅有的兩個(gè)外生蛋白。化膿鏈球菌的HA合酶，預(yù)計(jì)是一個(gè)帶有跨膜螺旋的膜蛋白，它既聚合HA又轉(zhuǎn)運(yùn)生長的多糖鏈到細(xì)胞外部。正如上文所討論的，多殺巴斯德氏菌的負(fù)責(zé)被膜生產(chǎn)的基因已經(jīng)被分離和測序。(例如見SEQIDNO:l和2)。該基因是本發(fā)明公開和要求的一部分。正如上文所討論的，多殺巴斯德氏菌被膜的聚合物對于宿主具有兩難性。利用PmHAS基因序列的信息，重組產(chǎn)生的帶有被"敲除"的HA合酶基因的多殺巴斯德氏菌菌株將能夠破壞多殺巴斯德氏菌細(xì)菌被膜的合成。將"敲除"菌株用作疫苗將可以使宿主生物擋住該領(lǐng)域病原體的攻擊。如上所述，Tn916是一個(gè)多能的被證實(shí)的誘變體，可以插入到多殺巴斯德氏菌的染色體的不同的看來是近似隨機(jī)的位點(diǎn)上。通過電轉(zhuǎn)移將Tn置于一個(gè)"自殺"質(zhì)粒上一例如不能在多殺巴斯德氏菌復(fù)制-引入細(xì)胞。Tn以4000次/每個(gè)生物的DNA的頻率移開或者跳離質(zhì)粒并進(jìn)入基因組。獲得的后代擁有來自Tn的四環(huán)素抗性基因并可以容易地通過藥物篩選出來。如上所述，事實(shí)上從毒性父本菌株中產(chǎn)生了一組獨(dú)立的轉(zhuǎn)座子突變體，它在被膜生物合成上有缺陷。對大約105個(gè)轉(zhuǎn)化的菌落通過聯(lián)合應(yīng)用目測的和生物化學(xué)篩選，發(fā)現(xiàn)了兩類被膜缺陷型，它們導(dǎo)致了微型被膜或者無被膜突變體。第一類(幾種獨(dú)立的菌株)具有非常小的HA被膜，因而稱作微型被膜。形成被膜的野生型菌株在培養(yǎng)基平板上產(chǎn)生大的粘液狀的，彩色的菌落，并且單個(gè)細(xì)胞形成的被膜的厚度在光學(xué)顯微鏡下測量大致相等與細(xì)胞體的直徑。相比之下，微型被膜菌株形成較小的彩色的菌落，在平板上看上去有些干；其單個(gè)細(xì)胞的被膜厚度只有大約野生型的四分之一或更小。四個(gè)突變體(四個(gè)獨(dú)立的菌株)看來是真正的無被膜的，它們在培養(yǎng)基平板上形成小的、干的菌落。在光學(xué)顯微鏡下沒檢測到被膜。無被膜菌株的浮力密度，與用透明質(zhì)酸酶處理而被剝?nèi)ケ荒さ靡吧痛直┫嗟?。這些菌株還缺少了HA合酶活性；將外生性放射性標(biāo)記的UDP-糖前體加入到來自這些突變體的制備物中，但沒有HA多糖的形成。兩個(gè)這樣的無被膜突變體，TnH和TnL，具有有趣的特性，它們以大約10-3的頻率偶爾地回復(fù)突變成野生型，在培養(yǎng)基平板上表現(xiàn)出被膜表型。通過光學(xué)顯微鏡觀察和HA多糖的放射性劑量試驗(yàn)真實(shí)，這種回復(fù)突變的細(xì)胞具有野生型被膜。其分子解釋是Tn偶然地從被膜基因處精確地切離(沒有添加或缺失堿基)并整合到染色體的其他部位。獲得的形成被膜的后代在培養(yǎng)基平板上很容易觀察。這種返祖現(xiàn)象是典型的遺傳學(xué)證據(jù)，表明這兩個(gè)菌株中的Tn曾經(jīng)誘變了被膜合成所需的一個(gè)重要位點(diǎn)。但是，由于其相對的不穩(wěn)定性，Tn-衍生的突變體對于減毒疫苗菌株是不穩(wěn)定的；會以某中頻率產(chǎn)生毒性形式。利用Southern雜交對兩種原來的無被膜突變體和形成被膜的回復(fù)突變進(jìn)行Tn位點(diǎn)的作圖。如圖12，經(jīng)HindIII或BastXI消化的類型證實(shí)，TnH和TnL在相同的位點(diǎn)上具有Tn因子。圖12是Tn突變體的Southern雜交作圖。將來自被膜突變體、形成被膜的回復(fù)突變、和對照的染色體DNA用HindIII消化。DNA用凝膠電泳分離并用于Southern雜交。由于內(nèi)部插入的限制位點(diǎn)，Tn探針識別出每個(gè)轉(zhuǎn)座子的兩條帶(形成一條較大的10kb和一條較小的5kb片段)。Tn探針不與來自不含有Tn的父本菌株的DNA雜交(0泳道)。還檢測了來自無被膜突變體TnH(H)和TnL(L)的獨(dú)立菌落的多個(gè)DNA制品或者單個(gè)形成被膜的回復(fù)突變體(劃線字母表示)。