本發(fā)明是關(guān)于一種免疫性lhrh組合物，且特別是關(guān)于一種免疫性lhrh組合物，其含有包含可功能性抑制豬只lhrh濃度的lhrh肽結(jié)構(gòu)，以有效地免疫去勢(shì)豬只、消除公豬臭和促進(jìn)生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
：促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasinghormone，gnrh)，也被稱(chēng)為促黃體激素釋放激素(luteinizing-hormone-releasinghormone，lhrh)，是一種營(yíng)養(yǎng)性肽激素，負(fù)責(zé)使濾泡刺激素(follicle-stimulatinghormone，fsh)和黃體成長(zhǎng)激素(luteinizinghormone，lh)由腦下垂體前葉釋放。lhrh是由下視丘內(nèi)的神經(jīng)元合成與釋放。自1970年代早期已證實(shí)接種下視丘激素lhrh疫苗可作為一種用以控制繁殖的免疫方法。引發(fā)對(duì)lhrh的免疫反應(yīng)可預(yù)防激素lh和fsh由腦下垂體前葉釋放，lh和fsh為性腺(雄性的睪丸與雌性的卵巢)發(fā)展和維持所需。因此，減少lh和fsh水平可導(dǎo)致生殖功能的喪失。絕育(或閹割)手術(shù)是獸醫(yī)學(xué)和畜牧動(dòng)物管理上最為廣泛使用的手術(shù)方法。家畜和伴侶動(dòng)物之兩種性別的顯著比例是利用常規(guī)手術(shù)絕育以防止各種伴隨性成熟的非欲求的特性。免疫阻絕lhrh作用可導(dǎo)致動(dòng)物不孕，因?yàn)閘hrh控制睪固酮生成，睪固酮生成進(jìn)而調(diào)控精子發(fā)展與雌激素生成，雌激素生成進(jìn)而導(dǎo)致卵子成熟。此外，基于lhrh的免疫療法提供一種用于雄性與雌性伴侶動(dòng)物(例如：狗、貓、馬和兔子)的節(jié)育方法，以及和緩非欲求的雄性激素-驅(qū)動(dòng)的行為(例如:發(fā)情、區(qū)域性標(biāo)記和攻擊)。一旦接受基于lhrh的免疫療法的免疫接種，此種過(guò)程是可逆性的，其取決于受試動(dòng)物的血清抗體水平。免疫去勢(shì)(例如：利用抗體對(duì)lhrh作用的抑制)在肉用動(dòng)物畜產(chǎn)上已有一種其他應(yīng)用。因?yàn)橛懭藚挼臍馕杜c風(fēng)味與其肉品相關(guān)，是睪固酮代謝的結(jié)果(例如：公豬臭(boartaint))，故雄性的肉品無(wú)法被加工制成特級(jí)肉塊。因?yàn)橐曅坌允秤脛?dòng)物的機(jī)械去勢(shì)(例如：手術(shù))為不人道，故免疫去勢(shì)針對(duì)此方法提供一種可接受的替代方案。多種免疫性型式的lhrh用于試驗(yàn)。例如，結(jié)合lhrh肽至載體蛋白以增強(qiáng)此肽激素的免疫效力。然而，此些蛋白載體對(duì)大規(guī)模使用過(guò)于昂貴，且作為結(jié)果的肽-蛋白結(jié)合物無(wú)法有效的(1)產(chǎn)生長(zhǎng)期的免疫去勢(shì)，也無(wú)法(2)在所有動(dòng)物產(chǎn)生抗-lhrh免疫反應(yīng)，此二種條件對(duì)作為去勢(shì)手術(shù)的替代方案的有效疫苗是需要的。更進(jìn)一步，以一種非免疫性10-mer肽的lhrh有效的免疫接種，取決于lhrh和載體蛋白間的結(jié)合位置。此外，聯(lián)結(jié)至lhrh的蛋白質(zhì)作為免疫原是有問(wèn)題的，因?yàn)閷?duì)此免疫原的免疫反應(yīng)的主體指向的是大的載體蛋白，而非lhrh肽(毒素或其他載體蛋白的質(zhì)量遠(yuǎn)大于lhrh的質(zhì)量，lhrh為10-mer肽)。此現(xiàn)象頻繁地造成載體蛋白所引發(fā)的表位免疫抑制。據(jù)此，為了在免疫去勢(shì)的多種應(yīng)用，應(yīng)該尋找一種免疫增強(qiáng)劑，此免疫增強(qiáng)劑適用于連結(jié)lhrh肽以產(chǎn)生作為疫苗制劑關(guān)鍵成份的價(jià)錢(qián)低廉的肽結(jié)構(gòu)，此免疫增強(qiáng)劑能夠刺激對(duì)lhrh早期且強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。同樣地，此免疫增強(qiáng)劑也需避免載體蛋白所引發(fā)的表位免疫抑制。因此，對(duì)免疫去勢(shì)具有一貫高效力的lhrh疫苗包括(1)在豬只的公豬臭消除和生長(zhǎng)曲線促進(jìn)的具體應(yīng)用，以及(2)用于行為矯正以易于牧場(chǎng)中動(dòng)物管理；特別是在豬只，業(yè)界亟需解決目前基于lhrh的免疫療法所不足之處。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供一種用于豬只去勢(shì)的疫苗組合物，其包含肽免疫原和獸醫(yī)學(xué)上可接受的載體或佐劑，其中肽免疫原包含(a)seqidno：1的lhrh肽，以及(b)選自由seqidno：2、3、4、5以及6組成的群組的至少一th抗原表位或免疫刺激性元件，其中l(wèi)hrh的肽可借由gly-gly或εnlys間隔序列(spacersequence)經(jīng)由其氨基端與th抗原表位和/或免疫刺激性元件共價(jià)連結(jié)。間隔“εnlys”是一個(gè)出現(xiàn)于二氨基酸間的賴(lài)氨酸殘基，用以連接(1)位于賴(lài)氨酸殘基的ε-nh2基團(tuán)的在先的氨基酸的羧酸端，以及(2)位于賴(lài)氨酸殘基羧酸端的接著的氨基酸的氨基端。本發(fā)明中所述的“εnlys”、“εlys”和“εk”可交替使用。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的肽免疫原包含seqidno：7、8、9或10，或其混合物，且獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑選自由isa50v2和emulsigend組成的群組。每劑量的肽免疫原的總量為超過(guò)6.25μg，優(yōu)選地為50μg至200μg。本發(fā)明的另一范疇是關(guān)于一種用以抑制豬只因性成熟所引發(fā)的特征的方法，包含利用本發(fā)明的疫苗組合物的有效量投予豬只，以降低豬只的睪固酮及其衍生物(例如︰二氫睪固酮和雌激素)產(chǎn)量。此特征包含，但不限于，公豬臭、性活動(dòng)力、生育力以及發(fā)情行為。本發(fā)明的方法可抑制公豬臭和睪丸與副睪的生長(zhǎng)。在一實(shí)施例中，借由肌肉注射投予公豬兩劑疫苗組合物，第一劑施用于早至3周齡的豬只，作為加強(qiáng)免疫的第二劑則于10至16周齡注射，或投予年齡更大的豬只，其于加強(qiáng)免疫后約兩周造成有效的免疫去勢(shì)、生長(zhǎng)促進(jìn)和公豬臭消除。本發(fā)明將詳細(xì)描述于以下的實(shí)施例中，并請(qǐng)參照附圖。附圖說(shuō)明圖1a和圖1b是公豬以配制于佐劑isa50v2(圖1a)或emulsigend(圖1b)中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后個(gè)別抗-lhrh抗體的效價(jià)。所有試驗(yàn)組的豬只(第1至4組和第8至11組)在加強(qiáng)免疫后兩周(即初免后十周，或10wpi，約為18周齡)具有高的抗-lhrh抗體效價(jià)。相對(duì)之下，注射目前市售疫苗(第7組和第14組)豬只的lhrh-抗體效價(jià)只在14wpi時(shí)上升，其效價(jià)低于本發(fā)明肽疫苗制劑(第1至4組和第8至11組)。第5和12組豬只接受生理食鹽水作為陰性對(duì)照組，且第6和13組豬只以手術(shù)程序去勢(shì)作為陽(yáng)性對(duì)照組。圖2a和圖2b是公豬以配制于佐劑isa50v2(圖2a)或emulsigend(圖2b)的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后豬只相對(duì)應(yīng)的睪固酮濃度，用以說(shuō)明個(gè)別動(dòng)物的去勢(shì)持續(xù)性。配制于isa50v2或emulsigend的所有組別在10wpi前維持低濃度的睪固酮，并維持低水平直到16wpi(24周齡)。相較之下，第7和14組接受疫苗的豬只具有高濃度的血清睪固酮直到12wpi，且低濃度的睪固酮在14wpi時(shí)濃度開(kāi)始上升，顯示免疫去勢(shì)的效力較低。圖3a和圖3b是公豬以配制于isa50v2(圖3a)或emulsigend(圖3b)的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后于24周齡豬只的個(gè)別體重。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化的陰性對(duì)照組和手術(shù)去勢(shì)組具有顯著較低的平均體重94.9kg(陰性對(duì)照組，第5和12組)和88kg(手術(shù)去勢(shì)組，第6和13組)。相對(duì)于手術(shù)去勢(shì)組，證明本發(fā)明的疫苗(第4和11組)可增加約27.9％的體重，具有顯著的好處。圖4a和圖4b是公豬以配制于佐劑isa50v2(圖4a)或emulsigend(圖4b)中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后個(gè)別抗-lhrh抗體的效價(jià)。所有試驗(yàn)組豬只在加強(qiáng)免疫后兩周在10wpi(即18周齡)具有高的抗-lhrh抗體效價(jià)。不論是配制在isa50v2或emulsigend組別的豬只，此抗體效價(jià)可維持于接近3.0(log10)直到16wpi(即24周齡)，此相當(dāng)于上市販?zhǔn)壑畷r(shí)。圖5a和圖5b是公豬以配制于佐劑isa50v2(圖5a)或emulsigend(圖5b)中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后的個(gè)別睪固酮濃度。在配制于isa50v2的第1至4組和配制于emulsigend的第8至11組豬只的血清睪固酮濃度相反地對(duì)應(yīng)至lhrh-抗體的血清效價(jià)，即較高的抗-lhrh抗體效價(jià)具有較低的血清睪固酮濃度，去勢(shì)血清睪固酮濃度于加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi或18周齡)達(dá)到1.87nmol/l的邊界值。除了第1組，配制于佐劑isa50v2或emulsigend中所有組別豬只均維持低濃度的血清睪固酮濃度直到16wpi(24周齡)。圖6a和圖6b是以配制于佐劑isa50v2(圖6a)或emulsigend(圖6b)中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種公豬后豬只的個(gè)別體重。陰性對(duì)照組(即未接種疫苗組(第5和11組))和手術(shù)去勢(shì)組(第6和12組)在24周齡時(shí)分別具有顯著較低的平均體重94.9kg和88kg。相對(duì)于手術(shù)去勢(shì)組的豬只，本發(fā)明的疫苗制劑(第4和10組)可增加約20.3％的體重，具有顯著的好處。圖7是公豬以配制于佐劑isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后抗-lhrh抗體效價(jià)的持續(xù)性。加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi)，第1至4組抗-lhrh抗體效價(jià)達(dá)到超過(guò)3.0(log10)，且此高效價(jià)持續(xù)至20wpi。第2和3組的動(dòng)物甚至可維持抗-lhrh抗體效價(jià)于3.0(log10)直到24wpi(即32周齡)。