專利名稱：一種檢測液泡膜質子流的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測液泡膜質子流的方法。
背景技術：
液泡是植物體內多功能的細胞器，在細胞體積、膨壓、pH和離子平衡的調節(jié)中起重 要作用。液泡能行使這些功能，源于它能積累高濃度離子的能力。 一些離子例如!T和Ca2+ 被認為可以強烈影響胞質中酶活和大分子物質，都被積累于液泡中。因液泡的離子積累能 力，它在調節(jié)無機離子平衡上起著非常重要的作用。 在植物細胞中，離子平衡主要通過質膜和胞內細胞器膜如液泡膜的離子進出調節(jié) 來實現(xiàn)的。從液泡進出的離子參與許多的信號途徑，同時也起始很多的代謝反應。特別是 對胞質中的PH和Ca2+信號的調控是液泡參與調控細胞離子平衡的典型例子。在煙草的懸 浮細胞中，液泡會隨著胞質中H+的升高而降低液泡內的pH值來調節(jié)胞質的pH。另外，液泡 膜上有很多轉運系統(tǒng)，例如Ca2+-ATPase和Ca2+/H+-antiporter，他們可以催化Ca2+進入液 泡，從而通過控制液泡上的慢通道和通道介導的液泡Ca2+流來調控胞質的離子平衡。
盡管已經(jīng)給出很多液泡參與調控胞質離子平衡的證據(jù)，但是對于特異的H+轉運和 H+流的研究還是很少。當植物細胞遭受多變的外部環(huán)境時，液泡和細胞質H+庫里的H+發(fā)生 瞬時的分配變化，該過程影響了許多基因功能實現(xiàn)，同時引發(fā)了許多的信號反應。
掃描離子選擇電極技術(SIET)是一項電生理技術，可以用電腦控制，非損傷地對 樣品進行離子和分子的特異活性監(jiān)測。迄今為止，很多離子和分子的感受器，例如Ca2+， H+， K+， Cl—， NO—， Mg2+， Cd2+，八13+等離子和02分子的電極感受器，都已經(jīng)研究完成。不同于其他 電生理技術，比如膜片鉗，SIET有許多優(yōu)點第一，SIET對于研究者來說容易操作。第二， SIET由于非損傷特點，測定樣品更加準確。第三，SIET能從組織，器官，細胞團，單細胞和細 胞器中測定離子和分子流。第四，SIET不僅能從離子通道，而且也能從轉運蛋白通道和逆 向轉運蛋白通道收集電流變化的數(shù)據(jù)。第五，SIET在測定時候，清楚地顯示微電極位置和 測定數(shù)據(jù)，全過程都是可見測定。 近年來，SIET技術已經(jīng)在許多關于組織和細胞跨膜離子流研究。在鹽脅迫下，用 SIET測定楊樹根Na+和H+流；另外，通過根中Ca2+離子流測定，證明根中Ca2+離子影響K+/ Na+離子平衡。此外，通過SIET，揭示了云杉花粉管中鈣調素調控C^+離子流的作用模式； 同樣地，利用SIET技術測定毛白楊花粉管細胞，發(fā)現(xiàn)鈣離子內流與肌動蛋白絲組織之間的 偶聯(lián)關系，深入地闡述了 NO介導的細胞壁構成的機理。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種提取植物液泡的方法。
本發(fā)明所提供的提取植物液泡的方法，包括如下步驟 提取并裂解植物葉片的原生質體，得到所述植物葉片的原生質體裂解溶液，分離 純化所述植物葉片的原生質體裂解溶液，得到所述植物的液泡提取液；
所述分離純化所述植物葉片的原生質體裂解溶液的方法包括如下密度梯度離心 步驟將所述植物葉片的原生質體裂解溶液加入到8% Ficoll-400溶液的上層，所述8% Ficoll-400溶液在下層，所述植物葉片的原生質體裂解溶液在上層，以500g-50000g的離 心力離心10min-50min，收集上數(shù)第一層溶液，即為所述植物的液泡提取液；
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmol Tris、 (0. 4-1)mol甘露醇和80g相對分子重量為400000的聚蔗糖混合，用水定容至1升，再用HC1 調節(jié)pH至7. 0-7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。 上述過程中，所述密度梯度離心步驟中，所述離心的方式為以500g、1000g或 50000g的離心力離心10min、30min或50min ; 上述過程中，所述每l升所述8XFicoll-400溶液的配制方法中，所述甘露醇的用 量為0. 4mol、0. 5mol或lmol ; 上述過程中，所述每1升所述8% Ficoll-400溶液的pH值為7. 5。 上述過程中，所述密度梯度離心步驟中，所述離心的方式為以500g的離心力離
心50min，或以lOOOg的離心力離心30min，或以50000g的離心力離心lOmin ; 上述過程中，所述植物為煙草。 本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測植物液泡膜離子流的方法。 本發(fā)明所提供的檢測植物液泡膜離子流的方法，包括如下步驟用掃描離子選擇
電極技術檢測植物液泡的液泡膜離子流，得到所述植物液泡的液泡膜離子流值。 上述過程中，所述離子流為H+流。 上述過程中，所述方法中，在用掃描離子選擇電極技術檢測植物液泡的液泡膜離
子流前，包括按照上述任一所述提取植物液泡的方法提取植物液泡的步驟。 上述過程中，所述用掃描離子選擇電極技術檢測植物液泡的液泡膜離子流的方法
