一種外周血中抗ny-eso-1自身抗體的檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種外周血中抗NY?ESO?1自身抗體的檢測方法，所述方法以NY?ESO?1重組蛋白為抗原制備抗NY?ESO?1抗體，將抗NY?ESO?1抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備抗體偶聯(lián)物，然后將NY?ESO?1重組蛋白混合液a與外周血待測樣品混合反應5?10min，最后再加入抗體偶聯(lián)物，檢測546nm處吸光值，根據(jù)標準曲線獲得樣品中抗NY?ESO?1自身抗體濃度；本發(fā)明還提供一種外周血中抗NY?ESO?1自身抗體的化學發(fā)光檢測方法。本發(fā)明所述外周血中抗NY?ESO?1自身抗體的檢測方法可在生化分析儀和化學發(fā)光免疫分析儀等大型自動化儀器上進行大樣本自動化檢測，靈敏度1?10ng/mL。
【專利說明】
一種外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法 (一)
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法。 (二)
【背景技術】
[0002] NY-ES0-1是癌-睪丸抗原（cancer-testis antigen，CTA)家族中的重要成員，在腫 瘤抗原中具有較強免疫原性，在多種腫瘤中廣泛表達，而在正常組織中幾乎不表達。NY-ES0-1抗原最初從食管癌組織中篩選得到的（Chen YT，et al.Cancer J.2000,6 Suppl3: S208-217.)。此后，發(fā)現(xiàn)NY-ES0-1在神經(jīng)母細胞瘤、滑膜肉瘤、惡性黑素瘤、卵巢癌等多種腫 瘤組織中均表達較高，在結直腸癌、肝癌、尿路上皮癌、多發(fā)性骨髓瘤、肺癌中也有一定程度 表達（Rodolfo M，et al.Cancer Research.2003,63:6948-6955;Jungbluth AA，et al. International J Cancer.2001,94:252-256；Barrow C,et al. Clinical Cancer Research.2006,12:764-771；Odunsi K,et al.Cancer Research.2003,63:6076-6083； Nakamura S,et al.J Gastroenterology and Hepatology·2006,21:1281-1285·)〇NY-ES0-1基因家族包括NY-ES0-ULAGE-1和ES03三個成員，不同于NY-ES0-1和LAGE-1特異性表 達于腫瘤組織，ES03廣泛表達于人體各種正常組織，不具腫瘤限制性。NY-ES0-1基因mRNA編 碼區(qū)長度543bp，編碼蛋白質相對分子量約18kD，由180個氨基酸組成，其N端有富含甘氨酸， C端存在疏水性氨基酸序列，有潛在跨膜區(qū)域。NY-ES0-1有20多個CD4+或CD8+T細胞識別表 位，并在多種腫瘤內可檢測到自發(fā)性免疫反應（Chen JL，et al.International J Cancer. 2015，136:E590-601.)。已發(fā)現(xiàn)第 155-163位氨基酸（QLSLLMWIT)、第 157-165位氨基 酸(SLLMWITQC)和第157-167位氨基酸（SLLMWITQCFL)3個抗原肽可誘導NY-ES0-1陽性腫瘤 患者產(chǎn)生CTL反應，可應用于腫瘤免疫治療（Karbach J，et al.International J Cancer · 2007，121:2042-2048 ·) JY-ESO-l作為免疫原性較強的CTA，可活化CD4+和CD8+T淋 巴細胞，誘導機體產(chǎn)生針對腫瘤的細胞和體液免疫應答。NY-ES0-1肽鏈中T淋巴細胞識別表 位主要以HLA-A2和HLA-DR限制性抗原肽為主。由于生殖細胞不表達HLA分子和血睪屏障存 在，針對CTA的腫瘤免疫治療一般對正常組織細胞不產(chǎn)生免疫毒性，目前NY-ES0-1被認為是 腫瘤免疫治療的理想靶抗原。
[0003] NY-ES0-1作為一種重要的腫瘤相關抗原，在腫瘤早期診斷，發(fā)生發(fā)展，治療效果評 價等方面也具有重要價值。由于NY-ES0-1在多種腫瘤組織中表達，而幾乎不在正常組織中 表達，其在腫瘤診斷中具有較高特異性，而且NY-ES0-1在腫瘤預后判斷也有重要意義，研究 發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞表達NY-ES0-1提示預后較差（Ohue Y，et al.0ncoimmunology.2014,3: e970032.)。在乳腺髓樣癌患者中，雌激素受體陰性者腫瘤組織NY-ES0-1陽性率高于雌激素 受體陽性者，NY-ES0-1陽性患者生存期低于NY-ES0-1陰性患者(Ademuyiwa F0，et al.PloS one. 2012，7: e38783.)。也有研究對頭頸部鱗癌患者進行多因素分析后認為NY-ES0-1是其 不良預后的獨立指標（Laban S，et al· International J Cancer.2014,135:1142-1152·)。 CTA參與初期階段胚胎發(fā)育和干細胞自我更新，其在腫瘤組織中表達局限于具有干細胞特 性的細胞，CT基因表達細胞可能是異常腫瘤干細胞克隆增殖的結果。表達CTA的腫瘤細胞失 去了分化能力，并且可能參與腫瘤復發(fā)和轉移(Colombo M,et al.International Reviews Immunology.2015,34:188-199.)。腫瘤干細胞中CT基因表達已應用于腫瘤復發(fā)和轉移的治 療。有研究從神經(jīng)膠質瘤細胞系和組織中分離出腫瘤干細胞，相較于分化細胞，腫瘤干細胞 中NY-ES0-1表達顯著升高。此外，NY-ES0-1也是非小細胞肺癌預后標志之一（John T，et al.PloS one.2013,8:e67876·)。
[0004] 由于NY-ES0-1是一個隱蔽抗原，同時又能有效誘導機體的細胞和體液免疫應答， 表達NY-ES0-1的腫瘤細胞由于壞死或分泌方式釋放表達的NY-ES0-1抗原入血，刺激機體免 疫細胞產(chǎn)生針對NY-ES0-1的自身循環(huán)抗體，因此，通過檢測外周血中特異性的NY-ES0-1自 身循環(huán)抗體可作為一個腫瘤標志物，用于腫瘤篩查、輔助診斷和預后判斷，判斷腫瘤細胞表 達NY-ES0-1抗原狀況，也可用于監(jiān)測和評價腫瘤患者細胞對免疫治療的反應性。 (三)