相較之下，陰性對(duì)照組(第5組)和手術(shù)去勢(shì)組(第6組)總是保持低的抗-lhrh抗體效價(jià)。圖8是公豬以配制于佐劑isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后豬只個(gè)別睪固酮濃度的去勢(shì)持續(xù)性。第1至4組所有豬只在加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi)具有低濃度的血清睪固酮，且證實(shí)可借由抗-lhrh抗體之抑制達(dá)到去勢(shì)程度。第1至4組豬只的睪固酮水平維持如去勢(shì)對(duì)照組(第6組)一樣低至20wpi(即28周齡)。圖9是豬只以配制于佐劑isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后于24wpi時(shí)的睪丸重量。在第1至4組，豬只的睪丸萎縮至無(wú)功能的尺寸。圖10是豬只以配制于佐劑isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后于24wpi時(shí)的副睪重量。在第1至4組，副睪的重量顯著地下降。圖11是豬只以配制于佐劑isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后的體重。在第1至4組中的動(dòng)物具有較陰性對(duì)照組和手術(shù)去勢(shì)組(第5和6組)更佳的體重增加表現(xiàn)。圖12是豬只以配制于佐劑isa50v2或emulsigend中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后對(duì)雄甾烯酮濃度的影響。在第1至4組中，脂肪中的雄甾烯酮濃度控制在0.5μg/g脂肪以下。在第3組，雄甾烯酮的平均值甚至控制在0.1384μg/g脂肪。圖13是豬只以配制于佐劑isa50v2或emulsigend的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后對(duì)糞臭素濃度的影響。在第1至3組中，糞臭素濃度控制在低于0.1μg/g脂肪。以第3組的糞臭素平均值最低(為0.0514μg/g脂肪)。圖14是公豬臭因子分布圖。第1組與第2組的表現(xiàn)相似，7/8樣品分布于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，一個(gè)樣品位于中度/高度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。第3組具有較佳的表現(xiàn)直到24wpi，其中所有樣品分布于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。手術(shù)去勢(shì)組(第6組)總是保持公豬臭因子的最低濃度。生理食鹽水對(duì)照組(第5組)只有2/8位于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，2/8位于中度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，且4/8位于高度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。圖15是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑利用不同初免和加強(qiáng)免疫時(shí)程表免疫接種后的抗-lhrh抗體效價(jià)，用以評(píng)估免疫去勢(shì)時(shí)程表的適應(yīng)性。第1組豬只證實(shí)了高度免疫原性，在22周齡時(shí)達(dá)到3.556(log10)的lhrh抗體平均效價(jià)，且在26周齡時(shí)維持于3.235(log10)。第2組達(dá)到其最高抗體效價(jià)，在18周齡時(shí)為3.526(log10)的平均效價(jià)，且在26周齡時(shí)維持于2.869(log10)。第3組于24周齡達(dá)到其最高平均抗體效價(jià)3.219(log10)，且在26周齡維持于2.682(log10)。圖16是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑利用不同初免和加強(qiáng)免疫時(shí)程表免疫接種后的血清睪固酮濃度，用以評(píng)估免疫去勢(shì)時(shí)程表的適應(yīng)性。第1組的豬只在20周齡(即加強(qiáng)免疫后兩周)時(shí)展現(xiàn)免疫去勢(shì)效果(睪固酮濃度≦1.87nmol/l)，且此效果持續(xù)至少六周直到26周齡。第2組的豬只睪固酮濃度在加強(qiáng)免疫后的2至6周期間(即由22周齡至26周齡)顯著地低于1.87nmol/l，且保持低水平(睪固酮濃度≦1.644nmol/l)直到26周齡。加強(qiáng)免疫后兩周，第3組的平均睪固酮濃度為4.535nmol/l。圖17a、圖17b、圖17c和圖17d是豬只以配制于佐劑isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后睪丸和副睪的重量。睪丸的重量于10wpi(圖17a)、12wpi(圖17b)、14wpi(圖17c)和16wpi(圖17d)測(cè)量。睪丸和副睪隨著時(shí)間逐漸萎縮，且副睪于10wpi時(shí)以及睪丸于12wpi時(shí)重量顯著地減少(p<0.001)。圖18a、圖18b、圖18c和圖18d是以配制于佐劑isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后的公豬臭因子(雄甾烯酮和糞臭素)量。雄甾烯酮和糞臭素量在10wpi(分別為圖18a和圖18c)和12wpi(分別為圖18b和圖18d)評(píng)估。免疫接種后，睪固酮濃度抑制到去勢(shì)程度(即低于1.87nmol/l)，造成脂肪中的雄甾烯酮減少。圖19a和圖19b是通過(guò)比較未接受處理的陰性對(duì)照組(圖19a)與以lhrh肽疫苗制劑接種公豬(圖19b)的脂肪中雄甾烯酮和糞臭素濃度進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。所有接種的組別從10wpi至16wpi皆處于敏化評(píng)估中的低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(低雄甾烯酮(<0.5μg/g脂肪)和低糞臭素濃度(<0.22μg/g脂肪))。圖20是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后對(duì)抗-lhrh抗體效價(jià)的持續(xù)性的影響。第1組的抗體效價(jià)從3.636±0.577(log10)(最高點(diǎn))減少到2.418±0.742(log10)(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))。第2組的抗體效價(jià)從3.868±0.221(log10)減少到2.806±0.213(log10)(實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí))。圖21是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后的睪固酮濃度。于本試驗(yàn)起始階段所有組別的睪固酮濃度為2.943±2.854(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)nmol/l。疫苗效力評(píng)估的時(shí)間點(diǎn)設(shè)為加強(qiáng)免疫后2周，其顯示最低睪固酮濃度。第1至4組豬只于加強(qiáng)免疫后2周的平均睪固酮濃度分別為1.265±0.353、1.329±0.636、1.904±2.297以及1.222±0.445(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)nmol/l。圖22a和圖22b是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后的睪丸長(zhǎng)度(圖22a)和體積(圖22b)。第1至4組的豬只于成對(duì)睪丸和成對(duì)副睪的重量與睪丸的長(zhǎng)度并無(wú)差異。依據(jù)各組別以箭號(hào)指出加強(qiáng)免疫的時(shí)間點(diǎn)。圖23a、圖23b和圖23c是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后于尸體剖檢時(shí)豬只的成對(duì)睪丸(圖23a)和成對(duì)副睪(圖23b)的重量，以及睪丸的長(zhǎng)度(圖23c)。圖24是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后于24周齡的雄甾烯酮和糞臭素濃度。在公豬臭因子分布圖中，除了第1組中的一只豬以外，第1至4組中所有豬只的危險(xiǎn)因子均位于低度/中度危險(xiǎn)。圖25是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后的抗-lhrh抗體效價(jià)。第1、2和3組在第0和3周齡的抗-lhrh抗體效價(jià)分別位于背景值1.718±0.297、1.765±0.340和1.770±0.283(log10)附近。在16周齡加強(qiáng)免疫后，在18周齡時(shí)，第4組的抗-lhrh抗體效價(jià)為3.249±0.346，第5組為2.893±0.786。圖26是豬只以配制于佐劑isa50v2中的lhrh1(seqidno：10)制劑免疫接種后的血清睪固酮濃度。第1和2組的豬只血清睪固酮濃度分別為2.154±0.921nmol/l于10周齡，以及2.183±1.231nmol/l于6周齡。第3組豬只于12周齡時(shí)有最低睪固酮濃度3.065±0.205nmol/l。第4和5組在20周齡的血清睪固酮濃度分別地被抑制至0.586±0.184和0.893±1.192nmol/l的低濃度。相較之下，接受疫苗(第6組)豬只的血清睪固酮在20周齡保持在高濃度(約9.415±7.560nmol/l)，且之后在22周齡下降至低濃度。圖27是公豬以配制于佐劑isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后的抗-lhrh抗體效價(jià)。第1和2組豬只的抗-lhrh抗體效價(jià)顯著地高于第3組(未去勢(shì)未接種疫苗(公豬))和第4組(手術(shù)去勢(shì)(閹豬))。圖28是第1和2組的公豬以不同劑量的配制于佐劑isa50v2的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種后的完全(100％)免疫去勢(shì)。圖29是顯示在與手術(shù)去勢(shì)組相比時(shí)，對(duì)于以配制于佐劑isa50v2中的lhrh3(seqidno：7、8和9)制劑免疫接種的公豬而言，因平均日采食量(adfi)的增加而有較高的平均體重。具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。下面的描述是用以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的最佳的預(yù)期模式。此描述的目的是說(shuō)明本發(fā)明的一般原理，且不應(yīng)被理解成具有限定意義。本發(fā)明的范圍借由參照所附的權(quán)利要求書(shū)而被最適地裁定。為了使文稿排版更美觀和便于閱讀，以下具體實(shí)施方式中出現(xiàn)的表格將被統(tǒng)一放置于文字之后。本發(fā)明提供包含lhrh的肽，lhrh為經(jīng)由其氨基端連結(jié)至共同刺激或輔助t細(xì)胞抗原表位(th抗原表位)的10-mer肽。本發(fā)明的名詞“l(fā)hrh”是指促黃體激素釋放激素(genbank：aab34379.1)，其為營(yíng)養(yǎng)性肽激素，負(fù)責(zé)使fsh和lh由腦下垂體前葉釋放。