專利名稱：基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種基于革蘭氏陽性安全 微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法。
背景技術(shù)：
透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid,以下簡稱HA)為一種線性不分支高分子多糖，以 UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GIcUA)以及UDP-N-乙酰葡萄糖氨(UDP-N_GlcNAc)兩種前體經(jīng)透 明質(zhì)酸合成酶(HA synthases,HAS)催化合成，其平均分子量可高達到數(shù)百萬道爾頓。它作 為一種多功能基質(zhì)，廣泛分布于人體組織器官，以其獨特的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)在機體的 正常生理活動中發(fā)揮非常重要的作用，如潤滑關(guān)節(jié)、維持皮膚良好的彈性、調(diào)節(jié)血管壁的通 透性、刺激調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)以及水電解質(zhì)擴散及運轉(zhuǎn)與促進創(chuàng)傷愈合等，其與機 體的生理與病理的關(guān)系非常密切。HA已經(jīng)廣泛用于制備關(guān)節(jié)疾病治療的藥物(Mazieres， et al 2007)、藥物輸送載體(Fuente，et al 2008 ；Bechara, et al 2008)、皮膚填充劑 (Romagnoli, et al 2008 ；Tezel and Fredrickson, 2008)(Leonelli, et al 2008)等醫(yī)藥領(lǐng)域方面。目前有兩種HA的生產(chǎn)方法，一種是從雞冠等動物組織里提取，另一種是采用鏈球 菌C群中的一些減毒菌株(獸疫鏈球菌或馬疫鏈球菌等)進行發(fā)酵，從發(fā)酵液中提取。從 雞冠中提取的HA雖然早已批準用于上述醫(yī)藥領(lǐng)域，然而，從中提取的HA結(jié)合有大量的糖蛋 白以及糖脂，使得其分離純化非常困難，得率非常低(每百克雞冠僅能提取0. 4克的純品)。 而且，雞冠來源的透明質(zhì)酸易受到種間病毒因子以及其它致病因子的污染。由于從動物組 織中提取HA的以上不足，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向微生物發(fā)酵來制備HA。目前研究最多的就 是采用獸疫鏈球菌或類馬疫鏈球菌來發(fā)酵生產(chǎn)HA。但由于上述鏈球菌屬于條件致病菌，對 生產(chǎn)人員的健康以及環(huán)境存在潛在的危害，越來越多的研究表明該類鏈球菌亦能產(chǎn)生一定 fi的內(nèi)(endotoxin)以&胃個生(virulence factors) (Leonard, et al 1998 ； Steiner and Malke,2002 ；Hashikawa, et al 2004 ；Lindsay, et al 2009)，使得從發(fā)酵液 中提取的HA存在包括內(nèi)毒素在內(nèi)的毒性因子污染的可能性。目前醫(yī)藥領(lǐng)域使用的HA仍然 采用從雞冠等組織中提取，其提取工藝復雜與原料的來源非常有限使產(chǎn)品價格非常昂貴。 因此研究一種提取方法簡單、原料易得、生產(chǎn)安全以及無毒素因子的新型的透明質(zhì)酸的制 備方法顯得非常必要。經(jīng)過對現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻號CN1636052A，
公開日2005_7_6， 記載了一種“在重組宿主細胞中產(chǎn)生透明質(zhì)酸的方法”，中國專利文獻號CN101426925A，
公開日2009-5-6，記載了一種“在芽孢桿菌細胞中生產(chǎn)透明質(zhì)酸的方法”，以及美國專利 文獻號 US2002/0160489,
公開日
2002-10-31，記載 了一種"Str印tococcus equisimilis hyaluronan synthase gene andexpression thereof in Bacillus subtilis (才古草芽f包桿 菌的str印tococcus equisimilis透明質(zhì)酸合成酶基因和其表達式)”，該技術(shù)利用枯草芽 孢桿菌作為宿主，將來源于Str印tococcusequisimilis透明質(zhì)酸合成酶基因及其調(diào)控序列整合到枯草芽孢桿菌宿主基因組中并實現(xiàn)透明質(zhì)酸的合成。上述現(xiàn)有技術(shù)的共性在于描述了采用枯草芽孢桿菌作為宿主，將合成透明質(zhì)酸的 相關(guān)基因與組成型淀粉酶基因的啟動子構(gòu)成一個人工操縱子，所有的基因均利用該組成型 淀粉酶基因的啟動子來啟動轉(zhuǎn)錄，透明質(zhì)酸的合成與宿主細胞的增殖是同步進行。上述技 術(shù)雖然能夠?qū)崿F(xiàn)透明質(zhì)酸在枯草芽孢桿菌中的異源合成，但是存在顯而易見的問題是隨 著透明質(zhì)酸的合成，發(fā)酵培養(yǎng)基的粘度也逐漸上升，溶氧量也迅速下降，細胞獲取氧的能力 也迅速下降，細胞的生物量也增加緩慢或停止增加，由此而導致細胞合成透明質(zhì)酸的能力 迅速下降。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提供一種基于革蘭氏陽性安全微生物的透 明質(zhì)酸的異源合成方法，通過將宿主細胞的生長與透明質(zhì)酸的合成分開進行大大提高了宿 主細胞合成透明質(zhì)酸的能力，不但實現(xiàn)透明質(zhì)酸在安全的革蘭氏陽性微生物中的合成，而 且其合成即可以是組成型的，也可以是被誘導的。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明包括以下步驟第一步、從革蘭氏陽性安全微生物宿主中分離與透明質(zhì)酸前體(即UDP-葡萄 糖醛酸與UDP-N-乙酰-葡萄糖氨)的合成相關(guān)的基因，這些基因包括UDP-葡萄糖脫 氫酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)，即 SEQ ID No. 31、SEQ ID No. 32、SEQ ID No. 33、SEQID No. 34 ；UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(UTP-glucose-1-phosphate Uridyltransferasegene)，即 SEQ ID No. 35、SEQ ID No. 36、SEQ ID No. 37 ；葡萄糖 _6_ 磷 酸變位酶基因(Phosphoglucomutase gene),即 SEQ ID No. 38、SEQ ID No. 39 ；葡萄 糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因(Phosphoglucoisomerase gene)，即SEQ ID No. 40 ；氨基轉(zhuǎn)移酶 (Aminotransferase)，即SEQ ID No. 41、N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基 因(N-Acetyl-glucosamine-l-phosphate uridyltransferase gene),艮口 SEQ ID No. 42、 SEQ IDNo.43。所述的革蘭氏陽性安全微生物宿主是指以下菌中的任一種Clostridium butyricum( 丁酸梭菌或酪酸梭菌)、Bacillus Iicheniformis (地衣芽孢桿菌)、 Bacillus amyloliquefaciens (角軍淀粉芽孢桿菌)、Bacillus cereus (有益或無毒賭 樣芽孢桿菌)、Bacillus brevis (短芽孢桿菌)、Bacillus pumilus (短小芽孢桿菌)、 Brevibacillus brevis (短短芽孢桿菌)>Baci 1 lusstearothermophiIus (嗜熱月旨肪芽孢桿 菌)、Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌)、Bacillusnatto (納豆芽孢桿菌)、Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)、Geobacillus stearothermophilus (嗜熱脂肪地芽孢桿菌)、 Bacillus coagulans (^ifelf lif)、Bacillus lentus (lif)、Bactroides amylophi Ius (嗜淀粉擬桿菌)。第二步、按照步驟一所述的革蘭氏陽性安全微生物宿主的密碼子偏好性對SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48 以及 SEQ ID No. 49 進 行堿基替換進行密碼子優(yōu)化，分別得到SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 27共27種不同的序列， 這些密碼子優(yōu)化的序列在革蘭氏陽性安全微生物宿主中能更好地表達；所述的含有SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47 以及SEQ ID No. 48基因的微生物依次分別為獸疫鏈球菌(Sti^ptococcus zoo印idemicus)、 類馬疫鏈球菌(Streptococcus equisimilis)、綠草履蟲小球藻病毒1 (Paramecium bursaria Chlorella virusl)、化膿鏈球菌(Streptococcus pygenes)以及乳房鏈球菌 (Streptococcus uberis)。所述綠草履蟲小球藻是一對共生系統(tǒng)，小球藻在綠草履蟲中生長繁殖，同時又能 提供綠草履蟲所需要的營養(yǎng)。在小球藻中存在一種病毒，該病毒基因組中含有透明質(zhì)酸合 成酶基因，該基因的表達能在小球藻中合成透明質(zhì)酸。所述的進行堿基替換是指按照宿主基因組的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，將 來自其它非宿主菌的與透明質(zhì)酸合成相關(guān)的基因按照宿主菌的基因在翻譯成蛋白質(zhì)時所 采用的密碼子偏好性進行堿基替換，但不改變堿基編碼的氨基酸的種類，使來自其它非宿 主菌的與透明質(zhì)酸合成相關(guān)的基因能夠在宿主菌中高效的表達。第三步、將來自SEQ ID No. 1到SEQ ID No. 27中的任一種基因以及SEQ ID No. 31 到SEQID No. 43基因的一種以上的基因與組成型啟動子或者可誘導啟動子組成一個基因表 達盒。所述的組成型啟動子是指宿主菌在培養(yǎng)的任何時期均具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子。所述的可誘導啟動子是指在宿主菌培養(yǎng)的特定時期才具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子， 具體包括化學誘導啟動子和物理誘導啟動子。所述的化學誘導啟動子包括=Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌)的果聚蔗糖 _ (Ievansucrase)―因的啟云力〒(Pbm-sacB) > Bacillus megaterium(巨^di包木干胃)的 木糖異構(gòu)酶基因的啟動子(Pbm-xylA)、Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)的果聚蔗糖 酶(Ievansucrase)基因的啟動子(Pbs-sacB)、Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)的木 糖異構(gòu)酶基因的啟動子(Pbs-xylA)、Eschelichia coli (大腸桿菌)的阿拉伯糖利用操縱 子的啟動子(Para)、Eschelichia coli (大腸桿菌)的乳糖利用操縱子的啟動子(Plac)、 Eschelichiacoli (大腸桿菌)、優(yōu)選Bacillus megaterium(巨大芽孢桿菌)的果聚蔴糖 酶(Ievansucrase)基因的啟動子(Pbm-sacB)、Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)的 果聚蔴糖酶(Ievansucrase)基因的啟動子(Pbs-sacB)與Bacillus megaterium(巨大芽 孢桿菌)的木糖異構(gòu)酶基因的啟動子(Pbm-xylA)。