使用一組新型低豐度人類血漿蛋白生物標(biāo)記對(duì)肝纖維化進(jìn)行臨床診斷的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提出一組新型的用于診斷肝纖維化和肝硬化的人類血漿蛋白生物標(biāo)記。目前沒有可靠的評(píng)估肝纖維化的無(wú)創(chuàng)方式?；?D?PAGE的蛋白組學(xué)研究用于鑒別潛在的纖維化生物標(biāo)記。分析了來(lái)自患有丙肝病毒(HCV)感染誘發(fā)的肝硬化的患者的血漿。鑒別了與肝瘢痕化相關(guān)且與病毒感染潛在相關(guān)的數(shù)種蛋白。這些生物標(biāo)記可與國(guó)際公布WO/2008/031051中的多肽聯(lián)合使用。這些新型生物標(biāo)記的濃度可使用免疫分析來(lái)測(cè)定，其中，所述濃度將反映纖維化的程度。本發(fā)明提出所述新型生物標(biāo)記中的每一個(gè)的纖維化評(píng)分分級(jí)。所有新型生物標(biāo)記的分值相加的結(jié)果將給出更為可靠的纖維化程度指標(biāo)，而非檢測(cè)單個(gè)生物標(biāo)記。
【專利說(shuō)明】使用一組新型低豐度人類血漿蛋白生物標(biāo)記對(duì)肝纖維化進(jìn)行 臨床診斷
[00011 本申請(qǐng)為2012年1月11日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、申請(qǐng)?zhí)枮?01080031411.7、申請(qǐng)日為 2010年5月13日、發(fā)明名稱為"使用一組新型低豐度人類血漿蛋白生物標(biāo)記對(duì)肝纖維化進(jìn)行 臨床診斷"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003]本申請(qǐng)要求2009年5月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/178,334號(hào)的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本申請(qǐng)總體上涉及使用一組抗體診斷肝纖維化或肝硬化的方法，所述抗體靶向一 組豐度非常低的新型肝瘢痕化生物標(biāo)記。這些新型蛋白還可用作肝炎、肝細(xì)胞癌(HCC)的生 物標(biāo)記以及肝瘢痕化、肝炎和HCC的藥物靶標(biāo)。
【背景技術(shù)】
[0005] 肝纖維化:肝纖維化是創(chuàng)傷愈合反應(yīng)，該創(chuàng)傷愈合反應(yīng)以肝臟中瘢痕組織（即細(xì)胞 外基質(zhì)）的過(guò)度集聚為特征。組織的正常結(jié)構(gòu)要素被過(guò)量的非功能性瘢痕組織取代。穿刺肝 臟進(jìn)行活檢是診斷和評(píng)估纖維化的主要手段，但有充分證據(jù)顯示該技術(shù)有許多限制和缺 點(diǎn)，包括患者不適、疼痛、出血以及極少數(shù)病例中的死亡。此外，如果纖維化在整個(gè)肝臟當(dāng)中 不是均一的，那么，活檢可能不可靠。肝纖維化可由包括酒精和病毒在內(nèi)的多種因素引起。
[0006] 肝硬化:肝硬化是肝瘢痕化的最嚴(yán)重的形式，并且，與肝纖維化不同，通常認(rèn)為肝 硬化是不可逆的且具有結(jié)節(jié)。在英國(guó)，肝硬化每年引起超過(guò)6000例的死亡，在美國(guó)，肝硬化 每年引起大約27，000例的死亡，肝硬化是第九大致死因素(MacSween等，（2002)，Pathology of the Liver，第四版，Churchill Livingstone)。肝硬化是HCC的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，在肝癌的 這個(gè)階段，唯一的治療手段是肝臟移植。在病毒誘發(fā)的肝癌病例中，肝瘢痕化和HCC可在移 植后復(fù)發(fā)。有必要在可逆的肝瘢痕化早期階段診斷纖維化，從而可預(yù)防不可逆的肝硬化。
[0007] 丙型肝炎病毒：全球約1 . 7億人口（即世界人口的3 % (參見，例如WHO、 J. Viral .Hepat. 1999;6:35-47))感染丙型肝炎病毒(HCV、HepC)，美國(guó)約四百萬(wàn)人口感染丙 型肝炎病毒。HCV是肝纖維化和肝硬化的主要病因。約80 %急性感染HCV的個(gè)體成為慢性感 染。因此，HCV是慢性肝炎的主要病因。一旦慢性感染該病毒，若不進(jìn)行治療病毒幾乎絕不清 除。在極少數(shù)病例中，HCV感染引發(fā)臨床急性疾病甚至肝衰竭。慢性HCV感染在個(gè)體間可顯著 不同，其中一些個(gè)體具有臨床上不明顯的肝臟疾病或具有最輕度的肝臟疾病且從不發(fā)生并 發(fā)癥，而其它個(gè)體具有臨床上明顯的慢性肝炎并繼續(xù)發(fā)展為肝纖維化和肝硬化。發(fā)展成肝 硬化的攜帶HCV的個(gè)體中的約20%將發(fā)展為末期肝臟疾病并且發(fā)展成原發(fā)性肝癌的風(fēng)險(xiǎn)增 加。
[0008] 需要改進(jìn)的方法來(lái)診斷患者中的肝纖維化和肝硬化。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供檢測(cè)纖維化和肝硬化的方法。