用于此揭露內(nèi)容中的名詞lhrh包含衍生自不同門(mén)(包含鳥(niǎo)類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、爬行動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物)的lhrh同系物。此lhrh肽優(yōu)選地包含如表1所示的seqidno：1的氨基酸序列。本發(fā)明的名詞“疫苗(vaccine)”為一般的臨床術(shù)語(yǔ)，用以描述可導(dǎo)致暴露于此疫苗的受試者產(chǎn)生抗體的免疫刺激性組合物。從臨床角度看，接受疫苗組合物的受試者將對(duì)存在于此疫苗中的抗原產(chǎn)生抗體。本申請(qǐng)案所敘述的疫苗組合物不限于用以改善對(duì)特定疾病或病原體的免疫力的生物制劑。本發(fā)明的名詞“輔助t細(xì)胞抗原表位(th抗原表位)”指衍生自外源病原體的th抗原表位，包含但不限于，例如：b型肝炎表面和核心抗原(hbsag和hbc)輔助t細(xì)胞抗原表位、百日咳毒素輔助t細(xì)胞抗原表位(ptth)、破傷風(fēng)毒素輔助t細(xì)胞抗原表位(ttth)、麻疹病毒f蛋白質(zhì)輔助t細(xì)胞抗原表位(mvfth)、砂眼披衣菌的主要外膜蛋白質(zhì)輔助t細(xì)胞抗原表位(ctth)、白喉毒素輔助t細(xì)胞抗原表位(dtth)、鐮狀瘧原蟲(chóng)環(huán)圍種蟲(chóng)輔助t細(xì)胞抗原表位(pfth)、曼氏住血吸蟲(chóng)三醣磷酸鹽異構(gòu)酶輔助t細(xì)胞抗原表位(smth)、大腸桿菌trat輔助t細(xì)胞抗原表位(tratth)。此等病原-衍生th抗原表位作為濫交th抗原表位的代表性例子，如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,759,551中之seqidno：2-9和42-52并入本文作為參考。有用的th抗原表位可包含組合的th抗原表位。wang等人(wo95/11998)描述一特別種類(lèi)的組合th抗原表位，稱(chēng)為“結(jié)構(gòu)性合成抗原庫(kù)(syntheticantigenlibrary，ssal)”。此ssal抗原表位包含眾多的th抗原表位，以氨基酸序列圍繞一在特定位置具有取代物的不變的殘基的結(jié)構(gòu)性架構(gòu)而組成。ssal的序列是借由保留相對(duì)不變的殘基，同時(shí)改變其他殘基以提供各種不同的mhc限制元素的辨認(rèn)而決定。此可借下列達(dá)成，將濫交th的初級(jí)氨基酸序列排成一列，選擇并保存造成th肽獨(dú)特結(jié)構(gòu)的殘基作為骨架，以及根據(jù)已知的mhc限制元素改變剩余的殘基。已有不變位置及具mhc限制元素的較佳氨基酸的可變位置的清單，可用于得到mhc-結(jié)合特色(mhc-bindingmotifs)。此等可作為設(shè)計(jì)ssalth抗原表位時(shí)的參考((meister等人，vaccine，1995；13:581-591)。在一實(shí)施例中，th抗原表位包含如表1所示的seqidno：2、3、4及/或5。seqidno：6是指衍生自致病的耶爾辛森氏屬(yersiniaspp.)細(xì)菌的侵染素蛋白質(zhì)的肽片段，其為微生物外膜蛋白質(zhì)，以調(diào)停細(xì)菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞。已證實(shí)細(xì)菌侵入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)需要耶爾辛森氏菌的侵染素分子和多種出現(xiàn)于培養(yǎng)的細(xì)胞上的β1家族整聯(lián)蛋白質(zhì)之間的交互作用。因?yàn)閠淋巴球具有豐富的β1整聯(lián)蛋白質(zhì)(特別是活化的免疫或記憶t細(xì)胞)，且證明t細(xì)胞協(xié)同刺激的特性與侵染素結(jié)構(gòu)區(qū)域有關(guān)，其可連結(jié)至包含lhrh結(jié)構(gòu)的濫交th抗原表位，以進(jìn)一步增強(qiáng)所設(shè)計(jì)的肽免疫原的免疫原性(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6,025,468)。本發(fā)明的肽包含至少一lhrh、th抗原表位，以及任選地共同刺激的侵染素肽結(jié)構(gòu)區(qū)域。lhrh肽(包含其同系物)可經(jīng)由其氨基端氨基酸與間隔共價(jià)連結(jié)到包含至少一已知含有th抗原表位的序列。th抗原表位可經(jīng)由其氨基端共價(jià)連結(jié)至共同刺激的侵染素肽結(jié)構(gòu)區(qū)域。間隔包含，但不限于，gly-gly、lys、εnlys、εnlys-(lys)n(此處n＝1至3)，或lys-lys-lys-εnlys(seqidno：11)等。本發(fā)明的肽具有約20個(gè)至約100個(gè)氨基酸殘基，較佳介于約20個(gè)至約70個(gè)氨基酸殘基，以及更佳介于約25個(gè)至約50個(gè)氨基酸殘基。在另一較佳實(shí)施例中，肽具有約27個(gè)至約45個(gè)氨基酸殘基。th抗原表位的數(shù)量包含，但不限于，一、二、三、四或更多個(gè)如本發(fā)明表1所示的th肽。本發(fā)明的肽包含至少一選自seqidno：2、3、4、5之th抗原表位的肽，其可任選地連結(jié)至seqidno：1的lhrh肽的氨基端。在一實(shí)施例中，th抗原表位可連結(jié)至lhrh的氨基端以形成本發(fā)明的肽。例如，seqidno：2和3的肽可借由間隔(gly-gly、lys或εnlys)連續(xù)地連結(jié)至lhrh的氨基端。如果有必要，此領(lǐng)域的習(xí)知技藝者可改變th抗原表位數(shù)目和用以連結(jié)至lhrh肽免疫原的間隔種類(lèi)，以提供本發(fā)明的最理想肽。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的肽包含如表2所示的seqidno：7、8、9和/或10，或與其具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，或至少99％相似性者。本發(fā)明的肽可以一般習(xí)知技藝者所熟知的化學(xué)合成方法制造；參見(jiàn)，例如，合成肽中的auser'sguide(grant編輯，w.h.freeman&co.出版，newyork,n.y.,1992，第382頁(yè))。因此，可利用叔丁氧基羰基(t-butyloxycarbonyl,t-boc)或9-芴甲氧羰基(9-fluorenyl-methyloxycarbonyl,f-moc)化學(xué)法之自動(dòng)化固相合成技術(shù)在應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)化肽合成儀(430a或431型)上合成肽。為合成聚賴(lài)氨酸核心部分，未保護(hù)的di(t-boc)或di(f-moc)-nα，nε)賴(lài)氨酸殘基可用以代替具有保護(hù)的ε-胺基的t-boc或f-moc。為改進(jìn)所設(shè)計(jì)的肽的溶解度，可在肽的氨基端增加額外的絲氨酸或/和賴(lài)氨酸殘基加以延長(zhǎng)。在組合完成所欲的肽后，依照標(biāo)準(zhǔn)程序處理樹(shù)脂，將肽由樹(shù)脂上切下，并去除位于氨基酸側(cè)鏈上的保護(hù)基團(tuán)。以高效能液相層析純化游離的肽，并確認(rèn)其生化特性。另外，較長(zhǎng)的線性肽可利用習(xí)知的重組dna技術(shù)合成。任何dna技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)手冊(cè)可提供詳細(xì)方法以制造本發(fā)明的肽。當(dāng)本發(fā)明的肽作為疫苗制劑的關(guān)鍵成份時(shí)，可在接受免疫接種的動(dòng)物產(chǎn)生免疫去勢(shì)，其包含與性成熟有關(guān)的物理及/或化學(xué)特性(例如：性行為、戰(zhàn)斗、徘徊、攻擊性行為、非欲求的感官特性、生殖器官腫瘤以及懷孕、動(dòng)情周期、生育力)的喪失。因此，抑制的特性包含抑制性行為(例如，避免雄性牛只駕乘其他雄性牛只)、避免或延遲排卵、使睪丸和副睪萎縮、降低睪固酮濃度、減少攻擊行為或減少非欲求的感官特性(例如公豬臭)。為了方便且有效地投予本發(fā)明的肽的有效量和適合的藥學(xué)上可接受的載體，以在此揭露的單位劑量型式配制本發(fā)明肽。單位劑量可為，例如，通常含有介于0.5μg至約2000μg的主要肽抗原量，較佳為超過(guò)6.25μg，最佳為25μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg或200μg。在含有補(bǔ)充活性成分的組合物的情況下，此劑量是通過(guò)參考所述成分的給藥的常用劑量和方式來(lái)決定。本發(fā)明亦提供包含用于肽免疫原投予的藥學(xué)上可接受的傳輸系統(tǒng)的組合物。此組合物包含至少一種本發(fā)明肽的免疫學(xué)上的有效量。在本發(fā)明組合物(疫苗)中，本發(fā)明肽的數(shù)量包含，但不限于，一、二、三、四或更多。例如，本發(fā)明的組合物包含seqidno：7、8、9、10或其混合物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包含seqidno：7、8、9或10的單一肽。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包含seqidno：7、8和9(在以下范例稱(chēng)為lhrh3)。在其他實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物包含seqidno：10(在以下范例稱(chēng)為lhrh1)。當(dāng)如此配制時(shí)，包含作為目標(biāo)抗原性位點(diǎn)的lhrh或其同系物的本發(fā)明組合物，可用于預(yù)防/消除公豬臭、促進(jìn)生長(zhǎng)、豬只免疫去勢(shì)，以及用于雄性和雌性的避孕。本發(fā)明的肽免疫原可利用佐劑、乳化劑、醫(yī)藥上可接受的載劑或其他例行提供于疫苗組合物的成分，配制作為免疫性組合物?？捎糜诒景l(fā)明的佐劑或乳化劑包括明礬、不完全弗羅恩特氏佐劑(ifa)、liposyn、皂角苷、鯊烯、l121、emulsigen、單磷?；|(zhì)a(mpl)、qs21，和isa720、isa50、isa50v2、isa35或isa206，以及其他有效的佐劑和乳化劑。此類(lèi)調(diào)配物可由此領(lǐng)域中一般熟知技藝者輕易決定，且也可包含可立即釋放及/或可持續(xù)釋放的調(diào)配物。此疫苗可借由任何合宜的途徑施用，包含皮下、口服、肌肉、腹腔或其他非經(jīng)腸途徑或腸胃途徑。相似地，免疫原可以單一劑量或多劑量施用。一般熟知技藝者可輕易地決定免疫接種的時(shí)程表。在特定實(shí)施例中，傳輸系統(tǒng)和佐劑為montanidetmisa50v2(一種包含植物油和二縮甘露醇油酸(mannideoleate)的油質(zhì)疫苗佐劑組合物以制造油包水(即w/o)乳化液)、80(也稱(chēng)為聚山梨醇酯80或聚氧乙烯(20)山梨醇酐單油酸酯)、cpg寡核苷酸和/或其任意組合。在其他實(shí)施例，此藥物組合物為具有emulsigen或emulsigend作為佐劑的水包油包水(即w/o/w)乳化液。亦提供其他例行合并于疫苗制劑的成分，以及劑量用法說(shuō)明書(shū)，以產(chǎn)生良好的b和t細(xì)胞免疫反應(yīng)。適合注射用的藥物劑型包括無(wú)菌水溶液(水溶性)或分散體和無(wú)菌粉末，以當(dāng)場(chǎng)配制無(wú)菌注射液或分散體。其于制造和儲(chǔ)存狀況下必須穩(wěn)定，且必須可對(duì)抗微生物(例如細(xì)菌或真菌)污染而加以保存。