最優(yōu)選巨大芽孢桿菌的的果聚蔗糖酶 (Ievansucrase)基因的啟動子(Pbm-sacB)。所述的化學誘導啟動子的轉(zhuǎn)錄通過以下方式實現(xiàn)所述的果聚蔗糖酶(Ievansucrase)基因的啟動子只有加入蔗糖后才可能起始其 下游基因的轉(zhuǎn)錄，蔗糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%到10%，優(yōu)選2%到6% (質(zhì)量體積百分 比)。所述的的木糖異構(gòu)酶基因的啟動子只有加入木糖后才可能起始其下游基因的轉(zhuǎn) 錄，木糖的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%到8%，優(yōu)選2% -6% (質(zhì)量體積百分比)。所述的阿拉伯糖利用操縱子的啟動子只有加入阿拉伯糖后才可能起始其下游基 因的轉(zhuǎn)錄，阿拉伯糖的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%到8%，優(yōu)選2% -6% (質(zhì)量體積百分比)。所述的乳糖利用操縱子的啟動子只有加入乳糖后才可能起始其下游基因的轉(zhuǎn)錄， 乳糖的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%到8%，優(yōu)選2% -6% (質(zhì)量體積百分比)。所述的物理誘導的啟動子包括來源于Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)的groESL基因的熱誘導啟動子、來源于Bacillus subtilis (枯草芽孢桿菌)的dnaK基因的 熱誘導啟動子、來源于Bacillus Iicheniformis (地衣芽孢桿菌)的groE基因的熱誘導啟 動子。第四步、采用電轉(zhuǎn)化的方法、制備原生質(zhì)體的方法或制備感受態(tài)細胞的方法將基 因表達盒轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性微生物宿主菌，用選擇標記篩選，得到能分泌透明質(zhì)酸的革蘭氏 陽性基因工程安全宿主菌；所述的選擇標記是指用來有效篩選含有透明質(zhì)酸合成相關(guān)基因的核酸構(gòu)建體的 宿主細胞的基因，比如紅霉素抗性基因，氯霉素抗性基因、D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因，核 糖醇脫氫酶基因，壯觀霉素抗性基因。第五步、對革蘭氏陽性基因工程安全宿主菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)階段加入誘導 透明質(zhì)酸合成的誘導劑以提高透明質(zhì)酸的合成水平，發(fā)酵結(jié)束后即從培養(yǎng)基中分離純化得 到基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸。所述的誘導透明質(zhì)酸合成的誘導劑是指蔗糖、木糖、阿拉伯糖或乳糖。所述的發(fā)酵培養(yǎng)是指配取葡萄糖5-20克/升、酵母浸粉0. 5-5克/升、七水硫 酸鎂0. 3-3克/升、磷酸二氫鉀3-8克/升、磷酸氫二鈉2-8克/升、硫酸銨2-8克/升、檸 檬酸鈉2-5克/升、七水硫酸亞鐵1-20毫克/升、一水硫酸錳1-20毫克/升、無水硫酸銅 0. 2-10毫克/升、氯化鋅0. 2-10毫克/升，用檸檬酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)酸堿度至6. 5-7. 5。發(fā) 酵溫度為28-37度，優(yōu)選30-37度，最優(yōu)選為33-35度，攪拌轉(zhuǎn)速為300-600轉(zhuǎn)/分鐘。所述的透明質(zhì)酸是由D-葡萄糖醛酸(GlcUA)與N-乙?；咸烟前?GlcNAc)以 雙糖單元交替連接而成的直鏈大分子酸性粘多糖，其分子量為五萬到五百萬道爾頓。為了增強透明質(zhì)酸在革蘭氏陽性宿主菌細胞的合成能力，本發(fā)明通過將與透明質(zhì) 酸合成相關(guān)的基因(SEQ ID NO. 1到27 ；SEQ ID No. 31到43)進行組合，構(gòu)成不同的基因表 達盒，然后轉(zhuǎn)化到宿主細胞的染色體中。所述的基因表達盒除了含有SEQ ID No. 31到43中 的一種或一種以上的基因外，含必須含有密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因，在組成型啟 動子或者誘導性啟動子的控制下進行轉(zhuǎn)錄并表達翻譯成有活性的酶蛋白，這些酶蛋白能增 強革蘭氏陽性宿主細胞合成透明質(zhì)酸前體以及合成透明質(zhì)酸的能力。比如可以將UDP-葡 萄糖脫氫酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)、UTP-葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 (UTP-glucose-l-phosphate Uridyltransferase gene)以及透明質(zhì)酸合成酶基因三種基 因組合在一起，基因加入核糖體結(jié)合位點，用組成型或者誘導性啟動子控制這三種基因的 表達。還可以將UDP-葡萄糖脫氫酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)、UTP-葡 萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(UTP-glucose-l-phosphate uridyltransferase gene)、葡萄 糖-6-磷酸變位酶基因(Phosphoglucomutase gene)、N-乙?；姿?葡糖氨-尿嘧 P 基轉(zhuǎn)移BS基因(N-Acetyl-glucosamine-l-phosphate uridyltransferase gene)以及透 明質(zhì)酸合成酶基因五種基因組合在一起，基因加入加入核糖體結(jié)合位點，用組成型或者誘 導性啟動子啟動這五種基因的轉(zhuǎn)錄，構(gòu)成一個人工操縱子。還可以將上述與透明質(zhì)酸合成 的所有的相關(guān)的基因組合在一起，構(gòu)成一個基因簇(gene cluster) 0在優(yōu)選方案中，本發(fā)明將UDP-葡萄糖脫氫酶基因(UDP-glucose dehydrogenase gene)，即 SEQ ID No. 31-34,UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(UTP-glucose-1-phosphate Uridyltransferase gene)，即 SEQ ID No. 35-37、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移 BS 基因(N-Acetyl-glucosamine-l-phosphate uridyl transferase gene),即 SEQ ID No. 43，以及優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因(SEQ ID No. 1-27中的任一種)組合構(gòu)成一個基因 表達盒，采用蔗糖誘導性的果聚蔗糖酶基因的啟動子來啟動這四種基因的轉(zhuǎn)錄。上述所采用的透明質(zhì)酸合成酶基因均按照革蘭氏陽性宿主菌的密碼子偏好性進 行優(yōu)化。為了進一步增強可誘導啟動子的轉(zhuǎn)錄活性，本發(fā)明還通過在可誘導啟動子上游或 下游引入增強子(enhancer)。增強子的存在能夠進一步增強可誘導啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。所 述增強子，在本發(fā)明中指任何能夠增強與之相連的啟動子轉(zhuǎn)錄活性的核酸序列。為了更有效地得到產(chǎn)透明質(zhì)酸的革蘭氏陽性基因工程菌，在構(gòu)建含與合成透明 質(zhì)酸前體以及透明質(zhì)酸合成酶基因的表達載體時，在表達載體中可以引入以下選擇標 記D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因(D-arabitol dehydrogenase gene)、核糖醇脫氫酶基因 (ribitol dehydrogenasegene)、紅霄素抗j"生基因(erythromycin resistance gene, erm) 、 氯霉素抗性基因(cat)、卡那霉素抗性基因(km)。由于D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因是安全的 選擇標記，本發(fā)明優(yōu)選使用該基因作為選擇標記。但并不說明本發(fā)明不使用其它選擇標記。 可以使用任何來源的D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因，該基因編碼產(chǎn)物D-阿拉伯糖醇脫氫酶可 以在NAD(H)的存在下將D-阿拉伯糖醇轉(zhuǎn)化為D-木酮糖或者D-核酮糖。還可以使用任何 來源的核糖醇脫氫酶基因，該基因編碼產(chǎn)物核糖醇脫氫酶可以在NAD(H)存在下將核糖醇 轉(zhuǎn)變?yōu)镈-核酮糖。本發(fā)明所述的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、有 益或無毒蠟樣芽孢桿菌、短芽孢桿菌、短短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜淀粉擬桿菌、嗜 熱脂肪地芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌、嗜淀粉擬桿菌、短小芽孢桿菌的獲取來 源為中國普通微生物保藏管理中心，所述的獸疫鏈球菌、類馬疫鏈球菌、化膿鏈球菌以及乳 房鏈球菌的保藏信息、獲取來源為德國DSMZ保存中心。為了得到較穩(wěn)定的能合成透明質(zhì)酸的基因工程革蘭氏陽性宿主菌，本發(fā)明將合成 透明質(zhì)酸的相關(guān)酶的基因連接到整合型表達質(zhì)粒載體或者附加型表達質(zhì)粒載體中。采用基因工程安全微生物宿主發(fā)酵制備的透明質(zhì)酸由于其生物安全性非常好，不 存在任何內(nèi)毒素與任何治病因子，因此即可以應(yīng)用于食品領(lǐng)域、化妝品領(lǐng)域以及藥品領(lǐng)域。 在食品領(lǐng)域可以制成口服液、膠囊等；在化妝品領(lǐng)域可以制成各種保水護膚品(潤膚膏、潤 膚露等)；在藥品領(lǐng)域可以制成關(guān)節(jié)潤滑注射液，促進傷口愈合的膠布；還可以用來進行修 飾衍生化制成透明質(zhì)酸衍生物。


圖1為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、木糖誘導的啟動子的芽孢桿菌整合表達載體；圖中l(wèi)acA，與，IacA分別表示beta-galactosidase基因的5，與3，端同源整合臂；erm 表示紅霉素抗性基因；szhas表示來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合 成酶基因；
PxylA表示來自巨大芽孢桿菌的木糖誘導啟動子；bla表示氨芐青霉素抗性基因；ori表示在大腸桿菌中復制起始DNA序列。圖2為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、蔗糖誘導的啟動子的芽孢桿菌整合表達載體；圖中PsacB表示來自枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子。圖3為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、乳糖誘導的啟動子的芽孢桿菌附加型表達載體；圖中szhasA 來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成 酶基因；Amp 氨芐青霉素抗性基因；ori-Bs 芽孢桿菌的質(zhì)粒的自主復制起始點序列；ori-Ec 大腸桿菌的質(zhì)粒的自主復制起始點序列；cat:氯霉素抗性基因。圖4為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子的附加型芽孢桿菌表達載體；圖中PsacB 來自枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的啟動子序列；圖中其余符號同圖3 所示。圖5為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、巨大芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子的整合型芽孢桿菌表達載體；圖中IacA，與，IacA分別表示beta-galactosidase基因的5，與3，端同源整合臂；erm表示紅霉素抗性基因；has表示來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成 酶基因；PbmsacB表示來自巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子；bla表示氨芐青霉素抗性基因；ori表示在大腸桿菌中復制起始DNA序列。圖6為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、巨大芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子的整合型芽孢桿菌表達載體；圖中cvhas表示來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因。圖7為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子的整合型芽孢桿菌表達載體；圖中
