一種治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL)是一種起源于淋巴細(xì)胞的B系或T系細(xì)胞在骨髓內(nèi)異 常增生的惡性腫瘤性疾病。異常增生的原始細(xì)胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同時(shí) 也可侵及骨髓外的組織，如腦膜、淋巴結(jié)、性腺、肝等。我國(guó)曾進(jìn)行過(guò)白血病發(fā)病情況調(diào)查， ALL發(fā)病率約為0.67/10萬(wàn)。在油田、污染區(qū)發(fā)病率明顯高于全國(guó)發(fā)病率。ALL兒童期（0~ 9歲）為發(fā)病高峰，可占兒童白血病的70%以上。ALL在成人中占成人白血病的20%左右。
[0003]Ph染色體是由第9號(hào)和第22號(hào)染色體易位t (9 ;22) (q34 ;qll)，導(dǎo)致bcr-abl融 合基因的形成，編碼具有高酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，通過(guò)激活下游多條生長(zhǎng) 信號(hào)通路，使造血細(xì)胞不依賴(lài)于造血刺激因子而生長(zhǎng)、增殖，并且抵抗凋亡，最終發(fā)生惡性 轉(zhuǎn)化而發(fā)生白血病。Ph+急性淋巴細(xì)胞白血?。≒h+ALL)見(jiàn)于2%~5%兒童和20%~30% 成人急性淋巴細(xì)胞白血病，年齡超過(guò)50歲者甚至高達(dá)50 %。
[0004] BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑（TKI)是Ph+白血病治療的里程牌，伊馬替尼是首個(gè)獲 準(zhǔn)上市的選擇性BCR-ABL酪氨酸激酶抑制劑。TKI問(wèn)世以前，Ph+ALL預(yù)后極差，盡管誘導(dǎo)化 療的完全緩解率CR達(dá)60 %~90 %，但CR持續(xù)時(shí)間僅為9~16個(gè)月，單純化療5年生存率 僅10 - 20 %。異基因造血干細(xì)胞移植是根治Ph+ALL的手段，但卻明顯受限于供體的獲得及 移植相關(guān)的高死亡率。雖然TKI顯著改善了 Ph+ALL的預(yù)后，TKI與化療聯(lián)合使初治Ph+ALL 的完全緩解率達(dá)90%以上，但緩解持續(xù)時(shí)間短，復(fù)發(fā)率很高。而在復(fù)發(fā)、難治的Ph+ALL，伊 馬替尼僅能使19%的患者獲得完全血液學(xué)緩解，療效持續(xù)時(shí)間2-3月，中位生存時(shí)間4. 9-9 個(gè)月。耐藥是伊馬替尼在Ph+ALL中療效不持久的最重要因素。第二代酪氨酸激酶抑制劑 達(dá)沙替尼、尼羅替尼等雖然可以在一定程度上克服伊馬替尼耐藥，迅速改善患者的血液學(xué)、 遺傳學(xué)指標(biāo)，完全緩解率達(dá)90%以上，但還是因?yàn)槟退幊霈F(xiàn)使得緩解期也很短暫。
[0005] 病毒唑，病毒唑又名利巴韋林、三氮唑核苷、尼斯可等，是廣譜強(qiáng)效的抗病毒藥物， 目前廣泛應(yīng)用于病毒性疾病的防治，未見(jiàn)將其與伊馬替尼聯(lián)合使用的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物，以克服單 獨(dú)使用伊馬替尼藥效不佳的缺陷。
[0007] 本發(fā)明提供了一種治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物，它含有相同或不同規(guī) 格單位制劑的用于同時(shí)或者分別給藥的病毒唑和伊馬替尼，以及藥學(xué)上可接受的載體。所 述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑1~500摩爾份，伊馬替尼0. 001~10摩爾份。
[0008] 單位制劑是指片劑的每片、膠囊劑的每粒、口服液的每毫升，注射劑的每瓶等。
[0009] 規(guī)格是指片劑的每片、注射劑或滴眼劑的每支、膠囊劑或栓劑的每?；蚱渌恳?個(gè)單位制劑中含有主藥的重量（或效價(jià)）或含量（％ )或裝量。
[0010] 優(yōu)選地，所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑10~30摩爾份，伊馬替尼 0. 001~10摩爾份。
[0011] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑10~20摩爾份，伊馬替 尼0. 001~10摩爾份。
[0012] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑30摩爾份，伊馬替尼1摩 爾份或10摩爾份。
[0013] 所述制劑為口服制劑。所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
[0014] 本發(fā)明還提供了病毒唑和伊馬替尼在制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥 物中的用途。