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，包含，例如︰水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)、其合適的混合物和植物油。借由例如涂層(例如卵磷脂)、借由在懸浮狀況下維持所需粒徑，以及借由使用界面活性劑，以維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？山栌筛鞣N抗細(xì)菌和抗真菌劑(例如：對(duì)羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等)預(yù)防微生物作用。在許多情況下，以含有等滲劑(例如：糖或氯化鈉)為較佳?？墒褂醚舆t吸收試劑(例如：?jiǎn)斡仓徜X或/和明膠)來(lái)延長(zhǎng)注射用的組合物的吸收或延遲釋放。本發(fā)明也提供借由對(duì)哺乳動(dòng)物投予目標(biāo)肽組合物一段時(shí)間，以引發(fā)抗-lhrh抗體效價(jià)、降低睪固酮濃度、避免公豬臭、使睪丸和副睪萎縮、豬只免疫去勢(shì)，以及避孕的方法。普遍來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法可于豬只引發(fā)抗-lhrh抗體效價(jià)，且抗-lhrh抗體效價(jià)于一或兩次疫苗接種后超過(guò)2.0，較佳為2.5或3.0(log10)。本發(fā)明的方法也可抑制豬只睪固酮濃度，睪固酮濃度于一或兩次疫苗接種后不超過(guò)2.5nmol/l，較佳為2.0、1.87或1.0nmol/l。再者，本發(fā)明的方法可增加豬只體重，較佳為增加10％或更多。本發(fā)明的組合物可以此領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)方法投予，包含，但不限于，口服或注射，以肌肉注射為優(yōu)選。本發(fā)明的組合物包含一或多個(gè)本發(fā)明肽免疫原的有效量，以及藥學(xué)上可接受的載體。適當(dāng)劑型單位的組合物通常包含每公斤體重約0.5μg至約1mg的肽免疫原。當(dāng)以多劑量投予，其可以方便地劃分為每劑量的適當(dāng)量。劑量可例如為6.25μg至200μg，較佳為50μg，可通過(guò)注射給藥，較佳為肌肉注射。此后可重復(fù)(加強(qiáng))劑量。劑量取決于受試者的年齡、體重，以及此疫苗和治療領(lǐng)域所熟知的一般健康狀況。本發(fā)明更提供抑制豬只由性成熟所引發(fā)的特征的方法，包含投予本發(fā)明的疫苗組合物的有效量。在本發(fā)明方法中，劑量投予次數(shù)與時(shí)機(jī)并無(wú)特別限制。普遍來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的方法包含至少一劑量，較佳為二、三、四、五劑量或更多，更佳為二劑量或更多。此領(lǐng)域之技術(shù)者可輕易知道增加劑量投予次數(shù)以引發(fā)功效。第一劑可投予任何時(shí)期的豬只(例如：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10周齡)。疫苗接種時(shí)間點(diǎn)可依豬只種類(lèi)、劑量、佐劑和投予方式而改變或修改。普遍來(lái)說(shuō)，是于3周齡后進(jìn)行初次免疫(第一劑)，以于3至8周齡為較佳。于初次免疫后3至13周間進(jìn)行加強(qiáng)免疫(第二劑)為較佳。接種時(shí)程表于初免和加強(qiáng)免疫間有3至13周。在一實(shí)施例中，較佳的疫苗接種時(shí)程表可依據(jù)以下事項(xiàng)：于約8周齡進(jìn)行初次免疫，于約16周齡進(jìn)行加強(qiáng)免疫，在某些狀況下于加強(qiáng)免疫后6至8周屠宰豬只。本發(fā)明的初免/加強(qiáng)免疫疫苗接種時(shí)程表適用于豬只。其取決于不同國(guó)家的生產(chǎn)方法，在許多狀況下，豬只并不會(huì)生長(zhǎng)到21周齡。本發(fā)明的特定實(shí)施例包含，但不限于，以下事項(xiàng)：(1)用于去勢(shì)豬只的疫苗組合物，包含肽免疫原以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的輸送載體或佐劑，其中肽免疫原包含(a)seqidno：1的lhrh肽，以及(b)選自由seqidno：2、3、4以及5組成的群組的至少一th抗原表位，以及，任選地，seqidno：6的免疫刺激肽，其中l(wèi)hrh肽經(jīng)由其氨基端殘基共價(jià)連結(jié)至th抗原表位。(2)依據(jù)(1)的疫苗組合物，其中l(wèi)hrh肽、th抗原表位，以及，任選地，免疫刺激肽，是利用gly-gly、εnlys、lys-εnlys、lys-lys-εnlys、lys-lys-lys-εnlys(seqidno：11)、εnlys-lys-lys或εnlys-lys-lys-lys(seqidno：12)加以連接。(3)依據(jù)(1)的疫苗組合物，其中肽免疫原包含seqidno：7、8、9和/或10，或其混合物。(4)依據(jù)(1)的疫苗組合物，其中獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑包含isa50、isa50v2或emulsigend。(5)依據(jù)(1)的疫苗組合物，其中每一劑量的肽免疫原的總量為約12.5μg至200μg。(6)用以抑制豬只由性成熟所引發(fā)的特性的方法，包含投予(1)的疫苗組合物的有效量給豬只。(7)依據(jù)(6)的方法，其中特性包含公豬臭、性活動(dòng)力、性行為、生育力以及發(fā)情行為。(8)依據(jù)(6)的方法，其中疫苗組合物是以肌肉或皮下注射投予。(9)依據(jù)(6)的方法，其中疫苗組合物的第一劑是施用于3周齡至8周齡的豬只。(10)依據(jù)(6)的方法，其中疫苗組合物的第二劑是施用于6周齡至16周齡的豬只。本發(fā)明的額外的特定實(shí)施例包含，但不限于，以下事項(xiàng)：(1)獸醫(yī)學(xué)組合物包含：肽免疫原，選自以下所組成的群組(i)seqidno：7、8以及9的混合物，(ii)seqidno：10，以及(iii)(i)和(ii)的結(jié)合；以及獸醫(yī)學(xué)上可接受的輸送載體或佐劑。(2)依據(jù)(1)的獸醫(yī)學(xué)組合物，其中(a)中的肽免疫原為(i)seqidno：7、8和9的混合物。(3)依據(jù)(2)的組合物，其中獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑包含isa50、isa50v2或emulsigend。(4)依據(jù)(2)的組合物，其中每一劑量的肽免疫原的總量為約12.5μg至200μg。(5)用以抑制豬只由性成熟所引發(fā)的特性的方法，包含投予(2)的組合物的有效量給豬只。(6)依據(jù)(5)的方法，其中特性包含公豬臭、性活動(dòng)力、性行為、生育力以及發(fā)情行為。(7)依據(jù)(5)的方法，其中組合物是以肌肉或皮下注射投予。(8)依據(jù)(5)的方法，其中組合物的第一劑是施用于3周齡至8周齡的豬只。(9)依據(jù)(5)的方法，其中組合物的第二劑是施用于6周齡至16周齡的豬只。(10)用以減少動(dòng)物睪固酮及其衍生物產(chǎn)量的方法，包含投予(2)的組合物的有效量給動(dòng)物。(11)依據(jù)(1)的獸醫(yī)學(xué)組合物，其中(a)中的肽免疫原為(ii)seqidno：10。(12)依據(jù)(11)的組合物，其中獸醫(yī)學(xué)上可接受的佐劑包含isa50、isa50v2或emulsigend。(13)依據(jù)(11)的組合物，其中每一劑量的肽免疫原的總量為約12.5μg至200μg。(14)用以抑制豬只由性成熟所引發(fā)的特性的方法，包含投予(11)的組合物的有效量給豬只。(15)依據(jù)(14)的方法，其中特性包含公豬臭、性活動(dòng)力、性行為、生育力以及發(fā)情行為。(16)依據(jù)(14)的方法，其中組合物是以肌肉或皮下注射投予。(17)依據(jù)(14)的方法，其中組合物的第一劑是施用于3周齡至8周齡的豬只。(18)依據(jù)(14)的方法，其中組合物的第二劑是施用于6周齡至16周齡的豬只。(19)用以減少動(dòng)物睪固酮及其衍生物產(chǎn)量的方法，包含投予(11)的組合物的有效量給動(dòng)物?！緦?shí)施例】實(shí)施例1lhrh肽的合成關(guān)于有效的lhrh疫苗設(shè)計(jì)和制劑的開(kāi)發(fā)工作中的lhrh相關(guān)肽結(jié)構(gòu)的合成方法于下文描述。此肽可于小規(guī)模合成以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)研究，以及大規(guī)模(公斤)量產(chǎn)以進(jìn)行工/商業(yè)的疫苗制劑生產(chǎn)和血清學(xué)測(cè)定。設(shè)計(jì)lhrh相關(guān)抗原性肽的大型體系(長(zhǎng)度介于約10至40個(gè)氨基酸)，以篩選和選擇供有效lhrh疫苗使用的最優(yōu)化肽結(jié)構(gòu)。每一個(gè)結(jié)構(gòu)含有合成地連接至特定th抗原表位或免疫刺激肽(記載于表1，seqidno：2至6)的lhrh肽(seqidno：1)。用于本發(fā)明lhrh疫苗的lhrh肽為seqidno：7至10。用于偵測(cè)及/或測(cè)定抗-lhrh抗體的免疫原性的研究或相關(guān)血清學(xué)試驗(yàn)的所有肽是使用應(yīng)用生物系統(tǒng)自動(dòng)肽合成儀(型號(hào)430a、431及/或433型)，以fmoc化學(xué)法小規(guī)模合成。借由在固相支持物上獨(dú)立合成以制造每一個(gè)肽，其在氨基端和側(cè)鏈具有fmoc保護(hù)，用以保護(hù)三官能團(tuán)氨基酸的基團(tuán)。由固相支持物上切下完整的肽，且借由90％三氟乙酸(tfa)移除側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)。利用基質(zhì)輔助激光脫附游離飛行時(shí)間(maldi-tof)質(zhì)譜儀評(píng)估合成肽制備以確認(rèn)其正確氨基酸型式。另外也借由逆相高效能液相層析(rp-hplc)評(píng)估每一個(gè)合成肽以確認(rèn)其合成概況和制品濃度。盡管?chē)?yán)格控制合成過(guò)程(包括階段性監(jiān)測(cè)耦合效率)，但在延長(zhǎng)循環(huán)期間的意外的事件(包括氨基酸插入、刪除、置換，和提前終止)也制造了肽相似物。因此，合成的制劑通常包含多種肽相似物和目標(biāo)肽。即使包含這些非預(yù)期的肽相似物，得到的合成肽制劑仍然適合免疫學(xué)應(yīng)用(包括免疫診斷(作為抗體捕獲抗原)和疫苗接種(作為肽免疫原)的使用)。一般來(lái)說(shuō)，這樣的肽相似物，無(wú)論是有意設(shè)計(jì)，或是在合成過(guò)程所生成作為副產(chǎn)物的混合物，經(jīng)常如所欲肽的純化制劑般有效，只要利用具鑒別力的品質(zhì)管理程序監(jiān)控制程和產(chǎn)品評(píng)估過(guò)程，以保證采用這些肽的最終產(chǎn)品的再現(xiàn)性和效力。數(shù)百至千公克量的大規(guī)模肽合成可于商業(yè)化自動(dòng)合成儀ubi2003上，以15mmole至50mmole規(guī)模，依據(jù)相同的固態(tài)肽合成原理加以實(shí)行。為了獲得田間試驗(yàn)中最終疫苗制劑的活性成分，利用淺洗脫梯度以逆相高效能液相層析純化lhrh肽結(jié)構(gòu)，以maldi-tof質(zhì)譜儀分析特性，并以氨基酸分析和逆相高效能液相層析分析純度和一致性。實(shí)施例2疫苗制劑的制備三個(gè)lhrh肽免疫原(lhrh3：seqidno：7、8和9)的混合物和單一肽免疫原(lhrh1：seqidno：10)分別配制于使用seppic(france)的isa佐劑的油包水(w/o)乳化液，或mvp(usa)的emulsigend的水包油包水(w/o/w)乳化液。