rep 可以在芽孢桿菌中自主復制的復制起始點片段；0RF2 未知功能的開放閱讀框架；bla 氨芐抗性基因；cat 氯霉素抗性基因；cvhas 來自PBCV的透明質(zhì)酸合成酶基因，按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化；PsacB 來自枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的啟動子；0RF3 未知功能的開放閱讀框架。圖8為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、巨大芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子的整合 型芽孢桿菌表達載體；圖中cvhas表示來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶 基因；PbmsacB表示來自巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子；Pamy表示來自枯草芽孢桿菌的α -淀粉酶基因啟動子；tuaD表示來自巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因。圖9為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、巨大芽孢桿菌的N-乙?；?1-磷酸-葡 糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、巨大芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子的整合型芽孢桿菌表達載 體；圖中g(shù)caD表示來自巨大芽孢桿菌的N-乙?；姿?葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基 因。圖10為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、巨大芽孢桿菌的N-乙?；?1-磷酸-葡糖 氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、巨大芽孢桿菌的蔗 糖誘導的啟動子的整合型芽孢桿菌表達載體；圖中g(shù)taB表示UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因；圖中其余符號同圖9所示。圖11為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、巨大芽孢桿菌的N-乙酰基-1-磷酸-葡糖 氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子及其調(diào)控元件的整合型芽孢 桿菌表達載體；圖中P43表示枯草芽孢桿菌的P43基因啟動子；cvhas表示來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶 基因；degQ與degU表示來自枯草芽孢桿菌的調(diào)控蛋白基因；PbssacB表示來自枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子；Pamy表示來自枯草芽孢桿菌的α -淀粉酶基因啟動子；
tuaD表示來自巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因；gtaB表示來自巨大芽孢桿菌UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因；gcaD表示來自巨大芽孢桿菌的N-乙酰基磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基 因。圖12為含來自化膿鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、巨大芽孢桿菌的N-乙酰基-1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子及其調(diào)控元件的整 合型芽孢桿菌表達載體；圖中pyhas表示來自化膿鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合 成酶基因。圖13為含來自乳房鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、巨大芽孢桿菌的N-乙?；?1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子及其調(diào)控元件的整 合型芽孢桿菌表達載體；圖中puhas表示來自化膿鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合 成酶基因。圖14為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、地衣芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移 酶基因、N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的 啟動子及其調(diào)控元件的整合型芽孢桿菌表達載體；圖中szhas表示來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合 成酶基因；degQ與degU表示來自枯草芽孢桿菌的調(diào)控蛋白基因；PbssacB表示來自枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子；tuaD表示來自地衣芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因；gtaB表示來自地衣芽孢桿菌UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因；gcaD表示來自地衣芽孢桿菌的N-乙?；姿?葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基 因。圖15為含來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、枯草芽孢桿菌的alpha-淀粉酶基因啟動 子、弱氧化醋酸桿菌的D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因以及枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子 的整合型芽孢桿菌表達載體；IacA，與，IacA分別表示beta-galactosidase基因的5，與3，端同源整合臂；aArDH ；表示來自弱氧化醋酸桿菌的D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因；cvhas表示來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶 基因；PbmsacB表示來自巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子；
bla表示氨芐青霉素抗性基因；ori表示在大腸桿菌中復制起始DNA序列；Pamy表示來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子；tuaD表示來自巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因。圖16為含來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的的透明質(zhì)酸 合成酶基因、地衣芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移 酶基因、N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、克萊伯肺炎球菌的D-阿拉伯 糖醇脫氫酶基因以及枯草芽孢桿菌的蔗糖誘導的啟動子及其調(diào)控元件的整合型芽孢桿菌 表達載體；圖中IacA，與，IacA分別表示beta-galactosidase基因的5，與3，端同源整合臂；DalD表示來自克萊伯肺炎球菌的D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因；P43表示枯草芽孢桿 菌的P43基因啟動子；szhas表示來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的透明質(zhì)酸合 成酶基因；degQ與degU表示來自枯草芽孢桿菌的調(diào)控蛋白基因；PbssacB表示來自枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的誘導啟動子；bla表示氨芐青霉素抗性基因；ori表示在大腸桿菌中復制起始DNA序列；Pamy表示來自巨大芽孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子；tuaD表示來自地衣芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因；gtaB表示來自地衣芽孢桿菌UTP-葡萄糖磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因；gcaD表示來自地衣芽孢桿菌的N-乙?；姿?葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基 因。圖17為實施例3步驟(I)PCR驗證結(jié)果示意圖。圖18為實施例3步驟(2) PCR驗證結(jié)果示意圖。圖19為實施例3步驟(7) PCR驗證結(jié)果示意圖。圖20為實施例7示意圖。圖21為實施例8示意圖。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施 例。實施例1 與合成透明質(zhì)酸前體相關(guān)的基因以及啟動子序列的克隆或者合成(1)獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的克隆采用文獻描述的提取細菌總DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)來提取獸疫鏈球菌總DNA。設(shè)計一對引物，以提取的獸疫鏈球菌總 DNA為模板進行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、56度40 秒、72度60秒共30個循環(huán)，最后延伸10分鐘的程序進行。設(shè)計的一對引物序列如下5，-CTTCTAGAATGAGAACATTAAAAAACCTCATA-3，(5，端帶有 XbaI 酶切位點，TCTAGA)