[0010] 在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)纖維化和肝硬化的方法，所述方法包括：（a) 測(cè)定取自患者的生物樣本中的HF-相關(guān)(HF-ASSOCIATED)多肽的水平；以及(b)將所述水平 (a)與所述HF-相關(guān)多肽的對(duì)照水平進(jìn)行比較以確定所述纖維化的陽(yáng)性診斷或陰性診斷。這 些生物標(biāo)記可應(yīng)用于表現(xiàn)出纖維化的任何疾病，所述纖維化例如肝纖維化、腎纖維化、心纖 維化(cardial fibrosis)、皮膚纖維化、胰纖維化等等，但在特定的實(shí)施方式中所述纖維化 為肝纖維化。本發(fā)明選擇下組中的多肽：14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯(lián)素、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白 酶、α-2-HS-糖蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白Ε、C4b-結(jié)合蛋白β鏈、完整/裂解的補(bǔ)體C3dg、 皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白、纖維蛋白原γ鏈、pH 5.46至pH 5.49處的β結(jié)合珠蛋白、結(jié)合珠蛋 白相關(guān)蛋白、血液結(jié)合素、免疫球蛋白J鏈、富亮氨酸α-2-糖蛋白、脂轉(zhuǎn)移抑制劑蛋白、視黃 醇結(jié)合蛋白4、血清對(duì)氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結(jié)合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。這些生物標(biāo) 記可與國(guó)際公布W0/2008/031051中的多肽聯(lián)合使用，所述多肽包括間-α-胰蛋白酶抑制劑 重鏈Η4片段、α?抗胰凝乳蛋白酶、載脂蛋白L1、前清蛋白、白蛋白、CD5抗原樣蛋白同等型、β2 糖蛋白Ι、α2巨球蛋白及免疫球蛋白成分、結(jié)合珠蛋白的α1、α2和β鏈、補(bǔ)體成分(03、04和!1因 子-相關(guān)蛋白1)、脂聯(lián)素、ApoE、凝血酶原、簇蛋白和血管緊張素原。在其它實(shí)施方式中，纖維 化包括HF-相關(guān)多肽的差異調(diào)控。在其它實(shí)施方式中，樣本取自血清或血漿。
[0011]在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測(cè)HF-相關(guān)多肽的方法，所述方法包括:a)從患 有纖維化或肝硬化的患者中分離生物樣本，b)從未患有纖維化的患者中分離生物樣本，c) 用2D-PAGE分析來(lái)自a)和b)的樣本，以及d)比較2D-PAGE結(jié)果以鑒別在患有和未患有纖維化 或肝硬化的患者之間差異表達(dá)的多肽。使用2D-PAGE時(shí)，生物標(biāo)記可使用常用的寬pH范圍檢 測(cè)，所述寬pH范圍例如pH 3至pH 10、pH 3至pH 11或pH 4至pH 7。豐度非常低的生物標(biāo)記可 用pH 3至pH 11的任何窄pH范圍檢測(cè)，所述窄pH范圍例如但不限于:pH 3至pH 5.6、pH 3至 pH 6、pH 3.9至pH 5·1、ρΗ 4.7至pH 5·9、ρΗ 5至pH 8、pH 5.3至pH 6·5、ρΗ 5.5至pH 6.7、 pH 6至pH 11、ρΗ 6.2至pH 7·5、ρΗ 6.3至pH 8·3、ρΗ 7至pH 10、pH 7至pH 11、ρΗ 3.5至pH 4.5、pH 3至pH 7和pH 6至pH 9。覆蓋這些窄pH范圍的2D-PAGE凝膠也可用于鑒別其他疾病 中的新型生物標(biāo)記及藥物靶標(biāo)。
[0012] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供將纖維化嚴(yán)重程度分級(jí)的方法，所述方法包括:a) 測(cè)定取自患者的生物樣本中至少一種HF-相關(guān)多肽的水平；以及b)將所述患者的生物樣本 中的所述HF-相關(guān)多肽水平與預(yù)先測(cè)定的無(wú)纖維化至肝硬化的患者人群中的所述HF-相關(guān) 多肽的水平進(jìn)行比較。
[0013] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在未治療的個(gè)體中以及在治療過(guò)程中的纖維化的 預(yù)后方面有用的試劑盒，所述試劑盒包含HF-相關(guān)藥劑，其中所述藥劑特異性檢測(cè)HF-相關(guān) 多肽。在特定的實(shí)施方式中，所述藥劑是結(jié)合HF-相關(guān)多肽的抗體或其功能等同物。這些抗 體可用于進(jìn)行免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射性免疫測(cè)定、蛋白斑點(diǎn)印跡、 蛋白印跡(Western blot)、透射比池法、散射比池法等等。HF-相關(guān)多肽還可使用非抗體途 徑來(lái)定量，例如，但不限于，使用質(zhì)譜進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。所述試劑盒可進(jìn)一步包含至少一種 靶標(biāo)，所述靶標(biāo)特異性地檢測(cè)用作預(yù)后指標(biāo)的另一基因或基因產(chǎn)物。
[0014] 在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供測(cè)定纖維化的預(yù)后的方法，所述方法包括：（a)測(cè) 定取自患者的生物樣本中的HF-相關(guān)多肽的水平;及(b)將(a)的所述水平與所述HF-相關(guān)多 肽的對(duì)照水平進(jìn)行比較以確定所述纖維化的陽(yáng)性診斷或陰性診斷。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1至圖4這幾幅圖顯示在主要的新型生物標(biāo)記的表達(dá)中觀察到的變化。每幅圖顯 示2D-PAGE凝膠的放大區(qū)域，其中，所鑒別的蛋白的相應(yīng)位置被圈出。圖中顯示了健康個(gè)體 和肝硬化患者的代表性血漿凝膠圖像。
[0016] 圖1顯示脂轉(zhuǎn)移抑制劑蛋白在正常血漿中出現(xiàn)但在肝硬化患者血漿中減少。