簡(jiǎn)而言之，以等摩爾比率混合在生理食鹽水中的肽(20％重量/體積氯化鈉溶液)，經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾(以0.22micron的過(guò)濾器)，并以均質(zhì)方式與isa50v2或emulsigend佐劑混合。全程監(jiān)測(cè)制備過(guò)程中的粘度。以鑒別測(cè)試(identitytest)、物理測(cè)試和無(wú)菌試驗(yàn)分析最終產(chǎn)物的特性。在無(wú)塵室中進(jìn)行所有配制、充填和包裝程序以維持無(wú)菌狀態(tài)。實(shí)施例3利用不同劑量的lhrh3(seqidno：7、8和9)疫苗制劑免疫接種公豬本實(shí)施例總共使用40只8周齡的公豬和8只手術(shù)去勢(shì)公豬。如表3和表4所示，這些豬只以每組8只分組，lhrh3(seqidno：7、8和9)以油質(zhì)基底佐劑(montanidetmisa50v或isa50v2)配制以形成油包水(w/o)乳化液(如表3第1至4組所示)，或以油質(zhì)基底佐劑emulsigend配制形成水包油包水(w/o/w)乳化液(如表4第8至11組所示)，以加強(qiáng)疫苗產(chǎn)品的免疫原性。三個(gè)對(duì)照組包含接受生理食鹽水的陰性對(duì)照組(第5和12組)、接受手術(shù)去勢(shì)的陽(yáng)性對(duì)照組(第6和13組)，以及接受最先進(jìn)市售lhrh疫苗的功效對(duì)照組(第7和14組)。血液樣品于初免后(或免疫接種后周數(shù)(wpi))0、4、8、10、12、14，和16周收集，分別測(cè)量豬只抗-lhrh抗體的血清效價(jià)和睪固酮的血清濃度。a.利用酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linkedimmunosorbentassay，elisa)分析血清抗-lhrh抗體效價(jià)開(kāi)發(fā)用于評(píng)估抗-lhrh抗體血清效價(jià)的酶聯(lián)免疫吸附分析法如以下所述。除非特別說(shuō)明，96-孔平底微盤(pán)的各孔洞分別以100μl的各目標(biāo)肽于37℃下涂覆1小時(shí)(以各2μg/ml或等摩爾混合物，于10mm的碳酸氫鈉緩沖液(ph9.5)中)。涂覆肽的孔洞以250μl含3％(重量)的明膠的pbs于37℃下培育1小時(shí)，以阻斷非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)，隨后以含有0.05％(體積)20的pbs洗滌三次并干燥。將100μl稀釋的血清樣品加入到每個(gè)孔洞中，并于37℃下反應(yīng)60分鐘。隨后以含有0.05％(體積)的20的pbs洗滌孔洞六次以移除未結(jié)合的抗體。加入100μl預(yù)先滴定為最佳稀釋濃度的以過(guò)氧化酶標(biāo)示的山羊-抗-豬igg抗體(置于含有1％(體積)的正常山羊血清與0.05％(體積)的20的pbs中)于每個(gè)孔洞中，并在37℃下再培育30分鐘。這些孔洞以含有0.05％(體積)的20的pbs洗滌六次以移除未結(jié)合的抗體，并以100μl受質(zhì)混合物(含0.04％(重量)的3’,3’,5’,5’-四甲基聯(lián)苯胺(tmb)和0.12％(體積)過(guò)氧化氫于檸檬酸鈉緩沖液中)反應(yīng)15分鐘。此受質(zhì)混合物借由形成有色的產(chǎn)物以檢測(cè)過(guò)氧化酶標(biāo)示。加入100μl的1.0m硫酸停止反應(yīng)并測(cè)定于450nm的吸光值(a450)。根據(jù)測(cè)定lhrh抗體血清效價(jià)的目的實(shí)行血清稀釋。為測(cè)定接受lhrh肽疫苗制劑豬只的抗體效價(jià)，將血清10倍連續(xù)稀釋(介于1:10至1:10,000)后，進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附分析，且所測(cè)定的血清效價(jià)以log10表示，其由a450的線性回歸分析計(jì)算而來(lái)。依據(jù)圖1a和圖1b，除了陰性(第5和12組)和手術(shù)去勢(shì)(第6和13組)組，包含seqidno：7、8以及9的試驗(yàn)組證明在加強(qiáng)免疫后兩周于10wpi(18周齡)具有高效價(jià)的lhrh抗體。接受疫苗接種組別(不僅是配制于isa50v2的組別(第1至4組)，也包括配制于emulsigend的組別(第8至11組))的抗體效價(jià)維持于接近或高于3.0(log10)直到16wpi(24周齡)(市場(chǎng)販?zhǔn)圬i只的時(shí)間)。相對(duì)來(lái)說(shuō)，接受豬只(第7組)的抗體效價(jià)只于14wpi(加強(qiáng)免疫后兩周)時(shí)上升，其抗體效價(jià)低于本發(fā)明的肽疫苗(第1至4組和第8至11組)。b.血清睪固酮濃度的評(píng)估借由市售酶聯(lián)免疫吸附分析法或放射免疫分析檢測(cè)血清睪固酮(tt)濃度。此試劑包括睪固酮酶聯(lián)免疫吸附分析法試劑(型號(hào)：eia-5179)、biovendor酶聯(lián)免疫吸附分析法試劑，以及seamans的放射免疫分析試劑。配制于isa50v2或emulsigend的第1至4組和第8至11組的血清中睪固酮濃度于特定實(shí)施例中分別地利用睪固酮酶聯(lián)免疫吸附分析法試劑加以測(cè)定，其與豬只相對(duì)應(yīng)的血清抗體效價(jià)呈逆相關(guān)，豬只于加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi或18周齡)具有低于去勢(shì)邊界值的濃度(去勢(shì)邊界值一般為1.87nmol/l，或更嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)為1.0nmol/l)。在配制于isa50v2或emulsigend之所有其他組別的豬只則維持睪固酮的去勢(shì)程度，如圖2a和圖2b所示，直到16wpi(即24周齡)，市場(chǎng)上豬只出售的時(shí)期。結(jié)果顯示本發(fā)明的lhrh3疫苗制劑對(duì)睪固酮具有劑量依賴(lài)性抑制，且第4和11組提供相對(duì)其他組別更高的抑制程度。與接受疫苗制劑的豬只相比，陰性和去勢(shì)對(duì)照組的豬只總是維持低抗-lhrh抗體效價(jià)的背景值水平，于作為未去勢(shì)動(dòng)物之陰性對(duì)照組(第5和12組)具血清睪固酮濃度波動(dòng)。對(duì)手術(shù)去勢(shì)陽(yáng)性對(duì)照組的豬只(第6和13組)而言，血清睪固酮濃度均保持于低去勢(shì)程度。接受lhrh疫苗的豬只直到12wpi仍維持高濃度的血清睪固酮，此時(shí)給予加強(qiáng)免疫，血清睪固酮濃度于14wpi(即加強(qiáng)免疫后兩周)后下降。結(jié)果清楚地顯示，對(duì)豬只去勢(shì)而言并不如本發(fā)明的疫苗制劑(第1至4組和第8至11組，包含配制于isa50v2或emulsigend的seqidno：7、8和9肽)般具有效力。c.體重依據(jù)圖3a和圖3b，全程監(jiān)測(cè)從免疫接種前(3周齡)至本試驗(yàn)結(jié)束(16wpi，24周齡)的豬只體重。結(jié)果顯示疫苗接種對(duì)動(dòng)物體重的影響。陰性對(duì)照組(接受生理食鹽水)和陽(yáng)性對(duì)照組(接受手術(shù)去勢(shì))的豬只于24周齡都具有顯著較低的平均體重，分別為94.9kg(陰性對(duì)照組，第5和12組)和88.8kg(手術(shù)去勢(shì)對(duì)照組，第6和13組)。相較于接受手術(shù)去勢(shì)的豬只(第6和13組)，接受200μg/ml/劑量之本發(fā)明疫苗制劑的豬只(第4和11組)具有顯著較高的經(jīng)濟(jì)效益，其于體重增加約27.9％。實(shí)施例4利用不同劑量lhrh1(seqidno：10)疫苗制劑免疫接種公豬在本實(shí)施例中，使用與實(shí)施例3類(lèi)似的試驗(yàn)方法，除了將疫苗制劑中的肽免疫原改成seqidno：10，并根據(jù)表5和表6調(diào)整劑量。免疫接種后，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集來(lái)自所有動(dòng)物的血清以測(cè)定lhrh抗體效價(jià)和血清睪固酮的相對(duì)應(yīng)濃度。此外，在犧牲時(shí)，也收集于24周齡豬只的性器官(睪丸和副睪)分析重量。a.利用酶聯(lián)免疫吸附分析法分析血清抗-lhrh抗體效價(jià)依據(jù)圖4a和圖4b，除了陰性(生理食鹽水)和陽(yáng)性(手術(shù)去勢(shì))對(duì)照組，包含seqidno：10之肽免疫原的所有試驗(yàn)組于加強(qiáng)免疫后二周的10wpi(18周齡)具有高效價(jià)的抗-lhrh抗體。不僅配制于佐劑isa50v2的第1至4組的豬只，也包括配制于emulsigend的第7至10組的豬只，此抗體效價(jià)維持于接近或高于3.0(log10)直到16wpi(24周齡)，即市場(chǎng)上豬只出售的時(shí)期。b.血清睪固酮濃度的評(píng)估依據(jù)圖5a和圖5b，配制于isa50v2的第1至4組或配制于emulsigend的第7至10組豬只的血清睪固酮濃度均與相對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)呈逆相關(guān)，且于加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi，18周齡)均達(dá)到低于去勢(shì)邊界值(<1.87nmol/l)的水準(zhǔn)。除了第1和7組的最低劑量，配制于isa50v2或emulsigend的所有其他組別的豬只均維持血清睪酮的去勢(shì)程度直到16wpi(24周齡)，此為市場(chǎng)上豬只出售的時(shí)期。c.體重依據(jù)圖6a和圖6b，全程監(jiān)測(cè)從免疫接種前(3周齡)至本試驗(yàn)結(jié)束(16wpi，24周齡)的豬只體重。結(jié)果顯示疫苗接種對(duì)動(dòng)物體重的影響。接受生理鹽水的陰性對(duì)照組和接受手術(shù)去勢(shì)的陽(yáng)性對(duì)照組豬只于24周齡都具有顯著較低的平均體重，分別為94.9kg(陰性對(duì)照組，第5和11組)和88.8kg(手術(shù)去勢(shì)對(duì)照組，第6和12組)。相較于接受手術(shù)去勢(shì)的豬只(第6和12組)，接受本發(fā)明疫苗制劑的豬只(第4和10組)具有顯著較高的經(jīng)濟(jì)效益，體重增加約20.3％。實(shí)施例5接受不同劑量lhrh1(seqidno：10)疫苗制劑豬只的免疫持續(xù)性在本實(shí)施例中，使用與實(shí)施例3類(lèi)似的試驗(yàn)方法，除了將肽免疫原改成seqidno：10，且根據(jù)表7調(diào)整劑量。于免疫接種后，在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集血清以測(cè)定lhrh抗體效價(jià)和相對(duì)應(yīng)的血清睪固酮濃度。此外，在豬只于32周齡犧牲時(shí)，收集豬只性器官(睪丸和副睪)測(cè)量重量。此試驗(yàn)的目的是延長(zhǎng)田間試驗(yàn)至24wpi或32周齡，收集血清樣品以測(cè)定lhrh抗體效價(jià)和相對(duì)應(yīng)的血清睪固酮濃度，用以評(píng)估依循標(biāo)準(zhǔn)免疫接種試驗(yàn)方法(于8周齡(0wpi)初免和于16周齡(8wpi)加強(qiáng)免疫)使用本發(fā)明疫苗制劑的免疫去勢(shì)效力的持續(xù)性。a.利用elisa分析血清抗-lhrh抗體效價(jià)如圖7所示，收集來(lái)自第1至4組豬只于加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi)的血清樣品，并測(cè)定其抗-lhrh抗體效價(jià)。