本發(fā)明涉及臨床消毒技術(shù)，具體涉及一種新型免洗抗菌凝膠的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

耐藥細(xì)菌感染是臨床抗感染治療中極為棘手的問題，也是造成重癥感染死亡的首要原因。2014年世界衛(wèi)生組織《全球抗生素耐藥報告》發(fā)出警告，耐藥致病菌在全世界范圍內(nèi)繼續(xù)蔓延擴(kuò)散，多重耐藥和新耐藥細(xì)菌持續(xù)不斷出現(xiàn)，耐藥菌感染所致疾病的死亡率依然不斷攀升。美國疾病控制與預(yù)防中心(cdc)最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，美國每年耐藥細(xì)菌感染的人數(shù)高達(dá)200多萬，有耐藥菌感染所致死亡人數(shù)達(dá)23000余人，每年用于對抗耐藥菌感染的費(fèi)用高達(dá)350億美元。我國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)(carss)最新監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示，目前臨床感染常見的致病菌已經(jīng)對大多數(shù)一線主流抗生素產(chǎn)生耐藥，特別是臨床分離的甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌(mrsa)和甲氧西林耐藥表皮葡萄球菌(mrse)檢出率依然較高。在我國廣州地鐵檢等公共設(shè)施超級細(xì)菌耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(mrsa)的檢出率為2.5％。為了嚴(yán)格控制感染，加強(qiáng)個人衛(wèi)生防護(hù)、去除手部細(xì)菌接觸是有效預(yù)防耐藥菌感染和傳播的重要措施。特別是醫(yī)院中人流量大、耐藥細(xì)菌分布密集，患者和家屬、以及醫(yī)務(wù)人員在就診和治療等過程中，互相接觸的機(jī)會較多，做好手部皮膚的清潔與消毒是防止醫(yī)院感染的重要措施，以及術(shù)前進(jìn)行手部消毒對于防止手術(shù)患者的醫(yī)院感染起著至關(guān)重要的作用。因此，研制能有效殺滅多重耐藥細(xì)菌的免洗消毒凝膠具有重要臨床意義和應(yīng)用價值。

目前免洗消毒凝膠的種類繁多，其中皮膚消毒劑的成分及含量各有不同。免洗消毒凝膠所采用的溶劑主要為易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，常用的為醇溶劑，尤其采用乙醇、異丙醇為最多，但是這些成分存在消毒作用時效不長、效果不理想、對皮膚刺激較大、易燃等缺點。此外，傳統(tǒng)的抑菌或抗菌凝膠或洗手液不能有效殺死耐藥細(xì)菌，抗耐藥細(xì)菌效果較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種免洗抗菌凝膠。

本發(fā)明的免洗抗菌凝膠的制備原料包括：3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素、卡波姆、甘油、乙醇和水。

進(jìn)一步，免洗抗菌凝膠由3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素、卡波姆、甘油、無水乙醇和去離子水制備而成；其中3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的質(zhì)量/體積百分比為0.1％、卡波姆的質(zhì)量/體積百分比為0.6％、甘油的體積百分比為5.0％、無水乙醇的體積百分比為45％，去離子水的體積百分比為50％。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述免洗抗菌凝膠的制備方法。

本發(fā)明的制備方法包括：在甘油、卡波姆和水的混合溶液中加入配方量的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素乙醇溶液。

采用試管法檢測免洗抗菌凝膠的最低抑菌濃度，以市售潔芙柔免洗消毒凝膠為對照，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌為抗菌對象，進(jìn)行最低抑菌濃度的檢測。結(jié)果表明本發(fā)明制備的免洗抗菌凝膠對革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明顯的殺菌作用，對上述四株細(xì)菌的最低抑菌濃度為15.625‰(v/v)，此時3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的濃度為16μg/ml，對耐藥細(xì)菌的殺菌活性強(qiáng)于對照凝膠的殺菌活性。

采用試管法檢測免洗抗菌凝膠的殺菌曲線，以金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐藥菌耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302)、usa300(lac)，中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)為檢測菌進(jìn)行殺菌活性的測定。殺菌曲線結(jié)果顯示，與對照組相比，凝膠濃度為15.625‰(v/v)對上述四種菌株有明顯的殺菌作用，隨著作用時間的延長，細(xì)菌數(shù)逐漸降低。

采用mtt法檢測化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范圍內(nèi)對人表皮細(xì)胞和人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示在上述濃度范圍內(nèi)化合物對人表皮細(xì)胞和人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞沒有毒性。

在sd大鼠完整皮膚，連續(xù)涂抹免洗抗菌凝膠14d，給藥側(cè)皮膚均未見紅斑和紅腫，與對照側(cè)皮膚比較未見異常。試驗期內(nèi)，試驗動物受試側(cè)皮膚最高積分均值為0，刺激強(qiáng)度屬無刺激性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的有效成分3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的核磁共振圖譜；