5，-ATCCGCGGTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC-3，(5，端帶有 SacII 酶切位點，CCGCGG)按照上面的方法擴增出的獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因大小為1254bp，即 SEQ IDNo. 44。(2)化膿鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的克隆采用文獻描述的提取細菌總DNA的方法(Cheng H and Jiang N，2006，28 =55-59, Biotechnol. Letters)來提取化膿鏈球菌總DNA。設(shè)計一對引物，以提取的化膿鏈球菌總 DNA為模板進行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、55度40 秒、72度70秒共32個循環(huán)，最后延伸10分鐘的程序進行。設(shè)計的一對引物序列如下5，-CTTCTAGAATGCTTATTTTTAAAAAAACTTTTA-3，(5，端帶有 XbaI 酶切位點，TCTAGA)5，-ATCCGCGGTTATTTAAAAATAGTGACCTTTTTAC-3，(5，端帶有 SacII 酶切位點， CCGCGG)按照上面的方法擴增出的化膿鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因大小為1260bp，即 SEQ IDNo. 47。(3)乳房鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的克隆采用文獻描述的提取細菌總DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)來提取乳房鏈球菌總DNA。設(shè)計一對引物，以提取的乳房鏈球菌總 DNA為模板進行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、55度40 秒、72度70秒共32個循環(huán)，最后延伸10分鐘的程序進行。設(shè)計的一對引物序列如下5，-CTTCTAGAATGGAAAAACTAAAAAATCTCATTAC-3，(5，端帶有 XbaI 酶切位點， TCTAGA)5，-ATCCGCGGTTATTTACTTGTCTTTTTACGAGTTCC-3，(5，端帶有 SacII 酶切位點， CCGCGG)按照上面的方法擴增出的乳房鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因大小為1254bp，即 SEQ IDNo. 48。(4)綠草履蟲小球藻病毒透明質(zhì)酸合成酶基因的優(yōu)化與合成按照GenBank公開報道的綠草履蟲小球藻屬病毒(Paramecium bursaria Chlorella virusl, PBCV1)的基因序列(SEQ ID No. 46)，該基因編碼框大小為1707堿基 (從起始密碼子ATG開始到終止密碼子TAA結(jié)束)。按照本發(fā)明采用的革蘭氏陽性宿主 菌基因組的密碼子偏好性進行優(yōu)化，優(yōu)化的方法是采用在線分子生物學軟件OptimumGene Codon Optimization Analysis、Gene Designer、Codon Optimizer 或Optimizer，分析后對 不同軟件給出的結(jié)果進行人工手動修正，使CAI數(shù)值達到0.80以上。然后委托專門的基因 合成部門進行全基因合成，得到密碼子優(yōu)化的綠草履蟲小球藻病毒透明質(zhì)酸合成酶基因。 優(yōu)化后的綠草履蟲小球藻病毒透明質(zhì)酸合成酶基因的序列為SEQ ID No. 15-21。(5)巨大芽孢桿菌的UDP-葡萄糖脫氫酶基因與UTP-葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因 的克隆。采用文獻描述的提取細菌總DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)來提取巨大芽孢桿菌總DNA。設(shè)計一對引物，以提取的總DNA為模板 進行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、58度40秒、72度 100秒共35個循環(huán)，最后延伸10分鐘的程序進行。設(shè)計的一對引物序列如下
5，-ATGGATCCGGTACCAGGAGGAAAAGTAAATGAAAATTC-3，(5，端帶有 BamHI 位點 GGATCC 與 KpnI 位點 GGTACC)5，-ATCTCGAGTTATAAAGTAGAAACTTTAGAATCACC-3，(5，端帶有 XhoI 酶切位點 CTCGAG)擴增出的含UDP-葡萄糖脫氫酶基因與UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因兩種基因 的DNA的大小為2. 4kb。其DNA序列為SEQ ID No :28。(6)巨大芽孢桿菌N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆。采用文獻描述的提取細菌總DNA的方法(Cheng H and Jiang N, 2006, 28 =55-59, Biotechnol. Letters)來提取巨大芽孢桿菌總DNA。設(shè)計一對引物，以提取的總DNA為模板 進行PCR反應(yīng)，具體反應(yīng)條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、58度40秒、72度 100秒共35個循環(huán)，最后延伸10分鐘的程序進行。設(shè)計的一對引物序列如下5，-ATCTCGAGTAGGAGGCCTGTTATGTCAAAAAGATATGCAGTC-3，(5，端帶有 XhoI 酶切位 點CTCGAG以及核糖體結(jié)合位點AGGAGG)5，-ATGAGCTCTTAGGATTTTTTATTAATATCAAGC-3，(5，端帶有 SacI 酶切位點 GAGCTC)擴增出的N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因大小為1380bp。其 DNA 序列為 SEQ ID No :29。(7)巨大芽孢桿菌alpha-淀粉酶基因啟動子序列的克隆。以巨大芽孢桿菌總DNA為模板，設(shè)計一對引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為94 度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、58度40秒、72度30秒共35個循環(huán)，最后延伸10分 鐘。得到大小約為390bp的alpha-淀粉酶基因啟動子序列。設(shè)計的引物序列為5，-CTTCTAGACATCGTTTCATCCCCTTTTTTTTGCAA-3，(5，端帶有 XbaI 酶切位點 TCTAGA)5，-CTGGATCCTTGCAGATAGTAAATAAAATTCAA-3，(5，端帶有 BamHI 酶切位點 GGATCC)得到的巨大芽孢桿菌alpha-淀粉酶基因啟動子序列為SEQ ID No :30。(8)枯草芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子序列的克隆。設(shè)計以下一對引物5’ -AAGCGAAAACATACCACCTATCAGATCCTTTTTAACCCATCACATATACCTG-3’5，-CTTCTAGACATATAAAACACCTCCTTTTTTATGTACTGTGTTAGCGG-3，(5，端帶有 XbaI 酶 切位點TCTAGA)以上述一對引物，以枯草芽孢桿菌總DNA為模板進行PCR，得到約450bp的果聚蔗 糖酶基因啟動子DNA片段。PCR反應(yīng)的條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、56 度30秒、72度30秒共35個循環(huán)，最后延伸10分鐘。(9)巨大芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子序列的克隆。設(shè)計以下一對引物5’ -AAGCGAAAACATACCACCTATCACTGATTCCAGCCGTGAAGGAAAAG-3’5，-CTTCTAGA ATGTTTTCTCCTTTTGTGTTAGTAAAG-3，(5，端帶有 XbaI 酶切位點 TCTAGA)以上述一對引物，以枯草芽孢桿菌總DNA為模板進行PCR，得到約630bp的果聚蔗 糖酶基因啟動子DNA片段。PCR反應(yīng)的條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、56度30秒、72度30秒共35個循環(huán)，最后延伸10分鐘。(10)枯草芽孢桿菌P43基因啟動子的克隆。設(shè)計以下一對引物5’ -CAATTGTTTTACTTCTTCAAGTTTCTTTTCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCTATAATG-3’5’ -CAGGTATATGTGATGGGTTAAAAAGGATCTGATAGGTGGTATGTTTTCGCTT-3’以上述一對引物，以枯草芽孢桿菌總DNA為模板進行PCR，得到約300bp的果聚蔗 糖酶基因啟動子DNA片段。PCR反應(yīng)的條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、56 度30秒、72度30秒共35個循環(huán)，最后延伸10分鐘。(11)枯草芽孢桿菌degQ序列的克隆。設(shè)計以下一對引物5，ATGGATCC lAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGC[ TCACGCAATTTTCATTGCATAATTGTATTTAT CG 3'其中5’端下劃線表示BamHI識別序列(GGATCC)，帶框堿基表示大腸桿菌trpA終 止子的互補鏈序列(AAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTGC)。5， CATTATAGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGAAAAGAAACTTGAAG AAGTAAAACAATTG-3’以上述一對引物，以枯草芽孢桿菌總DNA為模板進行PCR，得到約200bp的degQ的 DNA片段。PCR反應(yīng)的條件為94度預(yù)變性5分鐘，再按照94度30秒、56度30秒、72度20 秒共35個循環(huán)，最后延伸10分鐘。實施例2 含合成透明質(zhì)酸相關(guān)的基因以及啟動子序列的表達載體的構(gòu)建(1)含有來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶基 因的整合表達載體的構(gòu)建。來自獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性進行優(yōu) 化后，用BamHI與SacII雙酶切后，將雙酶切的透明質(zhì)酸合成酶基因膠回收，連接到用BamHI 與SacII雙酶切的整合型表達質(zhì)粒載體pAXOl中，構(gòu)成含有按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好 性優(yōu)化的獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的新的整合型表達載體pAX-szhasl。載體圖譜如

1。(2)含有來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶基 因以及枯草芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子的整合表達載體的構(gòu)建。來自獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性進行優(yōu) 化后，用BamHI與SacII雙酶切后，將雙酶切的透明質(zhì)酸合成酶基因膠回收，連接到用BamHI 與SacII雙酶切的整合型表達質(zhì)粒載體pAXOl中，構(gòu)成含有按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好 性優(yōu)化的獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的新的整合型表達載體pAX-szhasl (圖譜如圖 1)，然后用SpeI與XhoI雙酶切pAX-szhasl，膠回收得到載體片段DNA。將來自枯草芽孢桿 菌果聚蔗糖酶基因啟動子用SpeI與XhoI雙酶切，與SpeI與XhoI雙酶切的載體pAX-szhasl 連接，得到新的整合表達載體pAX-SZhaS2，該載體含有優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因以及可 誘導的蔗糖酶基因的啟動子。載體pAX-SZhaS2的圖譜如圖2。(3)含有來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶基 因以及枯草芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子的附加型表達載體的構(gòu)建。來自獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)
