本發(fā)明涉及一種抗菌凝膠及其制備方法，屬于凝膠制備領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳酸鏈球菌素對產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性菌有非常好的抑制作用，并可被人體內(nèi)的酶降解、消化，是一種安全、無毒、天然的新型食品防腐劑。乳酸鏈球菌素雖有高效的抗菌性，但其抗菌活性和溶解性是限制其應(yīng)用的主要原因，其活性和穩(wěn)定性受ph的升高而顯著降低，乳酸鏈球菌素在ph＝2～5穩(wěn)定，活性損失在20％以內(nèi)；ph＝6～7，效價損失35％以上。乳酸鏈球菌素溶于ph＝3的鹽酸溶液中121℃15min高壓蒸汽滅菌后仍能保持100％活性；而ph＝6或7，121℃20min高壓蒸汽滅菌后活性完全喪失。因此，該性質(zhì)嚴(yán)重限制了乳酸鏈球菌素在洗護(hù)產(chǎn)品中的應(yīng)用。

目前利用碳二亞胺在多糖接枝乳酸鏈球菌素方面只有兩例，利用的多糖分別是纖維素和透明質(zhì)酸。

如纖維素接枝乳酸鏈球菌素作為抗菌材料在食品包裝上的應(yīng)用研究發(fā)現(xiàn)，接枝后的包裝材料明顯提高了食品的貨架期。經(jīng)2,2,6,6-四甲基哌啶氧化的纖維素共價接枝乳酸鏈球菌素后形成的羧酸化纖維素膜可抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。1個化學(xué)當(dāng)量的乳酸鏈球菌素的接枝率為27.5％，4個化學(xué)當(dāng)量的乳酸鏈球菌素的接枝率為45.7％，雖然接枝率較高，但是纖維素通過氧化生成羧酸化纖維素，再對乳酸鏈球菌素進(jìn)行接枝，過程繁瑣，且產(chǎn)物不具備凝膠性能，不適合制備用于洗護(hù)類抗菌凝膠。

透明質(zhì)酸接枝乳酸鏈球菌素的研究發(fā)現(xiàn)可制備成可降解型抗菌凝膠，具有一定的抗菌作用。雖然也制備出了抗菌凝膠，但是透明質(zhì)酸共價交聯(lián)乳酸鏈球菌素實驗接枝率很低，約1％，且凝膠產(chǎn)物易被分解，抗菌強度和抗菌時效性均有待增強，而且成本高，不適合外用的洗護(hù)產(chǎn)品的制備。透明質(zhì)酸接枝乳酸鏈球菌素形成凝膠需要添加己二酸二酰肼作為交聯(lián)劑，該物質(zhì)對人體有害。

因此，有必要提供一種在適用環(huán)境廣、能有效發(fā)揮抗菌活性并適用于洗護(hù)產(chǎn)品中的乳酸鏈球菌素抗菌凝膠。

理論基礎(chǔ)以及相關(guān)實驗均可表明，結(jié)冷膠可作為優(yōu)良的蛋白載體，但是在本申請之前，未見有用結(jié)冷膠接枝乳酸鏈球菌素的公開報道或研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決以上現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明提供了一種抗菌凝膠及其制備方法，該抗菌凝膠通過去?；Y(jié)冷膠接枝乳酸鏈球菌素，穩(wěn)定了乳酸鏈球菌素的抗菌活性，也增大了乳酸鏈球菌素的適用范圍。

結(jié)冷膠與乳酸鏈球菌素的共價交聯(lián)是通過酸胺反應(yīng)實現(xiàn)的。具體過程為：水溶性碳二亞胺鹽通過與結(jié)冷膠上的羧基發(fā)生反應(yīng)形成不穩(wěn)定的o-?；逡蕴岣唪然幕钚裕^而與多肽上的氨基反應(yīng)發(fā)生分子重排作用形成較為穩(wěn)定的酰胺鍵。