包括如下步驟處理蓋玻片，得到處理后的蓋玻片，將所述植物液泡固定于所述處理后的蓋
玻片上，再加入測定液，進行測定； 上述過程中，所述處理蓋玻片的方法為用(0.005-0.01% )(質量百分含量)多聚 賴氨酸水浸泡所述蓋玻片(5-30)分鐘，干燥； 上述過程中，每1升測定液是按照如下方法配制得到的將0. 05mmol的2_ (N_嗎 啡啉)乙磺酸、(500-800)mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2禾P lOOmmolKCl混合 均勻，用水定容至1升，再用KOH調節(jié)pH至6. 8-7. 5 ; 上述過程中，所述測定中使用的電解液由NaCl、 KH2P04和水組成，NaCl在電解液 中的濃度為(13. 5-16. 5)mM，KH2P04在電解液中的濃度為(36-44)mM，所述電解液的pH值為 6. 8-7. 2。 上述過程中，所述處理蓋玻片的方法為如下1)、2)或3) :1)用0.008% (質量百 分含量)多聚賴氨酸水浸泡所述蓋玻片5分鐘，干燥；2)用0.005% (質量百分含量)多聚 賴氨酸水浸泡所述蓋玻片30min，干燥；3)用0.01% (質量百分含量)多聚賴氨酸水浸泡 所述蓋玻片15min，干燥； 上述過程中，所述每1升測定液的配制方法中，所述甘露醇為500mmol、650mmo1或 800mmo1 ;所述測定液的pH值為6. 8、7. 0或7. 5 ; 所述測定中使用的電解液由NaCl、 KH2P04和水組成，NaCl在電解液中的濃度為15mM、13. 5mM或16. 5慮，腿2 04在電解液中的濃度為40mM、36mM或44mM，電解液的pH為6. 8、 7. 0或7. 2。 上述過程中，所述植物為煙草。 本發(fā)明是首次測定液泡上H+流，且第一次運用SIET測定煙草液泡H+流。
本發(fā)明方法中提取液泡的方法不同于傳統(tǒng)方法傳統(tǒng)的液泡提取方法(M2)，是通 過對裂解的原生質體，進行不連續(xù)密度梯度超速離心來獲得液泡；然而，直接裂解法(Ml) 是一種高度簡化的液泡分離方法，它直接將原生質體裂解得到粗分離的液泡。根據(jù)SIET 的技術特點，本發(fā)明在M2的基礎上，建立了一套簡化且高效的適合SIET測定的液泡提取 方法(M3)。簡化的方法有以下幾處的改動第一，裂解出的液泡，在M3中直接鋪設于8% Ficoll-400溶液的頂層，代替M2方法中鋪設在四層Ficoll-400不連續(xù)梯度溶液的頂 層。第二，在M3中，鋪設好的Ficoll-400梯度，直接用水平轉頭進行500g-50000g離心 10min-50min，4t:;而在M2中，將鋪設好的梯度管，進行90， OOOg超速離心2小時。第三，離 心結束后，M3方法收集上層溶液；而M2方法收集1. 5%和7% Ficoll-400界面溶液。
實驗證明，通過M3分離的液泡，不僅與M2有相同的分離效果(干凈的觀測背景和 較高的液泡分離效率)，更重要的是在SIET的測定中M3和M2分離的液泡都表現(xiàn)出相似的 H+流測定數(shù)值和測定穩(wěn)定性(圖.2)。同時，作為從M2簡化的M3方法，比傳統(tǒng)的超速離心 法M2，操作更簡單而且費用更低廉。所以，簡化的液泡提取方法作為一種替代傳統(tǒng)超速離 心液泡提取方法，適合于SIET H+流測定。同時本發(fā)明方法對液泡具有非損傷性和穩(wěn)定性。 另外，用本發(fā)明方法檢測到鹽脅迫下轉SeNHXl基因煙草液泡H+外流增強，驗證了SeNHXl基 因的功能。 綜上所述，本發(fā)明建立了適合于SIET的簡化液泡提取方法和液泡H+流檢測系統(tǒng)。


圖1.光學顯微鏡觀察不同提取方法得到的液泡。圖中的標尺表示20um。
圖2.對通過Ml ， M2和M3方法分離得到的液泡用SIET進行H+流測定。
圖3.考察SIET測定液泡H+凈流的穩(wěn)定性和非損傷性。 圖4.測定在NaCl脅迫下，轉SeNHXl基因煙草和對照煙草液泡H+流變化。標準 誤差線上相同的字母表示在P《0. 05情況下沒有顯著性差異。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。 從Yakult公司購買纖維素酶(貨號L0012)與離析酶R-10(貨號L0021)。從美
國Amresco公司購買SDS， MES， K0H，甘露醇，F(xiàn)icoll-400， Tris等藥品。多聚賴氨酸購買于
美國Sigma公司(貨號P4707)。試驗中所有步驟都使用雙蒸水。光學顯微鏡使用Zeiss
M-35倒置相差顯微鏡。普通離心使用Sigma 3-18K離心機；超速離心使用BECKMAN Optima
L-80XP超速離心機。 下述實施例的各結果圖中標準誤差線上相同的字母表示數(shù)據(jù)在P《0. 05水平上 沒有顯著性差異。
實施例1 、檢測野生型煙草的液泡膜H+流