【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種人血清等體液中抗NY-ES0-1自身抗體的測定方法，即用于 外周血(包括血清、血漿和全血)等體液中抗NY-ES0-1自身抗體(包括I gG、I gA和I gM抗體）的 檢測。本發(fā)明為腫瘤高危人群診斷提供一種新的腫瘤標志物，也為NY-ES0-1陽性腫瘤的精 準治療和/或CAR-T、TCR-T等個性化免疫治療療效判斷提供依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明采用的技術方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，所述方法為：以NY-ES0-1重組蛋白為抗原制備抗NY-ES0-1抗體，將抗NY-ES0-1抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備抗體 偶聯(lián)物，然后將NY-ES0-1重組蛋白混合液a與外周血待測樣品混合反應5-10min，最后再加 入抗體偶聯(lián)物，檢測546nm處吸光值，根據(jù)標準曲線獲得樣品中抗NY-ES0-1自身抗體濃度； 所述NY-ES0-1重組蛋白混合液a質量組成為：NY-ES0-1重組蛋白100-200ng/ml，35g/L聚乙 二醇-6000，牛血清白蛋白（BSA) 5g/L，0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶劑為pH6 · 8的緩沖 液;所述標準曲線按如下方法制備：用NY-ES0-1重組蛋白為抗原免疫家兔制備兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體，再將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體按1000-62.5μg/ml梯度濃度用含體積 濃度0.1-1%牛血清白蛋白的緩沖液稀釋成稀釋液，以無抗體成份的含所述牛血清白蛋白 的緩沖液為空白對照，將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備特異性抗體偶 聯(lián)物，然后將NY-ES0-1重組蛋白混合液b與不同濃度稀釋液混合反應5-10min，最后再加入 特異性抗體偶聯(lián)物，分別測定546nm處吸光值，以吸光值為縱坐標，以稀釋液中兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體濃度作為橫坐標制作標準曲線;所述NY-ES0-1重組蛋白混合液b組成同NY-ES0-1重組蛋白混合液a (本發(fā)明所述NY-ES0-1重組蛋白混合液a、NY-ES0-1重組蛋白混合液 b均為NY-ES0-1重組蛋白混合液，為便于區(qū)分不同步驟用量不同而命名，字母本身沒有含 義)。
[0008] 進一步，所述膠乳微球以直徑為40-230M1，微球表面活化基團為-C00H或-NH2的質 量濃度10%膠乳液的形式加入，優(yōu)選購自美國Bangs公司。
[0009] 進一步，所述抗體偶聯(lián)物制備方法為：（1)膠乳微球活化：將膠乳微球與邱5.0_ 7.5、0.01-0.5mo 1 /L MES緩沖液(優(yōu)選pH6.5、0.05mo 1 /L)、水、吐溫-20混合，渦旋振蕩混勻， 制得膠乳混合液；向所述的膠乳混合液中加入50mg/mL NHS水溶液和10mg/mL碳二亞胺水溶 液，渦旋振蕩15-45分鐘，再超聲5-15次，每次超聲5-10秒，間隔15-30秒，超聲能量6000- 9000kJ(優(yōu)選超聲5次，每次超聲10秒，間隔15秒，超聲能量9000kJ);超聲結束后混合液過 Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱，用水洗至終體積為最初使用膠乳體積的2倍，獲得活化的膠 乳液;所述膠乳微球以直徑40_230nm，微球表面活化基團為-COOH或-NH 2的10wt %膠乳液形 式加入;所述膠乳微球與所述的緩沖液體積比為0.4:1，所述水與所述的緩沖液體積比為 1.5:1，所述吐溫-20與所述的緩沖液體積比為1-2:100(優(yōu)選2:100);所述NHS水溶液與所述 的緩沖液體積比為1:10-20(優(yōu)選1:16)，所述碳二亞胺水溶液與所述的緩沖液體積比為1: 10-20(優(yōu)選1:16); (2)偶聯(lián):將抗NY-ES0-1抗體溶于pH7.4、100-200mM PBS緩沖液(優(yōu)選 100mM)中制成抗體溶液，將抗體溶液與步驟(1)活化的膠乳液混勻后，于垂直混合儀反應ΙΑ小時 （優(yōu)選 4h); 再加入 pH6 · 8-8 · 0 、 0 · 5-4 · Omo 1/L 甘氨酸緩沖溶液 (優(yōu)選 pH7 · 4 、 lmo 1/L) 于 垂直混合儀混合10-60分鐘(優(yōu)選60min)，將反應液15000-30000rpm離心30-120分鐘(優(yōu)選 20000印111離心30分鐘），棄上清，保留沉淀，用洗滌液重懸沉淀，15000-30000印1]1離心15-120 分鐘(優(yōu)選20000rpm離心30分鐘），重復重懸和離心3-5次，取最后離心的沉淀即為抗體偶聯(lián) 物;所述洗滌液是指含體積濃度〇. 1 %牛血清白蛋白的pH7.4、50-500mM甘氨酸緩沖溶液(優(yōu) 選pH7.4、100mM);所述活化的膠乳液體積用量以抗NY-ES0-1抗體質量計為0.1-1.0ml/mg。
[0010] 進一步，所述標準曲線按如下方法制備：用NY-ES0-1重組蛋白為抗原免疫家兔制 備兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體，再將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體用含體積濃度0.25 %牛 血清白蛋白的緩沖液稀釋成lOOOμg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62 · 5μg/ml的稀釋 液，以無抗體成份的含所述牛血清白蛋白的緩沖液為空白對照，將兔抗NY-ES0-1特異性IgG 抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備特異性抗體偶聯(lián)物，然后將NY-ES0-1重組蛋白混合液b與不同濃 度稀釋液混合反應5-10min，最后再加入特異性抗體偶聯(lián)物，分別測定546nm處吸光值，以吸 光值為縱坐標，以兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體濃度作為橫坐標制作標準曲線;所述重組蛋 白混合液b質量組成為:NY-ES0-1重組蛋白100-200ng/ml，35 g//L聚乙二醇-6000,牛血清白 蛋白 5g/L，0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶劑為pH6 · 8、50mM的 Tr i s-HCl 緩沖液。