本發(fā)明的第一個目的是提供一種抗菌凝膠，所述凝膠由去?；Y(jié)冷膠與乳酸鏈球菌素共價接枝而成。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述抗菌凝膠由以下配料按重量份組成：去?；Y(jié)冷膠90-110份，乳酸鏈球菌素450-550份，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸900-1100份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽20-40份，n-羥基硫代琥珀酰亞胺20-40份，去離子水90-110份。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述凝膠選用的乳酸鏈球菌素為z型，效價1000iu/mg；選用的去酰基結(jié)冷膠是由低?；Y(jié)冷膠通過進(jìn)一步去?；幚淼玫?。

本發(fā)明的第二個目的為提供一種上述抗菌凝膠的制備方法，所述方法包括結(jié)冷膠的去酰基與去離子預(yù)處理、稱料、配制含去?；Y(jié)冷膠緩沖液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺作為縮合劑活化去酰基結(jié)冷膠、加入乳酸鏈球菌素進(jìn)行?；?、透析與成膠。

在本發(fā)明的一種實施方式中，所述結(jié)冷膠預(yù)處理具體步驟為：

去酰基：采用氫氧化鈉溶液溶解結(jié)冷膠，配制成終濃度為1％-2％(w/v)的溶液，煮沸10-20min，冷卻至室溫后透析液為中性；

去離子：將陽離子交換樹脂添加到結(jié)冷膠溶液中，40-60℃下攪拌10-60min，過濾回收樹脂，調(diào)節(jié)溶液ph至中性后濃縮，并凍干保存待用；

本發(fā)明的一種實施方式中，所述抗菌凝膠的制備步驟如下：

(1)結(jié)冷膠預(yù)處理：

去?；翰捎脷溲趸c溶液溶解結(jié)冷膠，配制成終濃度為1％-2％(w/v)的溶液，煮沸10-20min，冷卻至室溫后透析液為中性；

去離子：將陽離子交換樹脂添加到結(jié)冷膠溶液中，40-60℃下攪拌10-60min，過濾回收樹脂，調(diào)節(jié)溶液ph至中性后濃縮，并凍干保存待用；

(2)稱料：去?；Y(jié)冷膠90-110份，乳酸鏈球菌素450-550份，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸900-1100份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽20-40份，n-羥基硫代琥珀酰亞胺20-40份，水90-110份；

(3)配制：將處理后的去?；Y(jié)冷膠溶解于2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液，加熱配制成濃度為0.01-0.1％(w/w)的溶液；

(4)活化：分別選用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺，按1:1質(zhì)量比配制成混合液作為縮合劑，攪拌下加入含有去?；Y(jié)冷膠的緩沖液中，混合液的質(zhì)量比為1:10-10:1，活化反應(yīng)10-60min，反應(yīng)溫度為40-60℃；

(5)酰化：選用乳酸鏈球菌素作為?；瘎帕嚢柘录尤牒腥ヵ；Y(jié)冷膠和縮合劑的混合液中，?；瘯r間為10-15h，反應(yīng)溫度為40-60℃；

(6)透析：去離子水中透析5天，換水周期前期1-2小時，后期4-6小時；常溫透析；

(7)成膠：濃縮溶液濃度為1％或2％(w/v)形成凝膠。

本發(fā)明第三個目的是提供上述抗菌凝膠在外用洗護(hù)產(chǎn)品方面的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明采用熱堿處理，去除結(jié)冷膠上的乙?；?，有效地避免空間位阻的影響；本發(fā)明還采用陽離子交換去除結(jié)冷膠上的二價陽離子，提高羧基利用率；本發(fā)明首次采用去?；Y(jié)冷膠接枝乳酸鏈球菌素，制備得到的抗菌凝膠的乳酸鏈球菌素含量達(dá)到36％，并且在中性和堿性條件下的穩(wěn)定性得到增強，在ph為7.0時，抗菌活性保留89％，在ph為10.0時，抗菌活性能保留50％左右，依然具有很好的抗菌活性。

