一種mhc限制性殺傷t細胞的體外誘導培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及細胞體外誘導培養(yǎng)及擴增【技術領域】，特別涉及一種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法：分離臍帶血單個核細胞；臍帶血單個核細胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPMI-1640為基礎培養(yǎng)基，添加不同的細胞因子在培養(yǎng)細胞的4個階段使用。使用臍血中提取的MNC細胞作為原料，通過添加細胞因子，經(jīng)過15天的擴增培養(yǎng)獲得擴增10-15倍的CTL，并且具有旺盛的殺瘤活性，使臍血可以作為腫瘤過繼免疫治療所需T淋巴細胞的來源；該方法能夠獲得較其他方法數(shù)量更多的CTL，并且體外細胞毒性試驗與熒光定量PCR實驗檢測細胞毒性增強。
【專利說明】一種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法
[0001]【技術領域】
本發(fā)明涉及細胞體外誘導培養(yǎng)及擴增【技術領域】，特別涉及一種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法。
[0002]【背景技術】
腫瘤過繼免疫治療是指通過向腫瘤患者輸注抗腫瘤活性的免疫細胞，直接殺傷或激發(fā)機體免疫反應以達到殺傷腫瘤細胞治療腫瘤的目的，過繼免疫治療是腫瘤生物治療的重要組成部分，在腫瘤的治療中起著積極的作用，其中常見的細胞種類包括細胞因子誘導的T細胞(cytokine induced killor, CIK 細胞)、自然殺傷細胞(Nature killor, NK 細胞)和殺傷性T細胞(cytotoxic T cell，CTL)。其中CTL是機體特異性抗腫瘤免疫的主要效應細胞，是腫瘤免疫治療中較為理想的效應細胞種類。CTL是一類具有CD3+CD8+表面標志、具有MHC I限制性的T細胞，可以特異性地快速性殺傷靶細胞。雖然CTL受MHC I類分子限制性，T細胞過繼免疫療法須使用患者自身的血液進行，但HLA與患者相同或部分相同的健康個體也可獲得特異性的CTL。近年來的研究成果肯定了來自患者體內或經(jīng)體外腫瘤抗原刺激的腫瘤抗原特異性T細胞過繼免疫療法，但該方法仍有不足之處:患者在疾病狀態(tài)下免疫細胞功能低下，而且經(jīng)連續(xù)放化療之后，使體外擴增難度進一步增加。因此尋找功能健全的免疫細胞來源非常必要。
[0003]臍帶血干細胞是目前的研究熱點，其來源豐富，獲取方便，含有豐富的造血干細胞和免疫細胞；同時臍血造血干細胞具有多向分化潛能，在造血因子的作用下可以分化擴增。目前技術已能長時間儲存臍血，經(jīng)深低溫長期儲存的臍血經(jīng)過多種細胞因子組合誘導分化，可產(chǎn)生大量免疫細胞如CIK細胞和NK細胞，用于腫瘤過繼免疫治療，但有關擴展臍血CTL的報道尚不多見。
[0004]雖然很多研究結果顯示臍血特異性的CTL的殺傷活性較成人外周血CTL低，但臍血T細胞前體和輔助T細胞前體的含量與成人外周血相當，受異種抗原刺激的增殖反應強，仍然可作為過繼免疫治療的來源。如臍血T淋巴細胞分泌IFN-Y低于成人，但在IL-2刺激后，兩者無明顯差異。經(jīng)PHA-P刺激后能夠使臍血T淋巴細胞活化，有文獻報道，臍血淋巴細胞對不同濃度的植物血凝集素(PHA)和刀豆蛋白A的增殖反應與成人相同或高于成人，所以臍血T淋巴細胞可望成為腫瘤過繼免疫治療的主要替代細胞來源。
[0005]
【發(fā)明內容】

為了解決以上現(xiàn)有技術中本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種MHC限制性殺傷τ細胞(ctl，表型為ra3+ra8+)的體外誘導培養(yǎng)方法。
[0006]本發(fā)明是通過以下步驟得到的:
一種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(1)分離臍帶血單個核細胞；
(2)臍帶血單個核細胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎培養(yǎng)基，添加不同的細胞因子在培養(yǎng)細胞的4個階段使用，
第一階段為第I天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, 10-100ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10-1000IU/mL 的 IL-4 進行培養(yǎng)；
第二階段為第2天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF，lO-lOOng/mL的FLT-3L，lO-lOOng/mL 的 anti_CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng);
第三階段為第5-8天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF, lO-lOOng/mL的FLT-3L, lO-lOOng/mL 的 IL-15 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)；
第四階段為第9-15天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)。
[0007]一種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
(1)分離臍帶血單個核細胞；
