一種巨大芽孢桿菌t317及其菌劑和菌劑制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物菌劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種巨大芽孢桿菌T317及其菌劑和菌劑制備方法，所述巨大芽孢桿菌T317保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCM 2015753。所述菌劑制備方法包括以下步驟：（1）分離、篩選；（2）純化、保存；（3）固體發(fā)酵培養(yǎng)時；（4）菌劑制備，即得到巨大芽孢桿菌T317菌劑。本發(fā)明以巨大芽孢桿菌T317為出發(fā)菌株，對其固氮酶活性以及分泌生長素能力進行測定，發(fā)現(xiàn)菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽孢桿菌T317的固氮酶活性為800?900nmol/(mL·h)，其在生長代謝過程中吲哚乙酸的分泌量為300?400mg/L。CCTCCM 201575320151215
【專利說明】
-種巨大芽抱桿菌T317及其菌劑和菌劑制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物菌劑技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種巨大芽抱桿菌T317及其菌劑和菌 劑制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)長期過分依賴化學(xué)肥料和農(nóng)藥，已經(jīng)造成了農(nóng)田±質(zhì)和肥力下降，農(nóng)作 物品質(zhì)降低，食品和地下水等環(huán)境污染也日趨嚴(yán)重。隨著生態(tài)農(nóng)業(yè)和綠色食品生產(chǎn)的興起 和發(fā)展，加之我國大多數(shù)±壤中速效憐、鐘及其他一些養(yǎng)分的缺乏，微生物肥料作為生物技 術(shù)發(fā)展和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類重要肥源逐漸引起了人們的關(guān)注。
[0003] 巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)是一種好氧產(chǎn)抱革蘭氏陽性細菌，至今已 有一百多年的研究歷史。近年來，隨著微生物肥料的研究，巨大芽抱桿菌作為解憐菌被廣泛 應(yīng)用于解憐細菌肥料生產(chǎn)。目前，國內(nèi)對巨大芽抱桿菌在微生物肥料上的研究主要集中在 菌株選育、解憐效果、發(fā)酵條件優(yōu)化及與解鐘菌相互作用等方面，而對巨大芽抱桿菌的固氮 作用卻不多見。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種巨大芽抱桿菌T317,其具 有固氮酶活性和分泌生長素嗎I噪乙酸的功能。
[0005] 本發(fā)明的另一目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種巨大芽抱桿菌T317菌 劑，該具有較高的固氮酶活性且能分泌生長素，農(nóng)業(yè)應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟效益高。
[0006] 本發(fā)明的另一目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供一種巨大芽抱桿菌T317菌 劑制備方法，工藝簡單成熟，可規(guī)模化生產(chǎn)。
[0007] 本發(fā)明的目的通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)。
[000引一種巨大芽抱桿菌T317,所述巨大芽抱桿菌T317保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、 (化ina Center for Type Collection),地址為中國武漢大學(xué)，分類命名為巨大芽抱桿菌 T317 Bacillus megaterium T317,保藏號為CCTCCM 2015753,保藏日期：2015年 12月15日。
[0009] 所述巨大芽抱桿菌T317具有序列表NO. 1的DNA序列。
[0010] 所述巨大芽抱桿菌T317的固氮酶活性為800-900nmol/(mL . h)，其在生長代謝過 程中可W產(chǎn)生嗎I噪乙酸，嗎I噪乙酸的分泌量為300-400mg/L。
[0011] 固氮酶活性測定
[0012] 1、試驗方法
[0013] 采用乙烘還原法對各菌株的固氮酶活性進行測定。將保存的各菌株用VM-Ethanol 固體培養(yǎng)基活化，用接種環(huán)挑取1環(huán)菌體于1.5mL的無菌離屯、管中，用無菌水稀釋，按相同接 種量接入裝有5mL半固體培養(yǎng)基的lOmL試管中，用反口橡膠塞密封。37°C培養(yǎng)24h后，注入1/ 10體積的10%乙烘氣體，繼續(xù)培養(yǎng)2地，從試管中抽取0.5mL氣體注入氣相色譜儀(北京天普 分析儀器廠SP-2100)中，測定乙烘、乙締的含量。按下列公式計算固氮酶活性大小(北京農(nóng) 業(yè)大學(xué)微生物專業(yè)編，1986):
[0014] C=(hxXcXV)/(24.9XhsXt) (2.1)
[001引其中，hx為樣品峰面積值;hs為標(biāo)準(zhǔn)C2H4峰面積值;C為標(biāo)準(zhǔn)C2H4濃度(nmol/mU ;