[0017]圖2顯示鋅-α-2-糖蛋白在正常血漿中出現(xiàn)但在肝硬化患者血漿中減少。
[0018] 圖3顯示pH 5.46至pH 5.49處的β結(jié)合珠蛋白的特征點(diǎn)（feature)減少。上方的圖-β結(jié)合珠蛋白斑點(diǎn)的均勻分布陣列，該陣列顯示正常血漿和肝硬化患者血漿無(wú)顯著差別。下 方的圖-在約pH 5.46至pH 5.49處觀察到的β結(jié)合珠蛋白斑點(diǎn)的放大圖像，圖中顯示出在約 pH 5.46至pH 5.49處觀察到的β結(jié)合珠蛋白斑點(diǎn)在正常血漿中出現(xiàn)但在肝硬化患者血漿中 減少。
[0019] 圖4顯示肝硬化中補(bǔ)體C3的裂解減少。上方的圖-顯示補(bǔ)體C3dg未在正常血漿中出 現(xiàn)但在肝硬化患者血漿中出現(xiàn)。下方的圖-顯示在補(bǔ)體C3a鏈的硫酯位點(diǎn)之前的補(bǔ)體C3a鏈 的片段在正常血漿中出現(xiàn)但未在肝硬化患者血漿中出現(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下列描述概括上面總結(jié)的發(fā)明。然而，本發(fā)明不限于所描述的特定方法學(xué)、試驗(yàn)方 案、細(xì)胞系、動(dòng)物種屬、構(gòu)建體、試劑且就其本身而言可改變。同樣地，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅描 述特定實(shí)施方式，并非意于限定本發(fā)明的范圍。
[0021] 當(dāng)與健康個(gè)體相比時(shí)，本發(fā)明的
【發(fā)明人】發(fā)現(xiàn)多種蛋白在HCV-誘發(fā)的肝硬化患者的 人類血漿樣本中差異表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用在凝膠基質(zhì)中雙向分離蛋白以給出離散蛋白斑 點(diǎn)的技術(shù)來(lái)比較這些血清樣本而實(shí)現(xiàn)。該方法使用pH 3至pH 5.6的窄范圍pH值固定pH梯度 凝膠，該pH梯度凝膠不同于W0/2008/031051中使用的pH 3至pH 10的固定pH梯度凝膠。
[0022] 除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語(yǔ)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)的含義與相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù) 人員的普遍理解相同。
[0023] 就描述及公開的目的而言，本文提及的所有公開出版物和專利通過(guò)引用并入本 文，例如，可與本發(fā)明所述的內(nèi)容結(jié)合使用的公開出版物中所描述的構(gòu)建體和方法學(xué)。上面 討論的公開出版物及其全部?jī)?nèi)容在本發(fā)明的申請(qǐng)日之前被單獨(dú)提供用于公開。本文不被解 釋為承認(rèn)由于先于本發(fā)明的這種公開而本發(fā)明的發(fā)明人不享有在先權(quán)利。
[0024] a.定義
[0025] 為方便起見，在下面提供說(shuō)明書、實(shí)施例及附加的權(quán)利要求中采用的一些術(shù)語(yǔ)和 短語(yǔ)的含義。
[0026]除非上下文另外明確說(shuō)明，單數(shù)形式（"a" "an"和"the"）包括復(fù)數(shù)含義。
[0027] "2D-PAGE"是指雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0028] "ELISA"是指酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定。
[0029] "HCC"是指肝細(xì)胞癌。
[0030] "HCV"是指丙型肝炎病毒。
[0031] "HF"是指肝纖維化。
[0032] "kDa"是指千道爾頓。
[0033] "PBS"是指磷酸鹽緩沖鹽水。
[0034] "PBS-T"是指含吐溫的PBS溶液。
[0035] "生物樣本"包含取自有機(jī)體的、可用于診斷或監(jiān)測(cè)分析的多種樣本類型。該術(shù)語(yǔ) 包含血液和生物來(lái)源的其他液體樣本、固體組織樣本(如活檢樣本），或者由此而來(lái)的組織 培養(yǎng)物或細(xì)胞及其后代。另外，該術(shù)語(yǔ)可包含循環(huán)腫瘤細(xì)胞或其他細(xì)胞。該術(shù)語(yǔ)尤其包含臨 床樣本，并進(jìn)一步包括細(xì)胞培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解液、血清、血漿、尿、羊水、 生物液體及組織樣本。該術(shù)語(yǔ)還包含獲取后以任何方式處理的樣本，所述處理例如用試劑 處理、溶解、富集某些組分。
[0036] "生物分子序列"或"序列"是指多核苷酸或多肽序列的全部或部分。
[0037] "BLAST"是指基本局部比對(duì)搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool)，它 是檢測(cè)與給定查詢序列匹配的無(wú)間隔的子序列的一項(xiàng)技術(shù)。"BLASTP"是將氨基酸查詢序列 與蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的BLAST程序。"BLASTX"是將核酸查詢序列(雙鏈)的六框概念 翻譯產(chǎn)物與蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較的BLAST程序。
[0038] 在本文中可互換使用的"癌癥"、"贅生物"和"腫瘤"是指表現(xiàn)出異常生長(zhǎng)表型的細(xì) 胞或組織，所述異常生長(zhǎng)表型以細(xì)胞增殖顯著失控為特征。本發(fā)明的方法及組合物尤其應(yīng) 用于癌前的（即，良性的）、惡性的、轉(zhuǎn)移前的、轉(zhuǎn)移的和非轉(zhuǎn)移的細(xì)胞。