此外，本發(fā)明的抗菌凝膠具有熱可逆性、耐酸耐堿性、易于成膠性等優(yōu)良特性；且該凝膠成份均為食品添加劑，無任何毒副作用，即使被誤食，也不會對健康造成危害。同時該凝膠豐富了抗菌凝膠在私人護(hù)理領(lǐng)域中的應(yīng)用。

附圖說明

圖1為凝膠的形成機理圖；

圖2為結(jié)冷膠電鏡圖；

圖3為接枝物電鏡圖；

圖4為不同ph條件下抗菌凝膠溶液和乳酸鏈球菌素溶液的抗菌活性；

圖5為抗菌凝膠與乳酸鏈球菌素溶液的抑菌圈對比圖；

圖6為添加結(jié)冷膠的抑菌效果圖；

圖7為添加乳酸鏈球菌素溶液的抑菌效果圖；

圖8為添加抗菌凝膠的抑菌效果圖。

具體實施方式

實施例1：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

(1)稱料：低?；Y(jié)冷膠100份，乳酸鏈球菌素500份，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸1000份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽30份，n-羥基硫代琥珀酰亞胺30份，去離子水100份重量份稱好備用。

(2)結(jié)冷膠預(yù)處理：

去?；航Y(jié)冷膠需要經(jīng)過熱堿處理，處理方法為用0.05m氫氧化鈉溶液溶解結(jié)冷膠固體粉末，配制最終濃度為1％(w/v)溶液，煮沸10min，溶液呈金黃色，冷卻至室溫用去離子水透析，直至透析液為中性，黃色褪去至無色澄清透明狀。

去離子：將陽離子交換樹脂添加到低酰基結(jié)冷膠溶液中，添加濃度為30％(w/v)，并攪拌30min，處理溫度為50℃。通過粗濾器回收樹脂，調(diào)節(jié)溶液ph至中性后濃縮，并凍干保存。結(jié)冷膠電鏡圖見圖2。

(3)配制：將處理后的結(jié)冷膠溶解于0.05m，ph為5.5-6.7的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液至完全溶解，加熱溫度80℃，加熱時間20min，配制溶液濃度為0.1％(w/w)。

(4)活化：分別選用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺，按1:1質(zhì)量比配制成混合液作為縮合劑，磁力攪拌下加入含有結(jié)冷膠的緩沖液中，混合液的質(zhì)量比為1:1，活化反應(yīng)時間為30min，反應(yīng)溫度為60℃。

(5)?；喝鐧?quán)利要求2所述的?；涮卣髟谟冢哼x用乳酸鏈球菌素作為?；瘎?，磁力攪拌下加入含有結(jié)冷膠和縮合劑的混合液中，酰化時間為12小時，反應(yīng)溫度為60℃。

(6)透析：透析液選用去離子水，透析時間為5天，前期換水周期2h，后期換水周期6h，常溫透析。

(7)成膠：濃縮溶液濃度為1％或2％(w/v)形成凝膠。

對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠1，電鏡圖見圖3。

實施例2：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

(1)稱料：低?；Y(jié)冷膠90份，乳酸鏈球菌素450份，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸1100份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽20份，n-羥基硫代琥珀酰亞胺20份，去離子水90份重量份稱好備用。

(2)結(jié)冷膠預(yù)處理：

去?；航Y(jié)冷膠需要經(jīng)過熱堿處理，處理方法為用0.05m氫氧化鈉溶液溶解結(jié)冷膠固體粉末，配制最終濃度為1％(w/v)溶液，煮沸10min，溶液呈金黃色，冷卻至室溫用去離子水透析，直至透析液為中性，黃色褪去至無色澄清透明狀。

去離子：將陽離子交換樹脂添加到低?；Y(jié)冷膠溶液中，添加濃度為10％(w/v)，并攪拌10min，處理溫度為40℃。通過粗濾器回收樹脂，調(diào)節(jié)溶液ph至中性后濃縮，并凍干保存。

(3)配制：將處理后的結(jié)冷膠溶解于0.05m，ph為5.5-6.7的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液至完全溶解，加熱溫度60℃，加熱時間10min，配制溶液濃度為0.01％(w/w)。