[0011] 進一步，所述抗NY-ES0-1自身抗體為下列之一：抗NY-ES0-1自身抗體IgG、抗NY-ES0-1自身抗體IgA或抗NY-ES0-1自身抗體IgM，優(yōu)選抗NY-ES0-1自身抗體IgG。
[0012]此外，本發(fā)明還提供一種外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法（即化學發(fā)光 法檢測），所述方法:采用NY-ES0-1重組蛋白為包被抗原，加入待測樣品，再加入抗人IgG抗 體直接與2 '，6 二甲基羰基苯基10-甲基-9-叮啶甲酸酯4 ' -N-琥珀酰亞胺酯三氟甲基磺酸 鹽(簡稱吖啶酯DMAE-NHS) (CAS: 115853-74-2)偶聯(lián)制備的標記抗體，加入底物液A和底物液 B進行發(fā)光反應，檢測反應液發(fā)光強度，根據(jù)人抗NY-ES0-1 IgG抗體標準曲線，獲得待測樣品 中抗NY-ES0-1自身抗體濃度;所述底物液A組成為：質量濃度0.1 -0.25 %過氧化尿素、體積 濃度0.01 %Triton X-100，溶劑為 100mM、pH8.OTris緩沖液，底物液B組成為：100mM NaOH、 體積濃度2%的Triton X-100，溶劑為水;所述抗人IgG抗體與吖啶酯DMAE-NHS物質的量之 比為1:3-5;所述抗人IgG抗體為羊抗人IgG抗體或兔抗人IgG抗體;所述標準曲線按如下方 法制備：人抗NY-ES0-1 IgG抗體用含體積濃度0.25 %BSA的100mM，pH7.4的Tris-HCl緩沖液 稀釋成 1 OOOμg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml 的稀釋液，作為該化學發(fā)光檢 測方法的校準品或標準品，以無抗體成份的含所述牛血清白蛋白的緩沖液為空白對照，用 NY-ES0-1重組蛋白為包被抗原，分別加入所述不同濃度校準品或標準品，再加入抗人IgG抗 體直接與吖啶酯DMAE-NHS偶聯(lián)制備的標記抗體，加入底物液A和底物液B進行發(fā)光反應，檢 測反應液發(fā)光強度，以人抗NY-ESO-11gG抗體濃度為橫坐標，發(fā)光強度為縱坐標，繪制標準 曲線;所述底物液A和底物液B組成同待測樣品檢測所用底物液A和底物液B;所述人抗NY-ESO-1 IgG抗體制備方法為:收集抗NY-ES0-1自身IgG抗體陽性的人血清，用NY-ES0-1重組蛋 白-Sepharose 4B親和層析柱純化抗NY-ES0-1重組蛋白的特異性抗體，經(jīng)蛋白質定量后稀 釋。
[0013]進一步，優(yōu)選過氧化尿素質量濃度0.1%。
[0014]膠乳免疫增強法反應原理為：首先用NY-ES0-1重組蛋白偶聯(lián)膠乳微球，然后用該 偶聯(lián)重組蛋白的膠乳微球與樣本中的抗體發(fā)生結合，因凝集反應而出現(xiàn)濁度變化，可通過 檢測濁度變化程度而推測樣本中的自身抗體水平。
[0015] 膠乳免疫增強抑制法反應原理為:首先是樣本中的抗體與過量添加的NY-ES0-1抗 原發(fā)生特異性結合，然后用抗ΝΥ-ESO-lIgG抗體偶聯(lián)的膠乳微球來檢測剩余游離的NY-ES0-1抗原。由于添加的NY-ES0-1抗原量是已知的，因此，可根據(jù)剩余游離的NY-ES0-1抗原量來 推測樣本中的自身抗體水平。該反應模式為競爭抑制法，特異性較高。
[0016] ELISA和化學發(fā)光法檢測樣本中的抗NY-ES0-1自身抗體水平采用間接法。
[0017]本發(fā)明所述NY-ES0-1重組蛋白的制備為本領域公知方法，優(yōu)選通過PCR方法將NY-ES0-1 DNA序列連接到原核/真核細胞表達載體，用E.coli DE3和/或HEK293或CH0細胞表 達、生產(chǎn)和純化NY-ES0-1重組蛋白。
[0018] 本發(fā)明所述抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，還可以將NY-ES0-1重組蛋白作為包 被抗原，以羊或兔抗人IgG抗體與辣根過氧化物酶或吖啶酯偶聯(lián)物為示蹤抗體，建立間接法 非均相的血清等體液中抗NY-ES0-1自身抗體檢測方法。
[0019] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在:本發(fā)明所述外周血中抗NY-ES0-1 自身抗體的檢測方法可在生化分析儀和化學發(fā)光免疫分析儀等大型自動化儀器上進行大 樣本自動化檢測。本發(fā)明方法檢測靈敏度1 -1 〇ng/mL。 (四）
【附圖說明】
[0020] 圖1為反應原理示意圖，A為膠乳免疫增強法檢測抗NY-ES0-1自身抗體原理示意 圖，B為膠乳免疫增強抑制法檢測抗NY-ES0-1自身抗體原理示意圖，C為ELISA法檢測抗NY-ES0-1自身抗體原理示意圖，D為化學發(fā)光法檢測抗NY-ES0-1自身抗體原理示意圖；
[0021] 圖2為反應標準曲線，A為膠乳免疫增強法檢測抗NY-ES0-1自身抗體標準曲線，B為 膠乳免疫增強抑制法檢測抗NY-ES0-1自身抗體標準曲線，C為ELISA法檢測抗NY-ES0-1自身 抗體標準曲線，D為化學發(fā)光法檢測抗NY-ES0-1自身抗體標準曲線。 (五)
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于 此：
[0023] 實施例1
[0024] 1.NY-ES0-1重組蛋白制備
[0025] 1.1 NY-ESO-1 DNA 序列獲得
[0026] 1.1.1從NY-ES0-1表達的腫瘤細胞中獲取NY-ESO-1 DNA序列
[0027] 通過免疫印漬方法從腫瘤細胞中篩選NY-ES0-1陽性細胞株，2\106表達階430-1 的腫瘤細胞(如A375黑色素瘤細胞和MCF7乳腺癌細胞系，本實施例選用A375黑色素瘤細胞） 用RNAeasy試劑盒(購自Qiagen)分離純化總RNA，經(jīng)Oligo dTi5引物(購自Takara)將總RNA逆 轉錄為cDNA，通過聚合酶鏈式反應(PCR)方法從中擴增獲得NY-ES0-1 DNA序列（核苷酸序列 為SEQ ID N0.1所示，氨基酸序列為SEQ ID從).2所示），0嫩測序驗證。
[0028] 1.1.2 化學合成NY-ES0-1 DNA序列
[0029] 根據(jù)Genbank提供的NY-ES0-1 DNA序列（蛋白質ID:P78358)，委托商業(yè)公司進行化 學合成NY-ES0-1DNA序列（核苷酸序列為SEQIDN0.1所示，氨基酸序列為SEQIDN0.2所 示），并克隆至適當?shù)目寺⌒暂d體(如pUC19，pUC57等，本實施例選擇pUC57)。
[0030] 1 · 2通過原核細胞表達NY-ES0-1重組蛋白
[0031] 以步驟1.1獲得的NY-ES0-1 DNA為模板，用聚合酶鏈式反應(PCR)將NY-ES0-1 DNA 開放閱讀核苷酸序列(0RF)克隆到原核細胞表達載體pET15b或pET14b的Ndel/BamHI內切酶 位點，DNA測序驗證后，轉化Rosetta DE3大腸桿菌，挑選高表達NY-ES0-1的細菌克隆，擴大 培養(yǎng)至0D值到0.4-0.8時，用1. OmM IPTG在37 °C誘導4小時，lOOOOrpm離心15分鐘收集細菌 沉淀。