[0016] V為培養(yǎng)容器體積(mL); t為樣品培養(yǎng)時間化）；C為產(chǎn)生的C2出濃度[nmo 1 /(mL · h)]。
[0017] 2、試驗結(jié)果
[0018] 結(jié)合公式(2.1)和固氮酶活性測定圖4得知，固氮酶活性為800-900nmol/(血· h)。 由此可W說明，巨大芽抱桿菌T317在代謝過程中可W產(chǎn)生特定的固氮酶，可W自生固定大 氣中的氮氣。
[0019] 生長素定性含量測定
[0020] (1)挑取菌株分別接種(〇〇6日日=1.0，0.5mL菌懸液)到盛有50血King液體培養(yǎng)基的 250mLS角瓶中，每組3個重復(fù)。
[00別](2)接種完畢后，將立角瓶置于搖床上，28°C，125巧m，培養(yǎng)3d，待測。
[0022] (3)將上述在King液體培養(yǎng)基上生長3d的菌懸液SOiiL置于透明離屯、管中，同時加 50yL比色液。
[0023] (4)設(shè)陽性對照和陰性對照，陽性對照中加入50化濃度為lOmg/L的植物生長激素 (IAA)，同時加 SOiiL比色液。陰性對照中加50yLKing液體培養(yǎng)基，同時加 SOiiL比色液。
[0024] (5)將陽性對照液、陰形對照液和測定液置于白陶瓷板并置于室溫下15min，觀察 其顏色變化，顏色變紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，且顏色越深表示分泌IAA的能力越強； 若不變色則為陰性，表示該菌株不能分泌IAA，由此作為判斷依據(jù)進行判斷分析。
[0025] 培養(yǎng)基為King培養(yǎng)基（1L);試劑配方為：蛋白腺20g，K2HP〇4 1.725g，MgS〇4 · 7此0 1.5g，丙Ξ醇15mL，色氨酸0.1 g，蒸饋水lOOOmL。
[002引生長素定量測定
[0027] 參照Riberio等的方法略加改動。菌株T317接種到含有Ig/L色氨酸的LB液體培養(yǎng) 基中，30°C，180r/min，振蕩培養(yǎng)4她。將培養(yǎng)液lOOOOr/min離屯、5min，取100血上清液加到96 孔板中，與lOOmL Sa化owski's試劑（ImL 0.5mol/L FeCb和49mL 35%高氯酸）混勻，室溫 靜置30min，在波長530nm下用酶標(biāo)儀測定吸光度。用不同濃度的IAA標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線， 測定結(jié)果見表1。
[0028] 表1菌株T317 IAA測定結(jié)果
[0029]
[0030] 從表1和圖5可W看出，巨大芽抱桿菌T317的生長素濃度(分泌量)為312.48mg/L， 因此，可W判斷巨大芽抱桿菌T317在生長代謝過程中可W產(chǎn)生IAA，具有促進作物生長的功 能。
[0031] -種巨大芽抱桿菌T317的菌劑制備方法，包括W下步驟：
[0032] (1)分離、篩選
[0033] 選取含有巨大芽抱桿菌T317的固氮菌菌落的±樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固 氮菌菌落；
[0034] (2)純化、保存
[0035] 在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行劃線純化，培養(yǎng)分離得 到巨大芽抱桿菌T317單菌落，保存該單菌落備用；巨大芽抱桿菌T317單菌落如圖1所示。
[0036] 具體地，在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的菌落進行劃線純化，3(TC恒溫培 養(yǎng)36-48小時分離得到巨大芽抱桿菌T317單菌落，將平板上出現(xiàn)的單菌落保存在試管中，30 °。直溫培養(yǎng)36-48小時，置于4°C冰箱中保存。
[0037] (3)固體發(fā)酵培養(yǎng)
[0038] 選取上述巨大芽抱桿菌T317,用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)酵環(huán)境pH為7.1-7.4,接 種量0.5-1.0%，培養(yǎng)溫度為30-37°C，培養(yǎng)時間為48-60小時。
[0039] (4)菌劑制備
[0040] 將發(fā)酵后產(chǎn)物于5(TC烘干后用小型粉碎機打碎，設(shè)定最終產(chǎn)品活菌數(shù)為5億/g，進 行活菌數(shù)檢測，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是4-10億/g，產(chǎn)品活菌數(shù)完全符合國家標(biāo)準(zhǔn)《微 生物菌劑》GB20287-2006要求2億/gW上，即得到巨大芽抱桿菌T317菌劑。
[0041 ]固體發(fā)酵培養(yǎng)中固體培養(yǎng)基的配方優(yōu)化實驗
[0042] (3.1)菌種由實驗室自行分離，經(jīng)鑒定為芽抱桿菌屬中的Bacillus megaterium， 編號為T317。
[0043] (3.2)固體培養(yǎng)基為
[0044] 培養(yǎng)基一:LB培養(yǎng)基化ysogeny化oth，即溶菌肉湯培養(yǎng)基，是培養(yǎng)細菌最基礎(chǔ)最 常見的培養(yǎng)基）；
[0045] 培養(yǎng)基二:種子培養(yǎng)基配方(g/L):淀粉16,酵母抽提粉4瓜冊〇4 0.5，MgS〇4 0.5， 培養(yǎng)基二的抑為7.0;