圖2為本發(fā)明的免洗抗菌凝膠的殺菌曲線。

具體實施方式

實施例1：3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的合成路線及方法為：

a：將適量的4-羥基香豆素和無水乙醇混合后加熱至4-羥基香豆素溶解；

b：加入3-溴-4-氟苯甲醛，加熱回流；

c：有固體顆粒析出，繼續(xù)加熱，待反應(yīng)結(jié)束，冷卻、抽濾，再用乙醇重結(jié)晶，最終得純白色顆粒狀結(jié)晶。

結(jié)構(gòu)鑒定：

利用質(zhì)譜(ms)、核磁共振波譜(nmr)、紅外吸收光譜(ir)和紫外吸收光譜(uv)等有機(jī)波譜，對合成的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素進(jìn)行分子量、結(jié)構(gòu)和純度等鑒定。

鑒定結(jié)果為：

3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素

3,3′-(3-bromo-4-fluorobenzylidene)-bis-(4-hydroxycoumarin)

1hnmr(dmso-d6,δ,ppm):7.885-7.901(d,3h),7.763(s,2h),7.562-7.601(t,2h),7.279-7.357(m,4h),6.403(s,1h).

化合物對表皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒性評價

第一步，培養(yǎng)人表皮細(xì)胞(hacat細(xì)胞系)和人靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec細(xì)胞系)，收集細(xì)胞，用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按照2.5×10⁴個/孔的濃度接種于96孔板中，5％co2、37℃孵箱中培養(yǎng)。

第二步，實驗前棄去培養(yǎng)基，用pbs淋洗細(xì)胞3次。對照組設(shè)為3列24個孔，加入含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基100μl，dmso濃度共8個梯度，從化合物最高濃度32μg/ml和dmso濃度1％開始，向下倍比稀釋，5％co2、37℃孵育8～24h。

第三步，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml，即0.5％mtt)，繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)，倒去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl二甲基亞砜，低速震蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解，在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處檢測各孔的吸光度值。

結(jié)果如表1所示，與空白對照組相比，化合物3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素在0.5μg/ml-32μg/ml范圍內(nèi)對人表皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞生長沒有統(tǒng)計學(xué)差異，顯示化合物對上述細(xì)胞活性沒有影響，毒性較低。

表1.化合物對表皮細(xì)胞和靜脈內(nèi)皮細(xì)胞毒性試驗

實施例2：本發(fā)明免洗抗菌凝膠的制備

在本實施例中，免洗抗菌凝膠具體制備步驟如下。

第一步，將0.6g卡波姆940、5ml甘油和適量去離子水?dāng)嚢杌旌虾笤?0～60℃的水中微熱30min。

第二步，放置過夜，使卡波姆940充分溶脹。

第三步，將100mg3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素溶解在45ml無水乙醇中，攪拌均勻，將該溶液緩慢加入到步驟二的混合溶液中，邊加邊攪拌。

第四步，加入適量去離子水配至100ml，將凝膠ph值調(diào)至6～7。

ph調(diào)節(jié)劑可選用三乙醇胺。

另外一種制備方法中，用卡波姆941替換實施例2中的卡波姆940。

又一實施方案中，用卡波姆934替換實施例2中的卡波姆940。

實施例3：實施例2免洗消毒凝膠的最低抑菌濃度測定

第一步，免洗抗菌凝膠和對照凝膠的梯度稀釋方法：吸取100μl制好的免洗抗菌凝膠加入96孔板的每排第1號孔內(nèi)，l號孔經(jīng)混合后吸出100μl，加入2號孔內(nèi)，依次倍比稀釋至8號后，吸出100μl棄去，這樣凝膠的的梯度濃度依次為50％、25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰(v/v)，相對應(yīng)的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為512μg/ml、256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml。陽性對照為潔芙柔免洗手消毒凝膠，陰性對照為不含有3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的凝膠。此外，設(shè)置單獨使用梯度濃度的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素溶液作為對照。

第二步，檢測菌的準(zhǔn)備：取凍存于-20℃的金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)以及中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)四種檢測菌，劃線接種于m-h瓊脂培養(yǎng)基，在孵箱(35±2℃)中孵育20～24h。次日挑取單克隆菌落，接種于3mltsb培養(yǎng)基中，180rpm、37℃搖菌過夜。處于對數(shù)生長期的細(xì)菌菌液，用m-h肉湯培養(yǎng)基校正濃度至od630＝0.1(含菌量約10⁸cfu/ml)，再用m-h肉湯1:1000稀釋(含菌量約10⁵cfu/ml)。稀釋后的菌液應(yīng)在15min內(nèi)接種。

