制備具有高效腫瘤殺傷性cik細(xì)胞制劑的方法及制得的cik細(xì)胞制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法及制得的CIK細(xì)胞制劑，特別是在體外利用細(xì)胞因子高效誘導(dǎo)外周血單個核細(xì)胞分化CIK細(xì)胞中添加Anti?CTLA?4MAb以及Anti?PD?1MAb后其腫瘤殺傷活性顯著提高。所述提高CIK腫瘤殺傷活性的培養(yǎng)方法包括以下步驟：無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等體積稀釋后，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN?γ、IL?2，培養(yǎng)過程中在適宜的時間點加入Anti?CTLA?4MAb以及Anti?PD?1MAb，培養(yǎng)13?16天收獲細(xì)胞，制備CIK細(xì)胞制劑，可以阻斷腫瘤細(xì)胞的前期CTLA?4以及后期PD?1兩個免疫抑制途徑，從而大大提高了CIK的腫瘤殺傷活性。
【專利說明】
制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法及制得的CIK細(xì)胞制劑
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于細(xì)胞治療領(lǐng)域，尤其是涉及一種制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法及制得的CIK細(xì)胞制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]CIK(Cytokine-1nduced Killer Cells)中文全稱為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，是將人外周血單個核細(xì)胞在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。其既具有T淋巴細(xì)胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細(xì)胞(自然殺傷細(xì)胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。CIK細(xì)胞具有殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴(kuò)增等特點，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細(xì)胞。
[0003]細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞抗原4(CTLA-4)又名⑶152，是由CTLA-4基因編碼的一種跨膜蛋白質(zhì)，表達(dá)于活化的⑶4+和⑶8+T細(xì)胞。CTLA-4與其配體B7分子結(jié)合后產(chǎn)生抑制性信號，抑制T細(xì)胞激活，使腫瘤細(xì)胞免受T淋巴細(xì)胞攻擊。因此阻斷CTLA-4的免疫效應(yīng)可刺激免疫細(xì)胞大量增殖，從而誘導(dǎo)或增強抗腫瘤免疫反應(yīng)。
[0004]PD-1(programmed death I)程序性死亡受體I，是一種重要的免疫抑制分子。PD-1是近年來發(fā)現(xiàn)的負(fù)性刺激分子之一，為I型跨膜糖蛋白，分子大小為55kD，屬于⑶28型家族，作為抑制分子表達(dá)于活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞表面。腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)和分泌細(xì)胞程序性死亡配體-1(Programmed Death I LigancUFO-Ll)，PD_L1與腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞表面的I3D-1分子結(jié)合后，會抑制T、B淋巴細(xì)胞的活性，是腫瘤細(xì)胞逃避機體免疫的主要原因之一。目前的研究表明ro-Li在多種腫瘤細(xì)胞中可呈高表達(dá)，其異常表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)。
[0005]CTLA-4是機體免疫應(yīng)答過程中T淋巴細(xì)胞早期表達(dá)的免疫抑制分子，而PD-1是晚期表達(dá)的分子，因此兩者聯(lián)合使用可以同時阻斷腫瘤免疫的兩個通路，從而大大提高CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法及制得的CIK細(xì)胞制劑，通過阻斷腫瘤早期的CTLA-4以及晚期的ro-1兩種免疫逃逸途徑來顯著提高CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。
[0007]為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等體積稀釋后，用Ficoll淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，加入⑶3 mAb、⑶28 mAb、IFN_y、IL-2，培養(yǎng)過程中加入Ant1-CTLA-4MAb以及Ant1-PD-1 MAb，培養(yǎng)13-16天收獲細(xì)胞，制備具有高效腫瘤殺傷活性的CIK細(xì)胞制劑。
[0008]具體地說，包括以下步驟:
[0009](I)淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基的配置:淋巴細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有FBS、IL-2 ；
[0010](2)采集正常健康人或腫瘤患者外周血，經(jīng)檢測無污染后，等體積生理鹽水稀釋，利用Ficol I淋巴細(xì)胞分離液將稀釋外周血進(jìn)行單個核細(xì)胞分離;分離得到的PBMC用淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度至5 X 105-9 X 15個/ml，制成PBMC細(xì)胞懸液；