[0046] 培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基配方（g/L):淀粉15,豆巧25，KH2P04 2，Na油P〇4 0.5， CaC〇3〇.5，MgS〇4 0.5，MnS〇4 0.5,培養(yǎng)基Ξ的抑為7.0。
[0047] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方一和Ξ的缺陷是發(fā)酵成本高，不適宜生產(chǎn)。培養(yǎng)基二的種子 培養(yǎng)基配方發(fā)酵用量少，發(fā)酵效果好。
[0048] (3.3)固體發(fā)酵產(chǎn)抱條件的單因素試驗
[0049] ①淀粉原料對產(chǎn)抱量的影響：選用小麥粉、面粉和教皮為淀粉原料，按照豆巧：淀 粉原料=4: 的比例，在料水比為1.0:0.3(m:m)，接種量為1.0% (V:m)，37°C條件下發(fā) 酵4她，測定產(chǎn)抱量如表2所示。
[0050] 表2淀粉原料對產(chǎn)抱量的影響
[0化1 ]
[0052] ~②發(fā)酵溫度對產(chǎn)抱量的影響：將豆巧和小麥粉W4:l(m:m)的比例混合，按照料水' 比1.0:0.3(m:m)制作固體培養(yǎng)基，種子液添加量為1.0% (V:m)，在不同的發(fā)酵溫度下（30、 35、37、40、45 °C)發(fā)酵4她，測定產(chǎn)抱量如表3所示。
[0053] 表3發(fā)酵溫度對產(chǎn)抱量的影響
[0化4]
[0化5]③發(fā)酵時間對產(chǎn)抱量的影響：將豆巧和教皮W4:l(m:m)的比例混合，按照料水比 1.0:0.3(m:m)制作固體培養(yǎng)基，種子液添加量為1.0 % (V:m)，在37°C下發(fā)酵不同時間（24、 48、72、9化），測定產(chǎn)抱量如表4所示。
[0056]表4發(fā)酵時間對產(chǎn)抱量的影響 「0化71
[0058] ④接種量對產(chǎn)抱量影響:將豆巧和教皮W4:1 (m:m)的比例混合，W料水比1.0:0.3 (m:m)制作固體培養(yǎng)基，分別添加 W0.5% ,1.0% ,2.0% ,3.0% ,5.0% (V/m)的比例往培養(yǎng) 基中添加種子液，37 °C條件下發(fā)酵4她，測定產(chǎn)抱量如表5所示。
[0059] 表5接種量對產(chǎn)抱量影響
[0060]
[0061 ]⑤料水比對產(chǎn)抱量影響：將豆巧和教皮W4:1 (m:m)的比例混合，按照不同的料水 tt (1.0:0.1,1.0:0.2,1.0:0.3,1.0:0.4,1.0:0.5，m:m)制作發(fā)酵培養(yǎng)基，固定種子液接種 量為1.0%(V:m)，在37°C下發(fā)酵4她，測定產(chǎn)抱量如表6所示。
[0062] 表6料水比對產(chǎn)抱量影響
[0063]
[0064] (3.4)利用響應(yīng)面法分析確定最佳配方及發(fā)酵環(huán)境參數(shù)
[0065] (3.5)培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗證試驗用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基，W5%接 種量接入裝液量為20血的SOOmLS角瓶中，于30°C、18化/min條件下培養(yǎng)30h。發(fā)酵結(jié)束后測 定發(fā)酵液中的芽抱量。
[0066] 所述步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由W下重量份的原料組成:教皮65-75%，豆 巧20-28%，NaCl 4-5%，CaC〇3 1-2%，MnS〇4·出0 0.01-0.05%，MgS〇4*7H2〇 0.03- 0.08%，培養(yǎng)基的抑為7.1-7.4。該培養(yǎng)基的優(yōu)勢是可顯著地增加產(chǎn)抱量，減少生產(chǎn)成本。
[0067] 發(fā)酵培養(yǎng)基配方及環(huán)境參數(shù)
[0068] 結(jié)合單因素試驗，響應(yīng)面法分析和培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果驗證得出巨大芽抱桿菌最佳發(fā) 酵培養(yǎng)基配方及環(huán)境參數(shù)：
[0069] ①培養(yǎng)基
[0070] 優(yōu)選為，教皮70%，豆巧24%，NaCl 4.3%，CaC〇3 1.6%，MnS〇4 ·出0 0.04%， 1邑5〇4*7出00.06%。
[0071] ②發(fā)酵環(huán)境參數(shù)抑7.1-7.4,接種量0.5-1.0%，培養(yǎng)溫度30-37°C，培養(yǎng)時間48-60 小時。
[0072] 所述步驟（1)分離、篩選的具體方法為:選取±樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩， 靜置，取上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無菌水，懸浮，離屯、，去沉淀， 將上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用憐酸緩沖液懸浮，得到樣品液;在上述樣 品液中加入憐酸緩沖液，懸浮混合，得到稀釋菌懸液;將稀釋菌懸液水浴加熱，自然冷卻后 吸取涂布于無氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得固氮菌菌落。
