化合物Hu-17單獨(dú)或聯(lián)合鉑類藥物在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，更具體地講，本發(fā)明涉及化合物HU-17單獨(dú)或聯(lián)合鉑 類藥物在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，發(fā)病率位于婦科惡性 腫瘤第三位，死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤第一位（Agarwal R, Kaye SB. Nat Rev Cancer，2003,3(7):502-516.)。卵巢癌的發(fā)生也是與激素水平密切相關(guān)的。盡管 過去二十年卵巢癌的治療得到很大的改善，但是當(dāng)前其5年生存率仍然不超過30% (Bast RC, Hennessy B, Mills GB. Nature Reviews Cancer, 2009, 9 (6):415-428. )〇 臨 床上治療卵巢癌采用的是手術(shù)切除并輔助化療的綜合治療方法，紫杉醇與順鉑（或卡 鉬）聯(lián)合化療是卵巢癌治療的標(biāo)本化療方案（Jelovac D, Armstrong DK.CA Cancer J Clin, 2011,61 (3) : 183-203.) 〇
[0003] 順鉑進(jìn)入細(xì)胞后能與DNA、RNA以及蛋白結(jié)合，它的細(xì)胞毒性來源于與DNA結(jié)合 后形成的DNA加合物，加合物的形成引起DNA損傷并激活下游一系列信號(hào)通路最終誘導(dǎo) 腫瘤細(xì)胞凋亡或壞死。目前關(guān)于順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的確切機(jī)制還不完全清楚，但有研宄 表明順鉑介導(dǎo)的c-Ab 1和JNK/SAPK通路的激活參與了順鉑誘導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路（Nehm6 A，Baskaran R，Aebi S，et al.Cancer research，1997,57(15):3253_3257.);此外，順鉬引 起的DNA斷裂能誘導(dǎo)P53的產(chǎn)生并激活凋亡的內(nèi)源通路（Niedner H, Christen R, Lin X，et al. Molecular pharmacology, 2001，60 (6) : 1153-1160.)。紫杉醇的藥效作用機(jī)制主要是 它能與細(xì)胞內(nèi)的微管蛋白（tubulin)結(jié)合，穩(wěn)定了微管結(jié)構(gòu)進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻 滯最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡（Wang LG, Liu XM，Kreis W，et al.Cancer chemotherapy and pharmacology, 1999, 44(5) : 355-361.)。鉬類藥物（順鉬或卡鉬）與紫杉醇藥物的聯(lián)合化 療在卵巢癌的治療初期取得了較好的療效（Covens A, Carey M, Bryson P，et al. Gynecol Oncol, 2002, 85 (1) : 71-80. )，80%的卵巢癌患者對(duì)聯(lián)合化療有反應(yīng)，但患者中位無進(jìn)展生 存期仍僅有18個(gè)月，并且20% -30%的卵巢癌患者對(duì)初始的聯(lián)合化療治療無顯著療效 (Judson PL, Watson JM，Gehrig PA，et al.Cancer research，1999,59(10):2425-2432.)〇 [0004] 當(dāng)前，對(duì)順鉑和紫杉醇的耐藥機(jī)制已有大量研宄和報(bào)道。順鉑的耐藥機(jī)制主要包 括：減弱的腫瘤血管流動(dòng)、細(xì)胞外基質(zhì)的影響、細(xì)胞內(nèi)順鉑含量積累的減少（吸收減少或外 泵增加、細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽的減毒作用、增加的DNA修復(fù)、增強(qiáng)的DNA損傷耐受、促凋亡因子 的減少、熱休克蛋白含量的增加以及細(xì)胞信號(hào)通路的改變（Stewart DJ.Crit Rev Oncol Hematol，2007, 63 (1) : 12-31.)。順鉑與DNA結(jié)合能激活堿基錯(cuò)配修復(fù)通路，該通路的激活 能啟動(dòng)順鉑引起的細(xì)胞凋亡，有研宄報(bào)道錯(cuò)配修復(fù)機(jī)制發(fā)生缺陷與順鉑耐藥密切相關(guān)（Lin X，Howell SB. Molecular pharmacology, 1999, 56 (2): 390-395. )。P53 作為抑癌基因，在腫 瘤發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要的角色，DNA損傷時(shí)，P53被誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)而引起細(xì)胞周期阻滯 或誘導(dǎo)損傷的細(xì)胞發(fā)生凋亡。臨床數(shù)據(jù)顯示，60% -80%的卵巢癌中含有P53的突變或缺 失（Bast RC，Hennessy B, Mills GB.Nature Reviews Cancer, 2009,9(6): 415-428.)，而 P53 的缺失或突變均能引起順鉬耐藥（Perego P，Giarola M，Righetti SC, et al. Cancer research, 1996, 56(3) :556-562.)。還有研宄報(bào)道，在順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞中，順鉑誘導(dǎo)的 JNK激活以及P38激酶的活化均明顯下降，刺激JNK通路能激活c-Jun使耐藥細(xì)胞對(duì)順鉑敏 感，說明削弱的JNK/c-Jun通路與順鉬的耐藥相關(guān)（Brozovic A，F(xiàn)ritz G，Christmann M，et al.International journal of cancer, 2004, 112(6):974-985.)〇
[0005] 對(duì)于一線治療方案失敗的患者，拓?fù)涮婵?、阿霉素、依托泊苷以及吉西他濱等 作為二線治療藥物被用于耐藥的卵巢癌患者的治療（Markman M, Bookman MA.Oncologi st, 2000, 5(1) : 26-35.) 〇
