一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的制備方法，包括：將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中獲得莢膜多糖溶液，所述莢膜多糖溶液與CDAP接觸活化獲得活化后溶液，將所述活化后溶液與載體蛋白接觸結(jié)合獲得肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物。本發(fā)明所提供的方法對CDAP法進行改進，采用硼酸鹽緩沖液溶解肺炎鏈球菌莢膜多糖，不需要在反應(yīng)中調(diào)節(jié)pH值，化學(xué)試劑使用減少，制備工藝簡單，生產(chǎn)效率高。
【專利說明】
一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的 制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae)為革蘭氏陽性細(xì)菌，可導(dǎo)致相當(dāng)高的發(fā) 病率和死亡率，引起肺炎、腦膜炎、中耳炎和菌血癥等疾病?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近百種肺炎鏈球菌血 清型，而只有其中20幾種有致病性。肺炎鏈球菌莢膜多糖為其主要毒力決定因素，因為莢膜 不但保護細(xì)菌內(nèi)表面不受補體影響，而且其本身具弱免疫原性。
[0003] 2000年2月肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗Prevnar首先在美國得到許可，隨后國際 市場上陸續(xù)出現(xiàn)了10價、11價、13價肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合疫苗。肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗在 兒童中普遍接種，疫苗所包含的血清型致侵入性肺炎鏈球菌疾病顯著減少。
[0004] 制備結(jié)合物所常用的活化多糖方法大致有:溴化氰(CNBr)活化法，CDAP活化法，水 溶性碳化二亞胺(EDC)法。
[0005] CDAP活化法是先在多糖羥基上形成氰酸酯，通過異脲鍵將多糖與載體蛋白質(zhì)連接 起來。有資料表明，CDAP法能快速有效地活化肺炎鏈球菌多糖。CDAP活化多糖的關(guān)鍵參數(shù)是 濃度和pH值，傳統(tǒng)的CDAP法，是采用酸堿試劑調(diào)節(jié)維持反應(yīng)中的pH值完成多糖的活化反應(yīng)， 用己二胺、己二酰肼為間隔基，在一定pH值下與載體蛋白質(zhì)結(jié)合，并以酸堿試劑維持結(jié)合反 應(yīng)中的pH值，反應(yīng)過程中需要對反應(yīng)的pH和溫度進行連續(xù)監(jiān)控，操作步驟多，效率低、反應(yīng) 可控制性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是簡化肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物制備的過程，提供一種簡便 高效的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的制備方法。
[0007]為達到以上目的，本發(fā)明提供了一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的制備方 法，包括:將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中獲得莢膜多糖溶液。
[0008] 進一步的，所述方法還包括，將莢膜多糖溶液與CDAP接觸活化獲得活化后溶液，將 所述活化后溶液與載體蛋白接觸結(jié)合獲得肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物。
[0009] 具體的，本發(fā)明對于將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液的方式?jīng)]有特別 的限制，只要能夠形成充分溶解、性狀均一的溶液即可。例如可以在室溫下，攪拌溶解。
[0010] 其中，所述莢膜多糖溶液與CDAP接觸活化的步驟包括:在15-25 °C下將CDAP按比例 加入莢膜多糖溶液中，活化2_4min。
[0011]在本發(fā)明的一種實施方式中，可以將⑶AP溶于乙腈或注射用水中，形成⑶AP濃度 為100-200mg/mL的儲備液。
[0012]在活化步驟結(jié)束后，室溫條件下按比例加入載體蛋白，攪拌反應(yīng)2_4h，獲得肺炎鏈 球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物。
[0013]在本發(fā)明的一種實施方式中，在接觸結(jié)合步驟后，可以將體系經(jīng)氯化鈉溶液透析、 Sepharose 4FF凝膠層析柱進行純化，收集kD值0-0.3的分離峰得到純化后的產(chǎn)物。