[0039] "纖維化以HF-相關(guān)多肽的差異調(diào)控為特征"是指具有表現(xiàn)出瘢痕化的組織的受治 者，并且在所述瘢痕化的組織中HF-相關(guān)蛋白具有差異表達(dá)。
[0040] "纖維化表型"是指特征為纖維化細(xì)胞的多種生物現(xiàn)象。該現(xiàn)象可隨纖維化的類型 而變化，但纖維化表型通常由瘢痕組織形成中的異常情況來(lái)鑒別。
[0041 ] "細(xì)胞類型"是指來(lái)自給定來(lái)源(如，組織或器官）的細(xì)胞或處于給定分化狀態(tài)中的 細(xì)胞，或與給定病理或基因組成相關(guān)的細(xì)胞。
[0042] "互補(bǔ)的"是指探針分子與其靶標(biāo)相互作用表面的拓?fù)湎嗳菪曰蛳嗷ヅ鋵?duì)?？蓪?標(biāo)與其探針描述為互補(bǔ)的，并且，接觸表面的特征是彼此互補(bǔ)的。
[0043]術(shù)語(yǔ)"可檢測(cè)的"是指使用本申請(qǐng)中描述的和本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)可觀察 的多肽表達(dá)模式。例如，多肽表達(dá)可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(包括諸如蛋白印跡之類的免疫測(cè)定)來(lái) "檢測(cè)"。
[0044] "診斷（"diagnosis"和"diagnosing"）"通常包括確定受治者對(duì)疾病或失調(diào)的易感 性、確定受治者目前是否患有疾病或失調(diào)、對(duì)患有疾病或失調(diào)的受治者進(jìn)行預(yù)后(例如，對(duì) 轉(zhuǎn)移前或轉(zhuǎn)移的癌狀態(tài)或纖維化的鑒別)和診斷評(píng)價(jià)(therametrics)(例如，監(jiān)測(cè)受治者的 癥狀以提供關(guān)于治療效果或效力的信息）。
[0045] "差異表達(dá)"是指在基因的時(shí)間表達(dá)模式和組織表達(dá)模式中量的差異及質(zhì)的差異。 例如，差異表達(dá)的基因可在正常狀態(tài)與疾病狀態(tài)中使其表達(dá)被激活或完全不激活。這種性 質(zhì)上調(diào)控的基因可在受治者給定的組織、細(xì)胞類型或血清/血漿中表現(xiàn)出表達(dá)模式，所述表 達(dá)模式在對(duì)照狀態(tài)或疾病狀態(tài)下是可檢測(cè)的，或在對(duì)照狀態(tài)和疾病狀態(tài)下皆可檢測(cè)但具有 不同表達(dá)。如本文所使用的"差異表達(dá)的蛋白"是指唯一地鑒別出了差異表達(dá)的蛋白的氨基 酸序列，從而使樣本中差異表達(dá)的蛋白的檢測(cè)與樣本中差異表達(dá)的蛋白的出現(xiàn)相關(guān)聯(lián)。
[0046] "表達(dá)"通常是指多核苷酸序列經(jīng)歷成功的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而表達(dá)可檢測(cè)水平的氨 基酸序列或蛋白的過(guò)程。在一些語(yǔ)境中，表達(dá)是指mRNA的產(chǎn)生。在其它語(yǔ)境中，表達(dá)是指蛋 白或其片段的產(chǎn)生。所述片段可通過(guò)酶切或者正常狀態(tài)或疾病狀態(tài)特有的生物過(guò)程產(chǎn)生。 [0047] "表達(dá)產(chǎn)物"或"基因產(chǎn)物"是當(dāng)有機(jī)體中的基因被轉(zhuǎn)錄或翻譯或翻譯后修飾時(shí)產(chǎn) 生的生物分子，例如蛋白或mRNA。
[0048] "蛋白片段"是指蛋白的一部分。例如，蛋白片段可包含通過(guò)消化從培養(yǎng)的細(xì)胞分 離的全長(zhǎng)蛋白而獲得的多肽。在一種實(shí)施方式中，蛋白片段包含至少約6個(gè)氨基酸。在另一 實(shí)施方式中，所述片段包含至少約10個(gè)氨基酸。在又一實(shí)施方式中，蛋白片段包含至少約16 個(gè)氨基酸。
[0049] 在本申請(qǐng)的上下文中，術(shù)語(yǔ)"功能等同物"是指具有與全部或部分天然HF-相關(guān)蛋 白基本相似的功能特性或結(jié)構(gòu)特性的蛋白。術(shù)語(yǔ)"功能等同物"意于包括天然HF-相關(guān)蛋白 的"片段"、"突變子"、"衍生物"、"等位基因"、"雜交體"、"變體"、"類似物"或"化學(xué)衍生物"。
[0050] 在免疫球蛋白的上下文中，術(shù)語(yǔ)"功能等同物"是指表現(xiàn)出與母體免疫球蛋白基本 相似的免疫結(jié)合特性的免疫球蛋白分子。"免疫結(jié)合特性"是指在免疫球蛋白分子與該免疫 球蛋白的特異抗原之間發(fā)生的非共價(jià)相互作用類型。實(shí)際上，例如，單克隆抗體免疫球蛋白 的功能等同物可抑制母體單克隆抗體與其抗原結(jié)合。功能等同物可包含F(xiàn)(ab'）2片段、F (ab)分子、Fv片段、菌體展示技術(shù)單鏈可變片段(scFv)、單結(jié)構(gòu)域抗體、嵌合抗體等等，只 要免疫球蛋白表現(xiàn)出母體免疫球蛋白的特性。
[0051] 術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"是指由兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽構(gòu)成的蛋白，雖然典型地，所述多肽 不以天然狀態(tài)連接，但所述多肽由其相應(yīng)的氨基和羧基末端通過(guò)肽鍵連接形成單一的連續(xù) 多肽。應(yīng)當(dāng)理解的是，兩個(gè)或兩個(gè)以上的多肽成分可直接相連或通過(guò)肽連接體/間隔區(qū)間接 相連。