15化后，用KpnI與SacI雙酶切后，將雙酶切的透明質(zhì)酸合成酶基因膠回收，連接到用KpnI與 SacI雙酶切的整合型表達質(zhì)粒載體PNW33N中，構(gòu)成含有按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性 優(yōu)化的獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的新的附加型表達載體pNW-szhasl (圖譜如圖3)， 再用BamHI與KpnI雙酶切此載體，同時用BamHI與KpnI雙酶切來自枯草芽孢桿菌果聚蔗 糖酶基因啟動子，二者進行連接，構(gòu)成含有枯草芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子以及按照 枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的新的附加型表達載 體pNW-szhas2 (圖譜如圖4)。(4)含有來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶基 因以及巨大芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子的整合型表達載體的構(gòu)建。將來自獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性進行 優(yōu)化后，用SpeI與BamHI雙酶切后，將雙酶切的透明質(zhì)酸合成酶基因膠回收，連接到用SpeI 與BamHI雙酶切的整合型表達質(zhì)粒載體pAXOl中，構(gòu)成載體pAX-hasl，再用BamHI與SacII 雙酶切pAX-hasl，與用BamHI與SacII雙酶切的巨大芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子DNA 進行連接構(gòu)成整合型表達載體pAX-has2(圖譜如圖5)。該整合型表達載體含有巨大芽孢桿 菌果聚蔗糖酶基因啟動子以及來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的的透明 質(zhì)酸合成酶基因。(5)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因的整 合型表達載體的構(gòu)建。將來自PBCV的透明質(zhì)酸合成酶基因按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)化 后，用SpeI與SacII雙酶切后，將雙酶切的透明質(zhì)酸合成酶基因膠回收，連接到用SpeI與 SacII雙酶切的整合型表達質(zhì)粒載體pAXOl中，構(gòu)成含有按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性 優(yōu)化的獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因的新的整合型表達載體pAX-cvhasl，然后用SpeI 與XhoI雙酶切pAX-cvhasl，膠回收得到載體片段DNA。將來自巨大芽孢桿菌果聚蔗糖酶基 因啟動子用SpeI與XhoI雙酶切，與SpeI與XhoI雙酶切的載體pAX-cvhasl連接，得到新 的整合表達載體pAX-cvhas2，該載體含有優(yōu)化的來自PBCV的透明質(zhì)酸合成酶基因以及巨 大芽孢桿菌的可誘導蔗糖酶基因的啟動子。載體pAX-CVhaS2的圖譜如圖6。(6)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因以及 枯草芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子的附加型表達載體的構(gòu)建。將來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因用SpeI與 SacI雙酶切，膠回收酶切1.7kb的DNA片段。用SpeI與SacI雙酶切載體pHCMC04，二者 進行連接得到新的含透明質(zhì)酸合成酶基因的載體，再用BamHI與SpeI雙酶切此載體，與用 BamHI與SpeI雙酶切的枯草芽孢桿菌果聚蔗糖酶基因啟動子進行連接，構(gòu)成新的附加型表 達質(zhì)粒載體pHC-cvhas2 (圖譜如圖7)。(7)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因以及 來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動 子的整合型表達載體的構(gòu)建。將構(gòu)建的pAX-CVhaS2表達載體(如圖6)用XhoI與SacI雙酶切得到大片段線性 載體片段，膠回收。將來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子序列定向克隆到克隆質(zhì) 粒載體 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 與 BamHI 位點，構(gòu)成載體 pBS_Amy，再用 BamHI 與 SacI雙酶切此載體，將來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因定向克隆到用BamHI與 SacI雙酶切此載體中，構(gòu)成新的載體pBS-AG。再用XhoI與SacI雙酶切pBS_AG，回收大小 為1. 9kb的DNA片段，與XhoI與SacI雙酶切的pAX-CVhaS2表達載體連接，構(gòu)成新的芽孢 桿菌整合型表達載體PAX-AGH2。該載體中的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因是利用α-淀粉酶 基因啟動子控制進行組成型轉(zhuǎn)錄，而透明質(zhì)酸合成酶基因則在可誘導啟動子PsacB控制下 轉(zhuǎn)錄?？梢詫崿F(xiàn)透明質(zhì)酸的誘導合成。該載體的圖譜如圖8。(8)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因以 及來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因以及巨大芽孢桿菌的N-乙?；?1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子的整合型表 達載體的構(gòu)建。將來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子序列定向克隆到克隆載體 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 與 HindIII 位點，構(gòu)成載體 pBS_Amy2，再用 HindIII 與 BamHI 雙酶切此載體，把來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因定向克隆到此用HindIII 與BamHI雙酶切此載體中，構(gòu)成新載體pBS_AU2，再用BamHI與SacI雙酶切pBS_AU2，把巨 大芽孢桿菌的N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因定向克隆到此載體中， 再用XhoI與SacI雙酶切此載體，回收3. 3kb的DNA片段，連接到用XhoI與SacI雙酶切 的pAX-CVhaS2載體中，構(gòu)成新的芽孢桿菌整合表達載體pAX-CVhaS3。此載體的透明質(zhì)酸 合成酶基因用果聚蔗糖酶基因的啟動子誘導轉(zhuǎn)錄，而6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因與N-乙酰 基-ι-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因用組成型啟動子控制轉(zhuǎn)錄，因此透明質(zhì)酸的合 成受蔗糖的誘導。載體pAX-cvhas3的圖譜如圖9。(9)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因、6-磷 酸葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡 糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子的整合型表達載 體的構(gòu)建。將來自枯草芽孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子序列定向克隆到克隆載體 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 與 HindIII 位點，構(gòu)成載體 pBS_Amy2，用 HindIII 與 BamHI 雙酶切該載體，將枯草芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因定向克隆到此載體中，構(gòu)成 PBS-AU3，用BamHI與SpeI雙酶切pBS_AU3，將UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因定向克隆到 此載體中，構(gòu)成PBS-AUTl載體，再用SpeI與SacI雙酶切此載體，將N-乙?；?1-磷酸-葡 糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因定向克隆到此載體中，構(gòu)成pBS-AUTG載體，再用XhoI與SacI 雙酶切此載體，回收4. 3kb的DNA片段，與用XhoI與SacI雙酶切的pAX-CVhaS2載體連接， 構(gòu)成新的整合型表達載體pAX-CVhaS4。該載體的透明質(zhì)酸合成酶基因在巨大芽孢桿菌的 果聚蔗糖酶基因啟動子控制下轉(zhuǎn)錄，進行誘導表達。而6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡 萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因則在枯草芽 孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子控制下進行組成型轉(zhuǎn)錄。因此透明質(zhì)酸的合成受蔗糖的誘 導。整合型表達載體pAX-cvhas4的圖譜如圖10。(10)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因以 及來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因以及巨大芽孢桿菌的N-乙酰基-1-磷 酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子及其調(diào)控序列的整合型表達載體的構(gòu)建。將載體pAX-CVhaS3中的果聚蔗糖酶基因的啟動子用含有增強元件的果聚蔗糖酶 基因啟動子代替。將載體pAX-CvhaS3用SpeI與XhoI雙酶切，膠回收大片段DNA。將實施例 1克隆的P43基因啟動子、degQ基因以及degU基因按照S0E(spicing overlap extension PCR)技術(shù)組合在一起(參考 Heckman and Pease, 2007, Vol 2 (4), Nature Protocols)，其 中degQ與degU在p43基因啟動子的控制下進行強啟動轉(zhuǎn)錄。得到P43-degQ-degU的表達 盒，將該表達盒定向克隆到SpeI與XhoI雙酶切的pAX-CVhaS3載體中，構(gòu)成新的芽孢桿菌 表達載體pAX-CVhaS5。此載體的果聚蔗糖酶基因啟動子受degQ與degU的增強，因此其下 游的透明質(zhì)酸合成酶基因轉(zhuǎn)錄更強烈。載體pAX-cvhas5的圖譜如圖11。(11)含有來自化膿鏈球菌并按照巨大芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶 基因以及來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因以及巨大芽孢桿菌的N-乙酰 基-ι-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子及 其調(diào)控序列的整合型表達載體的構(gòu)建。將載體pAX-CVhaS5中來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成 酶基因替換成來自化膿鏈球菌并按照巨大芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因即 可，構(gòu)成新的整合表達載體pAX-sphasl。