除了TnL具有2個(gè)拷貝的Tn(亞培養(yǎng)的一個(gè)菌株含有3個(gè)拷貝)，所有突變體都具有單一的Tn插入。TnW(W)是粘液狀的含有Tn的對照菌株。標(biāo)出了入/HindIII標(biāo)準(zhǔn)的23.1,9.4,和6.6kb(從上至下)條帶的位置。無被膜突變體H和L(沒有HA合酶活性)，和一個(gè)代表性的微型被膜突變體TnD(D)中的Tn因子，作圖在相同的位置。由于回復(fù)突變成粘性表型，相關(guān)的Tn因子在各種情況中都移到了新的位點(diǎn)。突變體中被破壞的DNA在該位點(diǎn)被分離并產(chǎn)生了被膜基因的探針。隨后的序列分析確定出TnH和TnL相隔大約lkb。在各種情況中，這些突變體的回復(fù)突變在原來的位點(diǎn)上失去了Tn而得到了一個(gè)新的Tn位點(diǎn)(如圖12中，帶有下劃線的字母的泳道)。另外，從未發(fā)現(xiàn)任何微型被膜回復(fù)突變成形成被膜的形式。導(dǎo)致所有微型被膜突變體的Tn(以TnD代表)都作圖在與TnH和TnL突變體相同的17kb的HindIII片段上。這些定位通過BstXI的作圖得以確證。在另外的無被膜的突變體TnA和TnG中，Tn因子定位于其他不相關(guān)的基因上而HA被膜位點(diǎn)由于自發(fā)突變表現(xiàn)出無功能。這種偶發(fā)的自發(fā)突變是預(yù)料之中的；實(shí)際上，在對鏈球菌被膜位點(diǎn)的類似研究中，13個(gè)菌株中的12個(gè)是自發(fā)突變的結(jié)果。利用Tn916的插入誘變來鑒定并克隆多殺巴斯德氏菌與HA被膜生物合成相關(guān)的DNA。為了完成這項(xiàng)任務(wù)，進(jìn)行了三個(gè)步驟(i)利用相應(yīng)于Tn916末端DNA的一個(gè)引物對Tn插入位點(diǎn)的宿主DNA測序；(ii)根據(jù)新的序列設(shè)計(jì)出PCR引物以擴(kuò)增兩個(gè)Tn因子之間的DNA片段，并(iii)利用該被膜位點(diǎn)特異性PCR產(chǎn)物作為雜交探針來篩選野生型基因組在A病毒文庫中的功能性克隆。獲取臨近Tn的多殺巴斯德氏菌DNA的關(guān)鍵步驟是運(yùn)用最近DeAngelis，RL.(1998)"多殺巴斯德氏菌中轉(zhuǎn)座子Tn916的插入誘變和對破壞位點(diǎn)的直接測序"，微生物發(fā)病機(jī)制，中詳細(xì)描述的直接測序技術(shù)，該文獻(xiàn)在此提及可以參考。所有被膜類型的多殺巴斯德氏菌基因組都含有許多限制酶HhaI的位點(diǎn)；因此幾乎每個(gè)這樣消化的DNA片段都小于7kb，如圖13中0泳道所示。圖13描述了用于Tn插入位點(diǎn)的序列分析的嵌合DNA模板。通過這種方法，可以快速直接地獲得任何被Tn916破壞的基因的DNA序列。該方法利用了Tn因子有差異的敏感性和A型多殺巴斯德氏菌基因組的限制酶Hhal的位點(diǎn)。16kb的Tn因子只有1個(gè)Hhal位點(diǎn)，可產(chǎn)生12和4kb的消化片段。因此，任何Tn因子破壞的基因都會產(chǎn)生另外的一個(gè)12kb的DNA。這種增加的Hhal片段大小使得可以方便地通過瓊脂糖電泳簡單地從其余的染色體DNA中分析出Tn標(biāo)記的基因。該0.7%的凝膠電泳顯示出來自不含有Tn的父本菌株的(0泳道)、和幾種含有Tn的突變體(Tn突變體泳道)的染色體DNA的Hhal消化類型。入/HindIII標(biāo)準(zhǔn)(S泳道)以kb標(biāo)注。遷移至大約13-17kb的嵌合的Tn/基因組DNA片段(箭頭所示)只在Tn突變體中被發(fā)現(xiàn)。值得注意的是L泳道有三個(gè)嵌合條帶；該特殊的突變體具有三個(gè)Tn因子(見圖12)。嵌合DNA可以分離并直接用作測序模板；不需要克隆或PCR。得到的較大的嵌合DNA分子，易于從其余的較小的基因組片段中通過電泳分離出來，它可以用作循環(huán)測序反應(yīng)的模板。相當(dāng)于Tn916右側(cè)末端的PCR引物指導(dǎo)向外延伸至被破壞的DNA。因此，突變體DNA的插入位點(diǎn)的序列數(shù)據(jù)可以無需PCR擴(kuò)增或克隆模板DNA而常規(guī)地獲得。