不同濃度藥物：
[0051] 1、細(xì)胞株病毒唑組：1、5、10、50、75、100、250、500 yM;伊馬替尼組：0?001、0. 005、 0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、20 1^單獨(dú)或與10 1^、20 1^病毒唑聯(lián)合作用；
[0052] 2、原代細(xì)胞伊馬替尼：0?1、1、10、50、100 11]\1單獨(dú)或與100 1^病毒唑聯(lián)合作用） 孵育箱培養(yǎng)72小時(shí)候；
[0053] 然后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20 y1，再置于37°C、5%0)2孵箱中繼續(xù)孵育4 小時(shí)，然后加入MTT三聯(lián)溶解液100yl，繼續(xù)在37°C、5% C02孵箱孵育過(guò)夜。第二天用酶 標(biāo)儀測(cè)定每孔在570nm處的吸光度值，計(jì)算抑制率。生長(zhǎng)抑制率=1-實(shí)驗(yàn)孔0D值/對(duì)照 孔平均0D值，繪制生長(zhǎng)曲線。根據(jù)藥物對(duì)細(xì)胞的抑制與藥物濃度對(duì)數(shù)成正比的原理，利用 SPSS17.0中的Probit analys模型，計(jì)算出藥物對(duì)細(xì)胞作用的半數(shù)抑制濃度（IC5(I)。實(shí)驗(yàn) 重復(fù)3次。
[0054] 2. 2病毒唑單用以及聯(lián)合伊馬替尼對(duì)SUP-B15細(xì)胞株的促凋亡作用
[0055] 細(xì)胞株每個(gè)孔加5X104個(gè)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度藥物：用30、60、90yM 病毒唑，1 yM伊馬替尼，1 yM伊馬替尼聯(lián)合30 yM病毒唑分別作用于SUP-B15,24、48、72小 時(shí)后，用Annexin V-FITC和propidium iodide(PI)雙染法染色，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡 率。
[0056] 2. 3 病毒唑可抑制SUP-B15 細(xì)胞株的mT0R/eIF4E和MEK/ERK/Mnkl/eIF4E信號(hào)通 路表達(dá)
[0057] 細(xì)胞株每個(gè)孔加5 X 104個(gè)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度藥物：
[0058]SUP-B15細(xì)胞被不同濃度（30、60、90 yM)的病毒唑作用24、48、72h，SUP-B15細(xì)胞 被病毒唑（30 yM)、伊馬替尼（10 yM)單獨(dú)作用以及30 yM病毒唑聯(lián)合10 yM伊馬替尼作 用48h，不同濃度的U0126或CGP57380單獨(dú)作用于SUP-B15細(xì)胞，60 yM病毒唑單用或聯(lián)合 10 yM U0126 作用于 SUP-B15 細(xì)胞 6、24、48、72h ;
[0059] 取處理后的細(xì)胞IX 107個(gè)，用RIPA裂解液裂解，得到的蛋白用BCA法測(cè)定蛋白濃 度。取30-120ug總蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，使用以下一抗P-AKT (S473)、 p-mT0R(S2448)、p-4EBPl(T37/46)、p-eIF4E(S209)、p-cRaf(Ser338)、p-MEKl/2(Ser217/22 1)，p-ERKl/2 (Thr202/Tyr204)、p-Mnkl (Thr 197/202)、p-Lyn (Tyr396)、Mcl-1、AKT、mTOR、 4E-BP1、eIF4E、MEK、Mnkl、Cyclin D1 (Cell Signalling Technology, Danvers, MA, USA), GAPDH和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗進(jìn)行免疫印跡分析。
[0060] 2. 4病毒唑單用以及聯(lián)合伊馬替尼可抑制SUP-B15細(xì)胞株eIF4F復(fù)合物的合成
[0061] 細(xì)胞株每個(gè)孔加5 X 104個(gè)細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)分組加入不同濃度藥物：SUP-15細(xì)胞分別 被病毒唑（30 yM)、伊馬替尼（10 yM)單用或兩者聯(lián)合作用48h ;
[0062] 取處理后的細(xì)胞1 X 107個(gè)，提取總蛋白，離心所得上清液中加入50ul 7m-GTP_Sepharose beads(GE Healthcare)，4°C 解育 1-2 小時(shí)后珠子用 lmlPBS 洗三次，50ul 上樣緩沖液加入到珠子中，煮沸7分鐘。用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，用一抗 4E-BP1，eIF4E進(jìn)行免疫印跡分析。
[0063] 2. 5統(tǒng)計(jì)方法