(2)臍帶血單個核細胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎培養(yǎng)基，添加不同的細胞因子在培養(yǎng)細胞的4個階段使用，
第一階段在基礎培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的
Y-1FN, 5-50ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10_500IU/mL 的 IL-4 進行培養(yǎng)；
第二階段在基礎培養(yǎng)基中加入 10-50ng/mL 的 SCF, 10_50ng/mL 的 FLT-3L，lO-lOOng/mL的 ant1-CD3, lO-lOOng /mL 的 anti_CD28 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)；
第三階段在基礎培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L，5_50ng/mL的 IL-15 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)；
第四階段在基礎培養(yǎng)基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)。
[0008]所述的體外誘導培養(yǎng)方法，優(yōu)選
第一階段在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的\ -1FN, 10ng/mL的IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 進行培養(yǎng)；
第二階段在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL 的 anti_CD28 和 1000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)；
第三階段在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)；
第四階段在基礎培養(yǎng)基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)。
[0009]所述的體外誘導培養(yǎng)方法，優(yōu)選在每個階段中保持細胞密度為5 X IO6個/mL。
[0010]所述的體外誘導培養(yǎng)方法，優(yōu)選培養(yǎng)發(fā)生在37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內。
[0011]所述的體外誘導培養(yǎng)方法，優(yōu)選分離臍帶血單個核細胞的步驟包括:臍帶血用淋巴細胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個核細胞。
[0012]本發(fā)明的有益效果:
1)使用臍血中提取的MNC細胞作為原料，通過添加細胞因子，經(jīng)過15天的擴增培養(yǎng)獲得擴增10-15倍的CTL，并且具有旺盛的殺瘤活性，使臍血可以作為腫瘤過繼免疫治療所需T淋巴細胞的來源；
2)該方法能夠獲得較其他方法數(shù)量更多的CTL，并且體外細胞毒性試驗與熒光定量PCR實驗檢測細胞毒性增強。[0013]【專利附圖】

【附圖說明】
圖1是CTL細胞形態(tài)學觀察和增殖直方圖，A為培養(yǎng)前CTL細胞形態(tài)學觀察(X 200)；B為培養(yǎng)后CTL細胞形態(tài)學觀察；
圖2是流式細胞術檢測實施例1細胞表型在培養(yǎng)前后的變化，其中A、D、G為CTL細胞培養(yǎng)前后CD3CD8表型變化圖；B、E、H為CTL細胞培養(yǎng)前后CD4CD25表型變化圖；C、F、I為CTL細胞培養(yǎng)前后⑶3⑶56表型變化圖；
圖3是流式細胞術檢測實施例2細胞表型在培養(yǎng)前后的變化，其中A、D、G為CTL細胞培養(yǎng)前后CD3CD8表型變化圖；B、E、H為CTL細胞培養(yǎng)前后CD4CD25表型變化圖；C、F、I為CTL細胞培養(yǎng)前后⑶3⑶56表型變化圖；
圖4是流式細胞術檢測實施例3細胞表型在培養(yǎng)前后的變化，其中A、D、G為CTL細胞培養(yǎng)前后CD3CD8表型變化圖；B、E、H為CTL細胞培養(yǎng)前后CD4CD25表型變化圖；C、F、I為CTL細胞培養(yǎng)前后⑶3⑶56表型變化圖；
圖5是實施例1誘導得到的CTL細胞殺傷活性檢測結果(CCK8法)，A為直接提取的臍血MNC細胞，B為經(jīng)過培養(yǎng)的CTL細胞；
圖6是實施例1誘導得到的CLT細胞內TNF- a、GM-CSF, IFN- y、granzymeA、granzymeB、GM-CSF、granulysin、perforin等相關細胞因子基因的表達,實體柱為擴增前結果，空白柱為擴增后結果。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明:
實施例1:由臍血體外誘導培養(yǎng)CTL細胞
(I)足月正常分娩之臍血取自山東大學齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會同意)，用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋收集，24h內實驗。輸血傳播傳染病檢測合格的臍帶血用Ficoll淋巴細胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個核細胞(MNC)，待培養(yǎng)。
[0015]第一階段(第I天)在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的