[0073] 更具體地，分離、篩選的方法為：
[0074] 從廣東省東競市常平鎮(zhèn)黃泥塘農(nóng)場采取500肖±樣，加入化含0.01 %吐溫80的無菌 水，震蕩lOmin，靜置半個小時，取上清液于20°C下4820rpm離屯、20min。棄上清液，保留沉淀 物，加入30-50血含0.01 %吐溫80的無菌水懸浮，液體于20 °C下5000rpm離屯、5秒鐘，去沉淀， 將上清液倒入一個干無菌離屯、管中于20°C下4820rpm離屯、lOmin，棄上清液，保留沉淀物，將 沉淀物用lOmL的pH7.0憐酸緩沖液懸浮，得到樣品液;取ImL上述樣品液與9mL憐酸緩沖液懸 浮混合，即為10倍稀釋菌懸液。將稀釋菌懸液置于75°C水浴加熱15min，自然冷卻后吸取100 yL涂布于無氮培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)36-48小時獲得含巨大芽抱桿菌T317的固氮菌菌落。
[0075] 所述步驟（1)中，分離篩選培養(yǎng)基由W下質(zhì)量的原料制成：CaC〇3 1.0-1.4g， MgS〇4*7H2〇 0.6-1.2g，K2HP〇4 1.0-2. Og，化 Cl 0.1-0.4g，F(xiàn)eS〇4*7H2〇 0.001-0.005g， ΝειΜ〇4 · 2此0 0.05-0.1旨，薦糖5-10旨，瓊脂18-20旨，蒸饋水10001111，分離篩選培養(yǎng)基的口出％ 7.1-7.4。本發(fā)明的分離篩選培養(yǎng)基屬于改良無氮培養(yǎng)基。
[0076] 所述純化保存的具體方法為:在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的菌落進行 劃線純化，3(TC恒溫培養(yǎng)36-48小時分離得到枯草芽抱桿菌Τ317單菌落。將平板上出現(xiàn)的單 菌落保存在試管中，30°C恒溫培養(yǎng)36-48小時，置于4°C冰箱中保存。巨大芽抱桿菌T317保藏 于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、（畑ina Center for Type Col lection),保藏號碼為： CCTCCM2015753。
[0077] (2)純化保存培養(yǎng)基的配方為：牛肉膏3 . Og，蛋白腺10 . Og，氯化鋼5 . Og，瓊脂 18. Og，蒸饋水1000ml，純化保存培養(yǎng)基的抑為7.0-7.4。
[007引所述步驟（3)培養(yǎng)基培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由W下質(zhì)量的原料制成：Ca(X)3 1.0-1.4g， MgS04*7H20 0.6-1.2g，K2HP04 1.0-2. Og，化 Cl 0.1-0.4g，F(xiàn)eS04*7H20 0.001-0.005g， NaM04 · 2出0 0.05-0.1 g，薦糖5-lOg，瓊脂 18-20g，蒸饋水 1000ml，培養(yǎng)基的pH為7.1-7.4。
[0079] 所述步驟(2)和步驟(3)之間還包括有W下步驟：
[0080] (S1)革蘭氏染色:將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；
[0081] (S2)芽抱染色:將陽性菌進行芽抱染色，篩選得到含有芽抱的革蘭氏陽性菌單菌 落。
[0082] 芽抱染色及其革蘭氏染色
[0083] 革蘭氏染色和芽抱染色是兩種細菌鑒定的常規(guī)方法，染色可W縮小鑒定范圍。未 經(jīng)染色的細菌與周圍環(huán)境折光率差別甚小，在顯微鏡下極難觀察。革蘭氏染色后細菌與環(huán) 境形成鮮明對比，可W清楚地觀察到細菌的形態(tài)、排列及某些菌種屬于革蘭氏陽性(G+)或 者革蘭氏陰性菌(G1，用W分類鑒定。革蘭氏陰性菌普遍存在安全隱患，在農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用 過程中直接高溫滅菌后舍棄結(jié)構(gòu)特征。芽抱染色將菌體內(nèi)的芽抱進行染色，可W直觀觀察 芽抱的大小、位置、形狀等特點，進一步縮小其鑒定范圍。芽抱桿菌具有保質(zhì)期長，易于存放 的特點，在農(nóng)業(yè)微生物產(chǎn)品具有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。
[0084] 1、革蘭氏染色
[0085] (1)涂片：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜 質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻。將 樣品載玻片在火燈上方來回過3次，W固定細胞。
[0086] (2)初染:滴加2-5滴草酸錠結(jié)晶紫染液，染Imin，傾去染液，流水沖洗至無紫色。
[0087] (3)媒染:先用新配的艦液(艦l.Og、艦化鐘2.Og、蒸饋水300.OmU沖去殘水，再用 艦液覆蓋涂面Imin，后水洗。
[0088] (4)脫色:除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15-20秒后，立即用流水沖洗。
[0089] (5)復(fù)染:滴加1滴番紅染色液，染3-5min，水洗后用吸水紙吸干。
[0090] (6)鏡檢:將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