—、提取液泡 植物組織液泡提取過程主要包括以下三個步驟原生質體制備，原生質體的裂解， 液泡分離純化。根據(jù)不同的實驗需要，不同液泡純度的要求，可以采取不同的液泡提取方 法。不同于其他電生理技術，SIET對測定的樣品有自己的要求.首先，樣品要求直徑超過 10um，并且能在顯微鏡鏡頭下清楚找到；其次，對樣品測定環(huán)境要求越純越好；第三，樣品 準備不能改變緩沖液成分，最好不要引入其他離子或者官能團。 本實驗所用植物材料為野生型煙草'W38' (Nicotiana tabacum cv 'Wisconsin38')。 野生型煙草'W38'(即'威斯康辛38'或Wisconsin 38)的種子購自中國農業(yè)科 學院煙草研究所(即中國煙草總公司青州煙草研究所)。 下述實驗中的煙草葉片均是按照如下方法獲得野生型種子消毒后播于MS培 養(yǎng)基上。兩周之后，將有活力的萌發(fā)苗轉移到溫室，種植在含有蛭石、泥炭和腐殖質
(i : i : i ;V : v : v)的塑料盆中。溫室條件控制為白天溫度控制在25士2t:，夜間溫
度控制在20士2t:，光照16小時/天，相對濕度50±10%。苗期每周澆1/2Hoagland營養(yǎng) 液一次，如此培養(yǎng)獲得煙草植株。( — )實驗組-簡化梯度離心法(記作方法M3)
方法M3-l :
1、制備原生質體 lg煙草葉片，剪成2mmX2mm的方塊，放進細胞裂解緩沖液中，28。C輕微搖晃(40r/
min)6-8小時，得到的混合物即為細胞裂解液。細胞裂解液通過一層紗布過濾，取濾液；濾
液通過平轉頭4°C， 100g離心2分鐘，離心結束，丟棄上清液，留下沉淀。 1升細胞裂解緩沖液的配制方法是將15g離析酶、20g纖維素酶、0. 05g MES、和
0. 5mo1甘露醇用水混勻，用水定容至1升，用K0H調pH值至5. 7。 得到的原生質體如圖la所示，顯示原生質體狀態(tài)良好。 2、裂解原生質體 將步驟1得到的沉淀加入原生質體裂解緩沖液中，輕輕吸打10分鐘，得到煙草葉 片的原生質體裂解溶液(即液泡初提液)； 1升原生質體裂解緩沖液的配制方法將36. 43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混 勻，并用HCl調節(jié)pH值至7.5.
3、分離純化液泡 將步驟2得到的液泡初提液加入8% Ficoll-400溶液的頂層(8% Fico11-400溶 液在下層，液泡初提液在上層)。利用Sigma 3-18K冷凍離心機，使用平轉頭1000g普通離 心30miri，4°C，收集第一層溶液(從上至下數(shù)，即上數(shù)第一層溶液)，即得到液泡提取液。
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmo1的Tris、 0. 5mo1甘露醇和80g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均勻，用水定 容至1升，再用HC1調pH至7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。
方法M3-2 : 1、制備原生質體與方法M3-l中所述一致。
2、裂解原生質體與方法M3-l中所述一致。
3、分離純化液泡 將步驟2得到的液泡初提液加入8% Ficoll-400溶液的頂層(8% Ficoll-400溶 液在下層，液泡初提液在上層)。利用Sigma 3-18K冷凍離心機，使用平轉頭500g普通離心 50miri，4°C，收集第一層溶液(從上至下數(shù)，即上數(shù)第一層溶液)，即得到液泡提取液。
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmo1的Tris、
0. 4mo1甘露醇和80g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均勻，用水定 容至1升，再用HC1調pH至7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。 方法M3-3 : 1、制備原生質體與方法M3-l中所述一致。
2、裂解原生質體與方法M3-l中所述一致。
3、分離純化液泡 將步驟2得到的液泡初提液加入8% Ficoll-400溶液的頂層(8% Ficoll-400溶 液在下層，液泡初提液在上層)。利用Sigma 3-18K冷凍離心機，使用平轉頭50000g普通離 心10min，4t:，收集第一層溶液(從上至下數(shù)，即上數(shù)第一層溶液)，即得到液泡提取液。
每1升所述8% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmo1的Tris、
1. Omol甘露醇和80g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均勻，用水定 容至1升，再用HC1調pH至7. 5，得到1升所述8% Ficoll-400溶液。 ( 二 )對照組-直接裂解法(記作方法Ml) 直接裂解法就是通過直接裂解原生質體粗分離液泡的方法，此方法為現(xiàn)有技術。 1、制備原生質體 方法與實驗一中所述一致。 2、裂解原生質體 將步驟1得到的沉淀加入原生質體裂解緩沖液，用移液器反復吸打4次，然后間隔 2分鐘再次吸打，每次吸打4次，如此進行10分鐘。最后，加入甘露醇存儲液，直到混合溶液 中甘露醇濃度達到0. 5M。待溶液滲透勢穩(wěn)定后，進行H+流的SIET測定。
