一種獲得革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號肽的編碼基因的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種獲得革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號膚的編碼基因的方法。
【背景技術(shù)】 陽002] 群體感應(yīng)（如orumSensing,Q巧是指某些微生物群體其基因的表達受到與群體密 度相關(guān)的信號分子調(diào)控的現(xiàn)象。QS系統(tǒng)參與調(diào)控一系列生物學(xué)功能，如：菌體發(fā)光、抗生素 的生物合成、毒性因子的產(chǎn)生、胞外多糖的合成、細菌叢集、生物膜形成、質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移等。 W03]QS系統(tǒng)被認為參與調(diào)控細菌的多項生理功能，該系統(tǒng)包括自誘導(dǎo)膚 (autoin化Cin甜巧tide,AIP)、組氨酸蛋白激酶和感應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白，又稱為立組分系統(tǒng)。AIP作 為信號分子，用于指示細胞密度，當(dāng)AIP達到某一臨界的濃度闊值時，便可激活一系列特定 基因的表達。目前已經(jīng)在多種細菌上觀測到了群體感應(yīng)現(xiàn)象的存在，比如金黃色葡萄球菌、 變異鏈球菌等。
[0004]自然界的有些細菌具有群體感應(yīng)系統(tǒng)，可W通過監(jiān)測周圍環(huán)境中群體感應(yīng)信號分 子濃度，來感知自身和周圍環(huán)境中其他菌群的數(shù)量變化，當(dāng)信號分子濃度達到一定闊值時 就啟動菌體相關(guān)基因表達，調(diào)控菌濃度W及相關(guān)生物學(xué)功能。
[0005] 目前已知的革蘭氏陰性菌都是采用高絲氨酸內(nèi)醋（A巧l-homoserinelactones, AHLs)類化合物作為信號分子，而對于革蘭氏陽性菌來說通常利用寡膚類分子 (Autoin化cerpeptide,AI巧作為信號分子，但是不同種屬革蘭氏陽性菌其信號分子氨基 酸序列差異較大，目前篩選和定位革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號分子通常采用基因敲除后功 能驗證的方式進行定位，國內(nèi)外還沒有一種比較快速的在基因組上定位革蘭氏陽性菌信號 分子的方法。近年來隨著細菌群體感應(yīng)系統(tǒng)研究的逐步深入，迫切需要新的快速篩選和定 位革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號分子基因位置的方法。
[0006] 酸奶是含活菌的乳制品，正常發(fā)酵結(jié)束后，在產(chǎn)品膽存、運輸、銷售、食用前運一過 程中，菌體仍要生長繁殖，發(fā)生后酸化現(xiàn)象（postacidification)，即酸奶的抑值繼續(xù)下 降，W至出現(xiàn)消費者不可接受的過酸味及感官質(zhì)量下降。酸奶后酸化現(xiàn)象導(dǎo)致的結(jié)果是酸 奶無法長期膽存，酸奶膽存期短的缺陷困擾著酸奶的消費。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種獲得革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號膚的編碼基因的方法。
[0008] 本發(fā)明提供了一種獲得革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號膚的編碼基因的方法，包括如 下步驟：
[0009] (1)從已公開的革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng)信號膚編碼基因中收集序列；
[0010] 似獲取步驟（1)收集的序列的菌株信息，然后獲取所述菌株的16srDNA序列； W11] 做將待測革蘭氏陽性菌的16srDNA序列與步驟似獲得的16srDNA序列進行 序列比對并構(gòu)建遺傳進化樹，選擇與待測革蘭氏陽性菌親緣關(guān)系最近的3-9株菌；
[0012] (4)W步驟（3)得到的菌為基礎(chǔ)，對其群體感應(yīng)信號膚編碼基因進行序列比對，根 據(jù)保守序列設(shè)計簡并引物對；