[0032] NY-ES0-1復性和純化：以處理150g細菌沉淀為例進行說明。將150g細菌沉淀加入 1.5L包涵體裂解液I(pH8.0,50mM Tris-HCl緩沖液含ImM EDTA和100mM NaCl)后進行高壓 超聲破碎(壓力l〇MPa，超聲頻率20000Hz，超聲處理5min)，離心，沉淀用700ml包涵體裂解液 II(pH8.0,50mM Tris-HCl緩沖液含ImM EDTA、100mM NaCl和0.5%Triton X-100)進行洗 滌，洗滌2次，lOOOOrpm離心10min，產(chǎn)生的沉淀用0.5M尿素（用pH8.0，50mM Tris-HCl緩沖液 含ImM EDTA、100mM NaCl配制）洗滌 1次，lOOOOrpm離心 10min。沉淀用200ml、8M尿素（用 pH8.0,50mM Tris-HCl緩沖液含ImM EDTA、100mM NaCl配制）重懸，磁力攪拌30min后， lOOOOrpm離心 10min，上清（200ml)用pH 10.7，50mM K2HP〇4+lmM EDTA+50mM NaCl溶液稀釋 10倍，用1M NaOH調ρΗ10·7后靜置30min，再用2M HC1調pH至8.0，10000印111離心10111丨11，將上 清（2L)裝入透析袋中進行復性透析。透析液為pH8.0，50mM Tr i s-HCl緩沖液含ImM EDTA、 lOOmM NaCl、10mM還原型谷胱甘肽、2mM氧化型谷胱甘肽和ImM二硫蘇糖醇(DTThrC復性透 析48h，然后用pH8.0,50mM Tris-HCl緩沖液含100mM NaCl進行透析，透析3次后過鎳柱進行 純化，洗脫液為PH8.0，50mM Na2HP〇4緩沖液內含150mM NaCl和300mM咪唑。進一步用AKTA純 化重組蛋白峰，Lorry ' s酸試劑進行蛋白質定量。
[0033] 1.3真核細胞生產(chǎn)NY-ES0-1重組蛋白
[0034]以步驟1.1獲得的NY-ES0-1 DNA為模板，克隆到真核細胞表達載體pcDNA3.1(美國 Invitrogen公司），通過物理轉染的方法（基因槍或脂質體）轉染工程細胞CH0細胞（美國 ATCC公司），5%C0 2生物反應器中無血清培養(yǎng)液(美國Gibco公司)培養(yǎng)7-10天，收集上清液， 濃縮，用AKTA純化重組蛋白峰。Lorry ' s?H式劑進行蛋白質定量。
[0035] 2.抗NY-ES0-1重組蛋白兔源性多克隆抗體制備方法
[0036] 2.1動物免疫
[0037] 以1.2或1.3制備的NY-ES0-1重組蛋白，以lmg/次/只NY-ES0-1重組蛋白與完全福 氏佐劑等體積混勻，家兔皮下多點注射免疫。每2周1次，連續(xù)5次，間隔1周后采用分離頸動 脈，收集血液約80-120毫升，室溫放置2小時，4°C、10000rpm離心30min，分離收集血清。
[0038] 2.2抗體純化
[0039] 先制備NY-ES0-1重組蛋白-Sepharose 4B親和層析柱：取步驟1.2或1.3制備的無 游離氨基污染的高純度(90%)NY-ES0-1重組蛋白25mg與溴化氫活化的Sepharose 4B 2g (購自Pharmacia)進行交聯(lián)，按操作說明書進行交聯(lián)，獲得NY-ES0-1重組蛋白-Sepharose 4B親和層析柱。然后上述血清(步驟2.1收集)用NY-ES0-1重組蛋白-Sepharose 4B親和層析 柱純化抗NY-ESO-1重組蛋白的特異性I gG型抗體，最后用8 % SDS-PAGE檢測純度，需達到 90%，獲得兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體。將IgG用PBS稀釋到〈lmg/ml，用紫外分光光度法進 行定量。IgG量(mg/ml) = ( 1 · 42 X 0D28Qnm-0 · 74 X 0D4Q3nm) X 稀釋倍數(shù)。
[0040] 本實施例制備的抗NY-ES0-1多克隆抗體能與NY-ES0-1蛋白發(fā)生特異性結合反應， 而不與非NY-ES0-1蛋白發(fā)生非特異性反應。
[0041 ] 2.3兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體作為校準品或標準品
[0042]上述步驟2.2獲得的兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體經(jīng)蛋白質定量后用含體積濃度 0.25%85六的100111]\14!17.4的1^8-?：1緩沖液稀釋成含兔抗階450-1186抗體1000、500、 250、125、62.5以 8/!111不等的稀釋液，作為該膠乳檢測方法的校準品或標準品。
[0043] 上述步驟2.2獲得的兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體經(jīng)蛋白質定量后用含10%人血 清的100mM，pH7.4的Tris-HCl緩沖液稀釋成含兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體700、400、100μ g/ml不等的稀釋液，作為該膠乳檢測方法的質控品。
[0044] 2.4人抗NY-ES0-1自身抗體作為校準品或標準品
[0045] 收集抗NY-ES0-1自身IgG抗體陽性的血清100mL，用NY-ES0-1重組蛋白-Sepharose 4B親和層析柱純化抗NY-ES0-1重組蛋白的特異性抗體，最后用8 % SDS-PAGE檢測純度，需達 到90%，獲得人抗NY-ES0-1自身抗體。Lorry's酸試劑進行蛋白質定量。經(jīng)蛋白質定量后用 含體積濃度〇 . 25%BSA的100mM，pH7.4的Tris-HCl緩沖液稀釋成含抗NY-ES0-1自身抗體 1000、500、250、125、62.5μg/ml不等的稀釋液，作為該膠乳檢測方法的校準品或標準品。 [0046] 3.膠乳免疫增強法檢測人血清等體液中抗NY-ES0-1自身循環(huán)抗體
[0047] 3.1膠乳免疫增強抑制法
[0048]膠乳微球交聯(lián)兔源性多克隆IgG抗體，以活化交聯(lián)4mL的1%膠乳-抗體為例進行說 明。
[0049] 3.1.1膠乳活化
[0050] 3.1.1.1 0.05mol/L MES緩沖液（pH6.5)lml，直徑40-230nm，微球表面活化基團 為-C00H的10 %膠乳(美國Bangs公司）0.4ml，水2. lmL，20μ1吐溫-20，渦旋振蕩混勻。
[0051 ] 3· 1 丄 2加入50mg/mL NHS水溶液0· 25ml，10mg/mL碳二亞胺(EDAC)水溶液0 · 25mL， 禍旋振蕩30分鐘。