[0052] "基因"是指包含產(chǎn)生多肽或前體所需的調(diào)控序列和編碼序列的多核苷酸序列。多 肽可由全長(zhǎng)編碼序列編碼或由編碼序列的任何部分編碼?；蚩蓸?gòu)成不間斷的編碼序列或 者基因可包含以合適的剪接位點(diǎn)為邊界的一個(gè)或一個(gè)以上內(nèi)含子。此外，基因在編碼區(qū)或 非翻譯區(qū)內(nèi)可包含一種或一種以上修飾，所述修飾可影響表達(dá)產(chǎn)物的生物活性或化學(xué)結(jié) 構(gòu)、表達(dá)速率或表達(dá)調(diào)控方式。這樣的修飾包括但不限于:一個(gè)或一個(gè)以上核苷酸的突變、 插入、缺失和取代。就這點(diǎn)而言，這樣修飾的基因可稱為"天然"基因的"變體"。
[0053] "基因表達(dá)"是指多核苷酸序列經(jīng)歷成功的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而表達(dá)可檢測(cè)水平的核 苷酸序列的過(guò)程。
[0054]如本文所使用的術(shù)語(yǔ)"同源性"是指互補(bǔ)性的程度?？纱嬖诓糠滞椿蛲耆?(即，一致）。部分互補(bǔ)序列是至少部分抑制相同序列與靶多核苷酸的雜交的序列;部分互補(bǔ) 序列也是指使用功能性術(shù)語(yǔ)"基本同源"。低嚴(yán)格條件下，對(duì)完全互補(bǔ)序列與靶序列雜交的 抑制可使用雜交測(cè)定(DNA印跡(Southern blot)或RNA印跡(Northern blot)、液相雜交等 等)來(lái)檢測(cè)。低嚴(yán)格條件下，基本同源的序列或探針將競(jìng)爭(zhēng)并抑制完全同源的序列或探針與 靶序列的結(jié)合（即，雜交）。這不是說(shuō)低嚴(yán)格條件是允許非特異性結(jié)合的條件;低嚴(yán)格條件要 求兩序列的彼此結(jié)合是特異性的（即，選擇性的）相互作用。沒有非特異性結(jié)合可通過(guò)使用 第二靶序列來(lái)檢驗(yàn)，所述第二靶序列甚至缺乏部分互補(bǔ)程度(如，低于30%的一致性）；沒有 非特異性結(jié)合時(shí)，探針將不會(huì)與第二非互補(bǔ)的靶序列雜交。
[0055] 本文可互換使用的"個(gè)體"、"受治者"、"宿主"和"患者"是指需要診斷、處理或治療 的任何哺乳動(dòng)物受治者。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，個(gè)體、受治者、宿主或患者是人類。其他 受治者包括已知發(fā)生了 HCC和肝炎的土撥鼠和鴨。其他受治者可包括，但不限于:牛、馬、狗、 貓、豚鼠、兔、大鼠、靈長(zhǎng)類及小鼠。
[0056] "分離的"是指在與天然生成多核苷酸、多肽、免疫球蛋白或宿主細(xì)胞的環(huán)境不同 的環(huán)境中的多核苷酸、多肽、免疫球蛋白或宿主細(xì)胞。
[0057] "標(biāo)記"是指能夠直接提供可檢測(cè)的信號(hào)的藥劑或通過(guò)與信號(hào)產(chǎn)生系統(tǒng)中的一個(gè) 或一個(gè)以上額外成員相互作用而提供可檢測(cè)的信號(hào)的藥劑?？芍苯訖z測(cè)且可在本發(fā)明中使 用的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記。具體的熒光基團(tuán)包括熒光素、羅丹明、B0DIPY、花青染料等等。本發(fā) 明還考慮使用放射性同位素(例如 34、3￥、3!1，等等)作為標(biāo)記。也可使用諸如膠體金或有色 玻璃或塑料(如聚苯乙烯、聚乙烯、乳膠)珠之類的色度標(biāo)記。參見，例如，美國(guó)專利第4,366， 241 號(hào)、第4,277,437 號(hào)、第4,275,149 號(hào)、第3,996,345 號(hào)、第 3,939,350 號(hào)、第 3,850,752 號(hào)和 第3,817,837 號(hào)。
[0058]術(shù)語(yǔ)"正常生理?xiàng)l件"是指有生命的有機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)的典型條件。盡管一些器官或 有機(jī)體提供極端條件，但是有機(jī)體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境通常在pH 7左右（即，從pH 6.5至pH 7.5)變化，包含水作為主要溶劑，并存在于高于0°C且低于50°C的溫度條件下。不同鹽濃度 取決于用作參考的器官、有機(jī)體、細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室。
[0059] 本文可互換使用的"多核苷酸"和"核酸"是指任何長(zhǎng)度的核苷酸(核糖核苷酸或脫 氧核糖核苷酸）的聚合形式。因此，這些術(shù)語(yǔ)包括，但不限于:單鏈、雙鏈或多鏈的DNA或RNA、 基因組DNA、cDNA、DNA-RNA雜交體或包含嘌呤堿基和嘧啶堿基或其他天然的、化學(xué)或生物化 學(xué)修飾的、非天然的或衍生的核苷酸堿基的多聚體。這些術(shù)語(yǔ)還包括，但不限于:包含內(nèi)含 子序列的mRNA或cDNA。多核苷酸的骨架可包含糖和磷酸基團(tuán)（如通?？稍赗NA或DNA中發(fā)現(xiàn) 的)或者修飾的或取代的糖或磷酸基團(tuán)。可選地，多核苷酸骨架可包含諸如亞磷酰胺之類的 合成亞單位的多聚體，因此多核苷酸骨架可為寡脫氧核苷酸的氨基磷酸酯或混合的氨基磷 酸酯-磷酸雙酯寡聚體。多核苷酸可包含修飾的核苷酸(例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似 物）、尿嘧啶、其他糖和諸如氟代核糖和硫代酯之類的連接基團(tuán)，以及核苷酸支鏈。核苷酸序 列可由非核苷酸成分打斷。多核苷酸可在聚合后進(jìn)行進(jìn)一步修飾，例如通過(guò)與標(biāo)記成分結(jié) 合來(lái)修飾。此定義中包括的其他類型的修飾為加帽、用類似物取代天然生成的核苷酸中的 一個(gè)或一個(gè)以上，以及引入多核苷酸連接于蛋白、金屬離子、標(biāo)記成分、其他多核苷酸或固 相支持物的方法。術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"還包括肽核酸。多核苷酸可進(jìn)一步包括基因組DNA、cDNA 或DNA-RNA雜交體。