[0091] 2、芽抱染色
[0092] 在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻 片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在 火燈上方來回過3次，W固定細胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加1~2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液，染 色3min。用蒸饋水沖洗掉染液，風(fēng)干后，將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察。
[0093] 如圖2和圖3所示，通過革蘭氏染色和芽抱染色結(jié)果可W看出，巨大芽抱桿菌T317 為革蘭氏陽性菌，桿狀，含有芽抱。
[0094] 一種巨大芽抱桿菌T317的菌劑，由所述的一種巨大芽抱桿菌T317的菌劑制備方法 制備而成。
[0095] 本發(fā)明的有益效果：
[0096] (1)本發(fā)明W巨大芽抱桿菌T317為出發(fā)菌株，對其固氮酶活性W及分泌生長素能 力進行測定，發(fā)現(xiàn)菌株T317具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力。巨大芽抱桿菌T317的固 氮酶活性為800-90化mol/(血· h)，其在生長代謝過程中嗎I噪乙酸的分泌量為300-400mg/ L。
[0097] (2)通過單因素和正交試驗進行固體發(fā)酵的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，W提高巨 大芽抱桿菌T317產(chǎn)抱量。優(yōu)化后的固體配料，能直接應(yīng)用于巨大抱桿菌T317發(fā)酵，大大提高 生產(chǎn)的優(yōu)質(zhì)化。作為一種新的微生物菌劑，巨大芽抱桿菌T317在未來的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，將有良 好的應(yīng)用前景。
[0098] (3)本發(fā)明針對巨大芽抱桿菌T317的發(fā)酵配方進行優(yōu)化從而制備巨大芽抱桿菌 T317菌劑，大大提高了產(chǎn)抱量，增強了巨大芽抱桿菌T317的應(yīng)用效果，且能夠有效地降低生 產(chǎn)成本。
【附圖說明】
[0099] 利用附圖對發(fā)明作進一步說明，但附圖中的實施例不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制， 對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可W根據(jù)W下附圖獲得其 它的附圖。
[0100] 圖1為分離得到的巨大芽抱桿菌T317單菌落在顯微鏡下放大10X100倍的菌落圖。 [0101 ]圖2為巨大芽抱桿菌T317革蘭氏染色結(jié)果圖。
[0102] 圖3為巨大芽抱桿菌T317芽抱染色結(jié)果圖。
[0103] 圖4為巨大芽抱桿菌T317固氮酶活性測定結(jié)果圖。
[0104] 圖5為巨大芽抱桿菌T317IAA比色效果圖。
【具體實施方式】
[0105] 結(jié)合W下實施例對本發(fā)明作進一步描述。
[0106] 實施例1
[0107] 本實施例的一種巨大芽抱桿菌T317,所述巨大芽抱桿菌T317保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中屯、，保藏號為CCTCCM 2015753。所述巨大芽抱桿菌T317具有序列表N0.1的DNA序 列。
[0108] 所述巨大芽抱桿菌T317的固氮酶活性為800nmol/(mL . h)，其在生長代謝過程中 嗎I噪乙酸的分泌量為312.48mg/L。
[0109] -種巨大芽抱桿菌T317的菌劑制備方法，包括W下步驟：
[0110] (1)分離、篩選
[0111] 選取含有巨大芽抱桿菌T317的固氮菌菌落的±樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固 氮菌菌落；
[0112] (2)純化、保存
[0113] 在純化保存培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行純化，培養(yǎng)分離得到巨 大芽抱桿菌T317單菌落，保存該單菌落備用；
[0114] (3)固體發(fā)酵培養(yǎng)
[0115] 選取上述巨大芽抱桿菌T317,用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)酵環(huán)境pH為7.1，接種量 0.5%，培養(yǎng)溫度為30°C，培養(yǎng)時間為60小時；
[0116] (4)菌劑制備
[0117] 將發(fā)酵后產(chǎn)物烘干后打碎，進行活菌數(shù)檢測，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是4億/ g，即得到巨大芽抱桿菌T317菌劑。
[0118] 所述步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由W下重量份的原料組成:教皮70%，豆巧 24%，化(：14.3%，〔曰(：03 1.6%，]\111504*此0 0.04%，]\%504.7此0 0.06%，培養(yǎng)基的抑為 7.1。