[0011](3)將步驟(2)的PBMC細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)先包被⑶3 mAb的T-175培養(yǎng)瓶中，總體積50ml，并添加IFN-γ、IL-2;
[0012](4)培養(yǎng)第3天，細(xì)胞計數(shù)，并在培養(yǎng)體系中補加50ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基；
[0013](5)培養(yǎng)的第3-4天添加Ant1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中；
[0014](6)培養(yǎng)第5天，細(xì)胞計數(shù)，加入10ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基；
[0015](7)培養(yǎng)第7天，補加200ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、與步驟(3)中等量CD3 mAb，并添加CD28 mAb；
[0016](8)每隔2天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并補加與培養(yǎng)體系等體積的淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第13-15天加入Ant1-PD-1 MAb，孵育培養(yǎng)12_36h后，離心收獲CIK細(xì)胞。
[0017]所述步驟(I)中淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基中FBS的濃度為體積分?jǐn)?shù)2-5%、IL-2的終濃度為 300-1000IU/ml。
[0018]所述FicolI淋巴細(xì)胞分離液密度為1.077g/ml。
[0019]所述步驟(3)及步驟(7)中，CD3 mAb在培養(yǎng)體系中的添加量為5_20ng。
[0020]所述步驟(3)中，添加入培養(yǎng)體系中IFN-γ的終濃度為500-1000IU/ml。
[0021]所述步驟(5)中，所述培養(yǎng)體系中Ant1-CTLA-4MAb添加量為5-30ug。
[0022]所述步驟(7)中，CD28 mAb添加量為30_100ng。
[0023]所述步驟(8)中Ant1-PD-1MAb添加量為5_30ug。
[0024]上述的方法制備的CIK細(xì)胞制劑。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:在高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，加入CD3單克隆抗體(CD3 mAb)、CD28單克隆抗體(CD28 mAb)、干擾素-γ (IFN-γ )、白介素-2(IL_2)，培養(yǎng)過程中在適宜的時間點加入Ant1-CTLA-4MAb以及Ant1-PD-1 MAb，培養(yǎng)13-16天收獲細(xì)胞制備CIK細(xì)胞制劑。本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法可以顯著提高CIK的腫瘤殺傷活性。
【附圖說明】
[0026]圖1為誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天細(xì)胞生長情況圖。
[0027]圖2為細(xì)胞誘導(dǎo)擴(kuò)增生長曲線。
[0028]圖3為第16天回收細(xì)胞的流式檢測結(jié)果圖。
[0029]圖4為K562細(xì)胞殺傷實驗結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0030]下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明:
[0031]本發(fā)明制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等體積稀釋后，用Ficol I淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，加入CD3 mAb、CD28 mAb^IFN-γ、IL_2，培養(yǎng)過程中加入Ant1-CTLA_4MAb以及Ant1-PD-1 MAb，培養(yǎng)13-16天收獲細(xì)胞，制備具有高效腫瘤殺傷活性的CIK細(xì)胞制劑。
[0032]具體地說，包括以下步驟:
[0033](I)淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基的配置:淋巴細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有FBS、IL-2;
[0034](2)采集正常健康人或腫瘤患者外周血，經(jīng)檢測無污染后，等體積生理鹽水稀釋，利用Ficol I淋巴細(xì)胞分離液將稀釋外周血進(jìn)行單個核細(xì)胞分離;分離得到的PBMC用淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度至5 X 105-9 X 15個/ml，制成PBMC細(xì)胞懸液；
[0035](3)將步驟(2)的PBMC細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)先包被⑶3 mAb的T-175培養(yǎng)瓶中，總體積50ml，并添加IFN-γ、IL-2;
[0036](4)培養(yǎng)第3天，細(xì)胞計數(shù)，并在培養(yǎng)體系中補加50ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基；
[0037](5)培養(yǎng)的第3-4天添加Ant1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中；