新的序列信息可以用于設(shè)計(jì)PCR引物用以擴(kuò)增TnL和TnH突變體之間的DNA區(qū)域。將特異的lkb的產(chǎn)物用作雜交探針以獲得A型多殺巴斯德氏菌的5.8kb的被膜生物合成操縱子部分。如圖14所示，A型基因組DNA克隆的插入可以直接地指導(dǎo)大腸桿菌中HA的生物合成?，F(xiàn)發(fā)現(xiàn)該開放閱讀框編碼兩個(gè)蛋白，Kps和KfaA，它們類似于大腸桿菌中表現(xiàn)為多糖轉(zhuǎn)運(yùn)的分子；一個(gè)HA合酶，它聚合HA多糖；和一個(gè)前體形成酶，UDP-普通脫氫酶。該原始質(zhì)粒的缺失分析表明整個(gè)的HA合酶對于HA在異源細(xì)菌中的產(chǎn)生是基本的。相應(yīng)與TnH和TnL的原始的Tn插入位點(diǎn)以星號標(biāo)出。Tn插入事件看來導(dǎo)致了極性突變，它終止了下游HA合酶和脫氫酶基因的表達(dá)。因此，通過序列分析，發(fā)現(xiàn)了新的PmHAS和類似于E.coli的KfaA的、推測的多糖轉(zhuǎn)運(yùn)同源物的整個(gè)開放閱讀框。數(shù)據(jù)還表明，一個(gè)UDP-Glc脫氫酶同源基因，它能夠產(chǎn)生UDP-GlcA前體，和另一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，E.coli的kps基因的同源基因，存在于HA合酶附近。來自多殺巴斯德氏菌的單一的110kb的蛋白，PmHAS,指導(dǎo)E.coli中HA被膜的產(chǎn)生。帶有質(zhì)粒上含有PmHAS的重組細(xì)胞所產(chǎn)生的被膜的厚度與毒性野生型菌株的一樣。根據(jù)它對特異的HA裂解酶消化的敏感性和它與選擇性HA結(jié)合蛋白的作用，確定該被膜物質(zhì)是真正的HA。有趣的是，PmHAS在氨基酸水平上不與其他的HAS相似。為了獲得穩(wěn)定的同基因多殺巴斯德氏菌突變體，運(yùn)用了用于P.haemolytica誘變的方法。制備了用于通過HA合酶雙交叉而靶向滅活的敲除盒。將無啟動(dòng)子的氯霉素抗性基因(cat)插入整個(gè)PmHAS開放閱讀框的中間(XhoI位點(diǎn))，并克隆進(jìn)質(zhì)粒(pKK223-3)，它不能穩(wěn)定地在多殺巴斯德氏菌中復(fù)制。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到形成被膜的野生型菌株中并將細(xì)胞在含有氯霉素的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。當(dāng)整合到耙基因上時(shí)，完整的PmHAS蛋白不再形成。Cat基因由內(nèi)源的被膜基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄；下游基因UDP-葡萄糖脫氫酶會受到影響。因而形成了真正的同基因突變體。分離出了三個(gè)同基因的無被膜的突變體。這三個(gè)突變體中的任何一個(gè)在光學(xué)顯微鏡和墨水染色下都未檢測到被膜。HA合酶在DNA和生化水平上都被破壞了。見表II。通過利用針對PmHAS酶的一部分的抗體進(jìn)行的Western雜交分析，該無被膜的敲出突變體缺少了在野生型父本中存在的約110Kda的條帶，PmHAS酶。結(jié)合表II中的數(shù)據(jù)(缺少多糖的產(chǎn)生)，在該敲除菌株中未發(fā)現(xiàn)功能性的PmHAS。某些區(qū)域在各種被膜類型的基因中是普遍或相似的。這表現(xiàn)在如15所示的對D型和F型DNA的Souther雜交分析中。如圖15所示，將來自A，F(xiàn)，或D型菌株的染色體DNA用HindIII或者EcoRI消化(對于每個(gè)探針分別為右和左泳道)并用于Southern雜交。利用地高辛標(biāo)記的PCR產(chǎn)物探針，它相應(yīng)于kfaA同源序列(K)或者HA合酶(H)基因的區(qū)域，檢測其他被膜類型(標(biāo)有星號的條帶)細(xì)菌的同源序列。在F和D型中都顯示出了KfaA的同源序列。一個(gè)非常相似的合酶同源序列在F型中被發(fā)現(xiàn)，而在D型中卻沒有。該探針適合于篩選文庫。