[0064] 每個(gè)實(shí)驗(yàn)都重復(fù)三次，取平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差做為最后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)發(fā)表。各個(gè)樣本 之間采用t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)或者卡方檢驗(yàn)進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17. 0進(jìn)行分 析。P值小于0.05說(shuō)明差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0065] 3?實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0066] 3. 1病毒唑單用或與病毒唑伊馬替尼聯(lián)合作用于Ph+淋巴細(xì)胞株的抗白血病作用
[0067] 結(jié)果如圖1和表1~5所不：
[0068] 表1不同濃度頂對(duì)SUP-B15的抑制率
[0069]
[0070] 表2不同濃度RIB對(duì)SUP-B15的抑制率
[0071]
[0072] 表3不同濃度頂+RIB10 y M對(duì)SUP-B15的抑制率
[0073] 表4不同濃度頂+RIB20 y M對(duì)SUP-B15的抑制率
[0074]
[0075] 由表1、表2第4列以及表3也可以看出，將0.01~10yM伊馬替尼（頂）與10yM 病毒唑（RIB)聯(lián)合使用以后，對(duì)SUP-B15的抑制率遠(yuǎn)高于二者單獨(dú)使用的抑制率之和，如， 0. 01 yM伊馬替尼（頂）單獨(dú)使用時(shí)，抑制率僅7. 3423%，10 yM病毒唑（RIB)單獨(dú)使用時(shí)， 抑制率僅11. 9246%，而二者聯(lián)用的抑制率為31. 9217%，說(shuō)明將0.001~10 yM伊馬替尼 (頂）與10 yM病毒唑聯(lián)合使用，二者可以發(fā)揮協(xié)同增效的作用。
[0076] 由表1、表2第4列以及表3也可以看出，將0.01~10yM伊馬替尼（頂）與20yM 病毒唑（RIB)聯(lián)合使用以后，對(duì)SUP-B15的抑制率遠(yuǎn)0.01~10 yM伊馬替尼單獨(dú)使用，并 且還高于50 y M病毒唑單獨(dú)使用，說(shuō)明將0. 001~10 y M伊馬替尼（頂）與20 y M病毒唑聯(lián) 合使用，二者可以發(fā)揮協(xié)同增效的作用。
[0077] 表5病毒唑、伊馬替尼及聯(lián)用作用于SUP-B15、Ph+ALL原代細(xì)胞的IC50值（ymol/ L)
[0078]
[0079] MTT試驗(yàn)顯示病毒唑、伊馬替尼單用均可以抑制SUP-B15細(xì)胞株的細(xì)胞增殖，病毒 唑?qū)UP-B15細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度（IC50)為65. 177umol/L，伊馬替尼對(duì)SUP-B15細(xì)胞株 的IC50為1. 44umol/L ;兩者聯(lián)合具有協(xié)同抗細(xì)胞增殖作用，與10um〇l/L濃度的病毒唑聯(lián) 合后，伊馬替尼對(duì)SUP-B15細(xì)胞株的IC50分別降為0. 075umol/L，協(xié)同指數(shù)（CI)為0. 206。
[0080] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，病毒唑與伊馬替尼聯(lián)合使用可以發(fā)揮協(xié)同增效作用，二者可以制 備成為聯(lián)合用藥物，治療急性淋巴細(xì)胞白血病。
[0081] 3. 2病毒唑單用以及聯(lián)合伊馬替尼對(duì)SUP-B15細(xì)胞株的促凋亡作用
[0082] 結(jié)果如圖2與表6所示：
[0083] 表6不同濃度頂+RIB20yM對(duì)SUP-B15促凋亡作用
[0084]
[0085] 可以看出，病毒唑和伊馬替尼單獨(dú)均可促進(jìn)SUP-B15細(xì)胞株的凋亡發(fā)生，而二者 聯(lián)合使用后，作用大大高于二者單獨(dú)使用的抑制率之和，說(shuō)明將lyM伊馬替尼（IM)與 30 yM病毒唑聯(lián)合使用，二者可以發(fā)揮協(xié)同增效的作用。
[0086] 3. 3 病毒唑可抑制SUP-B15 細(xì)胞株的mT0R/eIF4E和MEK/ERK/Mnkl/eIF4E信號(hào)通 路表達(dá)
[0087] 結(jié)果如圖3所示，Western Blot分析顯示病毒挫單藥可以下調(diào)SUP-B15細(xì)胞株 mT0R/eIF4E 信號(hào)通路蛋白 Akt、mT0R、4EBPl、eIF4E 磷酸化，ERK/Mnkl/eIF4E 軸中 MEK、ERK、 Mnkl、eIF4E蛋白的磷酸化表達(dá)水平，以及下調(diào)下游靶蛋白Mcl-1的表達(dá)。
[0088] 3. 4病毒唑單用以及聯(lián)合伊馬替尼可抑制SUP-B15細(xì)胞株eIF4F復(fù)合物的合成