[0038](6)培養(yǎng)第5天，細(xì)胞計數(shù)，加入10ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基；
[0039](7)培養(yǎng)第7天，補加200ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、與步驟(3)中等量⑶3 mAb，并添加CD28 mAb；
[0040](8)每隔2天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并補加與培養(yǎng)體系等體積的淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第13-15天加入Ant1-PD-1 MAb，孵育培養(yǎng)12_36h后，離心收獲CIK細(xì)胞。
[0041 ]所述步驟(I)中淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基中FBS的濃度為體積分?jǐn)?shù)2-5%、IL-2的終濃度為 300-1000IU/ml;
[0042]所述?化011淋巴細(xì)胞分離液密度為1.0778/1111。
[0043]所述步驟(3)及步驟(7)中，CD3 mAb在培養(yǎng)體系中的添加量為5_20ng。
[0044]所述步驟(3)中，添加入培養(yǎng)體系中IFN-γ的終濃度為500-1000IU/ml。
[0045]所述步驟(5)中，所述培養(yǎng)體系中Ant1-CTLA-4MAb添加量為5-30ug。
[0046]所述步驟(7)中，CD28 mAb添加量為30_100ng。
[0047]所述步驟(8)中Ant1-PD-1MAb添加量為5_30ug。
[0048]上述的方法制備的CIK細(xì)胞制劑。
[0049]所述培養(yǎng)第7天開始將細(xì)胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)袋中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0050]實施例1
[0051 ]無菌采集外周血10ml，在潔凈室進(jìn)行PBMC的分離和CIK的體外培養(yǎng)。
[0052]PBMC分離:
[0053]?將外周血與生理鹽水等體積混合，室溫放置5分鐘。
[0054]?取200ul用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。
[0055]籲80mlFicoll離心分離PBMC。
[0056]籲離心參數(shù):500g、19度、20分鐘。
[0057]籲取白膜。
[0058]?加入生理鹽水至總體積10ml，洗滌兩次。
[0059]?離心參數(shù):300g、19度、5分鐘。
[0060]?使用移液管或者真空吸液栗移除上清液，不可傾倒。上清液余量在細(xì)胞沉淀上
0.5-1 cm 處。
[0061 ] ?細(xì)胞重懸到1ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基中。
[0062]?利用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
[0063]?計算細(xì)胞得率。
[0064]CIK誘導(dǎo)培養(yǎng):
[0065]?分離的PBMC計數(shù)后，按5 X 15個/ml密度接種。
[0066]籲將細(xì)胞加入CD3 mAb(lOng)包被的T175培養(yǎng)瓶中。
[0067]籲補充淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基至100ml，加入IFN-γ (500IU/ml)。
[0068]籲第3天，細(xì)胞計數(shù)，加入IL-2(500IU/ml)。
[0069]?培養(yǎng)的第3天添加5ugAnt1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中；
[0070]?第5天，細(xì)胞計數(shù)，加入10ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、IL-2(300IU/ml)。
[0071 ] 籲第7天(圖1)，細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入200ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、CD3 mAb (1ng)、CD28 mAb(30ng)。
[0072]?培養(yǎng)的第3天添加5ugAnt1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中；
[0073]?每隔2天補加與原培養(yǎng)體系同等體積的淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
[0074]籲第13天加入5ugAnt1-PD-l MAb，孵育培養(yǎng)36h。
[0075]?第16天，細(xì)胞計數(shù)(共獲得4.32*109)繪制生長曲線(圖2)，并通過流式檢測細(xì)胞表面抗原表達(dá)情況(圖3)。
[0076]注:每種因子后面括號內(nèi)數(shù)值表示各因子在培養(yǎng)體系中的終濃度。
[0077]CIK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞(K562細(xì)胞系)的體外殺傷率(以樣品I為例)
[0078]籲將兩組CIK細(xì)胞與靶細(xì)胞(Hela細(xì)胞)，按5:1、10:1、20:1、30:1比例加入96孔培養(yǎng)板，同時設(shè)靶細(xì)胞組、效應(yīng)細(xì)胞組和空白組，每組設(shè)3個平行孔，置于37°C，5%C02，培養(yǎng)箱培養(yǎng)
[0079]籲12h后，每孔取出ΙΟΟμΙ上清，再加入20μ1 5mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4h，再加入100μI 0.04mol/L HCl酸化異丙醇