[0119] 所述步驟（1)分離、篩選的具體方法為:選取±樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩， 靜置，取上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無菌水，懸浮，離屯、，去沉淀， 將上清液離屯、，棄上清液，保留沉淀物，將沉淀物用憐酸緩沖液懸浮，得到樣品液;在上述樣 品液中加入憐酸緩沖液，懸浮混合，得到稀釋菌懸液;將稀釋菌懸液水浴加熱，自然冷卻后 吸取涂布于無氮培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得固氮菌菌落。
[0120] 所述步驟（1)中，分離篩選培養(yǎng)基由W下質(zhì)量的原料制成：Ca(X)3 1.0g，MgS化· 7此0 0.6g，K2HP04l.0g，NaC10.1g，F(xiàn)eS04·7此0 0.001g，NaM04·2出0 0.05g，薦糖5g，瓊 脂18g，蒸饋水1000ml，分離篩選培養(yǎng)基的抑為7.1。
[0121] 實施例2
[0122] 本實施例與實施例1的不同之處在于，本實施例的所述步驟(2)和步驟(3)之間還 包括有W下步驟：
[0123] (S1)革蘭氏染色:將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌；
[0124] (S2)芽抱染色:將陽性菌進行芽抱染色，篩選得到含有芽抱的革蘭氏陽性菌單菌 落。
[0125] 具體地，革蘭氏染色方法為：
[0126] (1)涂片：在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜 質(zhì)。在載玻片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落于水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻。將 樣品載玻片在火燈上方來回過3次，W固定細胞。
[0127] (2)初染:滴加2-5滴草酸錠結(jié)晶紫染液，染Imin，傾去染液，流水沖洗至無紫色。
[01%] (3)媒染:先用新配的艦液(艦l.Og、艦化鐘2.Og、蒸饋水300.OmL)沖去殘水，再用 艦液覆蓋涂面Imin，后水洗。
[0129] (4)脫色:除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15-20秒后，立即用流水沖洗。
[0130] (5)復(fù)染:滴加1滴番紅染色液，染3-5min，水洗后用吸水紙吸干。
[0131] (6)鏡檢:將載玻片置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果。
[0132] 具體地，芽抱染色方法為：
[0133] 在無菌操作臺中，取一塊載玻片，在火焰燈上方略烤，去除玻片上的雜質(zhì)。在載玻 片中央滴一滴無菌水，挑取單個菌落水滴中，用灼燒過的接種環(huán)涂抹均勻。將樣品載玻片在 火燈上方來回過3次，W固定細胞。在涂布菌體的區(qū)域滴加1~2滴石碳酸堿性復(fù)紅染液，染 色3min。
[0134] 本實施例的其余內(nèi)容與實施例1相同，運里不再寶述。
[0135] 實施例3
[0136] 本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述巨大芽抱桿菌T317的固 氮酶活性為830nmol/(mL · h)，其在生長代謝過程中嗎I噪乙酸的分泌量為340mg/L。
[0137] 步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)
[0138] 選取上述巨大芽抱桿菌T317,用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)酵環(huán)境pH為7.2,接種量 0.6%，培養(yǎng)溫度為32°C，培養(yǎng)時間為58小時。
[0139] 所述步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由W下重量份的原料組成:教皮70%，豆巧 24%，化(：14.3%，〔曰(：03 1.6%，]\111504*此0 0.04%，]\%504.7此0 0.06%，培養(yǎng)基的抑為 7.2。
[0140] 所述步驟（1)中，分離篩選培養(yǎng)基由W下質(zhì)量的原料制成：Ca(X)3 1.2g，MgS化· 7此0 0.8g，K2HP04l.5g，NaC10.2g，F(xiàn)eS04·7此0 0.002g，NaM04·2出0 0.06g，薦糖6g，瓊 脂18g，蒸饋水1000ml，分離篩選培養(yǎng)基的抑為7.2。
[0141 ]本實施例的其余內(nèi)容與實施例1或2相同，運里不再寶述。
[0142] 實施例4
[0143] 本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述巨大芽抱桿菌T317的固 氮酶活性為885nmol/(mL · h)，其在生長代謝過程中嗎I噪乙酸的分泌量為375mg/L。
[0144] 步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)
[0145] 選取上述巨大芽抱桿菌T317,用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)酵環(huán)境pH為7.3,接種量 0.8%，培養(yǎng)溫度為35°C，培養(yǎng)時間為54小時。