[0052] 3.1.1.3混合液超聲5次，每次超聲10秒，間隔15秒，超聲能量90001^。過36?11 &(161 G-25葡聚糖凝膠柱(購自Pharmacia)，用水洗至終體積10-20ml，獲得活化的膠乳液。
[0053] 3.1.2抗NY-ES0-1特異性IgG抗體與膠乳交聯(lián)的優(yōu)化
[0054] 3.1.2.1上述步驟3.1.1活化的膠乳液1.01111，分別與0.1，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0， 1·2，1·4，1·6，1·8,2·Omg兔抗NY-ES0-1 特異性IgG抗體(分別溶于 1 ·0ml pH7·4，lOOmM PB緩 沖液中）混勻后，于垂直混合儀(寧波東芝醫(yī)療儀器公司）反應4小時。
[0055] 3.1.2.2分別加入1.0m〇l/L甘氨酸緩沖溶液(pH7.4) 1ml于垂直混合儀混合60分 鐘，以封閉殘留的活性基團，獲得抗體-膠乳偶聯(lián)液。
[0056] 3.1.3交聯(lián)物的分離
[0057] 3.1.3.1上述步驟3.1.2.2制備的抗體-膠乳偶聯(lián)液20000rpm離心30分鐘，棄上清， 保留沉淀。
[0058] 3.1.3.2用洗滌液40ml重懸沉淀(洗滌液:pH7.4，100mM甘氨酸緩沖溶液內含0.1 % BSA)，20000rpm離心30分鐘。
[0059] 3.1.3.3重復3.3.2步驟 3-5 次。
[0060] 3.1.4抗NY-ES0-1特異性IgG抗體與膠乳交聯(lián)物的保存
[0061 ] 上述步驟3.1.3.3獲得的膠乳沉淀中加入4ml含0.25 %BSA，0.3 % PVP，0.05 %NaN3 的pH7.4，500mM甘氨酸緩沖溶液，超聲(9000J) 15秒混勻，4 °C保存。
[0062] 3.2膠乳免疫增強法
[0063] 膠乳微球交聯(lián)NY-ES0-1重組蛋白，以活化交聯(lián)4mL的1%膠乳-重組蛋白為例進行 說明。
[0064] 3.2.1膠乳活化
[0065] 3.2.1.1 0.05mol/L MES緩沖液（pH6.5)lml，直徑80-400nm的 10%膠乳（美國 Bangs公司）0 · 4ml，水2 · lmL，吐溫-20 20μ1，渦旋振蕩混勻。
[0066] 3· 2 · 1 · 2加入50mg/mL NHS水溶液0· 25ml，10mg/mL碳二亞胺(EDAC)水溶液0 · 25mL， 禍旋振蕩30分鐘。
[0067] 3.2.1.3混合液超聲5次，每次超聲10秒，間隔15秒，超聲能量9000kJ。過Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱(購自Pharmacia)，用水洗至終體積10-20ml，獲得活化的膠乳液。
[0068] 3.2.2 NY-ES0-1重組蛋白與膠乳交聯(lián)的優(yōu)化
[0069] 3.2.2.1上述步驟3.2.1活化的膠乳液1.01111，分別與0.1，0.2,0.4,0.6,0.8，1.0， 1 · 2，1 · 4，1 · 6，1 · 8，2 · Omg NY-ES0-1 重組蛋白（步驟3 · 1 · 4)(分別溶于 1 · 0ml pH7 · 4，100mM PB緩沖液中）混勻后，于垂直混合儀反應4小時。
[0070] 3 · 2 · 2 · 2分別加入5mol/L甘氨酸緩沖溶液(PH7 · 4) 1ml于垂直混合儀混合60分鐘， 以封閉殘留的活性基團，獲得NY-ES0-1重組蛋白-膠乳混合液。
[0071] 3.2.3交聯(lián)物的分離
[0072] 3.2.3.1上述步驟3.2.2.2獲得的NY-ES0-1重組蛋白-膠乳混合液20000rpm離心30 分鐘，棄上清，保留沉淀。
[0073] 3.2.3.2用洗滌液40ml重懸沉淀(洗滌液:pH7.4，500mM甘氨酸緩沖溶液內含0.1 % BSA)，20000rpm離心30分鐘。
[0074] 3.2.3.3重復3.3.2步驟 3-5 次。
[0075] 3.2.4 NY-ES0-1重組蛋白與膠乳交聯(lián)物的保存
[0076] 上述步驟3.2.3.3獲得的膠乳沉淀中加入4ml含0.25 %BSA，0.3 % PVP，0.05 %NaN3 的pH7.4，1 OOmM甘氨酸緩沖溶液，超聲15秒混勻，4 °C保存。
[0077] 3.3抗NY-ES0-1特異性IgG抗體/NY-ES0-1重組蛋白與膠乳交聯(lián)最佳濃度的確定
[0078] 3.3.1主要試劑組成成分
[0079]膠乳免疫增強抑制法檢測
[0080] 試劑R1:50mM，pH6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tr i s-HCl)緩沖液中含：
[0081] PEG(MW 6000)35g/L;BSA 5g/L;NY-ES0-l重組蛋白 200 ng/mL;
[0082] Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05%。
[0083] 試劑R2:步驟3.1獲得的交聯(lián)抗NY-ES0-1特異性IgG抗體的膠乳微球。
[0084]膠乳免疫增強法檢測
[0085] 試劑R1:50mM，pH6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tris-HCl)緩沖液含：
[0086] PEG(MW 6000)35g/L;BSA5g/L;Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05% 〇
[0087] 試劑R2:步驟3.2獲得的交聯(lián)NY-ES0-1重組蛋白的膠乳微球。
[0088] 3.3.2檢測步驟
[0089] 反應類型：速率法溫度:37Γ比色杯光徑:0.6cm
[0090] 主/副波長：546nm/800nm單位:U/ml反應方向：上升
[0092] 3.3.3結果確定：
[0093] 計算校準品吸光度的差值(A校準-A空白），建立合適的數(shù)學模(非線性)如Logit-Log等，擬合成多點定標的校準曲線。根據(jù)各膠乳校準曲線的反應變化幅度、線性范圍、相關 系數(shù)和反應可重復性，確定最佳的抗體與膠乳比例為：lmg抗體:0.1-1.0ml膠乳（10% );活 化的膠乳液體積用量以抗NY-ES0-1抗體質量計為0.1-1.0ml/mg。
[0094] 3.4外周血抗NY-ES0-1自身抗體檢測
[0095] 3.4.1主要試劑組成成分
[0096]膠乳免疫增強抑制法
[0097] 試劑R1:50mM，pH6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tr i s-HCl)緩沖液中含：
[0098] PEG(MW 6000)35g/L;BSA 5g/L;NY-ES0-l重組蛋白 200 ng/mL;