所有樣本的抗-lhrh抗體效價(jià)均超過(guò)3.0(log10)，且此效價(jià)在10周的期間，直到20wpi(即28周齡)，仍維持于約3.0(log10)。此外，第2和3組維持抗-lhrh抗體效價(jià)于3.0(log10)直到24wpi(即32周齡)。相反地，陰性對(duì)照組(第5組)和去勢(shì)對(duì)照組(第6組)的抗體效價(jià)總是維持在低濃度的背景值程度。b.血清睪固酮濃度的評(píng)估如圖8所示，收集第1至4組豬只于加強(qiáng)免疫后兩周(即10wpi)的血清樣品，并測(cè)定血清睪固酮濃度。第1至4組豬只的所有樣品因?yàn)楦咝r(jià)抗-lhrh抗體的抑制，而具有位于去勢(shì)程度的血清睪固酮濃度。直到20wpi(即28周齡)，第1至4組的睪固酮濃度皆維持與手術(shù)去勢(shì)對(duì)照組(第6組)一樣低的程度。c.經(jīng)lhrh1疫苗制劑免疫去勢(shì)后的性器官(睪丸和副睪)萎縮在于24wpi(即32周齡)的擴(kuò)大試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，犧牲豬只并分析其性器官(包括睪丸和副睪)的重量，以評(píng)估免疫去勢(shì)效力。第1至4組豬只的睪丸和副睪萎縮至無(wú)功能的尺寸，如圖9至圖10所示。睪丸和副睪的重量也與血清睪固酮濃度相關(guān)。d.體重如圖11所示，第1至4組豬只相較于對(duì)照組(第5和6組)于體重增加上具有較佳的表現(xiàn)。e.以腹部脂肪的雄甾烯酮和糞臭素濃度衡量公豬臭的消除在試驗(yàn)期間，由試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的公豬臭因子定量證明腹部脂肪的公豬臭的有效消除可延長(zhǎng)豬只出售的時(shí)期至24wpi(即32周齡)。在此試驗(yàn)中，于豬只犧牲時(shí)由腹部脂肪萃取出雄甾烯酮和糞臭素，并以高效能液相層析偵測(cè)。參照?qǐng)D12，來(lái)自第1至4組豬只脂肪中雄甾烯酮濃度控制于0.5μg/g脂肪以下。特別在第3組，雄甾烯酮的平均值降低到0.1384μg/g脂肪。參照?qǐng)D13，第1至3組豬只的糞臭素濃度控制在0.1μg/g脂肪以下。對(duì)第3組豬只而言，其糞臭素的平均值為最低，為0.0514μg/g脂肪。此外，繪制特定樣品的個(gè)別雄甾烯酮和糞臭素濃度以評(píng)估公豬臭的風(fēng)險(xiǎn)因子，如圖14所示，將試驗(yàn)所收集的所有樣品分成如低度、中度/低度、中度/高度和高度四個(gè)區(qū)域。依照?qǐng)D14，手術(shù)去勢(shì)組(第6組)總是維持最低濃度的公豬臭因子。來(lái)自第3組豬只的樣品具有出色表現(xiàn)，其所有樣品均分布于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域直到24wpi。來(lái)自第2組豬只的樣品具有良好的表現(xiàn)直到24wpi，此時(shí)7/8的樣品分布于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，以及一個(gè)樣品位于高度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。來(lái)自第1組與第2組的樣品具有相似表現(xiàn)，其中7/8的樣品分布于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，且一個(gè)樣品出現(xiàn)于中度/高度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域。相反地，生理食鹽水對(duì)照組只有2/8樣品位于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，2/8位于中度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，且4/8位于高度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域(圖14)。本發(fā)明的lhrh1疫苗制劑證實(shí)其公豬臭消除效力可持續(xù)到24wpi(即32周齡)。本試驗(yàn)結(jié)果明確指出，接受不同劑量的本發(fā)明lhrh1疫苗制劑的豬只可有效地抑制雄甾烯酮和糞臭素的產(chǎn)生，以消除相對(duì)應(yīng)肉制品的公豬臭。實(shí)施例6以lhrh1疫苗制劑于不同時(shí)間間隔實(shí)行初免與加強(qiáng)免疫的免疫接種時(shí)程表對(duì)免疫去勢(shì)的影響在本實(shí)施例中，使用與實(shí)施例3類(lèi)似的試驗(yàn)方法，除了使用于疫苗制劑的肽免疫原改成seqidno：10和使用佐劑isa50v2外，根據(jù)表8修改初免與加強(qiáng)免疫接種的時(shí)間點(diǎn)。收集不同時(shí)間點(diǎn)的血清以測(cè)定抗-lhrh抗體效價(jià)與睪固酮的血清濃度。如圖15所示，第1組豬只證實(shí)了高度免疫原性，在22周齡豬只測(cè)得為3.556(log10)的抗lhrh平均抗體效價(jià)，且此效價(jià)維持于3.235(log10)直到26周齡。對(duì)第2組豬只而言，最高抗體效價(jià)為在18周齡的3.526(log10)，且在26周齡時(shí)維持在2.869(log10)。對(duì)第3組豬只而言，因?yàn)樵?2周齡之晚期加強(qiáng)免疫接種時(shí)程表，最高抗體效價(jià)為于24周齡(即加強(qiáng)免疫后兩周)的3.219(log10)，且效價(jià)維持于2.682(log10)直到26周齡。此外，如圖16所示，第1組的豬只在20周齡(即加強(qiáng)免疫后兩周)時(shí)顯現(xiàn)免疫去勢(shì)效應(yīng)(睪固酮濃度≦1.0nmol/l)，免疫去勢(shì)效應(yīng)持續(xù)至少6周至26周齡。第2組豬只也顯現(xiàn)高度免疫去勢(shì)效力。第2組豬只的睪固酮濃度于加強(qiáng)免疫后2至6周(即在22周齡)期間為低于1.0nmol/l，且維持相對(duì)低濃度(睪固酮濃度≦1.644nmol/l)直到26周齡。于加強(qiáng)免疫后兩周，第3組豬只的平均睪固酮濃度為4.535nmol/l。第3組豬只的睪固酮濃度在26周齡抑制至1.968nmol/l。此對(duì)豬農(nóng)有利，因?yàn)榭捎谀挲g較小的豬只進(jìn)行疫苗初次免疫，較佳于約3周齡，以方便進(jìn)行動(dòng)物管理。豬農(nóng)也可以對(duì)年齡較大的豬只進(jìn)行加強(qiáng)免疫，因此對(duì)工作者提供緩沖時(shí)間以免疫豬只。對(duì)于豬場(chǎng)實(shí)際的免疫去勢(shì)操作而言，可確保將睪固酮濃度穩(wěn)定地維持在低的去勢(shì)程度。本試驗(yàn)的結(jié)果指出，本發(fā)明疫苗制劑的應(yīng)用可提早至3至4周齡，以及遲至在18周齡提供加強(qiáng)免疫。初免和加強(qiáng)免疫時(shí)程表均可誘導(dǎo)高免疫原性，有效抑制于22至26周齡豬只的血清睪固酮濃度，此為肉品市場(chǎng)上一般豬只出售的時(shí)期。實(shí)施例7借由lhrh3疫苗制劑消除公豬臭于肉品產(chǎn)業(yè)建立謹(jǐn)慎和對(duì)消費(fèi)者友好的方法，設(shè)定雄甾烯酮的邊界值為0.5μg/g脂肪供公豬臭風(fēng)險(xiǎn)因子的評(píng)估。以中度雄甾烯酮水平(0.5-1.0μg/g脂肪)結(jié)合低度糞臭素水平(<0.1μg/g脂肪)，或以低度雄甾烯酮水平(<0.5μg/g脂肪)結(jié)合中度糞臭素水平(0.1-0.22μg/g脂肪)，表示發(fā)生公豬臭的低度風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)公豬臭的參數(shù)(生物標(biāo)記)均于中度水準(zhǔn)(雄甾烯酮0.5-1.0μg/g脂肪；糞臭素0.1-0.22μg/g脂肪)時(shí)，表示發(fā)生公豬臭的中度風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)生物標(biāo)記(雄甾烯酮和糞臭素)同時(shí)超過(guò)此些邊界值時(shí)，其意謂著視肉品為具有發(fā)生公豬臭的高度風(fēng)險(xiǎn)(表9)。在此實(shí)施例中，使用與實(shí)施例3類(lèi)似的試驗(yàn)方法。豬只以配制于佐劑isa50v2的lhrh3(seqidno：7、8和9)的油包水(w/o)乳化液進(jìn)行免疫接種(如表10所示)。免疫接種后，收集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清以測(cè)定血清睪固酮濃度和抗-lhrh抗體效價(jià)。此外，收集豬只的組織和器官以測(cè)定睪丸和副睪的重量，并利用高效能液相層析測(cè)定腹部脂肪的糞臭素和雄甾烯酮量。a.睪丸和副睪的萎縮由不同時(shí)間點(diǎn)(即于本研究中分別為10、12、14和16wpi)犧牲的豬只所分離器官的重量，可觀察到睪丸和副睪的萎縮(分別如圖17a至圖17d所示)。以本發(fā)明的疫苗制劑(lhrh3)免疫接種時(shí)，于本試驗(yàn)期間，在增加濃度的抗-lhrh抗體的抑制性影響下，睪丸和副睪隨時(shí)間萎縮，于10wpi時(shí)的副睪和于12wpi(p<0.05)時(shí)的睪丸的重量顯著地減少，如圖17所示。b.公豬臭的測(cè)定由接種的豬只或未去勢(shì)的公豬收集5g背部脂肪，分別加入1.5ml的100％甲醇。然后將脂肪磨碎直到完全均質(zhì)化。將脂肪萃取物置于15ml離心管中，并在室溫下超音波震蕩5分鐘。將脂肪萃取物置于冰上冷卻15分鐘，然后在5℃下以4,000rpm離心20分鐘，以分離組織碎片。將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5ml的離心管中。豬只以疫苗制劑免疫接種后，抗-lhrh抗體的最高效價(jià)出現(xiàn)在10wpi(即加強(qiáng)免疫后兩周)，睪固酮濃度抑制至接近去勢(shì)程度，為約或低于1.0nmol/l，其造成之脂肪中雄甾烯酮濃度的減少如圖18a所示。接受本發(fā)明的lhrh3疫苗制劑豬只的雄甾烯酮濃度為少于0.02至0.53μg/g脂肪，相較之下，接受生理食鹽水的陰性對(duì)照組豬只的雄甾烯酮濃度為約少于0.02至2.12μg/g脂肪。相對(duì)于對(duì)照組，其雄甾烯酮濃度于10wpi顯著地被抑制(p<0.05)直到16wpi(24周齡)本試驗(yàn)結(jié)束。此外，當(dāng)與陰性對(duì)照組的糞臭素濃度(為約0.04至0.36μg/g脂肪)(圖19a)比較時(shí)，接受本發(fā)明的lhrh3疫苗制劑豬只的糞臭素濃度介于約0.004至0.2μg/g脂肪(圖19b)。因?yàn)槌＿M(jìn)行豬只食物攝取和代謝衍生物(例如：儲(chǔ)存于相對(duì)應(yīng)脂肪組織的糞臭素)的控制，接受本發(fā)明的lhrh3疫苗制劑豬只的糞臭素濃度只有于14wpi顯著地減少。依照產(chǎn)業(yè)結(jié)論，當(dāng)雄甾烯酮和糞臭素二者同時(shí)超過(guò)邊界值(雄甾烯酮：0.5μg/g脂肪；糞臭素：0.22μg/g脂肪)時(shí)，其意謂著視肉品為發(fā)生公豬臭的高度風(fēng)險(xiǎn)。圖19的結(jié)果指出，由疫苗接種組別提供的所有脂肪樣品于對(duì)厭惡氣味的敏化評(píng)估中屬于低度風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域，其不論于10wpi或于16wpi具有低雄甾烯酮濃度(<0.5μg/g脂肪)和低糞臭素濃度(<0.22μg/g脂肪)；然而，陰性對(duì)照組豬只中有約50％的肉品曝露于發(fā)生公豬臭的風(fēng)險(xiǎn)中。