[0080]?在酶聯(lián)免疫檢測儀上選擇570nm波長測各孔OD值，取3個平每孔加入分析純DMSO150μ1，振蕩溶解5min。
[0081 ] ?平行孔平均OD值計算結(jié)果:
[0082]殺傷活性(%) = 1 —(實驗組OD值一效應(yīng)組OD值/靶細(xì)胞組OD值)X 100%。
[0083]當(dāng)效靶比為30:1時對腫瘤細(xì)胞的殺傷率可達(dá)到81.37%(圖4)。
[0084]實施例2
[0085]無菌采集外周血10ml，在潔凈室進(jìn)行PBMC的分離和CIK的體外培養(yǎng)。
[0086]PBMC 分離:
[0087]?將外周血與生理鹽水等體積混合，室溫放置5分鐘。
[0088]?取200ul用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。
[0089]籲80mlFicoll離心分離PBMC。
[0090]籲離心參數(shù):500g、19度、20分鐘。
[0091]籲取白膜。
[0092]?加入生理鹽水至總體積10ml，洗滌兩次。
[0093]?離心參數(shù):300g、19度、5分鐘。
[0094]?使用移液管或者真空吸液栗移除上清液，不可傾倒。上清液余量在細(xì)胞沉淀上
0.5-1 cm 處。
[0095]?細(xì)胞重懸到1ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基中。
[0096]?利用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
[0097]計算細(xì)胞得率。
[0098]CIK誘導(dǎo)培養(yǎng):
[0099]籲分離的PBMC計數(shù)后，按7 X 15個/ml密度接種。
[0100]籲將細(xì)胞加入CD3 mAb(20ng)包被的T175培養(yǎng)瓶中。
[0101]?補充淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基至100ml，加入IFN-γ (700IU/ml)。
[0102]?第 3天，細(xì)胞計數(shù)，加入 IL-2(700IU/ml)。
[0103]?培養(yǎng)的第4天添加15ugAnt1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中；
[0104]?第5天，細(xì)胞計數(shù)，加入10ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
[0105]籲第7天，細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入200ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、CD3mAb(20ng)、CD28 mAb(70ng)。
[0106]?每隔2天補加與原培養(yǎng)體系同等體積的淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
[0107]籲第14天加入 15ugAnt1-PD-l MAb，孵育培養(yǎng)24h。
[0108]?第16天，細(xì)胞計數(shù)，收獲細(xì)胞(共獲得4.48*19)。
[0109]備注:每種因子后面括號內(nèi)數(shù)值表示各因子在培養(yǎng)體系中的終濃度。
[0110]實施例3
[0111]無菌采集外周血10ml，在潔凈室進(jìn)行PBMC的分離和CIK的體外培養(yǎng)。
[0112]PBMC 分離:
[0113]?將外周血與生理鹽水等體積混合，室溫放置5分鐘。
[0114]?取200ul用血細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)。
[0115]籲80mlFicoll離心分離PBMC。
[0116]籲離心參數(shù):500g、19度、20分鐘。
[0117]籲取白膜。
[0118]?加入生理鹽水至總體積10ml，洗滌兩次。
[0119]?離心參數(shù):300g、19度、5分鐘。
[0120]?使用移液管或者真空吸液栗移除上清液，不可傾倒。上清液余量在細(xì)胞沉淀上
0.5-1 cm 處。
[0121 ]?細(xì)胞重懸到1ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基中。
[0122]?利用細(xì)胞計數(shù)儀進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。
[0123]計算細(xì)胞得率。
[0124]CIK誘導(dǎo)培養(yǎng):
[0125]籲分離的PBMC計數(shù)后，按9 X 15個/ml密度接種。
[0126]籲將細(xì)胞加入CD3 mAb(5ng)包被的T175培養(yǎng)瓶中。
[0127]籲補充淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基至100ml，加入FN-γ (1000IU/ml)。
[0128]籲第3天，細(xì)胞計數(shù)，加入IL-2( 1000IU/ml)。
[0129]籲培養(yǎng)的第3天添加30ugAnt1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中；
[0130]籲第5天，細(xì)胞計數(shù)，加入10ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
[0131 ]?第7天，細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞懸液移入細(xì)胞培養(yǎng)袋，加入200ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、CD3mAb(5ng)、CD28 mAb (10ng)0
[0132]?每隔2天補加與原培養(yǎng)體系同等體積的淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基。