[0006] 鉑類藥物（順鉑或卡鉑）清除卵巢癌細(xì)胞的作用機(jī)制主要是通過P53及JNK等分 子發(fā)揮作用，臨床資料顯示，約60% -80%的卵巢癌患者含有P53基因的突變或缺失，該基 因的突變或缺失直接削弱了以鉑類為基礎(chǔ)的化療療效；另外，還有約30%的卵巢癌患者對(duì) 鉑類藥物與紫杉醇類藥物結(jié)合的治療方法不敏感；同時(shí)，常規(guī)治療方法在有效劑量范圍內(nèi) 對(duì)機(jī)體能造成較大的傷害，如順鉑引起的較強(qiáng)的腎毒性和耳毒性。耐藥復(fù)發(fā)問題是腫瘤治 療中常發(fā)生的問題，基于當(dāng)前的治療藥物對(duì)耐藥復(fù)發(fā)的卵巢癌的治療效果并不顯著，研發(fā) 新型的化合物，特別是針對(duì)耐藥復(fù)發(fā)的卵巢癌的藥物仍然是醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域急需解決的問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供化合物Hu-17在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供化合物Hu-17與鉑類藥物聯(lián)合用藥在制備治療卵 巢癌藥物中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供化合物Hu-17在制備血管生成相關(guān)因子和金屬蛋 白酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供化合物HU-17與鉑類藥物聯(lián)合用藥在制備血管生 成相關(guān)因子和金屬蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明的第五個(gè)目的在于提供化合物HU-17在制備性激素抑制劑中的應(yīng)用。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)以上第一個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：化合物Hu-17在制備治療卵 巢癌藥物中的應(yīng)用，所述Hu-17分子式：C 63H96N40n，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0013]
[0014] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第二個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：化合物Hu-17與鉑類藥物 聯(lián)合用藥在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，所述鉑類是指順鉑或卡鉑，所述Hu-17分子式： C63H96N40n，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0015]
[0016] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第三個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：化合物Hu-17在制備血管 生成相關(guān)因子和金屬蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用，所述血管生成相關(guān)因子和金屬蛋白酶包括 VEGF a、TOGF a、EGF-2和MMP2,所述Hu-17分子式：C63H96N40 n，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0017]
[0018] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第四個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：化合物Hu-17與鉑類藥物 聯(lián)合用藥在制備血管生成相關(guān)因子和金屬蛋白酶抑制劑中的應(yīng)用，所述鉑類是指順鉑或卡 鉑，所述血管生成相關(guān)因子和金屬蛋白酶包括VEGFa、TOGFa、EGF-2和MMP2,所述Hu-17 分子式：C 63H96N40nl學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0019]
[0020] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明第五個(gè)目的，本發(fā)明公開以下技術(shù)方案：化合物Hu-17在制備性激 素抑制劑中的應(yīng)用，所述Hu-17分子式：C63H96N 40n，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0021]
[0022] 作為一個(gè)優(yōu)選方案，所述性激素為孕酮和雌激素。
[0023] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明提供化合物Hu-17單獨(dú)或聯(lián)合鉑類藥物（順鉑或卡 鉑）在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用，為卵巢癌患者特別是耐藥復(fù)發(fā)的卵巢癌患者提供了 新的治療方案，該治療方案能克服含有P53突變或缺失的患者對(duì)鉑類藥物產(chǎn)生的耐藥；本 發(fā)明的藥效作用機(jī)制清楚，實(shí)施的可行性較高，給耐藥復(fù)發(fā)的卵巢癌患者帶來新的治愈希 望，具有很大的社會(huì)意義和應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說明】
[0024] 圖1化合物Hu-17抑制卵巢癌細(xì)胞：A)化合物Hu-17(l. 25yM、2. 5yM、3. 75yM、 5 yM)處理 A2780 細(xì)胞 24、48 和 72 小時(shí)；B)化合物 Hu-17(2. 5 yM、3. 75 yM、5 yM)處理 H0-8910 細(xì)胞 24、48 和 72 小時(shí)；C)化合物 Hu-17(2. 5 yM、3. 75 yM、5 yM)處理 H0-8910PM 細(xì)胞 24、48 和 72 小時(shí)；D)化合物 Hu-17(2. 5 yM、3. 75 yM、5 yM)處理 SK-OV-3 細(xì)胞 24、48 和72小時(shí)。MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)活力，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制情況。各組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù) 三次，圖中數(shù)據(jù)以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示。
