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具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑及其制備方法

文檔序號:9241853閱讀:486來源:國知局
具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域,涉及間充質(zhì)干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的轉(zhuǎn)化應(yīng)用, 具體涉及具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑及 其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢早衰,是指已建立規(guī)律月經(jīng)的婦女,40歲以前,由于卵巢功能衰退而出現(xiàn)持 續(xù)性閉經(jīng)和性器官萎縮,常有促性腺激素水平的上升和雌激素的下降,40歲前卵巢早衰的 發(fā)病率約為1%~3%,而30歲內(nèi)的發(fā)病率約為0.1%。臨床表現(xiàn)伴有不同程度的潮熱多汗、 失眠多夢、煩躁易怒、心悸、疲乏、情緒緊張、陰道干澀、性功能低下、不孕不育、提前閉經(jīng)等 絕經(jīng)前后癥狀,使患者未老先衰,如果得不到及時(shí)的調(diào)整和治療,可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、心腦血 管疾病等慢性病的出現(xiàn),直接影響女性生活質(zhì)量,嚴(yán)重影響女性的正常工作,同時(shí)給其身心 健康和夫妻生活帶來極大痛苦。
[0003] 圍絕經(jīng)期綜合征出現(xiàn)的根本的原因是由于生理性或病理性或手術(shù)而引起的卵巢 功能衰竭。卵巢功能一旦衰竭或被切除和破壞,卵巢分泌的雌激素就會減少。女性全身有 多種雌激素受體,分布在幾乎女性全身所有的組織和器官,接受雌激素的控制和支配,一旦 雌激素減少,就會引發(fā)器官和組織的退行性變化,出現(xiàn)一系列的癥狀。由此可見,卵巢早衰 會引發(fā)圍絕經(jīng)期綜合征,治療卵巢早衰可以同時(shí)有利于治療圍絕經(jīng)期綜合征。卵巢早衰,其 病因迄今尚不清楚,所以對該病的研宄已成為國內(nèi)外生殖發(fā)育界的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。目前,國內(nèi) 外研宄多認(rèn)為卵巢早衰與遺傳、免疫、代謝以及醫(yī)源性等因素有關(guān)。已有研宄資料顯示染色 體突變,促卵泡生成素(FSH)促黃體生成素(LH)及其受體變異,代謝異常,藥物作用, 放化療損傷,病毒感染,免疫性以及其他高危因素如吸煙、抑郁等因素可能是其原因,這些 因素或使卵巢先天性卵細(xì)胞數(shù)目減少,或使其卵泡閉鎖加速,或被直接破壞,使卵泡過早衰 竭,對于卵巢早衰的治療現(xiàn)代醫(yī)學(xué)一般采用激素替代治療法。但卵巢早衰治療比較困難,西 醫(yī)臨床上采用激素替代療法,需要在大夫的指導(dǎo)下使用雌孕激素;研宄表明該雌激素和孕 激素治療的時(shí)候,有一定的作用,可以改善癥狀,但對卵巢功能的恢復(fù)并不理想,同時(shí)停藥 之后癥狀重新出現(xiàn),使卵巢處于依賴狀態(tài),有導(dǎo)致卵巢功能更差的可能,也就是說激素替代 療法僅僅起到了治標(biāo)的作用,而且這種方法副作用大,長期使用外源性激素有導(dǎo)致子宮內(nèi) 膜癌變的危險(xiǎn),并增加冠心病以及膽囊病的發(fā)病率。因此,該激素治療的效果不理想,同時(shí) 存在安全隱患。
[0004] 近年來,隨著基因治療和干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展,采用干細(xì)胞技術(shù)來代替激素的療法 愈來愈被關(guān)注;目前,存在有采用靜脈回輸間充質(zhì)干細(xì)胞/細(xì)胞因子,或采用經(jīng)腹部有創(chuàng) 介入腹腔鏡下卵巢原位注射間充質(zhì)干細(xì)胞/細(xì)胞因子的方法治療卵巢早衰,取得一定的療 效,但是該療效不是很理想,有效率低,具體表現(xiàn)在: 首先,靜脈回輸間充質(zhì)干細(xì)胞容易粘附成團(tuán),未經(jīng)過濾輸入易造成肺靜脈栓塞,表現(xiàn)為 呼吸急促、紫紺、躁動和驚厥等,也有造成心腦血管卒中偏癱的案例; 其次,雖然間充質(zhì)干細(xì)胞是低免疫原性,不表達(dá)或低表達(dá)II類抗原,但多次靜脈輸入 間充質(zhì)干細(xì)胞,仍有一定比例產(chǎn)生白細(xì)胞抗體,與輸入細(xì)胞的量/次成正比,抗原抗體反應(yīng) 可導(dǎo)致低熱、疲乏、呼吸窘迫等反應(yīng),靜脈輸入細(xì)胞或因子,歸巢的量有限,也一定程度影響 了療效。
[0005] 介入療法一般要在腹部開口,腹腔鏡下介入導(dǎo)管到血管或病變局部,一次性介入 療效有限,多次介入反復(fù)給患者帶來醫(yī)源性創(chuàng)傷,不能接受,不易普及。
[0006] 因此,到目前為止,還沒有確切有效的方法能恢復(fù)卵巢的功能,所以卵巢早衰病因 復(fù)雜、治療難度較大,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)迄今尚未取得突破進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供一種具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充 質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑,解決了目前的卵巢早衰和圍絕經(jīng)期綜合征治療用藥物吸收率 低、療效有限及使用時(shí)造成的創(chuàng)傷大的問題。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的是提供上述具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間 充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑的制備方法。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用的技術(shù)方案是: 一種具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑,是 由臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子和用于承載所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其 細(xì)胞因子的透明質(zhì)酸鹽組成的混懸液;該透明質(zhì)酸鹽無免疫原性,廣泛存在于人體結(jié)締組 織中,有一定的抗炎作用和藥物緩釋作用,無細(xì)胞毒性; 所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子與透明質(zhì)酸鹽的體積比為1:1~3 ; 所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度為〇. 5X 107~5X 107個/ml,所述透明質(zhì)酸鹽的 終濃度為〇. 〇1~〇. 1%。