1升原生質體裂解緩沖液的配制方法將36. 43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混 勻，并用HCl調節(jié)pH值至7.5.(三)對照組-傳統(tǒng)超速離心法(記作方法M2)，此方法為現(xiàn)有技術。 1、制備原生質體 方法與實驗一中所述一致。 2、裂解原生質體 將步驟1得到的沉淀加入原生質體裂解緩沖液中，輕輕吸打10分鐘，得到懸浮 液； 1升原生質體裂解緩沖液的配制方法將36. 43g甘露醇和3g Tris加入1L水，混 勻，并用HCl調節(jié)pH值至7.5。
3、分離純化液泡 將步驟2得到的懸浮液加入鋪設4層Ficoll-400溶液(25mM Tris-HC1，0. 5M甘 露醇，pH7. 5)的頂層。其中，四層不連續(xù)梯度的Ficoll-400濃度從上至下分別為1. 5， 7，12. 5和20% (質量百分含量)。利用BECKMAN Optima L-80XP超速離心機，使用平轉子進
行90，000g離心2h，4。C。完整的液泡帶在1.5%和7% Ficoll-400梯度界面之間，用槍吸
取1. 5%和7% Ficoll-400梯度界面之間的溶液，即得到液泡提取液。 每l升所述1.5% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmo1 Tris、
0. 5mo1甘露醇和15g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficol 1-400)混合均勻，用水定
容至1升，用HC1調pH值至7. 5，得到1升所述1. 5% Ficoll-400溶液。 每1升所述7% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmo1 Tris、0. 5mo1
甘露醇和70g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficoll-400)混合均勻，用水定容至1
升，用HC1調pH值至7. 5，得到1升所述7% Ficoll-400溶液。 每1升所述12. 5% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmol Tris、
0. 5mo1甘露醇和125g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficoll-400)混合均勻，用水
定容至1升，用HC1調pH值至7. 5，得到1升所述12. 5% Ficoll-400溶液。 每1升所述20% Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmo1 Tris、
0. 5mo1甘露醇和200g相對分子重量為400000的聚蔗糖(即Ficoll-400)混合均勻，用水
定容至1升，用HC1調pH值至7. 5，得到1升所述20% Ficoll-400溶液。 將上述三組實驗獲得的液泡，分別通過Zeiss M-35倒置相差顯微鏡進行觀測，統(tǒng)
計通過顯微鏡鏡頭能清楚辨認的液泡數(shù)量。對于每種提取方法提取的液泡，均取100ul的
液泡提取液，進行檢測，然后統(tǒng)計其中的液泡數(shù)量。將相對于M1方法提取所得液泡數(shù)量的
倍數(shù)設定為液泡提取效率。液泡提取效率二不同方法提取所得液泡數(shù)量/Ml方法提取所得
液泡數(shù)量。"能清楚辨認的液泡"的判斷標準為在光鏡下能清晰看見規(guī)則、透明封閉的泡狀球 體。 上述三個實驗均設3次重復，結果取平均數(shù)。 鏡檢結果如圖lb-d所示。Ml方法結果如圖lc所示，M2方法結果如圖ld所示， M3-l方法結果如圖le所示。M2和M3-1方法獲得的液泡，在顯微鏡下觀察具有相似干凈背 景，而由Ml分離得到的液泡溶液在顯微鏡下可以看到較多的雜質，甚至有未完全裂解的原 生質體。經(jīng)過原生質體的裂解，液泡、原生質體、原生質體和液泡復合物都會出現(xiàn)在裂解液 中。因為液泡是無色且透明，所以通過M1方法分離的液泡在許多不同顏色的雜質背景下， 很難被顯微鏡觀測發(fā)現(xiàn)。 液泡分離效率統(tǒng)計結果如圖lb所示，M2方法的液泡提取效率為Ml方法的10倍， M3-l方法的液泡提取效率為Ml方法的5倍。結果表明，通過M2和M3-l方法可以分離得到 比Ml更多的液泡，盡管M3-l的提取效率比傳統(tǒng)的M2方法有所下降，但對于利用SIET進行 H+流的測定，M3-l方法分離液泡的數(shù)量已經(jīng)完全達到測試的要求(實驗二中實驗證明)。
M3-2、 M3-3方法與M3-1方法的結果一致。
二、SIET測定液泡膜H+流
( — )方法
方法I : SIET測定系統(tǒng)使用的是美國揚格公司的BI0-001A測試系統(tǒng)。SPSS 13. 0分析軟 件用于數(shù)據(jù)分析。顯著性檢測用LSD在5%的顯著水平進行衡量。
使用SIET對通過Ml 、M2和M3分離得到的液泡進行H+流測定，對于每種方法提取
的液泡均取12個液泡進行測定，對每一個液泡均測2分鐘。具體步驟如下 在離子流測定之前，蓋玻片用0.008%多聚賴氨酸水溶液進行處理將干凈的蓋
玻片浸入0. 008%多聚賴氨酸水溶液中，浸泡5分鐘后，過夜風干，并干燥保存使用。實驗前
將處理過的蓋玻片固定在測試小室的底部。取液泡提取液加在蓋玻片的中央，靜置5分鐘，