(4)活化：分別選用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺，按1:1質(zhì)量比配制成混合液作為縮合劑，磁力攪拌下加入含有結(jié)冷膠的緩沖液中，混合液的質(zhì)量比為1:10，活化反應(yīng)時間為10min，反應(yīng)溫度為40℃。

(5)?；喝鐧?quán)利要求2所述的?；?，其特征在于：選用乳酸鏈球菌素作為?；瘎?，磁力攪拌下加入含有結(jié)冷膠和縮合劑的混合液中，?；瘯r間為10小時，反應(yīng)溫度為40℃。

(6)透析：透析液選用去離子水，透析時間為5天，前期換水周期1h，后期換水周期4h，常溫透析。

(7)成膠：濃縮溶液濃度為1％或2％(w/v)形成凝膠。

對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠2。

實施例3：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

(1)稱料：低?；Y(jié)冷膠110份，乳酸鏈球菌素450份，2-(n-嗎啡啉)乙磺酸900份，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽40份，n-羥基硫代琥珀酰亞胺40份，去離子水110份重量份稱好備用。

(2)結(jié)冷膠預(yù)處理：

去?；航Y(jié)冷膠需要經(jīng)過熱堿處理，處理方法為用0.05m氫氧化鈉溶液溶解結(jié)冷膠固體粉末，配制最終濃度為2％(w/v)溶液，煮沸20min，溶液呈金黃色，冷卻至室溫用去離子水透析，直至透析液為中性，黃色褪去至無色澄清透明狀。

去離子：將陽離子交換樹脂添加到低?；Y(jié)冷膠溶液中，添加濃度為50％(w/v)，并攪拌60min，處理溫度為60℃。通過粗濾器回收樹脂，調(diào)節(jié)溶液ph至中性后濃縮，并凍干保存。

(3)配制：將處理后的結(jié)冷膠溶解于0.05m，ph為5.5-6.7的2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液至完全溶解，加熱溫度100℃，加熱時間30min，配制溶液濃度為0.1％(w/w)。

(4)活化：分別選用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺，按1:1質(zhì)量比配制成混合液作為縮合劑，磁力攪拌下加入含有結(jié)冷膠的緩沖液中，混合液的質(zhì)量比為10:1，活化反應(yīng)時間為60min，反應(yīng)溫度為50℃。

(5)酰化：如權(quán)利要求2所述的?；?，其特征在于：選用乳酸鏈球菌素作為?；瘎?，磁力攪拌下加入含有結(jié)冷膠和縮合劑的混合液中，?；瘯r間為15小時，反應(yīng)溫度為50℃。

(6)透析：透析液選用去離子水，透析時間為5天，前期換水周期2h，后期換水周期4h，常溫透析。

(7)成膠：濃縮溶液濃度為1％或2％(w/v)形成凝膠。

對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠3。

實施例4：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例在結(jié)冷膠預(yù)處理過程中，只進(jìn)行去?；幚?，不進(jìn)行去離子處理，其他步驟參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠4。

實施例5：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例在結(jié)冷膠預(yù)處理過程中，只進(jìn)行去離子處理，不進(jìn)行去?；幚?，其他步驟、參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠5。

實施例6：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例步驟(1)中結(jié)冷膠添加量只有50份，其他步驟、參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠6。

實施例7：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例步驟(1)中結(jié)冷膠添加量為200份，其他步驟、參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠7。

實施例8：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例步驟(4)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺比例為2:1，其他步驟、參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠8。

實施例9：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例步驟(4)中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和n-羥基硫代琥珀酰亞胺的比例為1:2，其他步驟、參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠9。

實施例10：抗菌洗護(hù)凝膠的制備

與實施例1相比較，本實施例步驟(7)的形成凝膠的方法修改為在溶液中添加10％的cacl2作為交聯(lián)劑，靜置形成凝膠，其他步驟、參數(shù)均與實施例1相同。對制備得到的凝膠進(jìn)行編號，編號凝膠10。