圖譜如圖12。(12)含有來自乳房鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶 基因以及來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因以及巨大芽孢桿菌的N-乙酰 基-ι-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子及 其調(diào)控序列的整合型表達載體的構(gòu)建。將整合表達載體pAX-sphasl中的來自化膿鏈球菌并按照巨大芽孢桿菌密碼子優(yōu) 化的透明質(zhì)酸合成酶基因替換成來自乳房鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明 質(zhì)酸合成酶基因，構(gòu)成新的整合表達載體pAX-suhasl。圖譜如圖13。(13)含有來自獸疫鏈球菌并按照地衣芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基 因、以及來自地衣芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn) 移酶基因、N-乙酰基-1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及枯草芽孢桿菌的果聚蔗 糖酶基因啟動子及其調(diào)控元件的整合型表達載體的構(gòu)建。將來自巨大芽孢桿菌的α-淀粉酶基因啟動子序列定向克隆到克隆載體 pBlueScriptSK(-)的 XhoI 與 HindIII 位點，構(gòu)成載體 pBS_Amy3，用 HindIII 與 BamHI 雙酶切該載體，將地衣芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因定向克隆到此載體中，構(gòu)成 PBS-AU4，用BamHI與SpeI雙酶切pBS_AU4，將UTP-葡萄糖-1-磷酸尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因 定向克隆到此載體中，構(gòu)成PBS-AUT2載體，再用SpeI與SacI雙酶切此載體，將N-乙酰 基-1-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因定向克隆到此載體中，構(gòu)成PBS-AUTG2載體， 再用XhoI與SacI雙酶切此載體，回收4. 3kb的DNA片段，與用XhoI與SacI雙酶切的 pAX-szhas2載體連接，構(gòu)成新的整合型表達載體pAX-SZhaS3。再用BamHI與SacII雙酶 切pAX-SZhaS3，用按照地衣芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基 因替換按照枯草芽孢桿菌密碼子偏好性優(yōu)化的獸疫鏈球菌透明質(zhì)酸合成酶基因，構(gòu)成新的 載體pAX-SZhaS5。該載體的透明質(zhì)酸合成酶基因在枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動 子控制下轉(zhuǎn)錄，進行誘導表達。而6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基因、N-乙?；?-磷酸_葡糖氨_尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因則在巨大芽孢桿菌的α -淀粉酶 基因啟動子控制下進行組成型轉(zhuǎn)錄。因此透明質(zhì)酸的合成受蔗糖的誘導。整合型表達載體 pAX-szhas5的圖譜如圖14。(14)含有來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的串聯(lián)的透明質(zhì)酸合 成酶基因、以及來自地衣芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移 酶基因、N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖 酶基因啟動子的整合型表達載體的構(gòu)建。將巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子定向克隆到pBlueScript SK(-)的 BamHI與XbaI位點，然后再將來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸 合成酶基因定向克隆到XbaI與NotI位點，再將同一拷貝的來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽 孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因定向克隆到NotI與SacII位點。兩份基因添加 有核糖體結(jié)合位點序列AGGAGGTG。這樣，即有2份同樣的透明質(zhì)酸合成酶基因在同一啟動 子的控制下進行轉(zhuǎn)錄。用BamHI與SacII切下并回收PsacB-szhas-szhas表達盒，連接到 用BamHI與SacII雙酶切pAX_szhas5載體中，替換pAX_szhas5中的PsacB-szhas表達盒， 構(gòu)成新的載體pAX-szhas6。與pAX-SZhaS5相比，pAX-szhas6增加了一份透明質(zhì)酸合成酶 基因。(15)含有來自PBCV并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因、來 自弱氧化醋酸桿菌的D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因、來自巨大芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫 酶基因以及巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因啟動子的整合型表達載體的構(gòu)建。在表達載體pAX-AGH2的基礎(chǔ)上，用來自弱氧化醋酸桿菌的D-阿拉伯糖醇脫氫酶 基因取代紅霉素抗性基因。用SnaBI與SacII雙酶切pAX_AGH2，將D-阿拉伯糖醇脫氫酶基 因定向克隆到此雙酶切的載體中，得到載體PAX-AGH3，其圖譜如圖15。(16)含有來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶 基因、以及來自地衣芽孢桿菌的6-磷酸葡萄糖脫氫酶基因、UTP-葡萄糖-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶基 因、N-乙?；?1-磷酸-葡糖氨-尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因以及枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基 因啟動子與其調(diào)控序列以及D-阿拉伯糖醇脫氫酶基因的整合型表達載體的構(gòu)建。在表達載體pAX-SZhaS5的基礎(chǔ)上，用來自獸疫鏈球菌并按照枯草芽孢桿菌密碼 子優(yōu)化的的透明質(zhì)酸合成酶基因代替pAX-SZhaS5中的按照地衣芽孢桿菌密碼子優(yōu)化的透 明質(zhì)酸合成酶基因，再用SacII與SnaBI雙酶切，將來自克萊伯肺炎球菌的D-阿拉伯糖醇 脫氫酶基因定向克隆到SacII與SnaBI位點。構(gòu)成新的載體pAX-SZhaS6。此載體轉(zhuǎn)化宿 主細胞后不需采用紅霉素抗性篩選標記，而是采用安全的D-阿拉伯糖醇脫氫酶代謝標記。 pAX-szhas6的圖譜如圖16。實施例3 將實施例2構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化到不同的革蘭氏陽性細胞宿主中本項實施例描述幾種將實施例2構(gòu)建的表達載體轉(zhuǎn)化到革蘭氏陽性細胞宿主中 從而獲得能夠合成透明質(zhì)酸的宿主細胞的方法。在本實施例中列出以枯草芽孢桿菌細胞、 地衣芽孢桿菌細胞、巨大芽孢桿菌細胞、短短芽孢桿菌細胞作為合成透明質(zhì)酸的宿主，但并 不說明本發(fā)明不使用其它未列出的革蘭氏陽性宿主細胞。(1)將構(gòu)建的整合型表達載體載體pAX-CVhaS2轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌細胞中。按照以下方法制備枯草芽孢桿菌的感受態(tài)將枯草芽孢桿菌在LB平板上劃線得
19到單菌落，再將單菌落接種到3毫升液體LB培養(yǎng)基中在37度振蕩培養(yǎng)5小時，取出500微 升接種到10毫升SPI液體培養(yǎng)基中，在37度振蕩培養(yǎng)5小時到對數(shù)生長期。再從此含菌 體的SPI培養(yǎng)基中吸出200微升到2毫升SPII液體培養(yǎng)基中在37度150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)90 分鐘，再加入20微升lOmmol/L的EGTA，在37度150轉(zhuǎn)/分鐘培養(yǎng)10分鐘，再分裝成200 微升一管，加入1微克的質(zhì)粒載體pAX-CVhaS2，在37度振蕩培養(yǎng)90分鐘，將菌液全部涂布 在含有4微克/毫升紅霉素的LB平板上，在37度培養(yǎng)48小時，得到65個單菌落。挑取5 株菌提取總DNA，用下面一對引物進行擴增cvhasA基因。得到大小為1. 7kb的DNA條帶，與 來自PBCV的透明質(zhì)酸合成酶基因的實際大小一致，PCR驗證結(jié)果如圖17所示。圖17中的泳道1、2、3、5與6為用抗紅霉素的單菌落的總DNA做PCR后得到的大 小為1. 7kb的DNA。泳道4為對照菌(不抗紅霉素的單菌落)總DNA做PCR后的情況，沒有DNA帶出 現(xiàn)。M為500bp間隔大小的DNA分子量對照。自下而上依次為500bp，IOOObp, 1500bp, 2000bp (最亮的一條帶)，2500bp, 3000bp 等。所用的一對引物為5' -CT TCT AGA ATG GGA AAA AAC ATC ATC ATC ATG G-3'5' -CT CCGCGG TTA TAC AGA CTG GGC GTT CGT TGT AGC-3'擴增條件為94度變性40秒，58度退火40秒，72度延伸90秒，共35個循環(huán)。溶液的配制方法為SPI溶液SP鹽溶液中加入1 %體積的50%葡萄糖與1 %體積的100倍的CAFE溶 液；其中SP鹽溶液成分為0. 2%硫酸銨，1. 4%磷酸氫二鉀(帶3個結(jié)晶水)，0. 6%磷酸二 氫鉀，0. 02%七水硫酸鎂，0. 檸檬酸鈉。100倍的CAFE溶液成分為2%水解酪氨酸，10% 酵母浸粉。SPII溶液SPI溶液中加入1 %體積的50mmol/L的氯化鈣溶液與1 %體積的 250mmol/L的氯化鎂溶液。(2)將載體pHC-CVhaS2轉(zhuǎn)化到短短芽孢桿菌中。按照公開的文獻(周海燕等，浙江大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版)，34(4) 389-394,2008)描述的方法將附加型質(zhì)粒pHC-CVhaS2轉(zhuǎn)化到短短芽孢桿菌中。然后涂布在 含有10微克/毫升氯霉素與50微克/毫升氨芐青霉素的營養(yǎng)肉汁瓊脂篩選平板上，在37 度培養(yǎng)24-36小時。對長出的抗性菌落提取質(zhì)粒作為模板，用上述(1)描述的一對引物在 同樣條件下進行PCR擴增，得到大小為1. 7kb的特異DNA條帶，與來自PBCV的透明質(zhì)酸合 成酶基因?qū)嶋H大小一致，PCR驗證結(jié)果如圖18所示。圖18中的泳道2、3、4、5與6為用抗氯霉素與氨芐青霉素的單菌落的總DNA做PCR 后得到的大小為1. 7kb的DNA0泳道1為對照菌(不抗氯霉素與氨芐青霉素的單菌落)總DNA做PCR后的情況， 沒有DNA帶出現(xiàn)。M為500bp間隔大小的DNA分子量對照。自下而上依次為500bp，1000bp, 1500bp, 2000bp (最亮的一條帶)，2500bp, 3000bp 等。
