專利名稱：一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1,5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法和試劑盒。
背景技術(shù)：
1，5_脫水葡萄糖醇(1，5-AG)，又名2_脫氧葡萄糖、1，5_脫水山梨醇。臨床資料表明，血清1，5-AG的監(jiān)測可確切地反映較短期內(nèi)糖尿病的控制程度，是糖尿病監(jiān)護中的良好指標。自1，5_脫水葡糖醇對糖尿病的診斷意義被臨床所認識以來，已有陰離子交換層析法、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜質(zhì)譜法(LC-MS)、吡喃糖氧化酶分析法等諸多方法應(yīng)用于血清1，5-AG的測定。前三種方法需要對1，5-AG進行衍生和復雜的樣品前處理，同時需特殊、昂貴儀器，不適合臨床常規(guī)分析。吡喃糖氧化酶分析法雖好，但測定試劑的穩(wěn)定性普遍較差，難以在臨床推廣應(yīng)用。申請者研究發(fā)現(xiàn)，要開發(fā)穩(wěn)定的液體型血清1，5_AG吡喃糖氧化酶法測定試劑， 應(yīng)重點建立一種快速清除高濃度葡萄糖的方法，以消除葡萄糖對1，5-AG測定的干擾。 Fukumura Y (Clin Chem，1994，40 :2013_2016·)、陳國軍(中華醫(yī)學檢驗雜志，1999，22 (6) 358-361.)、第一化學藥品株式會社(中國專利申請?zhí)?7126042. 7)武漢埃克瑪生物技術(shù)有限公司(中國專利申請?zhí)?9116563. 2)等在測定1，5-AG時，將葡萄糖通過酶法途徑轉(zhuǎn)化為 6_磷酸葡萄糖，但生成的6-磷酸葡萄糖在丙酮酸激酶等含量不足時可重新轉(zhuǎn)化為葡萄糖， 即使引入ATP再生系統(tǒng)也無法避免葡萄糖對1，5-AG測定的干擾。馮景(檢驗醫(yī)學，2005， 20(6) :551-514.)等將葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與吡喃糖氧化酶反應(yīng)的6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，該酶法轉(zhuǎn)化途徑需要高濃度的三磷酸腺苷(ATP)以確保葡萄糖向6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過程中生成的二磷酸腺苷(ADP)對該轉(zhuǎn)化途徑存在反饋抑制，不利于高濃度的葡萄糖清除， 另外實驗發(fā)現(xiàn)該測定試劑存儲過程中ATP的逐步分解直接導致葡萄糖清除能力的降低，從而給制備液體型穩(wěn)定試劑帶來困難。協(xié)和梅迪克斯株式會社(中國專利申請?zhí)?9124799. X)在將葡萄糖轉(zhuǎn)化為果糖-1，6-二磷酸，同時使1，5_脫水葡糖醇轉(zhuǎn)化為1，5_脫水葡糖醇_6磷酸，然后再用1，5-脫水葡糖醇-6磷酸脫氫酶系對1，5-脫水葡糖醇-6磷酸進行定量測定。由于吡喃糖氧化酶對1，5_脫水葡糖醇-6磷酸不產(chǎn)生任何氧化作用，因此該葡萄糖消除方法無法應(yīng)用于1，5-脫水葡糖醇的吡喃糖氧化酶法測定。本發(fā)明的目的是為了解決上述技術(shù)的不足，建立一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法。在測定血清1，5-AG前，將葡萄糖轉(zhuǎn)化為不與吡喃糖氧化酶反應(yīng)的6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯，并使反應(yīng)中生成的ADP在PEP的存在下經(jīng)PK 作用重新轉(zhuǎn)化為ATP，體系中僅需0. 5mmol/LATP就可使60mmol/L的葡萄糖在180s內(nèi)完全轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯。依據(jù)該法構(gòu)建的葡萄糖清除試劑置2-8°C保存可穩(wěn)定14個月， 可以應(yīng)用于目前廣泛使用的臨床生化自動分析儀，從而達到大規(guī)模測定樣本的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的快速清除高濃度葡萄糖的方法?！N適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的快速清除高濃度葡萄糖的方法，包括配制PH6. 0-9.0的2-瑪啡琳乙基磺酸(MES)緩沖液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)和ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清樣本，并于20_50°C 反應(yīng)3-5分鐘。其中血清樣本和葡萄糖清除試劑的體積比控制在1/10-1/200，可以獲得很好的測試結(jié)果。在ATP存在下，GK將Glu轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同時生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD進一步把G6P轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯(G6PL)；反應(yīng)中生成的ADP在PEP的存在下經(jīng)PK作用重新轉(zhuǎn)化為ATP。上述反應(yīng)后可加入含4-氨基安替比林(4-AAP)、PR0D、過氧化物酶(服 )、3-羥基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA)的顯色劑進行顯色。