液泡固定在蓋玻片上，剩余的液體用槍吸掉，最后加入3ml的測定液。待液體穩(wěn)定過后，開
始進行SIET測定。 每1升測定液的配制方法將0. 05mmo1的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES) 、500mmol 甘露醇、0. lmmol NaC1、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KC1混合均勻，用水定容至1升，再用KOH 調節(jié)pH至7. 0。 使用非損傷微測系統(tǒng)(BI0-001A， Younger USA Sci. & Tech. Corp. ， USA)以靜態(tài) 和動態(tài)的方式選擇性地測定離子濃度。測定所用非損傷微電極(XY-H-01型)由旭月(北 京)科技有限公司提供。 選擇性的氫離子的液態(tài)交換劑(LIX)購自Sigma，產品目錄號為 Hydrogenionophore I_cocktail B，95293; 電解液由NaCl、KH2P04和水組成，NaCl在電解液中的濃度為15mM， KH2P04在電解 液中的濃度為40mM，電解液的pH7. 0。 數(shù)據(jù)采集軟件Asetl. 05 ;流速計算軟件Mageflux :http: 〃xuyue. net/ mageflux。 H+選擇性微電極前端灌充有20 m的選擇性的氫離子的液態(tài)交換劑 (LIX) ， H+選擇性微電極后端灌充有1cm的電解液柱。將電極固定器(EHB-1 ;World Precisionlnstruments)上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解液接觸。接地參比電 極(DRIREF-2 ;World Precision Instruments)為固體電極。 H+選擇性微電極在使用前經(jīng)過校正，能斯特斜率(Nernstian slopes)為58mV/ decade,校正液為pH5. 5和p朋.5的PBS緩沖液。 選擇性微電極在預先確定距離(5-30 iim)的兩點間重復運動，從而測得氫離子的 絕對濃度或濃度梯度，微電極的運動頻率通過編程設定在0. 3-0. 5Hz的范圍內。
方法II: 除蓋玻片的處理、測定液和電解液不同外，其余與方法I相同。 所述處理蓋玻片的方法為用0.005% (質量百分含量)多聚賴氨酸水浸泡所述 蓋玻片30min，干燥； 所述每1升測定液的配制方法為將0. 05mmol的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES)、 650mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KCl混合均勻，用水定容至1升， 再用K0H調節(jié)pH至6. 8。 所述測定中使用的電解液由NaCl、 KH2P04和水組成，NaCl在電解液中的濃度為 13. 5mM， KH2P04在電解液中的濃度為36mM，電解液的p朋.8。
方法III: 除蓋玻片的處理、測定液和電解液不同外，其余與方法I相同。
所述處理蓋玻片的方法為用0.01% (質量百分含量)多聚賴氨酸水浸泡所述蓋玻片15min，干燥; 所述每1升測定液的配制方法為將0. 05mmol的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸(MES)、 800mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KC1混合均勻，用水定容至1升， 再用K0H調節(jié)pH至7. 5。 所述測定中使用的電解液由NaCl、 KH2P04和水組成，NaCl在電解液中的濃度為 16. 5mM， KH2P04在電解液中的濃度為44mM，電解液的pH7. 2。用上述方法I分別檢測上述M3-l方法、M3-2方法、M3-3方法、M1方法、M2方法得 到的液泡，再用方法11 、方法111檢測上述M3-1方法得到的液泡。
(二)結果 方法1、方法11、方法III檢測上述M3-1方法得到的液泡，結果一致。
結果如圖2所示。 如圖2A，對12個液泡進行H+流的測定，考察數(shù)值的偏離度。圖中每一數(shù)據(jù)均為 用SIET進行2分鐘IT流測定的統(tǒng)計平均值，分析不同液泡提取方法對SIET進行IT流 測定穩(wěn)定性的影響。Ml得到的液泡H+流測定數(shù)據(jù)，出現(xiàn)大范圍的偏離，從-7nmolcm—、一1 到-0. 2翻lcm—2s—1 ;然而，M2和M3-1得到的液泡H+流測定數(shù)據(jù)，表現(xiàn)比較穩(wěn)定，都 在-0. 2nmolcm—2s—1附近波動。 如圖2B，對12個液泡測定值進行平均數(shù)統(tǒng)計，顯示M2和M3_l得到液泡H+流測定 數(shù)值幾乎一致，但與Ml得到的液泡H+流測定平均值相差很大，標準誤差線上相同的字母表 示在P《0. 05情況下沒有顯著性差異。 這些結果表明，通過M3-1方法分離的液泡，在SIET測定下與通過M2方法分離得 到的液泡有相似的H+流測定結果和數(shù)據(jù)穩(wěn)定性。SIET的測量穩(wěn)定性是受緩沖液中離子濃 度的波動和外界雜質的干擾所影響的，由于通過M1分離的液泡溶液中具有許多的雜質、細 胞碎片和葉綠體等，影響了 SIET測定H+流數(shù)據(jù)的準確性和穩(wěn)定性；而M2和M3-l有著相似 的測定背景，所以表現(xiàn)出相似的數(shù)值和穩(wěn)定性。 M3-2、M3-3方法得到的液泡的測定結果與M3_l方法得到的液泡的測定結果一致。