人/Hindlll標(biāo)準(zhǔn)以kb標(biāo)注。F型具有與兩種探針都相似的區(qū)域，而D型只與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白探針相似。以幾套相應(yīng)與A型序列的引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增出D型或F型基因組DNA，如圖16所示。圖16描述了用A型引物進(jìn)行異源DNA的PCR。利用相應(yīng)于A型菌株的kfaA同源基因(A圖)或者HA合酶基因(B圖)的各種引物對，擴(kuò)增來分離自幾種帶有不同被膜類型的其他多殺巴斯德氏菌菌株的基因組DNA。用Taq酶進(jìn)行了四十個(gè)循環(huán)(94°C，30秒；42°C，30秒；72°C，60秒)的聚合酶鏈反應(yīng)。將反應(yīng)混合物在1%的瓊脂糖凝膠上分離并用溴乙啶染色(泳道A，A型；D，D型；F,F型；0，無模板對照)。標(biāo)準(zhǔn)(S)為lOObp梯帶，1和0.5kb的條帶用箭頭標(biāo)出。P-I引物對得出了所有三種被膜類型的產(chǎn)物，但是D型產(chǎn)物比其他的產(chǎn)物小。P-II和P-III弓I物對只擴(kuò)增出A型和F型。相反，P-IV和P-V引物對只擴(kuò)增出A型。這表明A型和F型被膜基因位點(diǎn)之間比與D型更為相似。P-I引物對的PCR產(chǎn)物可用作良好的雜交探針用于其他類型的被膜基因位占。并非所有引物的聯(lián)合都能和異源模板DNA產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增出了F型0.2-lkb的、編碼HA合酶或者被膜聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)類似物的基因部分。還擴(kuò)增出了D型基因組的lkb的編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的區(qū)域。幾種PCR產(chǎn)物的序列分析揭示出了同源但是有差別的序列。總體上，這些數(shù)據(jù)提示A型和F型菌株之間最為相關(guān)而與D型并不相似。A型和F型KfaA同源基因與E.coli的KfaA的序列比較如圖17所示。以P-I引物對(見圖16)擴(kuò)增F型DNA所產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠純化并用原始的一個(gè)引物測序。發(fā)現(xiàn)A型和F型序列在氨基酸水平上非常相似；蛋白序列的部分比對顯示在此區(qū)域中這兩個(gè)序列大部分相同而帶有一些錯(cuò)配(圖17中差異用下劃線標(biāo)出)?？傮w上，多殺巴斯德氏菌序列與E.coli的可能作用于多糖轉(zhuǎn)運(yùn)的KfaA蛋白具有相當(dāng)?shù)耐葱?圖17中相同的殘基以粗體字標(biāo)出)。這些PCR產(chǎn)物還可用作雜交探針，從D型或F型基因組文庫中獲得功能性的被膜基因位點(diǎn)?？寺〉腄NA還用于構(gòu)建基因敲除的質(zhì)粒其中，獲得的突變體菌株可用于毒性試驗(yàn)或者疫苗。多殺巴斯德氏菌的細(xì)菌被膜的產(chǎn)生涉及至少下列的步驟(i)糖核苷前體的合成；(ii)前體聚合形成被膜多糖；和(iii)被膜組裝時(shí)，多糖向細(xì)胞外空間的輸出或轉(zhuǎn)運(yùn)。當(dāng)然可能存在調(diào)控基因或因子控制著酶的水平或酶的活性，但是焦點(diǎn)集中在這個(gè)途徑中主要的結(jié)構(gòu)酶。在Exoli中候選的編碼此過程的2型被膜基因都定位于細(xì)菌染色體的單一位點(diǎn)上。產(chǎn)生不同結(jié)構(gòu)的被膜的E.coli菌株具有上面(i)和(ii)兩步中不同的酶，但是在(iii)步中看來都共同擁有普遍的轉(zhuǎn)運(yùn)/輸出機(jī)制。在化膿鏈球菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)的完整的膜酶聚合前體糖，而且也轉(zhuǎn)運(yùn)HA多糖穿過膜。