[001引 妨W所述待測革蘭氏陽性菌的基因組DNA為模板，采用步驟（4)得到的簡并引物 對進行PCR擴增并測序；
[0014] (6)將步驟（5)得到的測序結(jié)果在現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中進行比對，獲得具有與其同一性 最高的區(qū)段的全長基因序列；
[001引 （7)根據(jù)步驟（6)獲得的全長基因序列設(shè)計特異引物對；
[0016] 做W所述待測革蘭氏陽性菌的基因組DNA為模板，采用步驟（7)得到的特異引物 對進行PCR擴增并測序，得到待測革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng)信號膚的編碼基因。
[0017] 所述革蘭氏陽性菌為具有群體感應(yīng)的革蘭氏陽性菌。所述革蘭氏陽性菌可為德氏 乳桿菌，具體可為德氏乳桿菌保加利亞亞種，更具體可為乳桿菌Ijj-6。
[0018] 所述步驟（1)中，所述"已公開的革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng)信號膚編碼基因"為 GenBank數(shù)據(jù)庫和/或如orumpeps數(shù)據(jù)庫和/或已發(fā)表文獻中的革蘭氏陽性菌的群體感應(yīng) 信號膚編碼基因（含全序列和片段）。
[0019] 所述步驟（2)中，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取所述菌株的16srDNA序列。
[0020] 所述步驟（3)中，選擇與待測革蘭氏陽性菌親緣關(guān)系為90% (優(yōu)選95% )W上的 困。
[OOW 所述步驟（4)中，所述簡并引物對具體可為序列表的序列1所示的單鏈DNA分子 和序列表的序列2所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
[00巧所述步驟（5)中，所述測序的結(jié)果如序列表的序列3所示。
[0023] 所述步驟化）中，所述現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫為GenBank數(shù)據(jù)庫，所述比對為BLAST比對。
[0024] 所述步驟（6)中，獲得具有與其同一性為90% (優(yōu)選95% )W上的區(qū)段的全長基 因序列。
[00巧]所述步驟（7)中，所述特異引物對具體可為序列表的序列4所示的單鏈DNA分子 和序列表的序列5所示的單鏈DNA分子組成的引物對。
[0026] 所示步驟做中，所述測序的結(jié)果如序列表的序列6所示。
[0027]德氏乳桿菌保加利亞亞種（Xactobacillus de化rueckiisubsp. bulgari州S) ljj-6,已于2015年09月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、（簡 稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所），保藏登 記號為CGMCCNO. 11346。 陽02引一方面，在MRS液體培養(yǎng)基中進行相同時間的培養(yǎng)，12小時時，乳桿菌ljj-6的菌 密度與現(xiàn)有的保加利亞乳桿菌類似，24小時后乳桿菌Ijj-6的菌密度顯著低于現(xiàn)有的保加 利亞乳桿菌。另一方面，進行相同時間的培養(yǎng)，加入乳桿菌ljj-6得到的酸奶的酸度值與加 入現(xiàn)有保加利亞乳桿菌得到的酸奶的酸度值沒有顯著差異，但將酸奶進行貨架期保存后， 加入乳桿菌ljj-6得到的酸奶的酸度值顯著低于加入現(xiàn)有保加利亞乳桿菌得到的酸奶的 酸度值。結(jié)果表明，乳桿菌ljj-6可W解決酸奶后酸化現(xiàn)象，為具有群體感性現(xiàn)象的保加利 亞乳桿菌菌株。
[0029] 本發(fā)明提供的方法，可W快速、準(zhǔn)確的獲得革蘭氏陽性菌群體感應(yīng)信號膚編碼基 因，具有很高的實用價值。
【附圖說明】
[0030] 圖1為實施例1中的酸度值結(jié)果。
[0031] 圖2為實施例2中的序列比對結(jié)果。
[0032] 圖3為實施例2中的遺傳進化樹。 陽03引圖4為實施例2中采用簡并引物對進行PCR擴增的電泳圖。
[0034] 圖5為實施例2中采用特異引物對進行PCR擴增的電泳圖。 陽03引圖6為實施例3中的菌液ODe。。?值結(jié)果。
【具體實施方式】
[0036] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設(shè)置=次重復(fù)實驗，結(jié)果取平 均值。