[0060] 本文可互換使用的"多肽"和"蛋白"是指任何長(zhǎng)度的氨基酸的聚合形式，可包括翻 譯的、非翻譯的、化學(xué)修飾的、生物化學(xué)修飾的和衍生的氨基酸。多肽或蛋白可為天然生成 的、重組的或合成的或這些的任何組合。此外，多肽或蛋白可包含天然生成的蛋白或肽的片 段。多肽或蛋白可為單個(gè)分子或可為多分子復(fù)合物。另外，這樣的多肽或蛋白可具有修飾的 肽骨架。這些術(shù)語(yǔ)包括融合蛋白，所述融合蛋白包括含有異源氨基酸序列的融合蛋白，含有 異源和同源前導(dǎo)序列的、含有或不含有N-末端蛋氨酸殘基、免疫標(biāo)記蛋白的融合蛋白等等。
[0061] 疾病或失調(diào)的"易染病體質(zhì)"指?jìng)€(gè)體對(duì)該疾病或失調(diào)的易感性。例如，與正常/野生 型個(gè)體相比，易感的個(gè)體在統(tǒng)計(jì)學(xué)上更可能患上癌癥或纖維化。
[0062]術(shù)語(yǔ)"預(yù)后（"prognosis"和"prognose"）"是指預(yù)測(cè)疾病過(guò)程的行為或技術(shù)。另外， 該術(shù)語(yǔ)是指通過(guò)疾病的一般過(guò)程所預(yù)期的或由個(gè)體病例的特定特征所顯示的從疾病中生 存并恢復(fù)的前景。此外，該術(shù)語(yǔ)是指根據(jù)其體征和癥狀鑒別疾病的行為或技術(shù)。
[0063]術(shù)語(yǔ)"預(yù)后指標(biāo)"或"指標(biāo)"是指可作為預(yù)后的根據(jù)或基礎(chǔ)的任何事物或與預(yù)后的 根據(jù)或基礎(chǔ)相關(guān)的任何事物。這些術(shù)語(yǔ)進(jìn)一步指鑒別診斷的任何根據(jù)或基礎(chǔ)，包括如本文 描述的測(cè)試結(jié)果和基因表達(dá)的特性，以及將疾病或病癥與表現(xiàn)出類似癥狀的其他疾病或病 癥相區(qū)分。另外，術(shù)語(yǔ)"指標(biāo)"或"預(yù)后指標(biāo)"是指包括如本文描述的測(cè)試結(jié)果和基因表達(dá)的 特性在內(nèi)的任何根據(jù)或基礎(chǔ)，術(shù)語(yǔ)"指標(biāo)"或"預(yù)后指標(biāo)"可用于區(qū)分惡性疾病可能的過(guò)程。 [0064] "蛋白捕獲劑"是指可將蛋白結(jié)合于自身的分子或多分子復(fù)合物。在一種實(shí)施方式 中，蛋白捕獲劑以基本特異的方式結(jié)合它們的結(jié)合配偶體。在一種實(shí)施方式中，蛋白捕獲劑 可表現(xiàn)出低于約1〇_6的解離常數(shù)(KD)。蛋白捕獲劑可包含諸如蛋白或多核苷酸之類的生物 分子。該生物分子可進(jìn)一步包含天然生成的、重組的或合成的生物分子。蛋白捕獲劑的例子 包括免疫球蛋白、抗原、受體或其他蛋白或其部分或片段。此外，應(yīng)當(dāng)理解的是，蛋白捕獲劑 不限于僅通過(guò)非共價(jià)相互作用與其結(jié)合配偶體相互作用的藥劑。相反，蛋白捕獲劑還可共 價(jià)連接于與它們結(jié)合的蛋白。例如，蛋白捕獲劑在結(jié)合后可與其結(jié)合配偶體發(fā)生光交聯(lián)。 [0065] "序列一致性"是指相似或互補(bǔ)的程度?？纱嬖诓糠忠恢滦曰蛲耆恢滦?。部分互 補(bǔ)序列是至少部分抑制相同序列與靶多核苷酸雜交的序列；也指使用功能性術(shù)語(yǔ)"基本一 致"。低嚴(yán)格條件下，對(duì)完全互補(bǔ)序列與靶序列的雜交的抑制可使用雜交測(cè)定(DNA印跡或 RNA印跡、液相雜交等等)來(lái)檢測(cè)。低嚴(yán)格條件下，基本一致的序列或探針將競(jìng)爭(zhēng)并抑制完全 一致序列或探針與靶序列的結(jié)合（即，雜交）。這不是說(shuō)低嚴(yán)格條件是允許非特異性結(jié)合的 條件;低嚴(yán)格條件要求兩序列彼此的結(jié)合是特異性的（即，選擇性的）相互作用。沒有非特異 性結(jié)合可使用第二靶序列來(lái)檢驗(yàn)，所述第二靶序列甚至缺乏部分程度的互補(bǔ)性（如，低于 30 %的一致性），沒有非特異性結(jié)合時(shí)，探針將不會(huì)與第二非互補(bǔ)靶序列雜交。
[0066] 本文中對(duì)兩個(gè)核酸或多肽序列觀察序列一致性的另一方法包括參考當(dāng)在特定區(qū) 域內(nèi)進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)性的比對(duì)時(shí)的兩個(gè)序列中的相同殘基。如本文所使用的序列一致性的百 分?jǐn)?shù)是指通過(guò)在比較窗口中比較兩個(gè)最佳對(duì)齊序列而測(cè)定的值，其中與兩個(gè)序列的最佳比 對(duì)的參考序列(不包含添加或缺失)相比，比較窗口中部分多核苷酸序列可包含添加或缺失 (即，缺口）。所述百分?jǐn)?shù)通過(guò)下列方式計(jì)算:測(cè)定在兩條序列中都出現(xiàn)的相同核酸堿基位點(diǎn) 的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位點(diǎn)數(shù)目，用匹配位點(diǎn)數(shù)目除以比較窗口中位點(diǎn)的總數(shù)，然后將結(jié)果乘 以100，從而產(chǎn)生序列一致性的百分?jǐn)?shù)。