A型多殺巴斯德氏菌具有四個(gè)不同的基因于這三個(gè)細(xì)菌被膜產(chǎn)生的生物合成步驟相關(guān)。(見圖14)。多殺巴斯德氏菌多糖轉(zhuǎn)運(yùn)子與E.coli.的同源物在蛋白水平上的相似型提示，一些其他的被膜基因的總體功能可能也與這兩個(gè)種相似。被膜作為毒性因子在禽霍亂中的作用已經(jīng)被確認(rèn)。為了防止在細(xì)菌被膜和毒性的研究中的差錯(cuò)和危險(xiǎn)，對確認(rèn)的突變體與野生型菌株進(jìn)行了比較。具有被破壞了的被膜基因的同基因A型突變體進(jìn)行測試，檢測它體外防止預(yù)先存在或預(yù)先免疫宿主，以及體內(nèi)感染活家禽的能力。按照本發(fā)明所述的方法生成穩(wěn)定的同基因突變體。利用在質(zhì)粒上的被破壞了的PmHAS基因(見圖18)和同源重組技術(shù)，產(chǎn)生出一種重組的多殺巴斯德氏菌菌株，它喪失了產(chǎn)生透明質(zhì)酸被膜的能力。該菌株進(jìn)而在DNA和生化水平上都進(jìn)行了分析。我們通過Southern雜交和PCR分析發(fā)現(xiàn)，功能性HA合酶基因被缺陷的含有cat盒插入的基因所替換了。(見圖19)。對基因破壞的確定如圖19所示。圖A為Southern雜交分析。各個(gè)菌株的染色體DNA經(jīng)HindIII消化，在0.7%的瓊脂糖凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維膜上。將印漬與多殺巴斯德氏菌的HAS基因探針雜交。檢測出兩條帶是由于PmHAS基因內(nèi)部的HindIII位點(diǎn)產(chǎn)生的。M泳道是粘型轉(zhuǎn)化子；KO泳道是無被膜的敲除突變體；P泳道為父本菌株。670bp的cat盒的加入導(dǎo)致了KO泳道中上方條帶的大小位移(用箭頭標(biāo)出)。圖19B為PCR分析。利用一對位于PmHAS的Xhol位點(diǎn)兩側(cè)的寡核苷酸引物，經(jīng)過35個(gè)循環(huán)的PCR，擴(kuò)增出來自各個(gè)菌株的細(xì)胞裂解物的DNA。來自正常的野生型基因的擴(kuò)增物的長度為650bp。將PCR反應(yīng)在1%的瓊脂糖凝膠上分離并用溴乙啶顯色。M泳道是粘型轉(zhuǎn)化子；KO泳道是無被膜的敲除突變體；P泳道為父本菌株。C泳道為克隆的PmHAS質(zhì)粒對照；而S泳道為分子量標(biāo)準(zhǔn)。敲除突變體模板產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為大約1300bp(用箭頭標(biāo)出)；該條帶由670bp的cat盒和來自PmHAS的650bp組成。在敲除菌株的反應(yīng)中未檢測出野生型擴(kuò)增物，因此發(fā)生了由雙交叉介導(dǎo)的同源重組。而且，利用對HA聚合物敏感的放射化學(xué)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該突變體菌株不生產(chǎn)HA，表II列出了各個(gè)菌株的HA生產(chǎn)。表n菌株HA多糖(納克/ml每OD,)p=野生型父本1,200M=粘型轉(zhuǎn)化子1,200KO=無被膜的敲除突變體<=0.05表II所列的菌株為各個(gè)菌株的過夜培養(yǎng)物，利用上文概述的特異性放射化學(xué)試驗(yàn)檢測其中HA聚合物的存在。培養(yǎng)物以分光光度法定量，數(shù)據(jù)以600nm處1.0個(gè)吸收值的培養(yǎng)物中HA的濃度而表示。野生型父本或粘液狀的、形成被膜的轉(zhuǎn)化子合成了基本數(shù)量的HA。相反，無被膜的敲除突變體未產(chǎn)生可檢測到的HA(KO)。因此，被膜在毒性中的作用得到了確證。所用的形態(tài)學(xué)方法也可以用于構(gòu)建多殺巴斯德氏菌的其他突變體，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明所公開的方法就可以完成此項(xiàng)任務(wù)。動(dòng)物測試比較了該突變體對互補(bǔ)的突變體對照和野生型A型多殺巴斯德氏菌的體內(nèi)病原型。將A型多殺巴斯德氏菌的敲除菌株ATCC15742，(它能導(dǎo)致禽霍亂)，運(yùn)至位于Ames,Iowa的USDA研究站進(jìn)行毒性測試。