Y-1FN, 10ng/mL 的 IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 得到個性化培養(yǎng)基 1，調整細胞密度為5 X 1O6個/mL，進行培養(yǎng)；
第二階段(第2-4天)在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF，20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基2，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第三階段(第5-8天)在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF，20ng/mL的FLT-3L，IOng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基3，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第四階段(第9-15天)在基礎培養(yǎng)基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基4，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)，得到CTL細胞。
[0016]上述細胞培養(yǎng)置于37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每隔I天通過臺盼藍染色法計數(shù)并檢測細胞免疫表型和活性。共培養(yǎng)15天后收獲細胞。細胞總數(shù)平均由培養(yǎng)前平均細胞數(shù)4.6 X IO7達到個性化培養(yǎng)后細胞數(shù)7 X IO8,增殖率平均為1522%。圖1是CTL細胞形態(tài)學觀察圖，A:為培養(yǎng)前CTL細胞形態(tài)學觀察(X 200) ；B為培養(yǎng)后CTL細胞形態(tài)學觀察，可見細胞聚集成克隆球(X 200)。
[0017]實施例2:由臍血體外誘導培養(yǎng)CTL細胞
(I)足月正常分娩之臍血取自山東大學齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會同意)，用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋收集，24h內實驗。輸血傳播傳染病檢測合格的臍帶血用Ficoll淋巴細胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個核細胞(MNC)，待培養(yǎng)。
[0018]第一階段(第I天)在基礎培養(yǎng)基中加入10ng/mL的GM-CSF，10ng/mL的
Y-1FN, 5ng/mL的IL-15, lug/mL的PHA-P和10IU/mL的IL-4得到個性化培養(yǎng)基1，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第二階段(第2-4天)在基礎培養(yǎng)基中加入10ng/mL的SCF，10ng/mL的FLT-3L，IOng/mL的ant1-CD3, 10ng/mL的anti_CD28和1000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基2，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第三階段(第5-8天) 在基礎培養(yǎng)基中加入10ng/mL的SCF，10ng/mL的FLT-3L，5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基3，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第四階段(第9-15天)在基礎培養(yǎng)基中加入5ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基4，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)，得到CTL細胞。
[0019]上述細胞培養(yǎng)置于37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每隔I天通過臺盼藍染色法計數(shù)并檢測細胞免疫表型和活性。共培養(yǎng)15天后收獲細胞。細胞總數(shù)平均由培養(yǎng)前平均細胞數(shù)4.7 X IO7達到個性化培養(yǎng)后細胞數(shù)2.32 X 108，增殖率平均為493%。
[0020]實施例3:由臍血體外誘導培養(yǎng)CTL細胞
(I)足月正常分娩之臍血取自山東大學齊魯醫(yī)院婦產(chǎn)科(產(chǎn)婦知情同意，并經(jīng)山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會同意)，用含枸櫞酸鈉抗凝劑的采血袋收集，24h內實驗。輸血傳播傳染病檢測合格的臍帶血用Ficoll淋巴細胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個核細胞(MNC)，待培養(yǎng)。
[0021 ] 第一階段(第I天)在基礎培養(yǎng)基中加入100ng/mL的GM-CSF，100ng/mL的