第三步，檢測菌的接種：用微量加樣器取100μl稀釋后的菌液依次加到96孔板中，最終接種細(xì)菌濃度為每孔5×10⁴/ml。這時從第1孔到第8孔藥物的濃度依次為25％、12.5％、6.25％、3.125％、15.625‰、7.8125‰、3.90625‰、1.953125‰(v/v)，相對應(yīng)的3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為256μg/ml、128μg/ml、64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml。振蕩1min，使各孔內(nèi)菌液混勻，微孔板加蓋以減少孵育過程中的蒸發(fā)，并置濕盒內(nèi)35℃孵育16～20h。同時每組設(shè)無凝膠生長對照孔(即只加100μlm-h肉湯和100μl復(fù)蘇后的菌液)和無菌對照孔(即只加200μlm-h肉湯)。

第四步，結(jié)果判斷：無菌對照孔在整個試驗過程中應(yīng)始終保持清亮，表明整個實驗是無菌操作。與生長對照孔中細(xì)菌生長特性(如微孔內(nèi)肉湯呈混濁狀，孔底出現(xiàn)沉淀等)相比較進(jìn)行判斷，無肉眼可見生長的最低凝膠濃度為測定凝膠對檢測菌的最低抑菌濃度(mic)。

結(jié)果如表2所示，可以看出，免洗消毒凝膠對金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)有明顯的殺菌作用，對上述四個細(xì)菌的最低抑菌濃度為15.625‰，此時3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素濃度為16μg/ml。與對照免洗手消毒凝膠和陰性對照凝膠相比，本發(fā)明免洗抗菌凝膠對藥物敏感菌和多重耐藥的金黃色葡萄球菌均有明顯殺菌活性，且比單獨使用3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素的抗菌活性高(由表2所示，本發(fā)明免洗抗菌凝膠內(nèi)含16μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素時有抑菌效果，3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素水溶液中內(nèi)含32μg/ml3,3′-(3-溴-4-氟苯亞甲基)-雙-4-羥基香豆素時有抑菌濃度)。

表2.免洗抗菌凝膠的最低抑菌濃度

實施例4：實施例2免洗抗菌凝膠殺菌曲線的測定

第一步，取無菌錐形瓶8個，分別標(biāo)記為“生長對照和免洗抗菌凝膠”。每瓶分別加入6ml營養(yǎng)肉湯。

第二步，在免洗抗菌凝膠標(biāo)記的錐形瓶中加入定量免洗抗菌凝膠，其濃度為15.625‰(v/v)，生長對照組加同等體積的去離子水。

第三步，在各錐形瓶中加入6μl濃度為0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的待測菌液金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)，各管菌液的最終濃度約為10⁵cfu/ml。

第四步，加菌后立即將錐形瓶均勻渦旋15s，倍比連續(xù)稀釋1000倍后，分別取0.1ml菌液接種于m-h瓊脂平板上(各接種兩份)，用l型玻棒均勻涂布接種，35℃孵育過夜后做菌落計數(shù)，并取其平均數(shù)。

第五步，37℃分別培養(yǎng)0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18h后，將錐形瓶均勻渦旋15s，同上法倍比連續(xù)稀釋100～10⁷倍后，分別取0.1ml菌液接種于m-h瓊脂平板上(各接種三份)，35℃孵育過夜后，取菌落數(shù)在30-300之間的平板計數(shù)，并取其平均數(shù)。

第六步，cfu＝三塊板的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)，即為原液中每毫升菌液中的活菌數(shù)。肉眼計數(shù)不同時間點的菌落，并求其平均值，從而在對數(shù)坐標(biāo)紙繪制不同時間點的殺菌曲線圖。

結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，抗菌凝膠作用后的金黃色葡萄球菌(s.aureas，atcc29213)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa，xj75302；usa300lac)和中度耐萬古霉素金黃色葡萄球菌(mu50atcc700699)的生長均受到明顯的抑制。隨著作用時間的延長，抗菌凝膠作用后的上述四種細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少，說明抗菌凝膠對藥物敏感菌和多重耐藥的金黃色葡萄球菌有快速、明顯的殺滅作用。

實施例5：實施例2抗菌凝膠皮膚刺激試驗

第一步，選健康、成年、皮膚無損傷的sd大鼠10只，將實驗動物背部脊柱兩側(cè)背毛剪掉，不損傷表皮，去毛范圍1.5cm×1.5cm。

第二步，取免洗抗菌凝膠受試物0.5ml直接涂在皮膚上，然后用二層紗布(2cm×2cm)和一層無刺激油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定，另一側(cè)作為對照。刺激4h后，用生理鹽水除去殘留受試物。

第三步，每天涂抹1次，連續(xù)14d，每次涂抹后24h觀察結(jié)果。

結(jié)果表明，連續(xù)涂抹14d，給藥側(cè)皮膚均未見紅斑和紅腫，與對照側(cè)皮膚比較未見異常。試驗期內(nèi)，試驗動物受試側(cè)皮膚最高積分均值為0，刺激強(qiáng)度屬無刺激性。