[0133]籲第15天加入30ugAnt1-PD-l MAb。
[0134]?孵育培養(yǎng)12h，細(xì)胞計數(shù)，收獲細(xì)胞(共獲得4.62*109)。
[0135]備注:每種因子后面括號內(nèi)數(shù)值表示各因子在培養(yǎng)體系中的終濃度。
[0136]本發(fā)明在此基礎(chǔ)上添加Ant1-CTLA-4MAb和Ant1-PD-1 MAb，兩者聯(lián)合使用可以同時阻斷腫瘤免疫前期的CTLA-4以及后期的ro-1的兩個腫瘤免疫通路，從而大大提高CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷活性。
[0137]綜上所述，本發(fā)明的內(nèi)容并不局限在上述的實施例中，相同領(lǐng)域內(nèi)的有識之士可以在本發(fā)明的技術(shù)指導(dǎo)思想之內(nèi)可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種制備具有高效腫瘤殺傷活性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，無菌采集健康人或患者外周血，生理鹽水等體積稀釋后，用Ficol I淋巴細(xì)胞分離液分離單個核細(xì)胞，在CIK細(xì)胞誘導(dǎo)過程中，加入CD3mAb、CD28mAb、IFN- γ、IL-2，培養(yǎng)過程中加入Anti_CTLA_4MAb以及Ant1-PD-lMAb，培養(yǎng)13-16天收獲細(xì)胞，制備具有高效腫瘤殺傷活性的CIK細(xì)胞制劑。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備具有高效腫瘤殺傷活性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基的配置:淋巴細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有FBS、IL-2; (2)采集正常健康人或腫瘤患者外周血，經(jīng)檢測無污染后，等體積生理鹽水稀釋，利用Ficol I淋巴細(xì)胞分離液將稀釋外周血進(jìn)行單個核細(xì)胞分離;分離得到的PBMC用淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基調(diào)整濃度至5 X 105-9 X 15個/ml，制成PBMC細(xì)胞懸液； (3)將步驟(2)的PBMC細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)先包被⑶3mAb的T-175培養(yǎng)瓶中，總體積50ml，并添加IFN-γ、IL-2; (4)培養(yǎng)第3天，細(xì)胞計數(shù)，并在培養(yǎng)體系中補加50ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基； (5)培養(yǎng)的第3-4天添加Ant1-CTLA-4MAb于培養(yǎng)體系中； (6)培養(yǎng)第5天，細(xì)胞計數(shù)，加入10ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基； (7)培養(yǎng)第7天，補加200ml淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基、與步驟(3)中等量CD3mAb，并添加CD28mAb； (8)每隔2天進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)并補加與培養(yǎng)體系等體積的淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在培養(yǎng)的第13-15天加入Ant1-PD-lMAb，孵育培養(yǎng)12-36h后，離心收獲CIK細(xì)胞。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述步驟(I)中淋巴細(xì)胞完全培養(yǎng)基中FBS的濃度為體積分?jǐn)?shù)2-5%、IL-2的終濃度為300-1000IU/mlo4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷性的CIK的方法，其特征在于，所述FicolI淋巴細(xì)胞分離液密度為1.077g/ml。5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述步驟(3)及步驟(7)中，CD3mAb在培養(yǎng)體系中的添加量為5_20ng。6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷活性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述步驟(3)中，添加入培養(yǎng)體系中IFN-γ的終濃度為500-1000IU/ml。7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述步驟(5)中，所述培養(yǎng)體系中Ant1-CTLA-4MAb添加量為5-30ug。8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述步驟(7)中，⑶28mAb添加量為30-1 OOng。9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備具有高效腫瘤殺傷性CIK細(xì)胞制劑的方法，其特征在于，所述步驟(8)中Ant1-PD-1MAb添加量為5-30ug。10.如權(quán)利要求1-9任一項所述的方法制備的CIK細(xì)胞制劑。
【文檔編號】C12N5/0783GK105861433SQ201610272170
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月27日
【發(fā)明人】張冰晶, 魯振宇, 韓洪起, 劉俊江, 秦臻
【申請人】天津普瑞賽爾生物科技有限公司