這些結果證明，通過M3分離的液泡，不僅與M2有相同的分離效果(干凈的觀測背 景和較高的液泡分離效率)，更重要的是在SIET的測定中M3和M2分離的液泡都表現(xiàn)出相 似的H+流測定數(shù)值和測定穩(wěn)定性。同時，作為從M2簡化的M3方法，比傳統(tǒng)的超速離心法 M2，操作更簡單而且費用更低廉。所以，簡化的液泡提取方法作為一種替代傳統(tǒng)超速離心液 泡提取方法，適合于SIET H+流測定。該結果還證明盡管M3的提取效率比傳統(tǒng)的M2方法 有所下降，但對于利用SIET進行H+流的測定，M3方法分離液泡的數(shù)量已經(jīng)完全達到測試的 要求。 實驗設3次重復，結果均一致。 實施例2、 SIET對液泡H+流非損傷測定 —、方法 檢測M3-l、 M3-2、 M3-3方法制備的液泡。同一個液泡每隔5分鐘測定一次，測三 次；每次檢測為2分鐘內連續(xù)測定；共檢測1個液泡，將3次測定所得到的平均值進行繪圖。 考察該方法對樣品的非損傷性。SIET測定方法如實施例2中方法I所述。
實驗設3次重復，結果取平均數(shù)。
二、結果 圖3 (a)，對同一個液泡進行三次連續(xù)2分鐘的H+凈流測定，每次結果分別記作 VI， V2和V3。圖3(b) ， VI、 V2和V3三次測定的平均值。標準誤差線上相同的字母表示在 P《0. 05情況下沒有顯著性差異。 結果顯示，H+流在三次2分鐘的測定(V1、V2和V3)過程中的所有值，表現(xiàn)出極其 相似的趨勢和穩(wěn)定性(圖3a)，同時每次測定的平均值幾乎都一致(圖3b)。表明，SIET表 現(xiàn)出良好的非損傷性和穩(wěn)定性。 比較其他離子流測定技術，SIET能精確地測定微弱的離子流。如圖2和3顯示， 微弱的H"流如0. 15cm—S—1和0. 2nmolcm—2s—1都可以被SIET檢測到，這些結果證明SIET可 以更準確地測定離子轉運過程中極其微弱的差別。 M3-2、M3-3方法得到的液泡的測定結果與M3_l方法得到的液泡的測定結果一致。
研究表明，組織和細胞受損傷可以引發(fā)一系列信號反應，同時許多離子運輸也參
與在信號轉導過程中，這就使得細胞損傷會導致離子流測定不準確和不穩(wěn)定。比其他電生
理技術如膜片鉗更優(yōu)異的是，SIET可以在測定過程中，保護樣品不受傷害，因此可以準確地
測定實時的H+流變化。另一個優(yōu)勢是，因為SIET的非損傷性，同一個液泡可以保持相同的
活性狀態(tài)，用于不同離子流的反復測定，這樣的數(shù)據(jù)具有更高的可比性。 實施例3、檢測轉基因煙草的液泡膜H+流 —、實驗材料的獲得( — )轉SeNHXl基因煙草的制備 pBI121載體購自北京科創(chuàng)勝達科技有限公司；農桿菌LBA4404菌株購自北京鼎國 生物技術有限公司；鹽角草購自江蘇晶隆海洋產業(yè)發(fā)展有限公司。 轉基因煙草是按照文獻(Zhou SF，Chen XY，Zhang XG，Li YX (2008) Improvedsalt tolerance in tobacco plants by co—transformation of a betaine synthesisgene BADH and a vacuolar Na+/H+ antiporter gene SeNHXl. Biotechnol Lett 30 :369-376) 中所述方法獲得的。 SeNHXl基因是以下述引物1和2為引物，用鹽角草的RNA合成的第一鏈cDNA作為 模板，PCR擴增出核苷酸序列如Genbank號為AY131235的第301-2200位的編碼基因，該編 碼基因編碼氨基酸序列如Genbank號為AAN08157所示的蛋白。
引物1:5' -TCTAGATGGAGGGAATTTGGAGGAGC-3';
引物2:5' -GGATCCTGCCTAACTGCCTCGGATT-3'。 擴增得到的SeNHXl基因插入含35S啟動子的pBI121的Xball和BamHI位點，構 建了 pBI121-35S-SeNHXl基因表達載體，將其轉化大腸桿菌并提取質粒進行測序鑒定，結 果表明構建的pBI121-35S-SeNHXl基因表達載體中基因插入方向及插入序列正確。確認無 誤后，將載體pBI121-35S-SeNHXl轉化農桿菌LBA4404菌株。隨后，利用農桿菌介導的葉盤 轉化法，對"W38"的葉盤組織進行菌液侵染轉化，侵染后的葉盤放置于含有卡那霉素的分化 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。通過卡那霉素的篩選，將具有抗性的煙草再生苗轉移到溫室培養(yǎng)，并對再 生苗進行PCR檢測(引物為上述引物1和引物2)，最終得到ll株轉化陽性苗，然后隨機從 11株陽性苗中選取5株，進行Southern和Northern分析；并通過雜交結果，選擇了 TO代 SeNHXl基因能夠轉錄表達、并單拷貝插入基因組的T1、T11和T15株系，將由此三個株系獲得的Tl代轉基因煙草分別記作TS1、 TS11和TS15。 [OH9] ( 二 )轉PBI空載體煙草(對照) 按照實驗(一)中所述方法將空載體pBI121轉入煙草中，得到第T0代煙草植株