實(shí)施例8本發(fā)明lhrh1疫苗制劑的免疫接種時(shí)程表的適應(yīng)性在本實(shí)施例中，使用與實(shí)施例3類(lèi)似的試驗(yàn)方法，除了劑量為25μg/2ml之外，以如表11所示配制于佐劑isa50v2以形成油包水(w/o)乳化液的lhrh1(seqidno：10)肽進(jìn)行免疫接種，且疫苗接種時(shí)間點(diǎn)如表11所示。a.利用elisa分析血清抗-lhrh抗體效價(jià)實(shí)施例初始階段的抗-lhrh抗體的效價(jià)為1.458±0.007(log10)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)，以其作為背景值。初免和加強(qiáng)免疫接種后(第1至3組)，其抗體效價(jià)逐漸增加且均于加強(qiáng)免疫后兩周達(dá)到最高水準(zhǔn)。第1組的平均抗體效價(jià)從10wpi的最高水準(zhǔn)3.636±0.577(log10)下降到在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的2.418±0.742(log10)。第2組的平均抗體效價(jià)從此四組中的最高水準(zhǔn)3.868±0.221(log10)下降到研究結(jié)束時(shí)的2.806±0.213(log10)。第3組和第4組的抗體濃度曲線相似。此結(jié)果顯示，第一次免疫接種可優(yōu)選地于8周齡到3周齡時(shí)投予(圖20)。b.血清睪固酮濃度的評(píng)估如圖21所示，所有組別于試驗(yàn)起始階段的睪固酮濃度為2.943±2.854(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)nmol/l。設(shè)定疫苗效力評(píng)估的時(shí)間點(diǎn)為加強(qiáng)免疫后兩周，其通常為免疫去勢(shì)中最低睪固酮(tt)濃度?；诖擞^察，第1至4組的平均睪固酮濃度分別為1.265±0.353、1.329±0.636、1.904±2.297以及1.222±0.445(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)nmol/l。借由克-瓦二氏單因子等級(jí)變異數(shù)分析法(kruskal-wallisonewayanalysisofvarianceonranks)分析，顯示組別間不具有統(tǒng)計(jì)上顯著性差異(p＝0.992)。此外，抗-lhrh抗體效價(jià)與睪固酮濃度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，具有-0.72的相關(guān)系數(shù)。在此，在加強(qiáng)免疫后，高抗-lhrh抗體效價(jià)造成低睪固酮濃度。為評(píng)估免疫持續(xù)性，以第3組的豬只表現(xiàn)最佳(即最低睪固酮濃度)，于24周齡的平均血清睪固酮濃度為0.896±0.386nmol/l。第3和4組的間則沒(méi)有顯著差異(p＝0.835)。隨時(shí)程表推進(jìn)，睪固酮的濃度增加至1.913±0.930nmol/l(第2組)和4.149±3.603nmol/l(第1組)。通過(guò)鄧恩法(dunn’smethod)分析，顯示第1和3組之間具有顯著差異(p＝0.010)。c.性器官測(cè)量從12周齡起測(cè)量睪丸尺寸(長(zhǎng)度和寬度)，并使用下述公式計(jì)算體積：睪丸體積＝1/2xaxb2，此處“a”為睪丸的長(zhǎng)度“b”為睪丸的寬度性器官的測(cè)量包含：(1)活體的睪丸長(zhǎng)度和寬度，以及(2)在尸體剖檢的睪丸和副睪重量、長(zhǎng)度和寬度。根據(jù)圖22和圖23，第1至4組間的成對(duì)睪丸重量、成對(duì)副睪重量和睪丸長(zhǎng)度沒(méi)有差異?；铙w的睪丸長(zhǎng)度和體積(如圖22a和圖22b所示)在22周齡前均高度地被抑制。然而，于每一個(gè)參數(shù)中，第2組豬只均具有最佳結(jié)果。于24周齡的雄甾烯酮和糞臭素濃度分布如圖24所示。依據(jù)討人喜歡的公豬臭因子濃度的類(lèi)別，第1、3和4組中87.5％的豬只為“低度風(fēng)險(xiǎn)”，其對(duì)人類(lèi)的味覺(jué)和嗅覺(jué)并不敏感。第2組的所有豬只落于“低度風(fēng)險(xiǎn)”區(qū)域，因此呈現(xiàn)100％有效。d.體重測(cè)定本試驗(yàn)中每頭豬只的體重。各分組豬只的生長(zhǎng)模式類(lèi)似。臺(tái)灣市場(chǎng)上販?zhǔn)圬i只的平均重量為約115kg，此可在26周齡前達(dá)成?？傊?，相較分別于8和16周齡實(shí)行初免和加強(qiáng)免疫的定期免疫接種計(jì)劃，本發(fā)明的初免時(shí)程表可彈性地改變至于3周齡的豬只施用。此外，如本試驗(yàn)所示，加強(qiáng)免疫的時(shí)程表可遲至于14至16周齡時(shí)施用。實(shí)施例9利用lhrh1疫苗制劑分析早期適應(yīng)性處理在本實(shí)施例中，使用與實(shí)施例3類(lèi)似的試驗(yàn)方法，除了于疫苗制劑使用的肽免疫原改成seqidno：10之外，疫苗接種時(shí)間點(diǎn)如表12所示。本實(shí)施例的目的為評(píng)估若疫苗制劑投予非常幼小豬仔時(shí)的去勢(shì)持續(xù)性，以及導(dǎo)致性器官萎縮的免疫治療。此試驗(yàn)可評(píng)估非常早期的“彈性治療方案”，以決定免疫接種方案的最早初免時(shí)間。a.血清抗-lhrh抗體效價(jià)分析如圖25所示，第1組(于3日齡(d3)進(jìn)行初免，并于3周齡進(jìn)行加強(qiáng)免疫)于12周齡的平均抗-lhrh抗體效價(jià)為2.346±0.451(log10)。另外，第2組(于7日齡進(jìn)行初免，并于3周齡進(jìn)行加強(qiáng)免疫)于6周齡的抗-lhrh抗體效價(jià)為2.173±0.527(log10)。于這些組別中，只有第3組的豬只(于3周齡進(jìn)行初次免疫且于6周齡進(jìn)行加強(qiáng)免疫)于8周齡的抗-lhrh抗體效價(jià)高達(dá)2.767±0.476(log10)。對(duì)在第1至3組的豬只而言，于加強(qiáng)免疫二周后達(dá)到最高的抗-lhrh抗體效價(jià)之后，第1、2和3組的抗體效價(jià)分別高于1.718±0.297、1.765±0.340和1.770±0.283(log10)。第4組豬只于3周齡實(shí)行初免，但于16周齡加強(qiáng)免疫。第4和5組的豬只于16周齡進(jìn)行加強(qiáng)免疫后二周(在18周齡)可達(dá)到較高的抗體效價(jià)，分別為3.249±0.346和2.893±0.786。接受市售疫苗的豬只(第6組)，抗-lhrh抗體效價(jià)在22周齡(即加強(qiáng)免疫后二周)被誘發(fā)至高于1.724±0.339(log10)。陽(yáng)性對(duì)照(即接受手術(shù)去勢(shì)的豬只(第7組))和陰性對(duì)照(即未接受疫苗接種的豬只(第8組))皆不會(huì)引發(fā)超過(guò)背景水平的抗-lhrh抗體效價(jià)，其分別測(cè)定數(shù)值為1.451±0.006和1.445±0.010(log10)。b.血清睪固酮濃度的評(píng)估如圖26所描述，第1和2組豬只的血清睪固酮濃度分別減少至最低濃度2.154±0.921nmol/l于10周齡以及2.183±1.231nmol/l于6周齡。第3組于3周齡投予第一劑，且睪固酮濃度曲線與第1和2組相似。第3組的最低睪固酮濃度為于12周齡的3.065±0.205nmol/l。無(wú)論是否于3或8周齡投予第一劑，當(dāng)延遲第4和5組的加強(qiáng)免疫接種至16周齡，第4和5組在20周齡之睪固酮濃度分別抑制至低水準(zhǔn)，為約0.586±0.184和0.893±1.192nmol/l。相反地，第6組的豬只依使用說(shuō)明進(jìn)行接種，在20周齡豬只的血清中，保持高濃度的睪固酮(約9.415±7.560nmol/l)。對(duì)接受手術(shù)去勢(shì)的第7組的豬只而言，每頭豬的睪固酮濃度始終保持在背景值(約0.559±0.372nmol/l)。對(duì)于未接受疫苗接種以作為陰性對(duì)照組(第8組)的豬只而言，試驗(yàn)期間中的平均睪固酮濃度維持在正常濃度(介于3.546±2.409nmol/l和7.380±3.269nmol/l之間)。綜上所述，抗-lhrh抗體效價(jià)可利用早在3周齡的初免和之后的加強(qiáng)免疫有效地誘導(dǎo)，其維持高抗體效價(jià)至試驗(yàn)結(jié)束，與依循常規(guī)疫苗接種時(shí)程表(于8周齡初免和16周齡加強(qiáng)免疫)者具有相似的抗體濃度曲線。因此，于3周齡至8周齡給予初次免疫，而于16周齡給予加強(qiáng)免疫時(shí)，血清睪酮濃度可有效地抑制至低水平。因此方便豬農(nóng)可于3周齡豬只(此時(shí)豬只要投予許多其他一般疫苗)實(shí)行具彈性的早期階段免疫去勢(shì)時(shí)程表。實(shí)施例10以100μg/ml/劑量的lhrh3疫苗制劑于田間試驗(yàn)(于8和16周齡分別進(jìn)行初免和加強(qiáng)免疫并在22周齡結(jié)束)評(píng)估免疫去勢(shì)效力于臺(tái)灣南部的豬場(chǎng)施行大規(guī)模的田間試驗(yàn)，利用二個(gè)gmp批次的lhrh3疫苗制劑于田間試驗(yàn)評(píng)估免疫去勢(shì)效力。在此實(shí)施例中，于豬場(chǎng)內(nèi)準(zhǔn)備36頭公豬和8至9周齡的8只去勢(shì)豬只。將豬只分為4組，并于0、8、10、12以及14wpi稱(chēng)重。所有豬只在0和8wpi免疫接種，且于0、8、10、12以及14wpi抽血以測(cè)定抗-lhrh抗體的血清效價(jià)和血清睪固酮濃度(如表13所示)。犧牲后，測(cè)量性器官(睪丸、副睪、精囊和前列腺腺體)重量、背部脂肪厚度和腰眼面積(最長(zhǎng)肌)。a.利用elisa分析血清抗-lhrh抗體效價(jià)如圖27和表14所示，第1和2組豬只的抗-lhrh抗體效價(jià)明顯高于第3組(未去勢(shì)對(duì)照組(公豬))和第4組(手術(shù)去勢(shì)對(duì)照組(閹豬))的豬只。例如，第1組的抗-lhrh抗體效價(jià)約為1.52±0.12(log10)至2.90±0.42(log10)，以及第2組的抗-lhrh抗體效價(jià)約為1.45±0.01(log10)至3.09±0.37(log10)。相較之下，第3和4組的所有抗-lhrh抗體效價(jià)顯著地低在第1和2組。b.對(duì)免疫去勢(shì)的血清睪固酮濃度的評(píng)估如圖28和表15所示，第1和2組所有豬只在以每劑量100μg/ml的lhrh3疫苗制劑免疫接種后，具有100％的免疫去勢(shì)率。第1和2組所有豬只的睪固酮濃度從8wpi起抑制至非常低的水平，達(dá)到免疫去勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的lhrh3疫苗制劑可有效地抑制豬只性成熟的特性。c.于接受疫苗接種豬只的體重增加豬只體重的測(cè)定如表16所示。第1和2組豬只體重高于第3組。如圖29和表17所示，與去勢(shì)對(duì)照組(第4組)相比，接種疫苗的豬只(第1和2組)的平均日增重(adg)較高。平均日增重增加的主要原因是平均日攝食量(adfi)的增加，而非飼料換肉率(fe)。田間試驗(yàn)的結(jié)果證明，本發(fā)明的lhrh3疫苗制劑當(dāng)利用分別于8和16周齡的初免和加強(qiáng)免疫方案以每劑量100μg投予時(shí)，可有效地免疫去勢(shì)及顯著地促進(jìn)公豬生長(zhǎng)。此促進(jìn)生長(zhǎng)的結(jié)果為豬只可超前常規(guī)育種計(jì)劃二周于市場(chǎng)上販?zhǔn)?，?duì)豬農(nóng)具有顯著的額外經(jīng)濟(jì)效益。d.