實施例11：凝膠穩(wěn)定性、抗菌活性驗證

一、通過凝膠抗菌實驗驗證抗菌凝膠的ph穩(wěn)定性。具體實驗過程為：

(1)準(zhǔn)確稱取5份相同質(zhì)量的乳酸鏈球菌素含量均為0.1％(w/v)的產(chǎn)物樣品或乳酸鏈球菌素樣品，經(jīng)凍干后的樣品分別浸泡于0.05m的ph分別為6.0、7.0、8.0的磷酸二氫鉀-氫氧化鈉緩沖液和0.05m的ph分別為9.0、10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，烘干后用蒸餾水漂洗，得到米黃色凝膠產(chǎn)物。

(2)在lb培養(yǎng)基中間挖出30mm×30mm×5mm的截面為正方形的瓊脂槽，在瓊脂槽中鋪上一層薄瓊脂，在其上注入50ul菌濃為1×10⁵cfu/m³的枯草芽孢桿菌菌懸液，輕輕搖晃均勻，待鋪滿整個瓊脂槽后鋪上一層1％(w/v)凝膠樣品，再將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，添加等量乳酸鏈球菌素作為對照組，每組做3個平行。將得到的凝膠覆蓋在涂有枯草芽孢桿菌的瓊脂槽中。再將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。

實驗結(jié)果見圖4，實驗結(jié)果表明，在ph為7.0時，乳酸鏈球菌素的抗菌活性由92％降低為73％，降低了20.7％，而抗菌凝膠的抗菌活性仍有89％，僅降低了3.3％，隨著ph逐漸上升，乳酸鏈球菌素溶液的抗菌活性下降幅度很大，而抗菌凝膠在ph為10.0的時候，抗菌活性保留50％左右，而此時乳酸鏈球菌素溶液已經(jīng)基本喪失活性。

二、通過瓊脂孔擴散實驗也驗證了中性條件下抗菌凝膠的抗菌活性比不接枝乳酸鏈球菌素高。具體實驗過程為：用菌濃為1×10⁵cfu/m³的枯草芽孢桿菌做指示菌涂布于lb培養(yǎng)基中，用打孔器在培養(yǎng)基的中央打出孔徑d＝4mm，深度h＝2mm的小孔，在小孔中注入50ulph為7.0，乳酸鏈球菌素含量均為0.15％(w/v)的抗菌凝膠樣品或乳酸鏈球菌素溶液，再將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。實驗結(jié)果見圖5，結(jié)果顯示抗菌凝膠樣品的抑菌圈為28mm，而同濃度同體積的乳酸鏈球菌素溶液的抑菌圈為22mm。

三、通過凝膠抗菌實驗表明接枝物凝膠具有很好的抗菌性。具體實驗過程為：在lb培養(yǎng)基中間挖出30mm×30mm×5mm的截面為正方形的瓊脂槽，在瓊脂槽中鋪上一層薄瓊脂，在其上注入50ul菌濃為1×10⁵cfu/m³的枯草芽孢桿菌菌懸液，輕輕搖晃均勻，待鋪滿整個瓊脂槽后鋪上一層1％(w/v)10種乳酸鏈球菌素不同含量的接枝物凝膠樣品，再將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h，添加等體積的1％(w/v)未接枝的結(jié)冷膠及1％(w/v)的乳酸鏈球菌素作為對照組，ph均為7.0，每組做3個平行。將得到的凝膠覆蓋在涂有枯草芽孢桿菌的瓊脂槽中。再將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱培養(yǎng)24h。結(jié)果如表1所示。

結(jié)冷膠、乳酸鏈球菌素及凝膠1的抑菌圖分別見圖6、圖7及圖8。

表1凝膠抗性實驗結(jié)果

其他物化方面的實驗表明凝膠在溶解性及廣譜性有一定的促進(jìn)作用。乳酸鏈球菌素共價交聯(lián)結(jié)冷膠之后，其溶解度受到結(jié)冷膠的影響而不再受乳酸鏈球菌素的限制。乳酸鏈球菌素在中性及弱堿性條件下的應(yīng)用也不再受到限制。

雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)力要求書所界定的為準(zhǔn)。