的種子，進行如下實驗。 二、煙草葉片的獲得 將轉基因種子(TO代轉基因株系Sl， Sll和S15的種子、對照TO代種子)播在含 有150mgml—1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上進行篩選，兩周之后，將存活的卡納抗性轉基因萌發(fā)苗
轉移到溫室，種植在含有蛭石、泥炭和腐殖質(i : i : i ;v : v : v)的塑料盆中。溫室條
件控制為白天溫度控制在25±2°C ，夜間溫度控制在20±2°C ，光照16小時/天，相對濕度 50±10%。苗期每周澆1/2Hoagland營養(yǎng)液一次，如此培養(yǎng)獲得煙草植株。
三、提取液泡 按照實施例1中實驗一中所述方法(M3-l、2、3)提取液泡，得到液泡提取液。 四、用SIET測定液泡膜H+流 用實施例1中的方法I進行檢測。 將來自于轉PBI空載體煙草的液泡、來自于轉基因株系TS1， TS11和TS15的液泡 分別進行如下檢測實驗。用SIET測定液泡膜H+流的方法與實施例1中所述一致。
在進行NaCl脅迫研究液泡瞬時H+流動力學分析之前，先進行0. 5分鐘不加NaCl 的對照測定，系統(tǒng)穩(wěn)定，向液泡提取液中加入NaCl儲存液，使得NaCl在混合溶液中的終濃 度達到150mM，經(jīng)過1分鐘的離子濃度均勻擴散后，進行H+流連續(xù)測定3-5分鐘。因為每一 個液泡狀態(tài)和每一次系統(tǒng)穩(wěn)定時間都不一樣。所以在正常的測定過程中，需要等待0. 5-5 分鐘的時間不等，用以達到液泡在對照狀態(tài)(不加鹽)情況下的穩(wěn)定。而圖4a中是不同液 泡在經(jīng)過不同的等待時間，達到最后穩(wěn)定之前的0. 5分鐘的測定數(shù)據(jù)。
實驗設6次重復，結果取平均數(shù)。 在圖4a中，每一個點表示6個不同液泡在此刻測定值的平均數(shù)。
圖4b，是對圖4a中加完NaCl后所得到動力學數(shù)據(jù)的平均值。
五、結果
結果如圖4所示。 圖4a為NaCl處理后時間依賴的瞬時H+動力曲線(M3_l方法得到的液泡)。表明， 轉SeNHXl基因煙草液泡H+流由內流轉為微弱外流；而PBI煙草表現(xiàn)出液泡H+內流爭強。
圖4b為150mM NaCl處理后液泡H+流平均值統(tǒng)計(M3_l方法得到的液泡)。表 明，在NaCl處理后，對照煙草表現(xiàn)出液泡凈H+內流增加，然而轉SeNHXl煙草表現(xiàn)出液泡凈 H+內流的減少，甚至H+轉向外流達到大約0. lpmolm—2s—、 M3-2、M3-3方法得到的液泡的測定結果與M3_l方法得到的液泡的測定結果一致。
六、結果分析 為了進一步證明SIET適合于液泡H+流測定，本發(fā)明檢測了在NaCl脅迫下轉 SeNHXl基因煙草和轉PBI空載體煙草(對照)中液泡H+流的變化情況。
已有研究證明SeNHXl是一個Na7H+逆向轉運蛋白基因，轉SeNHXl基因的T0代煙 草表現(xiàn)出抗鹽性的增強。轉基因TO代植株在鹽脅迫下比對照植株具有更高的干重，更強的 光合效率；同時，表現(xiàn)出增加的Na+離子濃度、K7Na+和細胞液滲透勢。(Zhou SF，Chen XY，Zhang XG， Li YX - Improved salt tolerance in tobacco plants byco—transformationof a betaine synthesis gene BADH and a vacuolar Na+/H+antiporter gene SeNHXl.Biotechnol. Lett. 2008,30 :369-376.)。 本實驗的結果證明在NaCl處理后，對照煙草表現(xiàn)出液泡凈!1+內流增加，然而轉SeNHXl煙草表現(xiàn)出液泡凈H+內流的減少，甚至H+轉向外流達到大約0. lpmolm—2s—、同時，NaCl處理后時間依賴的瞬時H+動力曲線也表明，轉SeNHXl基因煙草液泡H+流由內流轉為微弱外流；而PBI煙草表現(xiàn)出液泡H+內流爭強。，這些結果證明轉SeNHXl基因煙草在鹽脅迫下液泡H+外流得以加強。 通過本實驗證明，SeNHXl基因轉入煙草，增強轉基因植株在鹽脅迫下H+的外流，同時偶聯(lián)著Na+離子的液泡區(qū)隔化。所得的結論與NHXl被證明的基因功能，以及之前轉SeNHXl基因煙草所得的生理證據(jù)(耐鹽，植株積累高濃度Na+，增強的細胞滲透勢)相一致。
許多研究表明，轉NHXl基因植株，例如擬南芥，番茄，多年生黑麥草等，都表現(xiàn)出抗鹽性的增強。同時，NHX1在鹽脅迫下的離子轉運功能也在體外液泡膜H+轉運系統(tǒng)中得到證明。然而，迄今還沒有在鹽脅迫下，對亞活體液泡進行實時Na+和H+流測定。本發(fā)明對被分離的處于亞活體狀態(tài)的液泡進行鹽脅迫下實時H+流變化測定，證明了 SeNHXl作為Na7H+逆向轉運蛋白，增強了轉SeNHXl基因煙草中液泡H+的外流，同時也伴隨著更多Na+在液泡中的區(qū)隔化集中。
權利要求