[0146] 所述步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由W下重量份的原料組成:教皮65%，豆巧 28%，船(：14%，(：曰(：03 1%，]?11504.出0 0.01%，]\%504*7出0 0.03%，養(yǎng)基的口出％7.3。
[0147] 所述步驟（1)中，分離篩選培養(yǎng)基由W下質(zhì)量的原料制成：Ca(X)3 1.3g，MgS化· 7此0 1.0g，K2HP04l.8g，NaC10.3g，F(xiàn)eS04·7此0 0.004g，NaM04·2出0 0.09g，薦糖8g，瓊 脂19g，蒸饋水1000ml，分離篩選培養(yǎng)基的抑為7.3。
[014引實施例5
[0149] 本實施例與實施例1或2的不同之處在于，本實施例的所述巨大芽抱桿菌T317的固 氮酶活性為900nmol/(mL · h)，其在生長代謝過程中嗎I噪乙酸的分泌量為400mg/L。
[0150] 步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)
[0151] 選取上述巨大芽抱桿菌T317,用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)酵環(huán)境pH為7.4,接種量 1.0%，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)時間為48小時。
[0152] 所述步驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由W下重量份的原料組成:教皮75%，豆巧 20%，船(：15%，(：曰(：03 2%，]\111504.出0 0.05%，]\%504*7出0 0.08%，培養(yǎng)基的口出％7.4。
[0153] 所述步驟（1)中，分離篩選培養(yǎng)基由W下質(zhì)量的原料制成：Ca(X)3 1.4g，MgS化· 7此0 1.2g，K2HP04 2.0g，NaC10.4g，F(xiàn)eS04·7此0 0.005g，NaM04·2出0 0.1g，薦糖10g，瓊 脂20g，蒸饋水1000ml，分離篩選培養(yǎng)基的pH為7.4。
[0154] 本發(fā)明的巨大芽抱桿菌T317的16S rDNA序列菌種鑒定
[01W]細菌的個體微小，形態(tài)簡單，傳統(tǒng)方法鑒定細菌常根據(jù)它們在生理生化上的不同 反應(yīng)作為分類鑒定的主要依據(jù)。20世紀(jì)70年代后期W來，國際上通用的"正式的"或"官方 的"細菌分類方法是W《伯杰氏鑒定細菌學(xué)手冊》為依據(jù)。在生理生化鑒定中，通常會出現(xiàn)一 個或者幾個生理指標(biāo)不符合該菌種所具有的獨特性質(zhì)，難W明確對該菌株進行鑒定。目前， 細菌鑒定的方法通常將菌株的生理生化指標(biāo)與分子生物學(xué)特性相結(jié)合，得出較為可靠地結(jié) 論。其中DNA序列分析的16S rRNA基因進化發(fā)育系統(tǒng)已經(jīng)成為目前國際上細菌多相分類鑒 定常用的技術(shù)手段化im et al，2004;Prap et al，1997)。
[0156] 核糖體16S rDNA基因序列全長約1550bp，是由交替的保守區(qū)和可變區(qū)組成。利用 保守區(qū)域設(shè)計的通用引物，可W擴增出所有細菌的16S rDNA片段。16S rDNA序列分析技術(shù) 的基本原理是從微生物樣本中提取16S rDNA片段，通過克隆、測序或酶切、探針雜交獲得 16S rDNA的序列信息，再與16S rDNA數(shù)據(jù)庫的序列數(shù)據(jù)或者其他數(shù)據(jù)進行比較，確定其在 進化樹中的位置，從而鑒定樣本中可能存在的微生物種類。利用16S rDNA片段保守區(qū)域設(shè) 計的通用引物，不會對非細菌的DNA互補，而細菌的16S rDNA可變區(qū)的差異可W用來區(qū)分 不同的菌。因此通過對某菌株16S rDNA序列測定來獲得最終鑒定證明的做法是被普遍認(rèn)可 的。
[0157] 1、方法：
[015引（1化0?反應(yīng)體系（2化1^: lOXPCRBttffer 2.5 u：L dNTP 化瓦福) 2. 0 μ L 引物 (10 μ Μ) ：Q.5uL
[0159] 引物 1 勉述 αΟ ?? Μ) Q,掃 UL DNA模板化日打哲 Tag 醋瓣 μ L) Θ. S u L 加也0 巧u L
[0160] (2化0?反應(yīng)條件:95°(：預(yù)變性5111111，95°(：變性3〇3,58°(：退火3〇3,72°(：延伸8〇3,35 個循環(huán)，72°C延伸lOmin。使用ABI 3730x1 DM分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）進行DM測序。
[0161] 2、測序結(jié)果
[0162]
[0163]
[0164] 3、同源性分析
[01化]鑒定本細菌為Bacillus megateri皿，巨大芽抱桿菌。
[0166] 本發(fā)明由廣東省引進創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)團隊項目資助研發(fā)，制得的巨大芽抱桿菌T317及其 菌劑具有廣闊的市場前景，經(jīng)濟效益高。