利用靶向同源重組，敲除菌株的被模合成已經(jīng)被破壞，該敲除菌株預(yù)計(jì)毒性低iooo倍。進(jìn)行了毒性測試以檢測該KO菌株作為疫苗菌株的安全性。將火雞蛋在清潔的環(huán)境下孵化并飼養(yǎng)至2周大。對該家禽注射不同濃度的細(xì)菌(野生型或者該敲除菌株)。通過顯微鏡計(jì)數(shù)和培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)對細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。對動(dòng)物進(jìn)行肌肉注射并將其置于生物密封圍欄中。獲得了被接種的家禽(6或7只一組，每只的微生物劑量范圍從80至107個(gè)細(xì)菌，以10倍梯度遞進(jìn))。6天內(nèi)檢測其總體表現(xiàn)、活力和病態(tài)程度。死亡的或?yàn)l死的家禽進(jìn)行尸體解剖檢査損傷、膿腫和組織衰竭的存在。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果總結(jié)在表III中。表III菌株每次注射的細(xì)胞數(shù)發(fā)病率野生型8X10343%野生型86017%突變體w/HAS敲除1X1070%這種類型的實(shí)驗(yàn)的目的在于確定由于病原體被膜形成而感染的總體趨勢。每個(gè)實(shí)驗(yàn)中，白色火雞通過肌肉注射一定量的細(xì)菌而接種。計(jì)量火雞的病癥和死亡并制成表以比較突變體的相對毒性。還進(jìn)行了保護(hù)性試驗(yàn)，以確定被免疫的火雞是否能夠在野生型毒性菌株的攻擊下存活。還制備了感染牛和兔的A型敲除菌株。進(jìn)行了體內(nèi)測試以確定這兩種敲除菌株的病原性，并進(jìn)行了保護(hù)性試驗(yàn)，以確定被免疫的動(dòng)物是否能夠在野生型毒性菌株的攻擊下存活。進(jìn)行了兩主要類型的保護(hù)性實(shí)驗(yàn)。首先進(jìn)行被動(dòng)免疫。用潛在的疫苗KO菌株感染一只雞，接種大約1-2周后獲取其血清(帶有保護(hù)性抗體)。將該血清或進(jìn)而純化的抗體給一普通的雞注射。用野生型菌株攻擊該雞。該雞如果獲得了保護(hù)性抗體就能夠在其他致死的野生型菌株攻擊下存活。第二，進(jìn)行了自動(dòng)免疫。在此情況下，用潛在的疫苗KO菌株感染同樣的雞，并在幾周后用通常致死劑量的野生型菌株來攻擊該雞。此時(shí)檢測抗體介導(dǎo)的和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。根據(jù)本發(fā)明可以預(yù)計(jì)，由于其多糖相近的結(jié)構(gòu)類似性，不同的被膜形成類型的多殺巴斯德氏菌的被膜基因位點(diǎn)具有相似性。本發(fā)明還涉及同源的F型多殺巴斯德氏菌基因("PmCS")。PmCS序列的信息如SEQIDNO:3所示。F型基因與A型基因具有大約85%的相同性，其序列對比如圖20所示。通過Southern雜交和PCR分析，在DNA水平上還發(fā)現(xiàn)了在克隆的A型被膜基因和D和F型基因組的某個(gè)區(qū)域之間的這種同源性，如圖15，16，17所示。對F型基因組DNA在A噬菌體上的文庫進(jìn)行篩選，分離出該同源的被膜位點(diǎn)。還將對D型基因組DNA在入噬菌體上的文庫進(jìn)行篩選，以分離出同源的被膜位點(diǎn)。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解的是，可以以A和F型所用的同樣的方法確定出D型基因位點(diǎn)。A和F型PmHAS具有89%的相似性。利用PCR產(chǎn)物的雜交探針，圖16，根據(jù)HAS同源物和Kfa的同源物，獲得了F型多糖合酶基因。利用來自F型菌株的基因組DNA和來自Kfa和合酶區(qū)域的適當(dāng)?shù)囊?，產(chǎn)生了一個(gè)3kb的擴(kuò)增產(chǎn)物。將其用地高辛標(biāo)記并用于獲得克隆，并隨后獲得來自F型菌株的基因組DNA的入ZAP表達(dá)文庫(如對A型克隆所述的)的一個(gè)質(zhì)粒。對此陽性雜交克隆測序。