[0099] Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05%。
[0100] 試劑R2:步驟3.1獲得的交聯(lián)抗NY-ES0-1特異性IgG抗體的膠乳微球。
[0101]膠乳免疫增強法
[0102] 試劑R1:50mM，pH6.8的三羥甲基氨基甲烷(Tr i s-HCl)緩沖液含：
[0103] PEG(MW 6000)35g/L;BSA 5g/L;Tween-20 0.05% ;NaN3 0.05% 〇
[0104] 試劑R2:步驟3.2獲得的交聯(lián)NY-ES0-1重組蛋白的膠乳微球。
[0105] 3.4.2檢測步驟
[0106] 反應類型：固定時間2點法溫度:37°C比色杯光徑：1.0cm
[0107] 主/副波長:546nm/800nm單位:U/ml反應方向：上升
[0108]
3.4.3結果計算：
[0109]計算校準品吸光度的差值(A校準-A空白），建立合適的數(shù)學模(非線性)如Logit-Log 等，擬合成多點定標的校準曲線。根據(jù)樣品 (A 樣品-A 空白） 的吸光度差值，在工作曲線上 求得樣品中抗NY-ES0-1抗體的含量，標準曲線見圖2所示。
[0110]本實施例制備的膠乳免疫比濁法用于檢測外周血或血清抗NY-ES0-1自身抗體水 平，當樣品中含有NY-ES0-1時，交聯(lián)特異性抗體或抗原的膠乳微球可由于抗原抗體特異性 結合發(fā)生凝集，造成濁度增加，通過測定樣品吸光度變化，對照標準曲線，定量分析樣品中 抗NY-ES0-1自身抗體含量，檢測效能與酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、化學發(fā)光免疫檢測法接近 或等效。結果見表1所示。
[0111] 4.酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測人血清等體液中抗NY-ES0-1自身抗體
[0112] 4.1生物素標記NY-ES0-1重組蛋白
[0113] 10mg NY-ES0-1重組蛋白（步驟1.1或1.2制備)溶解在lml 0.01M碳酸鹽緩沖液中， 加入5mg NHS活化生物素，室溫避光輕輕攪拌1-2小時后，裝入透析袋中，4°C用0.15M pH7.4 PBS透析，換液4-6次后，10000-20000rpm離心15-30min去沉淀。加終濃度30 %甘油-20°C。
[0114] 生物素化NY-ES0-1重組蛋白最佳包被濃度確定。用50mM的碳酸鹽緩沖液(CBS)稀 釋鏈霉親和素至l〇yg/mL后，以lOOyL/孔包被反應微孔4°C過夜或37°C 120min，用含0.05 % Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)或Tris-HCl緩沖液(PBS)洗滌3次，用10%小牛血清室溫封 閉30min，再加入經(jīng)用含0.05%Tween-20和5%小牛血清的磷酸鹽緩沖液(PBS)或Tris-HCl 緩沖液(TBS)1:1000稀釋的生物素化NY-ES0-1重組蛋白100μL7孔，室溫反應30-60min，用含 0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)或Tris-HCl緩沖液(TBS)洗滌3次，加入含0.05% Tween-20和5%小牛血清的磷酸鹽緩沖液(roS)或Tris-HCl緩沖液(TBS)1:3000稀釋的兔抗 NY-ES0-1重組蛋白IgG抗體lOOyL/孔，室溫反應30-60min，用含0.05 % Tween-20的磷酸鹽緩 沖液(roS)或Tris-HCl緩沖液(PBS)洗滌3次，再加入lOOyL/孔的HRP標記羊抗兔IgG(美國 Jackson公司）室溫反應15-30min，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)或Tris-HCl 緩沖液(PBS)洗滌3次，最后加入四甲基聯(lián)苯氨(TMB)底物顯色觀察。以出現(xiàn)明顯藍色反應孔 的最高稀釋度孔為最佳稀釋濃度。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)生物素化NY-ES0-1重組蛋白最佳包被濃度以 lyg/mL為佳。
[0115] 4.2包被和封閉
[0116] 用50mM的碳酸鹽緩沖液稀釋NY-ES0-1重組蛋白至5yg/mL后，以100μL7孔包被反應 微孔，4°C過夜或37°C120min，用含0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(PBS)或Tris-HCl緩沖 液(TBS)洗滌3次，用10 %小牛血清室溫封閉30min，甩干，可直接進行下一步操作，也可經(jīng)充 分脫水干燥后，密封置4 °C可長期保存。
[0117] 采用生物素-親和素體系時(步驟4.1)，用50mM的碳酸鹽緩沖液稀釋鏈霉親和素至 l〇yg/mL后，以100μL7孔包被反應微孔，4°C過夜或37 °C 120min，用含0.05 % Tween-20的磷酸 鹽緩沖液(PBS)或Tr i s-HCl緩沖液(TBS)洗滌3次，用10 %小牛血清室溫封閉30min，甩干，經(jīng) 充分干燥后，密封置4 °C可長期保存。
[0118] 4.3 加樣
[0119] 加入100μL孔待檢測血清樣本，如定量時，則同時設立5個濃度為1000、500、250、 125、62.5以 8/!111人抗階43〇-1標準品或校準品（步驟2.4)，室溫或37°(：反應6〇1^11或4°(：過 夜。
[0120]如采用鏈霉親和素包被反應微孔時，同時加入生物素標記的NY-ES0-1重組蛋白 (步驟4.1)，混勻。
[0121] 4.4加酶標抗體
[0122] 上述反應微孔用含0.05%了《6611-20的磷酸鹽緩沖液（？83)或1^8-!1(：1緩沖液 (TBS)洗滌3次，最后再加入羊抗人酶標IgG抗體（購自美國Jackson公司），室溫反應30-120min〇
[0123] 4.5 顯色
[0124] 上述反應微孔用含0.05%了《6611-20的磷酸鹽緩沖液（？83)或1^8-!1(：1緩沖液 (roS)洗滌3次，加入100μ1/孔四甲基聯(lián)苯氨(TMB)或鄰苯二氨(0PD)底物避光顯色5-15min 觀察。如定量時，則加入50μ1/孔的1.8M的鹽酸或硫酸以終止反應。用酶標儀測各孔在450nm 或495nm處的吸光度0D值。
[0125] 4.6結果判定
[0126] 定性:凡出現(xiàn)明顯藍色或黃色反應者為陽性，否則為陰性。
[0127] 定量:根據(jù)抗NY-ES0-1標準孔的吸光度，繪制標準曲線，標準曲線見圖2所示，計算 各樣品孔的含量。結果見表1所示。
[0128] 5.化學發(fā)光免疫法檢測人血清等體液中抗NY-ES0-1自身循環(huán)抗體
[0129] 5.1吖啶酯標記特異性抗體