[0025] 圖2化合物Hu-17能顯著誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡：A) (a)化合物Hu-17 (2.5 yM、 3. 75 y M)處理A2780和SK-OV-3細(xì)胞42小時(shí)流式細(xì)胞儀檢測(cè)的Annexin V陽性細(xì)胞（統(tǒng) 計(jì)二四象限比例之和）的比例，（b)候選藥物（3. 75yM、5yM、6. 25yM)處理H0-8910和 H0-8910PM細(xì)胞48小時(shí)檢測(cè)的Annexin V陽性細(xì)胞比例。B)選取的H0-8910、H0-8910PM 和SK-OV-3細(xì)胞在不同藥物濃度處理后的凋亡散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)代表FITC-Annexin V，縱坐 標(biāo)代表PI，紅色散點(diǎn)（即第三象限）代表活細(xì)胞，藍(lán)色散點(diǎn)（即第二象限）代表晚期凋亡 的細(xì)胞，綠色散點(diǎn)（即第四象限）代表早期凋亡的細(xì)胞。C)5yM候選藥物（Hu-17)處理 H0-8910PM細(xì)胞48小時(shí)線粒體跨膜電位降低的細(xì)胞比例。D)線粒體跨膜電位變化的散點(diǎn) 圖，圖中橫坐標(biāo)為Rhl23,縱坐標(biāo)為PI，第四象限表示羅丹明123陽性細(xì)胞，一三象限表示膜 電位降低的細(xì)胞。各組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展 示，組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)法，其中**表示P〈0. 01，***表示P〈0. 001。
[0026] 圖3化合物Hu-17擾亂卵巢癌細(xì)胞周期：A) (a) A2780細(xì)胞經(jīng)候選藥物（2. 5 yM)處 理48小時(shí)后各周期比例的柱狀圖。（b) H0-8910細(xì)胞經(jīng)候選藥物（3. 75 y M)處理48小時(shí)候 后各周期比例的柱狀圖。（c)H0-8910PM細(xì)胞經(jīng)候選藥物（3. 75yM)處理48小時(shí)候后各周 期比例的柱狀圖。B)A2780、H0-8910、H0-8910PM細(xì)胞加藥前后的周期分布圖，圖中藍(lán)色部 分代表處于S期的細(xì)胞，其左右兩側(cè)紅色部分分別代表處于G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞。各 組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)三次，圖中數(shù)據(jù)以平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示，組間比較采用雙側(cè) t檢驗(yàn)法，其中*表示P〈0. 05, **表示P〈0. 01，林*表示P〈0. 001，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性 差異。
[0027]圖4化合物Hu-17在荷瘤小鼠上顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)：A)在裸鼠皮下移植 A2780細(xì)胞2周后給藥（腹腔注射給藥，三天兩次，5mg/kg/次）并動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤直徑，通過 公式V = l/2XaXb2計(jì)算出腫瘤體積，并得出相對(duì)腫瘤體積（RTV = Vt/V0，Vt表示實(shí)時(shí)測(cè) 量的腫瘤體積，V0表示給藥前腫瘤體積），繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，Candidate表示候選新藥組， Control表示陰性對(duì)照組。B)給藥結(jié)束3天后（Day31)，脫頸處死裸鼠，將兩組瘤體剝離后 稱得的瘤重。C)給藥期間動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)裸鼠體重的變化繪制成的體重變化曲線。圖中數(shù)據(jù)以 平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（mean土SD)展示，組間比較采用t檢驗(yàn)法，其中*表示P〈0. 05, **表示 P〈0. 01，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。D)兩組瘤體剝離后的照片。
[0028] 圖5體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)化合物Hu-17顯著增強(qiáng)順鉑對(duì)耐藥的卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和 誘導(dǎo)凋亡效果：A) A2780、H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)10 y M和20 y M的順鉑處 理48小時(shí)，MTT法檢測(cè)相對(duì)細(xì)胞活力。B)H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)20 y M順 鉑或2. 5 yMHu-17單獨(dú)或聯(lián)合處理48小時(shí)，MTT法檢測(cè)相對(duì)細(xì)胞活力。C) Western blot法 檢測(cè)H0-8910、H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞的蛋白P53的表達(dá)。D)流式技術(shù)檢測(cè)H0-8910、 H0-8910PM和SK-0V-3細(xì)胞經(jīng)20 y M順鉑或2. 5 y M Hu-17單獨(dú)或聯(lián)合處理48小時(shí)后的凋亡 細(xì)胞的比例