[0014] 優(yōu)選的，所述硼酸鹽緩沖液中硼酸的濃度為0.2-0.3mo 1/L，pH值為8.5-9.5。特別 優(yōu)選的，所述硼酸鹽緩沖液中硼酸根的濃度為〇. 25mol/L，pH值為9.0-9.2。
[0015] 可選的，所述硼酸鹽緩沖液的制備方法包括將硼酸和鹽溶于水后用酸堿堿調(diào)節(jié)pH 值。其中，所述鹽可以為氯化鉀或氯化鈉，在所述硼酸鹽緩沖液中，硼酸根離子的濃度與氯 離子或鈉離子的濃度的比例可以為0.8-1.2:1。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述硼酸鹽緩沖液是按照以下方式配制的：硼酸鹽 緩沖液濃度為〇.25mol/L，稱取15.458g硼酸和18.638g氯化鉀，加入注射用水950mL，用 5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至9.0-9.2，補加注射用水至lOOOmL即可。
[0017]優(yōu)選的，所述莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為6-32mg/mL。
[0018]可選的，所述莢膜多糖為水解后kD值為0.2-0.65的莢膜多糖，血清型包括但不限 于1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F或 33F 型。
[0019] 可選的，當(dāng)所述莢膜多糖的血清型為1、2、3、8、12?、158、17?、18(：、23?或33?型時， 莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為6_20mg/mL。
[0020] 可選的，當(dāng)所述莢膜多糖的血清型為4、5、6A、6B、7F、9N、9V、10A、11A、14、19A、19F、 20或22F型時，莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為15-32mg/mL。
[0021] 需要理解的是，以上所述的莢膜多糖濃度均為單一血清型的莢膜多糖濃度，并非 為多種血清型莢膜多糖的總濃度。
[0022] 在本發(fā)明中，上述列舉的莢膜多糖的血清型的名稱均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公 知的標(biāo)準(zhǔn)進行分類所確定的本領(lǐng)域所公知的血清型，并可以通過多種途徑(例如購買、贈與 等方式)獲得。本發(fā)明對于產(chǎn)生各種血清型的菌株沒有特別的限制，可以為本領(lǐng)域所有目前 已知或未知的生產(chǎn)特定血清型莢膜多糖的肺炎鏈球菌菌株。
[0023] 可選的，當(dāng)莢膜多糖的血清型為3、4、8、919￥、11六、14、18(：、19?、23?或33?型時，莢 膜多糖與CDAP的質(zhì)量比為1:0.1-0.3。
[0024]可選的，當(dāng)莢膜多糖的血清型為1、2、5、6A、6B、7F、10A、12F、15B、17F、19A、20S22F 型時，莢膜多糖與CDAP的質(zhì)量比為1:0.2-0.6。
[0025]其中，載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素 TT和/或白喉類毒素 DT。
[0026] 其中，相對于所述莢膜多糖，載體蛋白的用量可以按照以下比例確定，多糖：蛋白 質(zhì)量比為1:1-2.5。
[0027] 利用本發(fā)明所提供的方法制備獲得的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物也屬于本 發(fā)明的保護范圍。
[0028] 具體的，在本發(fā)明的一種實施方式中，每種莢膜多糖溶液中只含有一種血清型的 莢膜多糖，莢膜多糖溶液與載體蛋白結(jié)合后獲得單價的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物。 當(dāng)需要制備含有多個肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的多價疫苗時，可以利用本領(lǐng)域技術(shù) 人員所公知的方法將單價的肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物按一定比例進行混合。
[0029] 特別值得注意的是，在本發(fā)明所提供的方法中，不需要對所述莢膜多糖溶液的pH 值進行調(diào)節(jié)后再進行接觸活化，接觸活化的過程中也不再對體系的pH值進行調(diào)整，在接觸 活化后，不需要對所述活化后溶液進行pH值的調(diào)節(jié)，也不使用間隔基(例如己二胺、己二酰 肼），直接將所述活化后溶液與載體蛋白進行接觸結(jié)合，接觸結(jié)合過程中不需要對體系的溫 度和pH值進行監(jiān)測和調(diào)整，結(jié)合2-4h后進行柱純化即可以完成肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié) 合物的制備。與現(xiàn)有技術(shù)相比極大的提高了制備的效率，縮短了生產(chǎn)時間，減少了生產(chǎn)人員 和試劑的投入。