[0167] 最后應(yīng)當(dāng)說明的是，W上實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對本發(fā)明保 護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細地說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng) 當(dāng)理解，可W對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實 質(zhì)和范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種巨大芽孢桿菌T317,其特征在于:所述巨大芽孢桿菌T317保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏號為CCTCCM 2015753。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌T317,其特征在于:所述巨大芽孢桿菌T317 具有序列表NO. 1的DNA序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種巨大芽孢桿菌T317,其特征在于:所述巨大芽孢桿菌T317 的固氮酶活性為800-900nm〇V(mL · h)，其在生長代謝過程中吲哚乙酸的分泌量為300-400mg/L〇4. 權(quán)利要求1-3任意一項所述的一種巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法，其特征在于： 包括以下步驟： (1) 分離、篩選 選取含有巨大芽孢桿菌T317的固氮菌菌落的土樣，經(jīng)分離篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)得到固氮菌 菌落； (2) 純化、保存 在培養(yǎng)基上將分離、篩選獲得的固氮菌菌落進行純化，培養(yǎng)分離得到巨大芽孢桿菌 T317單菌落，保存該單菌落備用； (3) 固體發(fā)酵培養(yǎng) 選取上述巨大芽孢桿菌T317單菌落，用固體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，發(fā)酵環(huán)境pH為7.1-7.4， 接種量0.5-1.0%，培養(yǎng)溫度為30-37°C，培養(yǎng)時間為48-60小時； (4) 菌劑制備 將發(fā)酵后產(chǎn)物烘干后打碎，進行活菌數(shù)檢測，檢測結(jié)果顯示該活菌數(shù)范圍是4-10億/g， 即得到巨大芽孢桿菌T317菌劑。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(3)固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由以下重量份的原料組成:麩皮65-75份，豆柏20-28份，NaCl 4-5份，CaC0 3 1-2份，MnS〇4.H20 0.01-0.05份，MgS〇4.7H20 0.03-0.08份，培養(yǎng)基的pH為7.卜7.4。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(3 )固體發(fā)酵培養(yǎng)中，培養(yǎng)基由以下重量份的原料組成：麩皮70份，豆柏24份，NaCl 4.3 份，CaC03 1.6份，MnS〇4 · H2O 0.04份，MgS〇4 · 7H20 0.06份。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(1)分離、篩選的具體方法為:選取土樣，加入含吐溫80的無菌水，震蕩，靜置，取上清液離 心，棄上清液，保留沉淀物，加入含吐溫80的無菌水，懸浮，離心，去沉淀，將上清液離心，棄 上清液，保留沉淀物，將沉淀物用磷酸緩沖液懸浮，得到樣品液;在上述樣品液中加入磷酸 緩沖液，懸浮混合，得到稀釋菌懸液;將稀釋菌懸液水浴加熱，自然冷卻后吸取涂布于無氮 培養(yǎng)基，培養(yǎng)獲得固氮菌菌落。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟（1)中，分離篩選培養(yǎng)基由以下質(zhì)量的原料制成< &(：031.0-1.48，1^304.7!120 0.6-1.2g，K2HP〇4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，F(xiàn)eS〇4· 7H20 0.001-0.005g，NaM〇4· 2H20 0· 05-〇. lg，鹿糖5-10g，瓊脂18-20g，蒸餾水1000ml，分離篩選培養(yǎng)基的pH為7.1-7.4。9. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法，其特征在于:所述步 驟(2)和步驟(3)之間還包括有以下步驟： (51) 革蘭氏染色:將純化后的單菌落進行革蘭氏染色，篩選得到陽性菌； (52) 芽孢染色:將陽性菌進行芽孢染色，篩選得到含有芽孢的革蘭氏陽性菌單菌落。10.-種巨大芽孢桿菌T317的菌劑，其特征在于：由權(quán)利要求4-9任意一項所述的一種 巨大芽孢桿菌T317的菌劑制備方法制備而成。
【文檔編號】A01P21/00GK106011002SQ201610345378
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發(fā)明人】沈世華, 楊國平, 林敏 , 孫旭生, 王亞君, 尹坤, 楊盼盼, 張學(xué)賢, 陳三鳳, 譚志遠, 燕永亮
【申請人】東莞市保得生物工程有限公司