表明載體pHC-CVhaS2轉(zhuǎn)化到短短芽孢桿菌中。(3)將載體pAX-CVhaS5轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌細胞中。按照公開的文獻(莫靜燕等，生物技術(shù)，19 (5) ；75-77，2009)描述的方法將整合型 質(zhì)粒載體pAX-CVhaS5轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌細胞中。然后涂布在含有4微克/毫升紅霉素 與50微克/毫升氨芐青霉素的LB篩選平板上，在37度培養(yǎng)24-36小時。對長出的抗性菌 落提取總DNA作為模板，用上述⑴描述的一對引物在同樣條件下進行PCR擴增，得到大小 為1. 7kb的特異DNA條帶，與來自PBCV的透明質(zhì)酸合成酶基因?qū)嶋H大小一致。表明載體 pAX-cvhas5轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌細胞中。(4)將附加型表達載體pNW_szhas2轉(zhuǎn)化到凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans) 中。按照公開的文獻(Moro A et al, Biotechnology Techniques, 1995，Vol9 (8)， PP. 589-590)描述的方法培養(yǎng)凝結(jié)芽孢桿菌，然后在含有菌的培養(yǎng)基中加入質(zhì)粒 pNW-SZhaS2，在1500V電壓、25 μ F電容以及200歐姆電阻的條件下進行電穿孔轉(zhuǎn)化(所用 儀器為Bio-Rad Gene Pulser)。吸出菌液加入豐富培養(yǎng)基混勻，涂布在含有15 μ g/ml氯霉 素的豐富培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)2天。將長得的菌落提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中， 在含有50μ g/ml的豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)提取質(zhì)粒，用下面的一對引物為進行PCR，得到1. 2kb 的 DNA。5’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’表明載體pNW-SZhaS2轉(zhuǎn)化到凝結(jié)芽孢桿菌基因組中。(5)將附加型表達載體pNW-szhasl轉(zhuǎn)化到納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)中。按照公開的文獻(Moro A et al, Biotechnology Techniques, 1995，Vol9 (8)， PP. 589-590)描述的方法培養(yǎng)納豆芽孢桿菌，然后在含有菌的培養(yǎng)基中加入質(zhì)粒 pNW-szhasl，在1200V電壓、25 μ F電容以及200歐姆電阻的條件下進行電穿孔轉(zhuǎn)化(所用 儀器為Bio-Rad Gene Pulser)。吸出菌液加入豐富培養(yǎng)基混勻，涂布在含有15 μ g/ml氯霉 素的豐富培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)2天。將長得的菌落提取質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 α中， 在含有50μ g/ml的豐富培養(yǎng)基中培養(yǎng)提取質(zhì)粒，用下面的一對引物為進行PCR，得到1. 2kb 的 DNA。5’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’結(jié)果證明表達載體pNW-szhasl轉(zhuǎn)化到納豆芽孢桿菌基因組中。(6)將整合型表達載體pAX-szhase轉(zhuǎn)化嗜熱脂肪芽孢桿菌。按照公開的文獻(Moro A et al, Biotechnology Techniques, 1995，Vol9 (8)， PP. 589-590)描述的方法培養(yǎng)嗜熱脂肪芽孢桿菌，然后在含有菌的培養(yǎng)基中加入質(zhì)粒 pAX-SZhaS6，在1500V電壓、25 μ F電容以及200歐姆電阻的條件下進行電穿孔轉(zhuǎn)化(所用 儀器為Bio-Rad GenePulser)。吸出菌液加入豐富培養(yǎng)基混勻，涂布在含有4 μ g/ml紅霉 素的豐富培養(yǎng)基中在37°C培養(yǎng)2天。將長得的菌落提取總DNA，用下面的一對引物為進行 PCR，得至Ij 1. 2kb 的 DNA05’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’
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5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’結(jié)果證明表達載體pAX-szhase已經(jīng)轉(zhuǎn)化到嗜熱脂肪芽孢桿菌基因組中。(7)將載體pAX-SZhaS5轉(zhuǎn)化到巨大芽孢桿菌中。按照公開的文獻(張新建等，云南植物研究，29 (6) =666-670, 2007)描述的方法將 整合型質(zhì)粒載體pAX-SZhaS5轉(zhuǎn)化到巨大芽孢桿菌細胞中。然后涂布在含有4微克/毫升紅 霉素與50微克/毫升氨芐青霉素的LB篩選平板上，在37度培養(yǎng)24-36小時。對長出的抗 性菌落提取總DNA作為模板，用以下一對引物進行PCR擴增，得到大小為1.2kb的特異DNA 條帶，與來自獸疫鏈球菌的透明質(zhì)酸合成酶基因?qū)嶋H大小一致，PCR驗證結(jié)果如圖19所示。圖19中的泳道1、2、3、4、5與6為用抗紅霉素的單菌落的總DNA做PCR后得到的 大小為1. 2kb的DNA0M為500bp間隔大小的DNA分子量對照。自下而上依次為500bp，IOOObp, 1500bp, 2000bp (最亮的一條帶)，2500bp, 3000bp 等。所用的一對引物為5’ -CTTTCTAGAATGCGTACACTGAAAAATCTTATTACGG-3’5’ -ATCCGCGG TTACAATAATTTTTTGCGCGTTCCCC-3’PCR擴增的條件為94度變性40秒，58度退火40秒，72度延伸60秒，共35個循環(huán)。證明載體pAX-SZhaS5已經(jīng)轉(zhuǎn)化到巨大芽孢桿菌基因組中。實施例4 基因工程革蘭氏陽性菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的乳糖誘導發(fā)酵試驗用質(zhì)粒載體pNW-szhasl轉(zhuǎn)化納豆芽孢桿菌細胞后得到抗氯霉素的單菌落，經(jīng)驗 證后抗性菌落含有透明質(zhì)酸合成酶基因，挑取一株菌進行搖瓶發(fā)酵試驗。先將菌株接種在2 毫升LB培養(yǎng)基中(添加15微克/微升的氯霉素)培養(yǎng)過夜，再將1毫升菌液接種到含有100 毫升基本培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中(成分為KH2P04 7. Og/L, Na2HP04 5. Og/L, (NH4) 2S04 5. 0g/L，檸檬酸三鈉 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L，CaC12. 2H20 0. 25g/L，葡萄糖 10g/L，5 毫 升微量元素母液；微量元素母液成分為檸檬酸50g/L，F(xiàn)eS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/ L，CuS04. 5H20 lg/L，ZnC12 2g/L)。在37度、pH值7. 0、200轉(zhuǎn)/分鐘條件下先培養(yǎng)一段時 間直至葡萄糖基本消耗完全，再加入終濃度為乳糖作為誘導劑誘導36小時，發(fā)酵結(jié)束 后，離心取上清加入3倍體積的無水乙醇有白色絮狀沉淀產(chǎn)生。說明乳糖能誘導透明質(zhì)酸的合成。實施例5 基因工程革蘭氏陽性菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的木糖誘導發(fā)酵試驗用質(zhì)粒載體pAX-szhasl轉(zhuǎn)化解淀粉芽孢桿菌細胞后得到抗紅霉素的單菌落，經(jīng) 驗證后抗性菌落含有透明質(zhì)酸合成酶基因，挑取一株菌進行搖瓶發(fā)酵試驗。先將菌株接種 在2毫升LB培養(yǎng)基中(添加4微克/微升的紅霉素)培養(yǎng)過夜，再將1毫升菌液接種到 含有100毫升基本培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中(成分為KH2P04 7. 0g/L, Na2HP04 5. 0g/L, (NH4) 2S04 5. 0g/L，檸檬酸三鈉 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L, CaC12. 2H20 0.25g/L，葡萄 糖10g/L，5毫升微量元素母液；微量元素母液成分為檸檬酸50g/L，F(xiàn)eS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/L, CuS04. 5H20 lg/L, ZnC12 2g/L)。在 37 度、pH 值 7. 0,200 轉(zhuǎn) / 分鐘條件 下先培養(yǎng)一段時間直至葡萄糖基本消耗完全，再加入終濃度為0. 5%木糖作為誘導劑誘導 48小時，發(fā)酵結(jié)束后，離心取上清加入3倍體積的無水乙醇有白色絮狀沉淀產(chǎn)生。
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說明木糖能夠誘導透明質(zhì)酸的合成。實施例6 基因工程革蘭氏陽性菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的蔗糖誘導發(fā)酵試驗用質(zhì)粒載體pAX-CVhaS5轉(zhuǎn)化地衣芽孢桿菌細胞后得到抗紅霉素的單菌落，經(jīng)驗 證后抗性菌落含有透明質(zhì)酸合成酶基因，挑取一株菌進行搖瓶發(fā)酵試驗。先將菌株接種在2 毫升LB培養(yǎng)基中(添加4微克/微升的紅霉素)培養(yǎng)過夜，再將1毫升菌液接種到含有100 毫升基本培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中(成分為KH2P04 7. Og/L, Na2HP04 5. Og/L, (NH4) 2S04 5. Og/L，檸檬酸三鈉 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L，CaC12. 2H20 0. 25g/L，葡萄糖 5g/L，5 毫 升微量元素母液；微量元素母液成分為檸檬酸50g/L，F(xiàn)eS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/ L，CuS04. 5H20 lg/L，ZnC12 2g/L)。在37度、pH值7. 0、200轉(zhuǎn)/分鐘條件下先培養(yǎng)一段時 間直至葡萄糖基本消耗完全，再加入終濃度為2%蔗糖作為誘導劑誘導透明質(zhì)酸的合成，繼 續(xù)培養(yǎng)直至發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液變得較為粘稠，離心取上清加入3倍體積的無水 乙醇有白色絮狀沉淀產(chǎn)生。說明蔗糖能夠誘導透明質(zhì)酸的合成。實施例7 基因工程革蘭氏陽性菌產(chǎn)透明質(zhì)酸的發(fā)酵罐發(fā)酵試驗用整合表達載體pAX-szhase轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌細胞后得到抗紅霉素的菌落，經(jīng) 驗證后抗性菌落含有透明質(zhì)酸合成酶基因，挑取一株菌進行發(fā)酵罐發(fā)酵試驗。先將菌株接 種在4毫升LB培養(yǎng)基中(添加4微克/微升的紅霉素)培養(yǎng)過夜得到一級試管種子，再將 1毫升菌液接種到含有100毫升基本培養(yǎng)基的500毫升搖瓶中培養(yǎng)得到二級搖瓶種子，共培 養(yǎng)400毫升的二級種子。將400毫升搖瓶種子全部接入含3. 0升的發(fā)酵罐中，在37度、pH 值7. 0,600轉(zhuǎn)/分鐘條件下先培養(yǎng)一段時間直至葡萄糖基本消耗完全，將攪拌轉(zhuǎn)速降低到 400轉(zhuǎn)/分鐘，再補加蔗糖使終濃度達到2. 5%，同時補加酵母浸粉作為氮源，繼續(xù)培養(yǎng)直至 發(fā)酵結(jié)束。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液變得較為粘稠，取10毫升發(fā)酵液，離心取上清加入3倍體積 的無水乙醇有白色絮狀沉淀產(chǎn)生，所產(chǎn)生的白色絮狀沉淀如圖20，將此白色絮狀沉淀保存 在無水乙醇中?；九囵B(yǎng)基成分為KH2P047. Og/L, Na2HP04 5. 0g/L, (NH4)2S04 5. 0g/L，檸檬酸三 鈉 2. 5g/L，MgS04. 7H20 2. 5g/L，CaCl2. 2H20 0. 25g/L，葡萄糖 5g/L，5 毫升微量元素母液； 微量元素母液成分為檸檬酸 50g/L, FeS04. 7H20 10g/L, MnS04. H20 5g/L，CuS04. 5H201g/L, ZnCl2 2g/L。蔗糖補液瓶的濃度為50% (質(zhì)量體積百分比)，酵母浸粉補液瓶的濃度為20% (質(zhì)量體積百分比)。實施例8發(fā)酵液中透明質(zhì)酸的精制取實施例7得到發(fā)酵液800mL，邊攪拌邊加入氯苯，共加入200毫升，以5000rpm離 心lOmin，去除菌體沉淀，在上清液中加人10g氯化鈉充分溶解，再向其中加入3倍體積的 95%的乙醇，混勻并攪拌，靜置30分鐘，以3000rpm離心lOmin，得到白色沉淀物即為HA提 取物。將濃度為4. 2g/L的NaHC03水溶液450mL和濃度為5. 3g/L的Na2 C03水溶液50mL 加入上述提取物中，再加入20mg的胰蛋白酶(每mg蛋白質(zhì)加100個活力單位的酶量)，在 35°C、120rpm下攪拌水解2h。再加入氯化鈉到上述溶液中至濃度達到10g/L并攪拌使之完 全溶解，然后加入3倍體積的95%乙醇，靜置凝聚沉淀lh，以3000rpm離心得到透明質(zhì)酸的沉淀。