[0030] 本發(fā)明所提供的方法，通過將肺炎鏈球菌莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中使得反 應(yīng)體系獲得了合適的理化環(huán)境，這種合適的理化環(huán)境允許在后續(xù)制備過程中不需要再對體 系的pH、溫度進行監(jiān)測和調(diào)節(jié)，不需要添加額外的試劑以保證制備過程順利進行;這種合適 的理化環(huán)境使得后續(xù)的活化和結(jié)合步驟能夠在穩(wěn)定的條件下進行，避免了活化和結(jié)合步驟 因為部分組分的變化所引起的體系理化環(huán)境的變化，極大了簡化了肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋 白結(jié)合物的制備過程。
[0031] 采用本發(fā)明制備的結(jié)合物原液，其游離多糖含量均小于30%，所得結(jié)合物，具有肺 炎鏈球菌多糖的抗原性和免疫原性。
[0032] 本發(fā)明所述的制備方法或利用本發(fā)明所提供的方法制備的肺炎鏈球菌莢膜多糖 蛋白結(jié)合物可應(yīng)用于制備單價或多價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗(例如13價疫苗）。
[0033] 所述單價或多價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗中可包含基于鋁的佐劑。例如，所述鋁佐劑 可以為氫氧化鋁、磷酸鋁或明鞏。
【具體實施方式】
[0034]下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細(xì)說明。
[0035]以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 中所用技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0036]以下實施例中使用的硼酸鹽緩沖液按照以下方式配置:稱取硼酸和氯化鉀，加入 注射用水，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH后補加注射用水至1000mL即可。以下硼酸鹽緩沖液的濃度 以硼酸根計。
[0037]以下實施例中使用的CDAP指的是將CDAP溶于乙腈中形成的CDAP濃度為100mg/mL 的儲備液。
[0038]以下實施例中使用的各型肺炎鏈球菌莢膜多糖，均來自北京民海生物科技有限公 司。
[0039] 實施例1
[0040]本實施例用于說明1、8、9V、10A、19A、19F、20型肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制 備。
[0041 ] 用濃度0.25mol/L，pH值為9.0-9.2的硼酸鹽緩沖液(稱取15.4588硼酸和18.6388 氯化鉀，加入注射用水95〇11^，用51]1〇1/1氫氧化鈉溶液調(diào)口!1至9.〇-9.2，補加注射用水至 1000mL即可。（根據(jù)中華人民共和國藥典2015年版第三部通則8004配制。）），按表1(1、8、9V、 10八、19六、19?、20型肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的1、 8、利、1(^、194、19?、20型肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25°(：下按比例加入 CDAP，活化2min，按比例加入載體蛋白TT，室溫反應(yīng)2h，經(jīng)Sepharose 4FF凝膠層析柱純化， 收集kD值0-0.3的分離峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通 則3403)，檢測結(jié)果顯示多糖蛋白結(jié)合物與1、8、9V、1OA、19A、19F、20型肺炎鏈球菌血清形成 明顯的沉淀線，說明有良好的多糖抗原性。
[0042] 表 1
[0043] L0044」 實施例2
[0045]本實施例用于說明2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備。 [0046] 用濃度0.2mol/L，pH值為9.0-9.5的硼酸鹽緩沖液，按表2(2、5、64、22?、23?、33卩型 肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的2、5、6A、22F、23F、33F 型肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25°C下按比例加入⑶AP，活化2min，按比 例加入載體蛋白TT，室溫反應(yīng)2h，經(jīng)Sepharose 4FF凝膠層析柱純化，收集kD值0-0.3的分離 峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通則3403)，檢測結(jié)果顯 示多糖蛋白結(jié)合物與2、5、6A、22F、23F、33F型肺炎鏈球菌血清形成明顯的沉淀線，說明有良 好的多糖抗原性。
[0047] 表 2
[0048] LUU4V」 頭施例?