[0067] "嚴(yán)格條件"是指在此條件下探針可與其靶多核苷酸序列雜交而不與其他序列雜 交的條件。嚴(yán)格條件是依賴序列的（例如，較長(zhǎng)序列在較高溫度的條件下特異性雜交）。通 常，選擇嚴(yán)格條件為約5°C，低于特定序列在限定的離子強(qiáng)度和pH條件下的熱熔點(diǎn)(1?)。1?是 平衡時(shí)50%與靶序列互補(bǔ)的探針與靶序列雜交的溫度(在限定的離子強(qiáng)度、pH和多核苷酸 濃度條件下）。典型地，嚴(yán)格條件對(duì)短探針（例如，10至50個(gè)核苷酸)而言是約pH 7.0至約pH 8.3，鹽濃度為至少約0.0謂至約1.01的鈉離子濃度(或其他鹽），且溫度為至少約30°(：的條 件。嚴(yán)格條件還可通過(guò)加入諸如甲酰胺之類的去穩(wěn)定劑而實(shí)現(xiàn)。
[0068] "基本純化的"是指從自然環(huán)境中分離出來(lái)的化合物，且所述化合物至少約60%， 至少約65%，至少約70%，至少約75%，至少約80%，至少約83%，至少約85%，至少約88%， 至少約90%，至少約91 %，至少約92%，至少約93%，至少約94%，至少約95%，至少約96%， 至少約97%，至少約98%，至少約99%，至少約99.9%，或至少約99.99%或更多不含與其天 然結(jié)合的其它組分。
[0069] "靶蛋白"是指與蛋白捕獲劑特異性雜交或結(jié)合的多肽，所述多肽通常來(lái)源于生物 樣本。所述靶蛋白的存在或缺乏會(huì)被檢測(cè)，或者所述靶蛋白會(huì)被定量。所述靶蛋白具有可被 指向靶標(biāo)的相應(yīng)的蛋白捕獲劑識(shí)別的結(jié)構(gòu)。所述靶蛋白或氨基酸還可指蛋白捕獲劑所指向 的更大蛋白的特定亞結(jié)構(gòu)或期望檢測(cè)其表達(dá)水平的整體結(jié)構(gòu)(例如，基因或mRNA)。
[0070] 術(shù)語(yǔ)"治療（"treatment"，"treating"，"treat"，等等)"是指獲得預(yù)期的藥理學(xué) 和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀而言可為預(yù)防性的，和/或所 述效果就部分或完全穩(wěn)定或者部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不利影響而言可為 治療性的。"治療"包括哺乳動(dòng)物(尤其是人類)疾病的任何治療，并包括：（a)預(yù)防在受治者 中發(fā)生疾病或癥狀，所述受治者可易于感染所述疾病或癥狀但尚未診斷出患有該疾病或癥 狀;（b)抑制疾病癥狀，即，阻止其發(fā)展;或者(c)緩解疾病癥狀，即，使疾病或癥狀復(fù)原。
[0071] b.HF-相關(guān)多肽
[0072] -方面，本發(fā)明涉及"HF-相關(guān)多肽"，所述"HF-相關(guān)多肽"包括其差異表達(dá)與肝纖 維化相關(guān)的多肽。HF-相關(guān)多肽還包括天然生成的蛋白的變體，其中這樣的變體與天然生成 的蛋白相同或基本相似?？傮w上，由BLAST檢測(cè)時(shí)，變體多肽的序列與本文描述的HF-相關(guān)多 肽具有至少約80%的序列一致性，通常具有至少約90%的序列一致性，且更通常地，具有至 少約98%的序列一致性。變體多肽可為天然或非天然糖基化的。
[0073]總體上，如用本領(lǐng)域熟知的方法(例如BLAST)所測(cè)定的，本文描述的HF-相關(guān)多肽 的變體具有大于至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約83 %、至少約 85%、至少約88%、至少約90%、至少約91 %、至少約92 %、至少約93%、至少約94%、至少約 95 %、至少約96 %、至少約97 %、至少約98 %、至少約99 %、至少約99.9 %或可大于至少約 99.99 %的序列一致性。
[0074]在一種實(shí)施方式中，變體HF-相關(guān)多肽可為突變多肽。HF-相關(guān)多肽中的突變可由 氨基酸取代、添加或缺失(但不限于此)產(chǎn)生。氨基酸取代可為保守氨基酸取代或去除非必 須氨基酸的取代?？傮w上，保守氨基酸取代是保持被取代氨基酸的常規(guī)電荷、疏水性、親水 性和/或位阻效應(yīng)的氨基酸取代。
[0075]在一些突變的HF-相關(guān)多肽中，氨基酸可被取代以改變磷酸化位點(diǎn)或乙?；稽c(diǎn)。
[0076] 重要的是，變體多肽可設(shè)計(jì)成保持或具有提高的蛋白特定區(qū)域(例如，功能性結(jié)構(gòu) 域和/或與共有序列有關(guān)的區(qū)域，其中多肽是蛋白家族成員）的生物活性。用于產(chǎn)生變體的 氨基酸改變的選擇可基于氨基酸的可接近性（內(nèi)部的與外部的）、變體多肽的熱穩(wěn)定性、預(yù) 期糖基化位點(diǎn)、預(yù)期二硫橋、預(yù)期的金屬結(jié)合位點(diǎn)及脯氨酸環(huán)內(nèi)的預(yù)期取代。半胱氨酸耗竭 突變蛋白可依照美國(guó)專利第4,959,314號(hào)的公開內(nèi)容而產(chǎn)生。
[0077] 變體還包括本文公開的HF-相關(guān)多肽的片段，尤其是生物活性片段及對(duì)應(yīng)于功能 結(jié)構(gòu)域的片段。典型地，目標(biāo)片段將為至少約l〇aa至至少約15aa長(zhǎng)，通常至少約50aa長(zhǎng)，并 可長(zhǎng)達(dá)300aa或更長(zhǎng)。本文描述的蛋白變體由本發(fā)明范圍內(nèi)的多核苷酸編碼。
[0078] 本發(fā)明的HF-相關(guān)多肽在非天然生成的環(huán)境中提供，例如，從其天然生成的環(huán)境中 分離。在一些實(shí)施方式中，HF-相關(guān)蛋白以基本純化的形式存在。
[0079] c. HF-相關(guān)藥劑:調(diào)節(jié)劑及結(jié)合配偶體
[0080]另一方面，本發(fā)明提供"HF-相關(guān)藥劑"，所述HF-相關(guān)藥劑是指由"HF-相關(guān)多肽結(jié) 合配偶體"構(gòu)成的一類分子。