一種提取植物液泡的方法，包括如下步驟提取并裂解植物葉片的原生質體，得到所述植物葉片的原生質體裂解溶液，分離純化所述植物葉片的原生質體裂解溶液，得到所述植物的液泡提取液；所述分離純化所述植物葉片的原生質體裂解溶液的方法包括如下密度梯度離心步驟將所述植物葉片的原生質體裂解溶液加入到8％Ficoll-400溶液的上層，所述8％Ficoll-400溶液在下層，所述植物葉片的原生質體裂解溶液在上層，以500g-50000g的離心力離心10min-50min，收集上數(shù)第一層溶液，即為所述植物的液泡提取液；每1升所述8％Ficoll-400溶液是按照如下方法配制的將25mmol Tris、(0.4-1)mol甘露醇和80g相對分子重量為400000的聚蔗糖混合，用水定容至1升，再用HCl調節(jié)pH至7.0-7.5，得到1升所述8％Ficoll-400溶液。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述密度梯度離心步驟中，所述離心的方 式為以500g、 lOOOg或50000g的離心力離心10min、30min或50min ;所述每1升所述8% Ficoll-400溶液的配制方法中，所述甘露醇的用量為0. 4mol、 0. 5mol或lmol ;所述每1升所述8% Ficoll-400溶液的pH值為7.5。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述密度梯度離心步驟中，所述離心 的方式為:以500g的離心力離心50min，或以lOOOg的離心力離心30min，或以50000g的離 心力離心lOmin。
4. 根據(jù)權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述植物為煙草。
5. —種檢測植物液泡膜離子流的方法，包括如下步驟用掃描離子選擇電極技術檢測 植物液泡的液泡膜離子流，得到所述植物液泡的液泡膜離子流值。
6. 根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述離子流為H+流。
7. 根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述方法中，在用掃描離子選擇電極 技術檢測植物液泡的液泡膜離子流前，包括按照權利要求1-3中任一所述方法提取植物液 泡的步驟。
8. 根據(jù)權利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于所述用掃描離子選擇電極技術檢測植物液泡的液泡膜離子流的方法包括如下步驟處理蓋玻片，得到處理后的蓋玻片，將 所述植物液泡固定于所述處理后的蓋玻片上，再加入測定液，進行測定；每1升測定液是按照如下方法配制得到的將0. 05mmol的2_(N_嗎啡啉)乙磺酸、 (500-800)mmol甘露醇、0. lmmol NaCl、0. lmmol CaCl2和lOOmmol KC1混合均勻，用水定容 至1升，再用KOH調節(jié)pH至6. 8-7. 5 ;所述測定中使用的電解液由NaCl、 KH2P04和水組成，NaCl在電解液中的濃度為 (13. 5-16. 5)mM， KH2P04在電解液中的濃度為(36-44) mM，所述電解液的pH值為6. 8-7. 2。
9. 根據(jù)權利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于所述每1升測定液的配制方法中，所述甘露醇為500mmol、650mmo1或800mmo1 ;所述測 定液的pH值為6.8、7.0或7. 5 ;所述測定中使用的電解液由NaCl、腿^04和水組成，NaCl在電解液中的濃度為15mM、 13. 5mM或16. 5mM，KH2P04在電解液中的濃度為40mM、36mM或44mM，電解液的pH為6. 8、7. 0 或7. 2。
10.根據(jù)權利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于所述植物為煙草:
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測液泡膜質子流的技術。該方法包括如下步驟用掃描離子選擇電極技術檢測植物液泡的液泡膜離子流，得到所述植物液泡的液泡膜離子流值。實驗證明，通過M3分離的液泡，不僅與M2有相同的分離效果(干凈的觀測背景和較高的液泡分離效率)，更重要的是在SIET的測定中M3和M2分離的液泡都表現(xiàn)出相似的H+流測定數(shù)值和測定穩(wěn)定性(圖.2)。同時，作為從M2簡化的M3方法，比傳統(tǒng)的超速離心法M2，操作更簡單而且費用更低廉。所以，簡化的液泡提取方法作為一種替代傳統(tǒng)超速離心液泡提取方法，適合于SIET H+流測定。同時本發(fā)明方法對液泡具有非損傷性和穩(wěn)定性。另外，用本發(fā)明方法檢測到鹽脅迫下轉SeNHX1基因煙草液泡H+外流增強，驗證了SeNHX1基因的功能。綜上所述，本發(fā)明建立了適合于SIET的簡化液泡提取方法和液泡H+流檢測系統(tǒng)。
文檔編號C12N5/04GK101792730SQ201010117670
公開日2010年8月4日 申請日期2010年3月3日 優(yōu)先權日2010年3月3日
發(fā)明者李銀心, 陳顯揚 申請人:中國科學院植物研究所