[0010] 在上述技術(shù)方案中,所述透明質(zhì)酸鹽的分子量為30~300萬道爾頓。
[0011] 在上述技術(shù)方案中,所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子是人的傳代培養(yǎng) 8代以內(nèi)的異體臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子;更優(yōu)選的是,所述間充質(zhì)干細(xì)胞 及其細(xì)胞因子是來源于檢測合格的健康產(chǎn)婦的胎盤或新生兒的臍帶,將所述胎盤或臍帶經(jīng) 組織培養(yǎng)法培養(yǎng)獲得原代間充質(zhì)干細(xì)胞,再將原代間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)至8代以內(nèi), 收集間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子,凍存待用;其中,采用胎盤或臍帶作為間充質(zhì)干細(xì)胞及其 細(xì)胞因子的來源,是因臍帶的增殖能力更強(qiáng),胎盤分泌細(xì)胞因子的能力更強(qiáng)。
[0012] 上述具有卵巢早衰及圍絕經(jīng)期綜合征治療作用的間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制 劑,包括: 制備臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子; 將所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子與透明質(zhì)酸鹽按照所述比例混勻,制 得;所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的終濃度為〇.5X107~5X107個/ml,所述透明質(zhì)酸鹽的 終濃度為〇. 〇1~〇. 1%。
[0013] 在上述技術(shù)方案中,所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法為: 臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備:取志愿、健康合格、產(chǎn)后24~72小時(shí)的冷藏新生兒臍 帶,浸泡消毒后,剪切成3~4cm的小段,用止血鉗去除每段臍帶中的血管(一根靜脈兩根動 脈),將臍帶組織塊與組織皮面分離,浸泡清洗后,將臍帶組織塊煎成3~4_3的塊狀,浸泡清 洗,2000rpm離心3min,棄上清,將得到的臍帶組織按0. 5g/瓶的質(zhì)量濃度接種到T175培養(yǎng) 瓶中,再在培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清,搖勻,于37 °C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 培養(yǎng)至第5天和第8天時(shí)分別換培養(yǎng)液,2周后,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40~80%時(shí),加入胰酶首 次消化傳代,換用無血清培養(yǎng)基,收集第3~8代間充質(zhì)干細(xì)胞,凍存?zhèn)溆谩?br>[0014] 胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的制備:取志愿、健康合格、產(chǎn)后24~72小時(shí)的冷藏胎 盤,用止血鉗剝離覆蓋在胎盤絨毛板表面的羊膜組織后,再用精細(xì)剪從胎盤上剪取足量的 胎盤絨毛膜組織塊,清洗后,用組織鑷剔除上述胎盤絨毛膜組織塊上的血管組織和滋養(yǎng)層 組織,再次清洗后,用彎窄頭精細(xì)剪將剔除后的胎盤絨毛膜組織塊煎成3~5_ 3大小的組織 塊,2000rpm離心5min,棄上清,將得到的胎盤絨毛膜組織按lg/瓶的質(zhì)量濃度接種到T175 培養(yǎng)瓶中,再在培養(yǎng)瓶中加入DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清,搖勻,于37°0、5%〇) 2培養(yǎng)箱中 培養(yǎng),5天后首次換液,2周后,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到40%~80%時(shí)傳代,換用無血清培養(yǎng)基,收集 3~8代間充質(zhì)干細(xì)胞,凍存?zhèn)溆谩?br>[0015] 在上述技術(shù)方案中,所述臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞因子的制備方法為: 將臍帶或胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞傳至第3~8代后,加入胰酶消化再次傳代,待細(xì)胞融合度 到達(dá)60%~70%時(shí),采用1%~10%02低氧培養(yǎng),或者換培養(yǎng)液撤去胎牛血清饑餓培養(yǎng),72小時(shí)后 收集培養(yǎng)基上清,限外過濾除去小分子物質(zhì)后,凍存待用。
[0016] 在上述技術(shù)方案中,所述間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑為用于局部靶向注射的 間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子制劑;在本發(fā)明的技術(shù)方案中,該間充質(zhì)干細(xì)胞及其細(xì)胞因子 制劑的使用方法為局部靶向注射; 在上述
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