對于A型HA合酶基因，PmHAS，通過E.coli中在pKK223-3(Pharmacia)載體上的表達(dá)來檢測其功能。發(fā)現(xiàn)該酶如期地在體外將UDP-GlaNAc和UDP-GlaA摻入到高分子量的聚合物軟骨素分子中。用抗體和Western雜交分子檢測被膜多糖合酶。針對相應(yīng)于合酶中共有的同源區(qū)域(12-20個(gè)氨基酸殘基)的一個(gè)合成的多肽生產(chǎn)出抗體。Western雜交確定了A型和F型多殺巴斯德氏菌都具有免疫反應(yīng)活性的、經(jīng)SDS-PAGE確定的110kDa的蛋白。圖21是天然的和重組的PmHAS蛋白的Western雜交分析。將E.coli中產(chǎn)生的天然的PmHAS和不同的重組截短的PmHAS衍生蛋白在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行比較。對于重組樣品，將總裂解物(T)，膜(M)，和細(xì)胞質(zhì)(C)用于抗PmHAS抗體的Western雜交。在天然的多殺巴斯德氏菌中發(fā)現(xiàn)的原始的蛋白(Pm，W泳道；用箭頭標(biāo)記)遷移至約U0kDa處；敲除疫苗菌株(KO菌株)則失去了這條帶。天然的PmHAS和在羧基端缺失了一部分的重組體形式(PmACC)都具有HA合酶活性。其他截短的結(jié)構(gòu)沒有活性。4.PmHAS在診斷中的應(yīng)用本發(fā)明還涉及生產(chǎn)有用的探針，以利于本領(lǐng)域中對A,D，和F型多殺巴斯德氏菌或P.haemlytica的鑒定。對動(dòng)物中存在的特定菌株的診斷目前是通過血清學(xué)、凝聚作用、或者限制酶切分析后的DNA指紋法來確定。前兩種方法問題在于常常產(chǎn)生錯(cuò)誤的鑒定，并且非常依賴于分型抗血清的來源。CarterA，D,和F型的被膜血清學(xué)方t去并不使用抗體，因?yàn)檫@些聚合物是極低免疫原性的。實(shí)際上常規(guī)使用的是利用酶解和吖啶黃的細(xì)胞絮凝的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)。DNA指紋法是精確的，但是它需要備檔大量的類型菌株的廣泛資料。幾套被膜特異性引物就可以用于快速地進(jìn)行這些流行病學(xué)研究，在半天之內(nèi)以少量的操作而無需亞培養(yǎng)，通過快速的簡便的PCR分析來鑒定平原性分離物。一旦病原體被鑒定出來，就可以做出有根據(jù)的決定來選擇抗生素和疫苗。由于當(dāng)前分型方法中的問題，顯然可以利用被膜DNA的信息快速確定多殺巴斯德氏菌類型。雜交或者基于PCR的分型都可以因其實(shí)用、靈敏和快速而被考慮。一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，適當(dāng)標(biāo)記的合酶DNA的探針(或者擴(kuò)展到被膜類型中不同的被膜基因位點(diǎn))，由于其具有獨(dú)特性的優(yōu)點(diǎn)，在適當(dāng)?shù)碾s交條件下可以具有非常好的性能(例如，互補(bǔ)基因和探針的雜交產(chǎn)生出信號，而來自其他被膜類型的不相同的基因則不雜交而不會獲得信號)。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)出能夠區(qū)分被膜類型的PCR引物。正確大小的擴(kuò)增產(chǎn)物表明特定的被膜類型；無擴(kuò)增產(chǎn)物則表明另一種有差異的被膜類型。在本領(lǐng)域當(dāng)前的情況下，可以考慮在一個(gè)反應(yīng)中應(yīng)用幾對PCR引物，產(chǎn)生有差別的不同大小的幾條帶。這種多重方法可以是多個(gè)反應(yīng)同時(shí)進(jìn)行。關(guān)于不同被膜的生物合成酶，尤其是該合酶的基因位點(diǎn)的DNA序列信息，可以使這些測試快速地區(qū)分不同的病原體菌株。因此，很清楚的是，在本發(fā)明中提供了一個(gè)分離的并測序了的PmHAS和一種完全滿足上述的目的和優(yōu)點(diǎn)的方法，它可用于制造和利用PmHAS和多殺巴斯德氏菌的敲除菌株。