所述顯色劑中各組分的最適含量為4-氨基安替比林(4-AAP)2mmol/L、PROD 50KU/ L、過氧化物酶(HRP)6KU/L和3-羥基-2，4，6-三溴苯甲酸(TBHBA) 2. Ommol/L0用于本發(fā)明吡喃糖氧化酶法測定血清1，5_脫水葡糖醇的測定方法為兩點終點法，使用的儀器為日立7080生化分析儀等類型全自動生化分析儀。用于實現(xiàn)以上方法的葡萄糖清除試劑的主要物質(zhì)為2_瑪啡琳乙基磺酸(MES) 緩沖液、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)和三磷酸腺苷(ATP)組合。上面所述的各主要物質(zhì)最適濃度為pH6. 0-9. OMES緩沖液為20-2000mmol/L、GK 為 1-50KU/L、G6PD 為 5-200KU/L、NADP 為 5_60mmol/L、PK 為 0. 5-20KU/L、PEP 為 l_3mmol/ L、ATP 為 0. 2-2mmol/L、血清樣本中的 Glu 為 0_60mmol/L。本發(fā)明所述的葡萄糖清除方法與Fukumura Y等(方法1)、馮景(方法2)等所描述的方法葡萄糖清除方法相比較結(jié)果見表1。表權(quán)利要求
1.一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法， 其特征在于配制PH6. 0-9. 0的2-瑪啡琳乙基磺酸(MES)緩沖液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)和ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清樣本，在ATP存在下，GK將Glu轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同時生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下， G6PD進一步把G6P轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯(G6PL)；反應(yīng)中生成的ADP在PEP的存在下經(jīng)PK作用重新轉(zhuǎn)化為ATP。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5_脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法，其特征在于用于實現(xiàn)上述方法的葡萄糖清除試劑的主要物質(zhì)為 2-瑪啡琳乙基磺酸(MES)緩沖液、葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)和三磷酸腺苷 (ATP)組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5_脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法，其特征在于測試溫度控制在20-50°C，時間控制在3-5分鐘，血清樣本和葡萄糖清除試劑的體積比控制在1/10-1/200。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5_脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法，其中葡萄糖清除試劑的主要物質(zhì)的最適濃度為PH6. 0-9. OMES緩沖液為 20-2000mmol/L、GK 為 1-50KU/L、G6PD 為 5-200KU/L、NADP 為 5_60mmol/L、PK 為 0. 5-20KU/L, PEP 為 l_3mmol/L、ATP 為 0. 2_2mmol/L、血清樣本中的 Glu 為 0_60mmol/L。
5.一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除的試劑盒，該試劑盒含有PH6. 0-9. 0的2-瑪啡琳乙基磺酸(MES)緩沖液，該緩沖液包含一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)和ATP。
6.權(quán)利要求5所述的試劑盒，其中各組分的最適濃度為pH6.0-9. OMES緩沖液為 20-2000mmol/L、GK 為 1_50KU/L、G6PD 為 5_200KU/L、NADP 為 5_60mmol/L、PK 為 0. 5-20KU/ L、PEP 為 l-3mmol/L、ATP 為 0. 2_2mmol/L、血清樣本中的 Glu 為 0_60mmol/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種適用于吡喃糖氧化酶法測定血清1，5-脫水葡糖醇的高濃度葡萄糖清除方法，包括配制pH6.0-9.0的2-瑪啡琳乙基磺酸(MES)緩沖液，其中含有一定量的葡萄糖激酶(GK)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)、丙酮酸激酶(PK)、磷酸烯醇式丙酮酸鹽(PEP)、ATP，加入含葡萄糖(Glu)的血清樣本，并于20-50℃反應(yīng)3-5分鐘。在ATP存在下，GK將Glu轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸(G6P)，同時生成二磷酸腺苷(ADP)；在NADP+存在下，G6PD進一步把G6P轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖內(nèi)酯(G6PL)；反應(yīng)中生成的ADP在PEP的存在下經(jīng)PK作用重新轉(zhuǎn)化為ATP。依據(jù)該法構(gòu)建的葡萄糖清除試劑置2-8℃保存可穩(wěn)定14個月，可以應(yīng)用于目前廣泛使用的臨床生化自動分析儀。
文檔編號C12Q1/48GK102382875SQ20111032452
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月22日
發(fā)明者商純爾, 陳青松 申請人:浙江夸克生物科技有限公司