[0089] 結(jié)果如圖4所示，7-甲基鳥嘌呤帽親和分析法顯示病毒唑單藥可增加eIF4E與 4EBP1的結(jié)合，減少與eIF4G的結(jié)合，從而抑制eIF4F翻譯起始復(fù)合物的合成，與伊馬替尼聯(lián) 合表現(xiàn)出協(xié)同抑制作用，說(shuō)明將10yM伊馬替尼（頂）與30yM病毒唑聯(lián)合使用，二者可以 發(fā)揮協(xié)同增效的作用。
[0090] 4、實(shí)驗(yàn)結(jié)論
[0091] 上述研宄結(jié)果證實(shí)病毒唑通過(guò)抑制mT0R/eIF4E、ERK/Mnkl/eIF4E兩條通路來(lái)影 響P-eIF4E的表達(dá)水平和eIF4F翻譯起始復(fù)合物的組裝，減少M(fèi)cl-1下游癌蛋白翻譯，促進(jìn) 細(xì)胞凋亡，抑制Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡，病毒唑與伊馬替尼聯(lián)合具 有協(xié)同抗Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病的作用。
[0092] 綜上，病毒唑與伊馬替尼聯(lián)合使用可以發(fā)揮協(xié)同增效作用，二者可以制備成為聯(lián) 合用藥物，治療急性淋巴細(xì)胞白血病，特別是Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物，其特征在于：它含有相同或不同規(guī)格 單位制劑的用于同時(shí)或者分別給藥的病毒唑和伊馬替尼，以及藥學(xué)上可接受的載體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為： 病毒唑1~500摩爾份，伊馬替尼0.0 Ol~10摩爾份。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為： 病毒唑10~30摩爾份，伊馬替尼0. 001~10摩爾份。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為： 病毒唑10~20摩爾份，伊馬替尼0. 001~10摩爾份。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為： 病毒唑30摩爾份，伊馬替尼1摩爾份或10摩爾份。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任意一項(xiàng)所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述制劑為口服制 劑。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的聯(lián)合用藥物，其特征在于：所述口服制劑是膠囊劑、片劑。8. 病毒唑和伊馬替尼在制備治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物中的用途。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒唑 1~500摩爾份，伊馬替尼0. 001~10摩爾份。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒 唑10~30摩爾份，伊馬替尼0. 001~10摩爾份。11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒 唑10~20摩爾份，伊馬替尼0. 001~10摩爾份。12. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的用途，其特征在于：所述病毒唑和伊馬替尼的配比為：病毒 唑30摩爾份，伊馬替尼1摩爾份或10摩爾份。13. 根據(jù)權(quán)利要求8~12任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于：所述制劑為口服制劑。14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于：所述口服制劑是膠囊劑、片劑。15. 權(quán)利要求8~14任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于：所述治療急性淋巴細(xì)胞白血 病的藥物是治療Ph+急性淋巴細(xì)胞白血病的藥物。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種治療急性淋巴細(xì)胞白血病的聯(lián)合用藥物，它含有相同或不同規(guī)格單位制劑的用于同時(shí)或者分別給藥的病毒唑和伊馬替尼，以及藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明病毒唑與伊馬替尼的聯(lián)合用藥物對(duì)急性淋巴細(xì)胞白血病的療效佳，臨床應(yīng)用前景良好。
【IPC分類】A61K31/7056, A61P35/02, A61K31/506
【公開(kāi)號(hào)】CN104958312
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510245756
【發(fā)明人】龔玉萍, 石芳芳
【申請(qǐng)人】四川大學(xué)華西醫(yī)院
【公開(kāi)日】2015年10月7日
【申請(qǐng)日】2015年5月14日