將得到的該沉淀加到含NaCl濃度為10g/L、Na2HP04濃度為0. 2g/L、NaH2 P04濃 度為0. 06g/L的500mL水溶液中，攪拌溶解，向其中加入3倍體積的95%乙醇，混勻攪拌， 3000rpm離心回收得到透明質(zhì)酸沉淀，并用30mL 80%的乙醇洗滌，干燥得到固體透明質(zhì) 酸。將上述得到的固體HA溶于Na2HP04濃度為0. lg/L、NaH2P04濃度為0. 05g/L, NaCl濃 度為10g/L的400mL水溶液中，攪拌溶解，然后向溶液中加入用酸預(yù)處理過的5g活性炭并 以80rpm，50°C攪拌lh，然后經(jīng)0. 22m的濾膜抽濾，得到澄清的濾液。將該濾液經(jīng)35000Da 透析袋用1000mL去離子水在4°C透析過夜。在透析袋中加入3倍體積的95%乙醇，混勻攪 拌得到絮狀的透明質(zhì)酸，離心得到沉淀，用20mL丙酮洗滌沉淀。固體HA經(jīng)冷凍、真空干燥 研磨得到白色粉末狀透明質(zhì)酸精制品。所使用的藥品均為醫(yī)用級的藥品，在空氣凈化級別為1萬的潔凈環(huán)境中操作。采用該方法能夠從發(fā)酵液中制備符合化妝品級別以及醫(yī)藥外用的透明質(zhì)酸純品。實施例9 基因工程革蘭氏陽性菌發(fā)酵制備的透明質(zhì)酸的紅外檢測鑒定將實施例8得到的白色透明質(zhì)酸進行溴化鉀壓片，再進行紅外光譜檢測分析，得 到紅外吸收特征性光譜圖，與標準透明質(zhì)酸的紅外吸收特征性光譜圖進行比較，結(jié)果可以 看出，基因工程產(chǎn)生的白色絮狀沉淀即為透明質(zhì)酸?；蚬こ谈锾m氏陽性菌分泌產(chǎn)生的白 色絮狀沉淀的紅外吸收光譜圖如圖21。由圖21可以看出，在3400CHT1附近有強烈的0_H伸縮振動，表明該物質(zhì)具有多羥 基結(jié)構(gòu)，而透明質(zhì)酸屬于含有多羥基的粘多糖。在1620、1043與1542CHT1處有較強的吸收， 表明含有C = 0、C-N伸縮振動與N-H彎曲振動，表明該物質(zhì)含有乙酰氨基的結(jié)構(gòu)，而透明質(zhì) 酸含有乙酰氨基。在1427cm—1處有0 = C-0伸縮振動吸收帶，表明存在葡萄糖醛酸上解離 的羧基與羥基結(jié)構(gòu)。在U^jOO-SSOcnT1處無吸收帶，表明該物質(zhì)不含硫酸化的基團。該 物質(zhì)的紅外吸收峰與透明質(zhì)酸標準特征吸收峰完全吻合，表明基因工程革蘭氏陽性菌產(chǎn)生 的白色絮狀沉淀為透明質(zhì)酸粘多糖。該方法能夠證明基因工程革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的白色絮狀沉淀即為透明質(zhì)酸。實施例10 含基因工程革蘭氏陽性安全微生物產(chǎn)生的透明質(zhì)酸的潤膚露的制備 按照下面的配方制得含透明質(zhì)酸的潤膚露(單位均為質(zhì)量體積百分比)
權(quán)利要求
一種基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其特征在于包括以下步驟第一步、從革蘭氏陽性安全微生物宿主中分離與透明質(zhì)酸前體，即UDP 葡萄糖醛酸以及UDP N 乙酰 葡萄糖氨的合成相關(guān)的基因，包括UDP 葡萄糖脫氫酶基因，即SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34；UTP 葡萄糖 1 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，即SEQ ID No.35、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37；葡萄糖 6 磷酸變位酶基因，即SEQ ID No.38、SEQ ID No.39；葡萄糖 6 磷酸異構(gòu)酶基因，即SEQ ID No.40；氨基轉(zhuǎn)移酶，即SEQ ID No.41以及N 乙?；?1 磷酸 葡糖氨 尿嘧啶基轉(zhuǎn)移酶基因，即SEQ ID No.42和SEQ ID No.43；第二步、按照步驟一所述的革蘭氏陽性安全微生物宿主的密碼子偏好性對SEQ ID No.44、SEQ ID No.45、SEQ ID No.46、SEQ ID No.47、SEQ ID No.48進行堿基替換，分別得到SEQ IDNo.1到SEQ ID No.27共27種不同的序列；第三步、將來自SEQ ID No.1到SEQ ID No.27中的任一種基因以及SEQ ID No.31到SEQ IDNo.43基因的一種以上的基因與組成型啟動子或者可誘導啟動子組成一個基因表達盒；第四步、采用電轉(zhuǎn)化的方法、制備原生質(zhì)體的方法或制備感受態(tài)細胞的方法將基因表達盒轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性微生物宿主菌，用選擇標記篩選，得到能分泌透明質(zhì)酸的革蘭氏陽性基因工程安全宿主菌；第五步、對革蘭氏陽性基因工程安全宿主菌進行發(fā)酵培養(yǎng)，在培養(yǎng)階段加入誘導透明質(zhì)酸合成的誘導劑以提高透明質(zhì)酸的合成水平，發(fā)酵結(jié)束后即從培養(yǎng)基中分離純化得到基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸；所述的透明質(zhì)酸由D 葡萄糖醛酸與N 乙酰基葡萄糖氨以雙糖單元交替連接而成的直鏈大分子酸性粘多糖，其分子量為五萬到五百萬道爾頓。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的革蘭氏陽性安全微生物宿主是指以下菌中的任一種丁酸梭菌或酪酸梭菌、 地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、有益或無毒蠟樣芽孢桿菌、短芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、短 短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、嗜熱脂肪地 芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、緩慢芽孢桿菌或嗜淀粉擬桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的含有 SEQ ID No. 44、SEQ ID No. 45、SEQ ID No. 46、SEQ ID No. 47、SEQ ID No. 48基因的微生物依次分別為獸疫鏈球菌、類馬疫鏈球菌、綠草履蟲小球藻病毒1、化膿 鏈球菌以及乳房鏈球菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的進行堿基替換是指按照宿主基因組的密碼子偏好性進行密碼子優(yōu)化，將來 自其它非宿主菌的與透明質(zhì)酸合成相關(guān)的基因按照宿主菌的基因在翻譯成蛋白質(zhì)時所采 用的密碼子偏好性進行堿基替換。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的基因表達盒中包括組成型啟動子或化學誘導啟動子，其中組成型啟動子是指宿主菌在培養(yǎng)的任何時期均具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子；所述的可誘導啟動子是指在宿主菌培養(yǎng)的特定時期才具有轉(zhuǎn)錄活性的啟動子，具體包括化學誘導 啟動子和物理誘導啟動子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的化學誘導啟動子包括巨大芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的啟動子、巨大芽孢 桿菌的木糖異構(gòu)酶基因的啟動子、枯草芽孢桿菌的果聚蔗糖酶基因的啟動子、枯草芽孢桿 菌的木糖異構(gòu)酶基因的啟動子、大腸桿菌的阿拉伯糖利用操縱子的啟動子、大腸桿菌的乳 糖利用操縱子的啟動子、大腸桿菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的化學誘導啟動子的轉(zhuǎn)錄是指所述的果聚蔗糖酶基因的啟動子只有加入蔗糖后才可能起始其下游基因的轉(zhuǎn)錄，蔗糖 的濃度為0.5%到10% ；所述的的木糖異構(gòu)酶基因的啟動子只有加入木糖后才可能起始其下游基因的轉(zhuǎn)錄，木 糖的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%到8% ；。所述的阿拉伯糖利用操縱子的啟動子只有加入阿拉伯糖后才可能起始其下游基因的 轉(zhuǎn)錄，阿拉伯糖的質(zhì)量百分比濃度為0.5%到8% ；所述的乳糖利用操縱子的啟動子只有加入乳糖后才可能起始其下游基因的轉(zhuǎn)錄，乳糖 的質(zhì)量百分比濃度為0. 5%到8%。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的物理誘導的啟動子包括來源于枯草芽孢桿菌的groESL基因的熱誘導啟動 子、來源于枯草芽孢桿菌的dnaK基因的熱誘導啟動子以及來源于地衣芽孢桿菌的groE基 因的熱誘導啟動子。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，其 特征是，所述的選擇標記是指用來有效篩選含有透明質(zhì)酸合成相關(guān)基因的革蘭氏陽性安 全微生物宿主的基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法， 其特征是，所述的發(fā)酵培養(yǎng)是指配取葡萄糖5-20克/升、酵母浸粉0. 5-5克/升、七水硫 酸鎂0. 3-3克/升、磷酸二氫鉀3-8克/升、磷酸氫二鈉2-8克/升、硫酸銨2-8克/升、檸 檬酸鈉2-5克/升、七水硫酸亞鐵1-20毫克/升、一水硫酸錳1-20毫克/升、無水硫酸銅 0. 2-10毫克/升、氯化鋅0. 2-10毫克/升，用檸檬酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)酸堿度至6. 5-7. 5 ；發(fā) 酵溫度為28-37度，攪拌轉(zhuǎn)速為300-600轉(zhuǎn)/分鐘。
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸的異源合成方法，通過從革蘭氏陽性安全微生物宿主中克隆與透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)的基因(序列表中的SEQ ID No.31到SEQ ID No.43)；按照革蘭氏陽性安全微生物宿主的基因密碼子偏好性重新設(shè)計并合成透明質(zhì)酸合成酶基因(序列表中的SEQ ID No.1到SEQ ID No.27)，并將與透明質(zhì)酸前體合成相關(guān)的基因與優(yōu)化的透明質(zhì)酸合成酶基因組成基因表達盒，最后將基因表達盒轉(zhuǎn)化革蘭氏陽性微生物宿主菌，得到能分泌透明質(zhì)酸的革蘭氏陽性基因工程安全宿主菌，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)得到基于革蘭氏陽性安全微生物的透明質(zhì)酸。本發(fā)明大大提高了宿主細胞合成透明質(zhì)酸的能力。
文檔編號C12R1/10GK101935679SQ201010117889
公開日2011年1月5日 申請日期2010年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月4日
發(fā)明者程海榮, 鄧子新 申請人:上海交通大學;淄博科銳控制系統(tǒng)工程有限公司