[0050]本實施例用于說明3、4、9Ν、12F、17F、18C型肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備。 [0051 ] 用濃度0.3mol/L，pH值為9.0-9.1的硼酸鹽緩沖液，按表3(3、4、9112?、17?、18(：型 肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的3、4、9N、12F、17F、18C 型肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25°C下按比例加入⑶AP，活化2min，按比 例加入載體蛋白DT，室溫反應(yīng)2h，經(jīng)Sepharose 4FF凝膠層析柱純化，收集kD值0-0.3的分離 峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通則3403)，檢測結(jié)果顯 示多糖蛋白結(jié)合物與3、4、9N、12F、17F、18C型肺炎鏈球菌血清形成明顯的沉淀線，說明有良 好的多糖抗原性。
[0052] 表 3
[0053]
[0054] 實施例4
[0055]本實施例用于說明68、7?、11六、14、158型肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備。
[0056] 用濃度0.25mol/L，pH值為8.5-9.1的硼酸鹽緩沖液，按表4(68、7?、114、14、158型 肺炎鏈球菌多糖蛋白結(jié)合物的制備)給出的濃度分別完全溶解降解的6B、7F、11A、14、15B型 肺炎鏈球菌莢膜多糖，分別獲得莢膜多糖溶液，25 °C下按比例加入CDAP，活化2min，按比例 加入載體蛋白TT，室溫反應(yīng)2h，經(jīng)Sepharose 4FF凝膠層析柱純化，收集kD值0-0.3的分離 峰。采用免疫雙擴散法(按照中華人民共和國藥典2015年版第三部通則3403)，檢測結(jié)果顯 示多糖蛋白結(jié)合物與6B、7F、11A、14、15B型肺炎鏈球菌血清形成明顯的沉淀線，說明有良好 的多糖抗原性。
[0057] 表 4
[0058] LUUDVJ 頭施例t)
[0060] 本實施例用于說明13價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗制備。
[0061] 將實施例1-4制備的1、3、4、5、6六、68、7?、利、14、18(：、194、19?及23?血清型原液組 合配制并添加磷酸鋁佐劑，獲得包含磷酸鋁佐劑的13價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗。除了 6B血清 型為8yg/mL外，其余各血清型均為4yg/mL;添加不高于0.25mg/mL磷酸錯佐劑以及作為賦形 劑的氯化鈉和琥珀酸鹽及0.2%。的吐溫80。
[0062] 實施例6
[0063] 本實施例用于說明13價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗免疫原性研究。
[0064]用制備的13價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗、陽性對照和陰性對照分別免疫NIH小鼠（每組 20只），于0、14、28天共免疫三針，42天采血，分離血清，用ELISA法檢測血清中抗各型多糖的 IgG水平。陰性對照平均吸光值X2.1(如陰性對照平均吸光值小于0.05,則按0.05計算）為 Cutoff值；以免疫血清吸光值多Cutoff值判定為陽轉(zhuǎn)。
[0065]表5 (結(jié)合疫苗免疫小鼠后陽轉(zhuǎn)率及各血清型GMT結(jié)果)給出了ELISA分析的小鼠各 血清型陽轉(zhuǎn)率及抗體幾何平均滴度(GMT)。數(shù)據(jù)表明，13價肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗中除7F的陽 轉(zhuǎn)率為95%，其它各血清型的陽轉(zhuǎn)率均為100% ;與陽性對照相比較接近或高于其陽性對 照，而陽性對照中不包含的血清型也產(chǎn)生了較高的抗體滴度。
[0066]表 5
[0067]
[0068] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種肺炎鏈球菌莢膜多糖蛋白結(jié)合物的制備方法，其特征在于包括:將肺炎鏈球菌 莢膜多糖溶解于硼酸鹽緩沖液中獲得莢膜多糖溶液。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述硼酸鹽緩沖液中硼酸根的濃度為 0 · 2-0 · 3mol/L，pH 值為 8 · 5-9 · 5。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括將所述莢膜多糖溶液與CDAP 接觸活化獲得活化后溶液，將所述活化后溶液與載體蛋白接觸結(jié)合獲得肺炎鏈球菌莢膜多 糖蛋白結(jié)合物。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖為水解后kD值 為0.2-0.65的莢膜多糖，血清型為1、2、3、4、5、6厶、68、7卩、8、91叭、1(^、11厶、12卩、14、158、 17卩、18(：、19厶、19卩、20、22卩、23卩或33卩型。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖的血清型為1、2、3、8、12F、 158、17?、18(：、23?或33?型，莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為6-2〇11^/111匕6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述莢膜多糖的血清型為4、5、6A、6B、7F、 9N、9V、10A、11A、14、19A、19F、20或22F型，莢膜多糖溶液中莢膜多糖的濃度為15-32mg/mL。7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任意一項所述的方法，其特征在于，莢膜多糖的血清型為3、4、8、 91利、11厶、14、18(：、19?、23?或33?型，莢膜多糖與〇^的質(zhì)量比為1:0.1-0.3。8. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任意一項所述的方法，其特征在于，莢膜多糖的血清型為1、2、5、 6八、68、7?、1(^、12?、158、17?、19厶、20或22?型，莢膜多糖與00厶?的質(zhì)量比為1:0.2-0.6。9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任意一項所述的方法，其特征在于，載體蛋白為破傷風(fēng)類毒素 TT 或白喉類毒素 DT。10. 權(quán)利要求1-9中任意一項所述的方法在制備肺炎鏈球菌結(jié)合疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/04GK106039300SQ201610364332
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發(fā)明人】張明華, 龐強, 唐秀麗, 任濤, 段霄, 何迎楓, 崔曉雪, 劉建凱
【申請人】北京民海生物科技有限公司