[0130]采用直接標記法。1 Omg羊或兔抗人I gG抗體，以羊抗人I gG抗體為優(yōu)先，分別溶解在 10ml 100mM，pH 9.0的碳酸鹽緩沖液中與160μ1吖啶酯溶液（lmg 2'，6'_二甲基羰基苯基 10-甲基-9-吖啶甲酸酯4 ' -N-琥珀酰亞胺酯三氟甲基磺酸鹽(簡稱吖啶酯DMAE-NHS) (CAS: 115853-74-2)溶于1.0ml二甲基甲酰胺中，B丫啶酯DMAE-NHS購自百靈威科技有限公司），羊 或兔抗人IgG抗體與吖啶酯DMAE-NHS摩爾比為1:4。輕輕攪拌混勻，室溫避光輕輕攪拌3小 時。過Sephadex G-50凝膠柱(購自Pharmacia)，用pH 9.0、100mM磷酸鹽緩沖液進行洗脫，收 集IgG峰，獲得羊或兔抗人IgG抗體-[? 丫啶酯，即標記抗體。IgG量(mg/ml) = (OD280nm-0D4Q3nmX 0.3) X0.62。
[0131]吖啶酯標抗體最佳稀釋濃度確定。用pH 9.6、50mM的碳酸鹽緩沖液稀釋人IgG抗原 (購自美國Jackson公司）至lyg/mL后，以100μL7孔包被反應微孔，4°C過夜或37°C放置 120min，用含體積濃度0.05 % Tween-20的pH 7.4、50mM磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，用10 % 小牛血清室溫封閉30min，再分別加入100μ1經(jīng)含5%小牛血清的pH 7.4、50mM磷酸鹽緩沖液 (PBS)以1:1000、1:2500、1:5000、1:10000、1:20000稀釋的羊或兔抗人IgG抗體-叮啶酯室溫 反應60min，用含0.05 % Tween-20的PBS(pH7.4、50mM)洗滌3次，加入含質量濃度0.1 %H2〇2的 0.1M NaOH溶液100μ1/孔，用羅氏E601化學發(fā)光免疫分析儀(美國Roche公司）測各孔發(fā)光強 度。以發(fā)光強度較高反應孔的最高稀釋度孔為最佳稀釋濃度。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)以1:5000為佳。
[0132] 5.2包被和封閉
[0133] 用pH 9.6、50mM的碳酸鹽緩沖液稀釋NY-ES0-1重組蛋白至lyg/mL后，以lOOyL/孔 包被反應微孔，4°C過夜或37°C放置120min，用含體積濃度0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH 7.4、50mM)或pH 7.4Tris-HCl緩沖液（TBS)洗滌3次，用10%小牛血清室溫封閉 30min，甩干，經(jīng)充分干燥后，密封置4 °C可長期保存。
[0134] 采用生物素-親和素體系時（步驟4.1 )，用pH 9.6、50mM的碳酸鹽緩沖液稀釋鏈霉 親和素至l〇yg/mL后，以100μL7孔包被反應微孔，4°C過夜或37°C放置120min，用含體積濃度 0.05%Tween-20的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4PBS)或Tris-HCl緩沖液(pH 7.4TBS)洗滌3次，用 10 %小牛血清室溫封閉30min，甩干，經(jīng)充分干燥后，密封置4°C可長期保存。
[0135] 5.3 加樣
[0136] 加入lOOyL/孔待檢測血清樣本，如定量時，則同時設立步驟2.4制備的5個濃度為 1000、500、250、125、62.5以 8/1111人抗階430-1自身抗體標準品或校準品，室溫或37°(：反應 60min或4°C過夜。
[0137] 如采用鏈霉親和素包被反應微孔時（步驟4.1)，同時加入lOOyL/孔生物素標記的 NY-ES0-1重組蛋白lμg/ml，混勻。
[0138] 5.4加叮啶酯標記抗體
[0139] 上述反應微孔用含體積濃度0.05%1>的11-20的磷酸鹽緩沖液（？!17.4?85)或 Tris-HCl緩沖液(pH7.4TBS)洗滌3次，最后再加入經(jīng)吖啶酯標記的羊或兔抗人IgG抗體100μ L/孔，室溫反應60min。
[0140] 5.5增強發(fā)光
[0141] 上述各孔加入50yL底物液A(內含質量濃度0.1-0.25 %的過氧化尿素（以0.1 %為 好，過氧化尿素為美國Sigma公司產(chǎn)品）和體積濃度0.01 %的Triton X-100，溶劑為100mM， pH8.0的Tris緩沖液)和50yL底物液B(內含10mM NaOH和體積濃度2%的Triton X-100，溶劑 為水），混勻，立刻用羅氏E601化學發(fā)光免疫分析儀(美國Roche公司）測各孔發(fā)光強度。
[0142] 5.6結果判定
[0143] 定量:根據(jù)抗NY-ES0-1標準孔的發(fā)光強度，以步驟2.4制備的人抗NY-ES0-1抗體的 校正品濃度為橫坐標，發(fā)光強度為縱坐標，繪制標準曲線，標準曲線見圖2所示，計算各樣品 孔的含量。結果見表1所示。該方法靈敏度Ι-lOng/mL，與ELISA相關性r 2 = 0.97。
[0144] 表1臨床血清樣本用4種不同方法檢測結果(單位:yg/mL)
[0145]
【主權項】
1. 一種外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述方法為：以NY-ESO-1重組蛋白為抗原制備抗NY-ES0-1抗體，將抗NY-ES0-1抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備抗體偶聯(lián) 物，然后將NY-ES0-1重組蛋白混合液a與外周血待測樣品混合，室溫反應5-10min，最后再加 入抗體偶聯(lián)物，檢測546nm處吸光值，根據(jù)標準曲線獲得外周血待測樣品中抗NY-ES0-1自身 抗體濃度;所述NY-ES0-1重組蛋白混合液a質量組成為:NY-ES0-1重組蛋白100-200ng/ml， 35g/L聚乙二醇-6000，牛血清白蛋白 5g/L，0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶劑為pH6 · 8的 緩沖液;所述標準曲線按如下方法制備：用NY-ES0-1重組蛋白為抗原免疫家兔制備兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體，再將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體分別按1000-62.5μg/ml梯度濃度 用含體積濃度〇. 1-1 %牛血清白蛋白的緩沖液稀釋成稀釋液，以含所述牛血清白蛋白緩沖 液為空白對照，將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備特異性抗體偶聯(lián)物，然 后將NY-ES0-1重組蛋白混合液b與不同梯度的稀釋液混合，反應5-10min，最后再加入特異 性抗體偶聯(lián)物，分別測定546nm處吸光值，以吸光值為縱坐標，以稀釋液中兔抗NY-ES0-1特 異性抗體IgG濃度作為橫坐標制作標準曲線；所述NY-ES0-1重組蛋白混合液b組成同NY-ES0-1重組蛋白混合液a。2. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述膠乳 微球以直徑為40-230nm，微球表面活化基團為-C00H或-NH 2的質量濃度10%膠乳液的形式 加入。3. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述抗體 偶聯(lián)物制備方法為：（1)膠乳微球活化:將膠乳微球與PH5.0-7.5、0.01-0.5mol/L MES緩沖 液、水、吐溫-20混合，禍旋振蕩混勻，制得膠乳混合液；向所述的膠乳混合液中加入50mg/mL NHS水溶液和10mg/mL碳二亞胺水溶液，渦旋振蕩15-45分鐘，再超聲5-15次，每次超聲5-10 秒，間隔15-30秒，超聲能量6000-9000kJ;超聲結束后混合液過Sephadex G-25葡聚糖凝膠 柱，用水洗至終體積為最初使用膠乳體積的2倍，獲得活化的膠乳液;所述膠乳微球以直徑 為40-230nm，微球表面活化基團為-C00H或-NH 2的質量濃度10 %膠乳液形式加入;所述膠乳 微球與緩沖液體積比為〇. 4:1，所述水與緩沖液體積比為1.5:1，所述吐溫-20與所述緩沖液 體積比為1-2:100;所述NHS水溶液與所述緩沖液體積比為1:10-20，所述碳二亞胺水溶液與 所述緩沖液體積比為1:10-20; (2)偶聯(lián):將抗NY-ES0-1抗體溶于pH7.4、100-200mM PBS緩沖 液中制成抗體溶液，將抗體溶液與步驟（1)活化的膠乳液混勻后，于垂直混合儀反應1-4小 時;再加入PH6.8-8.0、0.5-4. Omol/L甘氨酸緩沖溶液于垂直混合儀混合10-60分鐘，將反應 液15000-30000rpm離心30-120分鐘，棄上清，保留沉淀，用洗滌液重懸沉淀，15000-30000rpm離心15-120分鐘，重復重懸和離心3-5次，取最后離心的沉淀即為抗體偶聯(lián)物;所 述洗滌液是指含體積濃度0.1 %牛血清白蛋白的pH7.4、50-500mM甘氨酸緩沖溶液;所述活 化的膠乳液體積用量以抗NY-ES0-1抗體質量計為0.1-1.0ml/mg。4. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述標準 曲線按如下方法制備：用NY-ES0-1重組蛋白為抗原免疫家兔制備兔抗NY-ES0-1特異性IgG 抗體，再將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體用含體積濃度0.25 %牛血清白蛋白的緩沖液稀釋 成 1000μg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62 · 5μg/ml 的稀釋液，以無抗體成份的含所述 的牛血清白蛋白緩沖液為空白對照，將兔抗NY-ES0-1特異性IgG抗體與膠乳微球偶聯(lián)制備 特異性抗體偶聯(lián)物，然后將NY-ES0-1重組蛋白混合液b與不同濃度稀釋液混合反應5- lOmin，最后再加入特異性抗體偶聯(lián)物，分別測定546nm處吸光值，以吸光值為縱坐標，以稀 釋液中兔抗NY-ESO-1特異性IgG抗體濃度作為橫坐標制作標準曲線;所述重組蛋白混合液b 質量組成為:NY-ESO-1重組蛋白100-200ng/ml，35g//L聚乙二醇-6000，牛血清白蛋白5g/L， 0 · 05 % Tween-20，NaN3 0 · 05 %，溶劑為pH6 · 8、50mM的 Tr i s-HCl 緩沖液。5. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述抗NY-ES0-1自身抗體為下列之一：抗NY-ESO-1自身抗體IgG、抗NY-ESO-1自身抗體IgA或抗NY-ESO-1自身抗體IgM。6. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述抗體 偶聯(lián)物與NY-ESO-1重組蛋白混合液a體積比為1:3,所述外周血待測樣品與抗體偶聯(lián)物體積 比為3:50。7. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述配制 NY-ESO-1重組蛋白混合液a的溶劑為pH6.8、50mM的Tr is-HCl緩沖液。8. 如權利要求1所述外周血中抗NY-ESO-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述稀釋 兔抗NY-ESO-1特異性IgG抗體的緩沖液為pH6.8、50mM的Tris-HCl緩沖液。9. 一種外周血中抗NY-ESO-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述方法:采用NY-ESO-1重組蛋白為包被抗原，加入待測樣品，再加入抗人IgG抗體直接與吖啶酯DMAE-NHS偶聯(lián)制 備的標記抗體，加入底物液A和底物液B進行發(fā)光反應，檢測反應液發(fā)光強度，根據(jù)人抗NY-ESO-1 IgG抗體標準曲線，獲得待測樣品中抗NY-ESO-1自身抗體濃度;所述抗人IgG抗體與吖 啶酯DMAE-NHS物質的量之比為1:3-5;所述抗人IgG抗體為羊抗人IgG抗體或兔抗人IgG抗 體;所述底物液A組成為:質量濃度0.1-0.25 %過氧化尿素、體積濃度0.01 % Triton X-100， 溶劑為100mM、pH8.0Tris緩沖液，底物液B組成為：10mM NaOH、體積濃度2%的Triton X-100，溶劑為水;所述人抗NY-ESO-1 IgG抗體標準曲線制備方法為：人抗NY-ESO-1 IgG抗體用 含體積濃度〇. 25%牛血清白蛋白的100mM，pH7.4的Tris-HCl緩沖液稀釋成1000μg/ml、500μ g/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml的稀釋液，以無抗體成份的含所述牛血清白蛋白的緩 沖液為空白對照，用NY-ES0-1重組蛋白為包被抗原，分別加入所述稀釋液，再加入抗人IgG 抗體直接與吖啶酯DMAE-NHS偶聯(lián)制備的標記抗體，加入底物液A和底物液B進行發(fā)光反應， 檢測反應液發(fā)光強度，以稀釋液中人抗NY-ESO-lIgG抗體濃度為橫坐標，發(fā)光強度為縱坐 標，繪制標準曲線;所述底物液A和底物液B組成同待測樣品檢測所用底物液A和底物液B。10. 如權利要求9所述外周血中抗NY-ES0-1自身抗體的檢測方法，其特征在于所述過氧 化尿素質量濃度為〇. 1 %。
【文檔編號】G01N33/68GK105866433SQ201610319075
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】朱永良, 潘天慧, 黃建, 楊賽賽
【申請人】浙江大學