Y-1FN, 50ng/mL 的 IL-15, 5ug/mL 的 PHA-P 和 500IU/mL 的 IL-4 得到個性化培養(yǎng)基 1，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第二階段(第2-4天)在基礎培養(yǎng)基中加入50ng/mL的SCF, 50ng/mL的FLT-3L，IOOng/mL的ant1-CD3, 100ng/mL的anti_CD28和2000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基2，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第三階段(第5-8天)在基礎培養(yǎng)基中加入50ng/mL的SCF, 50ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基3，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)；
第四階段(第9-15天)在基礎培養(yǎng)基中加入50ng/mL的IL-15和2000IU/mL的IL-2到個性化培養(yǎng)基4，調整細胞密度為5 X IO6個/mL，進行培養(yǎng)，得到CTL細胞。
[0022]上述細胞培養(yǎng)置于37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。每隔I天通過臺盼藍染色法計數(shù)并檢測細胞免疫表型和活性。共培養(yǎng)15天后收獲細胞。細胞總數(shù)平均由培養(yǎng)前平均細胞數(shù)4. 9 X 107達到個性化培養(yǎng)后細胞數(shù)6. 1 X 108，增殖率平均為1244%。
[0023]誘導培養(yǎng)結果鑒定 1.免疫表型鑒定
分別用PE標記小鼠抗人單克隆抗體⑶3、⑶25，F(xiàn)ITC標記小鼠抗人單克隆抗體⑶8、 CD56、CD4，分別以相應PE-小鼠IgGl和FITC-小鼠IgGl、FITC_小鼠IgG2b作為同型對照 抗體，使用流式細胞儀對直接分離的臍血單個核細胞和經(jīng)過體外誘導培養(yǎng)得到的細胞進行 檢測。實施例1、2、3的檢測結果分別見圖2，圖3，圖4，其中A、D、G為CTL細胞培養(yǎng)前后 ⑶3⑶8表型變化圖；B、E、H為CTL細胞培養(yǎng)前后⑶4⑶25表型變化圖；C、F、I為CTL細胞 培養(yǎng)前后CD3CD56表型變化圖。
[0024]經(jīng)流式細胞儀檢測顯示，直接分離的臍血單個核細胞流式分型的結果95%以上均 為CD3-CD8-雙陰性，而在體外培養(yǎng)15d后，經(jīng)過實施例1體外誘導培養(yǎng)收獲的CTL細胞 CD3+CD8+細胞的比例高達82. 77%，CD4+CD25+細胞僅有1. 44%，同時還含有少量的CD3-CD56+ 細胞（0. 45%)。實施例2和實施例3體外誘導培養(yǎng)收獲的CTL細胞OT3+ra8+細胞的比例也 達到53. 34%和76. 35%。綜合考慮實驗結果與培養(yǎng)成本，我們認為實施例1為最優(yōu)。
[0025]2.細胞殺傷活性檢測（CCK-8法）
收集對數(shù)生長期K562細胞、Hela細胞為靶細胞，并調整密度為1 X 105個/mL。將經(jīng)過 體外誘導培養(yǎng)收獲的CTL細胞作為實驗組，以直接分離的臍血MNC細胞作為對照組。根據(jù) 不同效靶比，調整CTL細胞密度為1 X 105/ml和1 X 106/mL兩組，分別按效靶比（1:1，10:1) 將CTL細胞與靶細胞（各lOOul)混合，同時設相應的僅靶細胞對照孔，僅CTL細胞對照孔 和培養(yǎng)基空白對照孔，終體積均為200ul/孔，每組均設8個平行孔。37°C 5% C02培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)，在培養(yǎng)的3h和6h分別取下一排孔，加入10ul CCK-8并混勻，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 小時后，測定每孔450nm波長處的0D值。
[0026]細胞毒活性的計算方法：求出8個平行孔的平 均值，按以下方法計算效應細胞毒活性，以殺傷率％表示： 細胞毒活性=1-(效靶細胞作用孔0￡)值-效應細胞孔OD值卜靶細胞孔OD值xl 00%
比較不同效靶比、不同時間點下對照組細胞及CTL細胞對Hela細胞和HK562細胞的殺 傷活性，結果見圖5，CTL細胞殺傷活性檢測結果（CCK8法）。實驗結果顯示經(jīng)過培養(yǎng)的CTL 細胞比直接提取的臍血MNC細胞殺傷力顯著增高，而且效靶比越高、殺瘤時間越長，殺傷效 果就越好。直接提取的MNC細胞殺傷效果平均值為61. 88%，最低32. 45%，最高71. 96% ;培 養(yǎng)的CTL細胞殺傷效果均能達到80%以上，平均值為90. 33%，與對照組相比有顯著提高。
[0027]3、Real-time RT-PCR法檢測相關基因表達
取直接分離的臍血單個核細胞和經(jīng)過體外誘導培養(yǎng)收獲的CTL細胞，各1 X 106個細 胞。按Trizol試劑盒說明提取總RNA;進行RT-PCR獲得cDNA,檢測顆粒酶（granzyme )A、顆粒酶 B、GM-CSF、顆粒溶素(Granulysin )、IFN-y、TGF-betal、TNF-a 和穿孔素 (perforin )基因的表達，以GAPDH為內參基因。采用SYBR Green Dye I法在PCR儀MX 3000P進行定量PCR反應，以直接分離的臍血MNC細胞作為對照組并將其結果設為1，見圖 6。