生殖道性器官的萎縮在14wpi(即22周齡)本試驗(yàn)結(jié)束時(shí)犧牲豬只，對(duì)睪丸、副睪、精囊和前列腺稱(chēng)重，以評(píng)估免疫去勢(shì)效力。對(duì)第1和2組的豬只而言，生殖道性器官(包括睪丸、副睪、精囊和前列腺)的重量顯著地下降(表18)，且這些生殖道性器官萎縮至無(wú)功能的尺寸。綜上所述，本發(fā)明的lhrh肽疫苗制劑具有比市售產(chǎn)品更高的免疫去勢(shì)效果。于畜牧業(yè)領(lǐng)域中，除了因?yàn)槿说酪蛩貙⒊Ｒ?guī)的手術(shù)去勢(shì)改變成免疫去勢(shì)之外，此種免疫去勢(shì)所造成的顯著重量增加還可產(chǎn)生顯著的經(jīng)濟(jì)效益，故為往后動(dòng)物去勢(shì)的趨勢(shì)。雖然本發(fā)明已經(jīng)通過(guò)實(shí)施例及較佳實(shí)施例加以描述，可被理解的是，本發(fā)明并不限于所揭露的實(shí)施例。相反的，其意圖涵蓋各種修改和類(lèi)似的排列(如對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員為顯而易見(jiàn)者)。因此，應(yīng)賦予本案所附的權(quán)利要求書(shū)最寬的解釋?zhuān)园写朔N的修改和類(lèi)似的排列。所有說(shuō)明書(shū)中所揭示的發(fā)明技術(shù)特點(diǎn)可以任意方式組合。說(shuō)明書(shū)中揭示之每一技術(shù)特點(diǎn)可以提供相同、等同或相似目的的其他方式替換。因此，除非另有特別說(shuō)明，文中所有揭示的特點(diǎn)均只是等同或相似特點(diǎn)的一般系列的實(shí)例。由上述可知，熟習(xí)此技藝者能輕易地了解本發(fā)明的必要特征，在不脫離其精神與范圍之下能就本發(fā)明做許多改變與調(diào)整以應(yīng)用于不同用途與條件。表1、lhrh、th抗原表位和協(xié)同刺激的侵染素肽結(jié)構(gòu)區(qū)域序列表2、本發(fā)明lhrh肽免疫原序列表3、配制于isa50v2中的lhrh3制劑的研究設(shè)計(jì)*周齡；#wpi：疫苗接種后周數(shù)(初免后周數(shù))(weekspost(first)immunization)；§lhrh3包含seqidno：7、8以及9的肽。表4、配制于emulsigend中的lhrh3制劑的研究設(shè)計(jì)*周齡；#wpi：疫苗接種后周數(shù)(初免后周數(shù))；§lhrh3包含seqidno：7、8以及9的肽。表5、配制于isa50v2中的lhrh1制劑的研究設(shè)計(jì)*周齡；#wpi：疫苗接種后周數(shù)(初免后周數(shù))；§lhrh1包含seqidno：10的肽。表6、配制于emulsigend中的lhrh1制劑的研究設(shè)計(jì)*周齡；#wpi：疫苗接種后周數(shù)(初免后周數(shù))；§lhrh1包含seqidno：10的肽。表7、免疫持續(xù)性的研究設(shè)計(jì)*周齡；#wpi：疫苗接種后周數(shù)(初免后周數(shù))；§lhrh1包含seqidno：10的肽。表8、疫苗接種的時(shí)間點(diǎn)疫苗接種：25μg/ml的seqidno：10的肽；b：采血。表9、借由雄甾烯酮和糞臭素的組合的邊界值(cut-offvalues)對(duì)公豬臭的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估表10、公豬臭消除的研究設(shè)計(jì)*周齡；§lhrh3包含seqidno：7、8以及9的肽。表11、免疫接種適應(yīng)性研究的時(shí)程表表12、早齡適應(yīng)性研究的時(shí)程表日齡；*w:周齡；#wpi：疫苗接種后周數(shù)(初免后周數(shù))。表13、免疫持續(xù)性的研究設(shè)計(jì)表14、抗-lhrh抗體的效價(jià)分析表15、睪固酮濃度和免疫去勢(shì)*設(shè)定睪固酮的去勢(shì)程度為在第二次注射后二周(10wpi)≦1.87nmol/l(99％置信區(qū)間)。表16、相較于對(duì)照組豬只(第3和4組)的接受疫苗制劑豬只(第1和2組)的體重表17、平均日增重、平均日采食量和飼料換肉率組別平均日增重(kg)平均日采食量(kg)飼料換肉率10.9232.4892.69621.0002.6322.63230.9062.2202.45340.8092.2882.828表18、生殖道性器官重量表18(續(xù))、生殖道性器官重量【序列表】<110>美國(guó)聯(lián)合生物醫(yī)學(xué)公司<120>免疫性lhrh組合物及其在豬只中的應(yīng)用<130>1004263.212wo(2033-wo)<140>tbd<141>2014-07-25<150>pct/us2014048164/<151>2014-07-25<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>10<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(10)<223>lhrh肽<400>1gluhistrpsertyrglyleuargprogly1510<210>2<211>17<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(17)<223>破傷風(fēng)毒素(aa.830-844)<400>2lyslysglntyrilelysalaasnserlyspheileglyleuthrglu151015leu<210>3<211>17<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(17)<223>麻疹病毒f蛋白質(zhì)輔助t細(xì)胞抗原表位<400>3leusergluilelysglyvalilevalhisargleugluglyvalgly151015gly<210>4<211>15<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(15)<223>b型肝炎表面抗原輔助t細(xì)胞抗原表位<400>4phepheleuleuthrargileleuthrileproglnserleuglu151015<210>5<211>19<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(19)<223>結(jié)構(gòu)性合成抗原庫(kù)(ssal)輔助t細(xì)胞抗原表位<220><221>misc_feature<222>(4)..(4)<223>sort<220><221>misc_feature<222>(7)..(7)<223>korr<220><221>misc_feature<222>(8)..(8)<223>gort<220><221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>hort<220><221>misc_feature<222>(13)..(13)<223>korr<400>5ileserilexaagluilexaaxaavalilevalxaaxaailegluthr151015ileleuphe<210>6<211>16<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>來(lái)自侵染素之協(xié)同刺激的肽結(jié)構(gòu)區(qū)域<400>6thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015<210>7<211>27<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(17)<223>破傷風(fēng)毒素輔助t細(xì)胞抗原表位<220><221>肽<222>(18)..(27)<223>lhrh<400>7lyslysglntyrilelysalaasnserlyspheileglyilethrglu151015leugluhistrpsertyrglyleuargprogly2025<210>8<211>45<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>來(lái)自侵染素之協(xié)同刺激的肽結(jié)構(gòu)區(qū)域<220><221>肽<222>(17)..(18)<223>連接子<220><221>肽<222>(19)..(35)<223>麻疹病毒f蛋白質(zhì)輔助t細(xì)胞抗原表位<220><221>肽<222>(36)..(45)<223>lhrh<400>8thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015glyglyleusergluilelysglyvalilevalhisargleuglugly202530valglyglygluhistrpsertyrglyleuargprogly354045<210>9<211>45<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>來(lái)自侵染素之協(xié)同刺激的肽結(jié)構(gòu)區(qū)域<220><221>肽<222>(17)..(18)<223>連接子<220><221>肽<222>(19)..(33)<223>b型肝炎表面抗原輔助t細(xì)胞抗原表位<220><221>肽<222>(34)..(35)<223>連接子<220><221>肽<222>(36)..(45)<223>lhrh<400>9thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015glyglyphepheleuleuthrargileleuthrileproglnserleu202530gluglyglygluhistrpsertyrglyleuargprogly354045<210>10<211>47<212>prt<213>豬<220><221>肽<222>(1)..(16)<223>來(lái)自侵染素之協(xié)同刺激的肽結(jié)構(gòu)區(qū)域<220><221>肽<222>(17)..(17)<223>epsilonk作為連接子<220><221>肽<222>(18)..(36)<223>結(jié)構(gòu)性合成抗原庫(kù)1(ssal1)輔助t細(xì)胞抗原表位<220><221>misc_feature<222>(21)..(21)<223>sort<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>rork<220><221>misc_feature<222>(25)..(25)<223>torg<220><221>misc_feature<222>(29)..(29)<223>torh<220><221>misc_feature<222>(30)..(30)<223>korr<220><221>肽<222>(37)..(37)<223>epsilonk作為連接子<220><221>肽<222>(38)..(47)<223>lhrh<400>10thralalysserlyslyspheprosertyrthralathrtyrglnphe151015lysileserilexaagluilexaaxaavalilevalxaaxaaileglu202530thrileleuphelysgluhistrpsertyrglyleuargprogly354045<210>11<211>4<212>prt<213>人類(lèi)<220><221>肽<222>(4)..(4)<223>epsilonk<220><221>肽<222>(1)..(4)<223>間隔<400>11lyslyslyslys1<210>12<211>4<212>prt<213>人類(lèi)<220><221>肽<222>(1)..(1)<223>eps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