雖然本發(fā)明結(jié)合特殊的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但是顯然對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說可以有許多變換和修改。因此，處于后文權(quán)利要求所確定的精神和范圍之內(nèi)的所有這些修改與變化，都包括在本發(fā)明之中。<image>imageseeoriginaldocumentpage53</image>SEQIDNO:2-18ATTTTTTAAGGACAGAAAATGAATACATTATCACAAGCAATAAAAGCATATAACAGCAATGACTATCAA52TTAGCACTCAAATTATTTGAAAAGTCGGCGGAAATCTATGGACGGAAAATTGTTGAATTTCAAATTACC121AAATGCCAAGAAAAACTCTCAGCACATCCTTCTGTTAATTCAGCACATCTTTCTGTAAATAAAGAAGAA190AAAGTCAATGTTTGCGATAGTCCGTTAGATATTGCAACACAACTGTTACTTTCCAACGTAAAAAAATTA259GTACTTTCTGACTCGGAAAAAAACACGTTAAAAAATAAATGGAAATTGCTCACTGAGAAGAAATCTGAA32BAATGCGGAGGTAAGAGCGGTCGCCCTTGTACCAAAAGATTTTCCCAAAGATCTGGTTTTAGCGCCTTTA397CCTGATCATGTTAATGATTTTACATGGTACAAAAAGCGMAGPARAGACTTGGCMAAAACCTGAACAT466CAACATGTTGGTCTTTCTATTATCGTTACAACATTCAATCGACCAGCAATTTTATCGATTACATTAGCC535TGTTTAGTAAACCAAAAAACACATTACCCGTTTGAAGTTATCGTGACAGATGATGGTAGTCAGGAAGAT604CTATCACCGATCATTCGCCAATATGAAAATAAATTGGATATTCGCTACGTCAGACAAAAAGATAACGGT673TTTCAAGCCAGTGCCGCTCGGAATATGGGMTACGCTTAGCAAAATATGACTTTATTGGCTTACTCGAC742TGTGATATGGCGCCAAATCCATTATGGGTTCATTCTTATGTTGCAGAGCTATTAGAAGMGATGATTTA811ACAATCATTGGTCCAAGAAAATACATCGATACACAACATATTGACCCAAAAGACTTCTTAAATAACGCG8B0AGTTTGCTTGAATCATTACCAGAAGTGAAAACCAATAMAGTGTTGCCGCAAAAGGGGAAGGAACAGTT949TCTCTGGATTGGCGCTTAGAACAATTCGAAAAAACAGAAAATCTCCGCTTATCCGATTCGCCTTTCCGT1018TTTTTTGCGGCGGGTAATGTTGCTTTCGCTAAAAAATGGCTAAATAAMCCGGTTTCTTTGATGAGGAA1087TTTAATCACTGGGGTGGAGAAGATGTGGAATTTGGATATCGCTTATTCCGTTACGGTAGTTTCTTTAAA1156ACTATTGATGGCATTATGGCCTACCATCAAGAGCCACCAGGTAAAGAAAATGAAACCGATCGTGAAGCG1225GGAAAAAATATTACGCTCGATATTATGAGAGAAAAGGTCCCTTATATCTATAGAAAACTTTTACCAATA1294GAAGATTCGCATATCAATAGAGTACCTTTAGTTTCAATTTATATCCCAGCTTATAACTGTGCAAACTAT1363ATTCAACGTTGCGTAGATAGTGCACTGAATCAGACTGTTGTTGATCTCGAGGTTTGTATTTGTAACGAT1432GGTTCAACAGATAATACCTTAGAAGTGATCAATAAGCTTTATGGTAATAATCCTAGGGTACGCATCATG150115701639GATAAAACGCTAGCTTGTGTTTATACCACTAATA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