[0015] 所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑1~500摩爾份，伊馬替尼0. 001~10 摩爾份。
[0016] 優(yōu)選地，所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑10~30摩爾份，伊馬替尼 0. 001~10摩爾份。
[0017] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑10~20摩爾份，伊馬替 尼0. 001~10摩爾份。
[0018] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑30摩爾份，伊馬替尼1摩 爾份或10摩爾份。
[0019] 所述制劑為口服制劑。所述口服制劑是膠囊劑、片劑。
[0020] 其中，所述治療急性淋巴細(xì)胞白血病的藥物是治療Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病的藥 物。
[0021] 本發(fā)明病毒唑與伊馬替尼的聯(lián)合用藥物對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病的療效佳，特別是 對(duì)Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病有良好療效，并且本發(fā)明聯(lián)合用藥物中的兩個(gè)組分聯(lián)合使用可 以發(fā)揮協(xié)同增效作用，臨床應(yīng)用前景良好。
[0022] 下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但是并不是對(duì)本發(fā)明的限 制，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述 基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1病毒唑單用或與病毒唑伊馬替尼聯(lián)合作用于Ph+淋巴細(xì)胞株的抗白血病作用 的結(jié)果。A.不同濃度（30、60、90、120yM)的病毒唑分別作用于SUP-B15細(xì)胞持續(xù)24、48、 72、96h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，圖中顯示的是細(xì)胞的生存率。B. 1 yM的伊馬替尼單獨(dú)以及 分別與10 u M或20 y M病毒唑聯(lián)合作用于SUP-B15細(xì)胞72h，圖中顯示了不同處理下的伊馬 替尼的IC50值。
[0024] 圖2病毒唑單用以及聯(lián)合伊馬替尼對(duì)SUP-B15細(xì)胞株的促凋亡作用的結(jié)果。 A. 60yM病毒唑分別作用于SUP-B15細(xì)胞24、48、7211，用流式分析&111^^11^411'(：和？1雙染 法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。PBS作為陰性對(duì)照。B. 30 y M和60 y M病毒唑分別作用于SUP-B1548h 后的細(xì)胞凋亡率。C. 1 y M伊馬替尼、30 y M病毒唑單獨(dú)以及聯(lián)合作用于SUP-B15細(xì)胞48h 后的細(xì)胞凋亡率。
[0025] 圖3病毒唑可抑制SUP-B15細(xì)胞株的mT0R/eIF4E和MEK/ERK/Mnkl/eIF4E信號(hào)通 路表達(dá)結(jié)果。A. SUP-B15細(xì)胞被不同濃度（30、60、90yM)的病毒唑作用48h后，提取蛋白， western bolt檢測(cè)mT0R/eIF4E信號(hào)通路以及Mcl-1的表達(dá)。B. SUP-B15細(xì)胞被60yM病 毒唑分別作用24、48、72h后，用western bolt檢測(cè)mT0R/eIF4E信號(hào)通路以及Mcl-1的表 達(dá)。C. SUP-B15細(xì)胞被病毒唑（30yM)、伊馬替尼（10yM)單獨(dú)作用以及30yM病毒唑聯(lián) 合10yM伊馬替尼作用48h后，用western bolt檢測(cè)mT0R/eIF4E信號(hào)通路以及Mcl-1的 表達(dá)。D. SUP-B15細(xì)胞被病毒唑（30yM)、伊馬替尼（10yM)單獨(dú)作用以及30yM病毒唑聯(lián) 合10 y M伊馬替尼作用48h后，用western bolt檢測(cè)MEK/ERK/Mnkl/eIF4E信號(hào)通路以及 Mcl-1的表達(dá)。
[0026] 圖4病毒唑單用以及聯(lián)合伊馬替尼可抑制SUP-B15細(xì)胞株eIF4F復(fù)合物的合 成的結(jié)果。A. SUP-15細(xì)胞被病毒唑（30yM)、伊馬替尼（10yM)單用或兩者聯(lián)合作用 48h。用500 yl RIPA裂解液裂解1X107個(gè)細(xì)胞，離心所得總蛋白的一半上清液中加入 7m-GTP_Sepharose beads (GE Healthcare)解育 l_2h，離心所得beads 中加入 50ul SDS-PAG 上樣緩沖液，煮沸7分鐘，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用一抗eIF4G、eIF4E和 4E-BP1進(jìn)行免疫印跡。GAPDH作為內(nèi)參水平。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明聯(lián)合用藥物治療急性淋巴細(xì)胞白血病的作用