[0028]結果顯示TNF- a、GM_CSF和IFN_ y等相關細胞因子的mRNA表達水平水平均有不 同程度增加，與對照組相比較，其中IFN-y、TGF-betal上調較為明顯（P〈0. 05)，其余因子均大幅上調(P〈0.01)。[0029]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受實施例的限制，其它任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所做的改變、修飾、組合、替代、簡化均應為等效替換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟: (1)分離臍帶血單個核細胞； (2)臍帶血單個核細胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎培養(yǎng)基，添加不同的細胞因子在培養(yǎng)細胞的4個階段使用， 第一階段為第I天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, lO-lOOng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10-1000IU/mL 的 IL-4 進行培養(yǎng)； 第二階段為第2天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF，lO-lOOng/mL的FLT-3L，lO-lOOng/mL 的 anti_CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng); 第三階段為第5-8天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的SCF, lO-lOOng/mL的FLT-3L, lO-lOOng/mL 的 IL-15 和 100-1000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)； 第四階段為第9-15天，在基礎培養(yǎng)基中加入10-100ng/mL的IL-15和100_1000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)。
2.—種MHC限制性殺傷T細胞的體外誘導培養(yǎng)方法，其特征是包括以下步驟: (1)分離臍帶血單個核細胞； (2)臍帶血單個核細胞放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采用含10%FBS的RPM1-1640為基礎培養(yǎng)基，添加不同的細胞因子在培養(yǎng)細胞的4個階段使用， 第一階段在基礎培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的GM-CSF，lO-lOOng/mL的Y-1FN, 5-50ng/mL 的 IL-15, l_5ug/mL 的 PHA-P 和 10_500IU/mL 的 IL-4 進行培養(yǎng)； 第二階段在基礎培養(yǎng)基中加入 10-50ng/mL 的 SCF, 10-50ng/mL 的 FLT-3L，lO-lOOng/mL的 ant1-CD3, lO-lOOng/mL 的 anti_CD28 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)； 第三階段在基礎培養(yǎng)基中加入10-50ng/mL的SCF, 10-50ng/mL的FLT-3L，5_50ng/mL的 IL-15 和 1000-2000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)； 第四階段在基礎培養(yǎng)基中加入5-50ng/mL的IL-15和1000-2000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求2所述的體外誘導培養(yǎng)方法，其特征在于 第一階段在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的GM-CSF，50ng/mL的\ -1FN, 10ng/mL的IL-15, 2ug/mL 的 PHA-P 和 100IU/mL 的 IL-4 進行培養(yǎng)； 第二階段在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，50ng/mL的ant1-CD3, 50ng/mL 的 anti_CD28 和 1000IU/mL 的 IL-2 進行培養(yǎng)； 第三階段在基礎培養(yǎng)基中加入20ng/mL的SCF, 20ng/mL的FLT-3L，10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)； 第四階段在基礎培養(yǎng)基中加入10ng/mL的IL-15和1000IU/mL的IL-2進行培養(yǎng)。
4.根據(jù)權利要求1或2所述的體外誘導培養(yǎng)方法，其特征在于在每個階段中保持細胞密度為5 X IO6個/mL。
5.根據(jù)權利要求1或2或4所述的體外誘導培養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)發(fā)生在37°C、5% CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱內。
6.根據(jù)權利要求1或2或4所述的體外誘導培養(yǎng)方法，其特征在于分離臍帶血單個核細胞的步驟包括:臍帶血用淋巴細胞分離液分離，用密度梯度離心法分離得到臍帶血單個核細胞 。
【文檔編號】C12N5/0783GK103740643SQ201410026036
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月21日 優(yōu)先權日:2014年1月21日
【發(fā)明者】明奕, 張海燕, 李棟 申請人:山東省齊魯干細胞工程有限公司