[0037] MRS液體培養(yǎng)基的制備方法如下：取酪蛋白腺10. 0克、牛肉浸取物10. 0克、酵母 提取液5. 0克、葡萄糖5. 0克、乙酸鋼5. 0克、巧樣酸二胺2. 0克、吐溫801. 0克、憐酸氨二 鐘2. 0克、屯水硫酸儀0. 2克、屯水硫酸儘0. 05克和碳酸巧20. 0克，用蒸饋水溶解并定容 至1. 0升，調(diào)抑至6. 8。
[0038] 保加利亞乳桿菌LJJ:崔文明等，"保加利亞乳桿菌LJJ自溶的影響因素分析"，食 品與發(fā)酵工業(yè)，2013年第39卷第7期（總第307期），6-12。
[0039] 實施例1、乳桿菌ljj-6的鑒定、保藏和應(yīng)用
[0040] 一、乳桿菌ljj-6的鑒定和保藏
[0041] 2012年08月，從內(nèi)蒙牧區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到一株菌，將其命名為ljj-6。
[0042] ljj-6的形態(tài)特征：革蘭氏陽性桿菌，菌體粗而長，菌體長2ym~9ym、寬 0. 15ym~0. 18ym，單個體呈長桿狀或成鏈，菌體兩端稍圓，通常呈單個，平行或短鏈排 列。 陽043] ljj-6的生理生化特征：兼性厭氧菌，最適培養(yǎng)溫度為3°C，最適宜生長的抑為 6. 5-7. 0,最適宜的培養(yǎng)基為MRS培養(yǎng)基；能夠發(fā)酵牛奶中的乳糖生成乳酸，同時產(chǎn)生特殊 的香氣。 W44]ljj-6的16SRNA的編碼序列（見序列表的序列9)與GenBank中的德氏乳桿菌保 加利亞亞種ATCCl1842的16sRNA的編碼序列同源性為98 %。
[0045] 本發(fā)明提供的德氏乳桿菌保加利亞亞種（Xactobacillusde化rueckiisubsp. bulgari州S)Ijj-6,已于2015年09月09日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中屯、（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生 物研究所），保藏登記號為CGMCCNO. 11346。德氏乳桿菌保加利亞亞種化actobacillus de化rueckiisubsp.bulgari州S)Ijj-6,簡稱乳桿菌Ijj-6。
[0046] 二、乳桿菌1jj-6的培養(yǎng)（MRS培養(yǎng)基）
[0047] 1、分組處理如下（進行=次重復(fù)試驗，每次重復(fù)試驗中每組設(shè)置5個重復(fù)處理）：
[0048] 第一組：將乳桿菌ljj-6接種至MRS液體培養(yǎng)基并使其初始濃度為IO4C化/ml, 37°C靜置培養(yǎng)20小時；
[0049] 第二組：將保加利亞乳桿菌LJJ接種至MRS液體培養(yǎng)基并使其初始濃度為IO4C化/ ml, 37°C靜置培養(yǎng)20小時。
[0050] 2、步驟1中，靜置培養(yǎng)12小時時，檢測檢測培養(yǎng)體系的ODe。。?值。第一組的ODe。。? 值為 2. 4 + 0. 1，第二組的ODe。。?值為 2. 4 + 0. 15。
[0051] 3、完成步驟1后，檢測培養(yǎng)體系的ODe。。?值。 陽化引第一組的孤600J直為2. 8 + 0. 1，第二組的OD600J直為3. 45 + 0. 15。
[0053] 4、完成步驟1后，檢測培養(yǎng)體系的抑值。
[0054] 第一組的抑值4. 4 +0.2,第二組的抑值4. 3 +0.2,兩組之間無顯著性差異。
[00對結(jié)果表明：在培養(yǎng)過程中，乳桿菌Ijj-6和保加利亞乳桿菌LJJ的起始生長速度沒 有顯著差異；隨著培養(yǎng)時間的增加，培養(yǎng)體系中的菌濃度越來越高，乳桿菌ljj-6由于具備 群體感應(yīng)現(xiàn)象從而生長速度變慢，而保加利亞乳桿菌LJJ由于不具備群體感性現(xiàn)象從而生 長速度沒有變慢。
[0056] S、乳桿菌Ij j-6的培養(yǎng)（牛奶）
[0057] 1、分組處理如下（進行=次重復(fù)試驗，每次重復(fù)試驗中每組設(shè)置5個重復(fù)處理）： 陽05引第一組：將乳桿菌Ijj-6接種至S元純牛奶并使其初始濃度為IO4C化/ml, 37°C靜 置培養(yǎng)12小時；
[0059] 第二組：將保加利亞乳桿菌LJJ接種至S元純牛奶并使其初始濃度為IO4C化/ml, 37°C靜置培養(yǎng)12小時。
[0060] 接種了乳桿菌的純牛奶靜置培養(yǎng)后稱為酸奶。 陽061] 2、完成步驟1后，檢測酸奶的酸度值。