[0028] 1?實(shí)驗(yàn)材料
[0029] 1. 1細(xì)胞株
[0030] SUP-B15人類(lèi)Ph+急性淋巴細(xì)胞細(xì)胞株，表達(dá)P190BCR-ABL融合基因（the American Type Culture Collection, CRL-1929)
[0031] 各類(lèi)急性白血病及慢性粒細(xì)胞白血病原代細(xì)胞（Ph+ALL，Ph_ALL，AML，CML):均來(lái) 自四川大學(xué)華西醫(yī)院血液科，采集外周血及骨髓標(biāo)本前得到書(shū)面同意并獲得醫(yī)院倫理委員 會(huì)的通過(guò)和批準(zhǔn)。收集分離方法：選取符合納入標(biāo)準(zhǔn)的急性白血病患者，于無(wú)菌條件下抽 取外周血或骨髓3-4ml于肝素抗凝的無(wú)菌試管中。取15ml無(wú)菌離心管，將所取外周血加入 等體積無(wú)菌PBS溶液中，按1:1比例稀釋。另取一只15ml無(wú)菌離心管，預(yù)先加入等體積人 淋巴細(xì)胞分離液，將稀釋后的外周血沿管壁緩慢加入淋巴細(xì)胞分離液試管內(nèi)，使二者形成 清晰界面，以2000RPM(每秒2000轉(zhuǎn)）離心25min。取出離心管，吸取中間層單個(gè)核細(xì)胞， 置于另一離心管中，PBS洗滌細(xì)胞2次，1000RPM離心5min，棄去上清，用10%胎牛血清的 RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。
[0032] 1. 2實(shí)驗(yàn)藥物
[0033] 伊馬替尼（IM):諾華制藥有限公司
[0034]病毒挫（RIB) :sigma 公司
[0035] 1. 3實(shí)驗(yàn)試劑
[0036] 小牛血清、青鏈霉素、RPMI 1640、MDM培養(yǎng)基為hyclo公司產(chǎn)品；MTT為sigma 公司產(chǎn)品；十二烷基硫酸鈉（SDS)為Sigma公司產(chǎn)品，異丁醇、濃鹽酸為天津天大化學(xué)試 劑廠產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為T(mén)hermo公司產(chǎn)品；RIPA buffer為碧云天公司產(chǎn)品；人 淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll液）為天津?yàn)?yáng)公司產(chǎn)品；一抗：P-AKT(S473)、p-mT0R(S2448)、 P-4EBP1 (T37/46)、p-eIF4E (S209)、p-cRaf (Ser338)、p-MEKl/2 (Ser217/221)，p-ERKl/2 (T hr202/Tyr204)、p-Mnkl(Thrl97/202)、p-Lyn(Tyr396)、Mcl-1、AKT、mT0R、4E-BPl、eIF4E、MEK、Mnkl、CyclinD1(美國(guó)CellSignalingTechnology公司），GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記的二抗購(gòu)自碧云天公司。
[0037] 1. 4實(shí)驗(yàn)儀器
[0038] 超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備公司
[0039] 0)2恒溫培養(yǎng)箱：ThermoHEPACLASS100,芬蘭
[0040]低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：S0RVALLLEGENDMACH1. 6R
[0041] 普通光學(xué)顯微鏡：0LYMPUS，日本
[0042] 96孔板：Corning公司，美國(guó)
[0043] -8〇°C冰箱：Heraeus，美國(guó)
[0044] 凝膠成像儀：Bio-rad公司，美國(guó)
[0045]全自動(dòng)酶標(biāo)儀：ThermoMultiscanSpectrum，芬蘭
[0046] -20°C冰箱BCD-287F為青島海爾公司產(chǎn)品
[0047] 15ml離心管為美國(guó)BD公司產(chǎn)品
[0048] 2?實(shí)驗(yàn)方法
[0049] 2. 1病毒唑單用或與病毒唑伊馬替尼聯(lián)合作用于Ph+淋巴細(xì)胞株的抗白血病作用
[0050] 細(xì)胞株每個(gè)孔加5 X 104個(gè)細(xì)胞，原代細(xì)胞每個(gè)孔5 X 10 5個(gè)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入