[0081] HF-相關(guān)多肽結(jié)合配偶體是結(jié)合于HF-相關(guān)多肽的分子。示例性的多肽結(jié)合配偶體 是免疫球蛋白。結(jié)合配偶體可調(diào)節(jié)HF-相關(guān)多肽的生物活性，但毋需如此。
[0082] d.免疫球蛋白
[0083]用于鑒別HF-相關(guān)蛋白的HF-相關(guān)藥劑包括特異性結(jié)合于HF-相關(guān)多肽的免疫球蛋 白及免疫球蛋白的功能等同物。術(shù)語(yǔ)"免疫球蛋白"和"抗體"可互換使用且在本文中以其最 廣的意義使用。因此，"免疫球蛋白"和"抗體"包括完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩 個(gè)完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們表現(xiàn)出預(yù)期 的生物活性。在一種實(shí)施方式中，受治者免疫球蛋白包含至少一個(gè)人類恒定結(jié)構(gòu)域。在另一 實(shí)施方式中，HF-相關(guān)藥劑免疫球蛋白包含表現(xiàn)出與人類恒定結(jié)構(gòu)域至少約90 %至95 %的 序列一致性但保持人類效應(yīng)功能的恒定結(jié)構(gòu)域。免疫球蛋白HF-相關(guān)藥劑或其功能等同物 可為人類的、嵌合的、人源化的、鼠的、CDR-嫁接的、噬菌體展示的、細(xì)菌展示的、酵母展示 的、轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的、誘變的和隨機(jī)化的。
[0084] i. 一般性抗體
[0085] 術(shù)語(yǔ)"抗體"和"免疫球蛋白"包括可結(jié)合抗原的完全組裝的抗體和抗體片段（例 如，F(xiàn)ab'、F'（ab)2、Fv、單鏈抗體、雙價(jià)小抗體），包括重組抗體和抗體片段。優(yōu)選地，免疫球 蛋白或抗體是嵌合的、人類的或人源化的。
[0086] 重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域識(shí)別同源抗原的特定表位或結(jié)合于同源抗原的特定表 位。術(shù)語(yǔ)"表位"是指免疫球蛋白的可變末端結(jié)合的抗原上的特異性結(jié)合位點(diǎn)或抗原決定 簇。表位可為線性的，即，由在原HF-相關(guān)序列中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基序列組成。表位也可為構(gòu) 象的，從而使得免疫球蛋白識(shí)別在折疊的HF-相關(guān)分子中發(fā)現(xiàn)的3-D結(jié)構(gòu)。表位也可為線性 與構(gòu)象性元件的組合。此外，如由目標(biāo)方位的腫瘤細(xì)胞表達(dá)的分子的碳水化合物部分也可 為表位。
[0087] 如果：1)免疫球蛋白表現(xiàn)出結(jié)合活性的閾值水平，和/或2)免疫球蛋白不與已知的 相關(guān)多肽分子進(jìn)行顯著地交叉反應(yīng)，那么認(rèn)為所述免疫球蛋白是"特異性結(jié)合的"。本領(lǐng)域 普通技術(shù)人員可容易地測(cè)定免疫球蛋白的結(jié)合親和力，例如，通過(guò)Scatchard分析 (Scatchard，Ann .NY Acad · Sci · 51:660-672、1949)來(lái)測(cè)定。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的免 疫球蛋白以高于其他蛋白至少1〇3倍，更為優(yōu)選地至少1〇 4倍，更為優(yōu)選地至少1〇5倍，甚至更 為優(yōu)選地至少1〇6倍的水平結(jié)合于HF-相關(guān)蛋白。
[0088] ii.多克隆抗體和單克隆抗體
[0089]本發(fā)明的免疫球蛋白可為多克隆的或單克隆的，并可由任何本領(lǐng)域熟知的方法產(chǎn) 生。
[0090] 優(yōu)選地，多克隆抗體通過(guò)多次皮下（sc)、腹膜內(nèi)（ip)或肌肉內(nèi)（im)注射相關(guān)抗原 和佐劑而在動(dòng)物中產(chǎn)生。將相關(guān)抗原結(jié)合于蛋白可以是有用的，所述蛋白在待免疫的物種 中是免疫原性的。另外，諸如明礬之類的聚集劑或其他藥劑適用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)。
[0091] 術(shù)語(yǔ)"單克隆抗體"指從基本同源的抗體群獲得的抗體。單克隆抗體是高度特異性 的，針對(duì)單一的抗原位點(diǎn)。此外，與典型地包括針對(duì)不同決定簇的不同抗體的多克隆抗體的 制備不同，每個(gè)單克隆抗體針對(duì)抗原的單個(gè)決定簇。
[0092]除了其特異性外，單克隆抗體的優(yōu)點(diǎn)還在于他們可被合成而不被其他免疫球蛋白 污染。例如，單克隆抗體可通過(guò)雜交瘤方法或通過(guò)重組DNA方法產(chǎn)生。單克隆抗體HF-相關(guān)藥 劑還可從噬菌體抗體文庫(kù)中分離。
[0093] i i i .嵌合抗體和人源化抗體
[0094] 根據(jù)可變區(qū)可來(lái)自一個(gè)物種(例如嚙齒類），恒定區(qū)可來(lái)自第二物種(例如人)這種 定義，HF-相關(guān)多肽結(jié)合免疫球蛋白或抗體可為"嵌合的"。
[0095] 非人類HF-相關(guān)蛋白結(jié)合抗體的"人源化"形式是嵌合抗體，所述嵌合抗體含有來(lái) 自非人類免疫球蛋白的最少序列。大多數(shù)情況下，人源化抗體是其中受體高變區(qū)的殘基被 具有期望的特異性、親和性及能力的非人類物種高變區(qū)的殘基(供體抗體)取代的人類免疫 球蛋白（受體抗體），所述非人類物種例如小鼠、大鼠、兔或非人靈長(zhǎng)類。一些情況下，人類免 疫球蛋白的骨架區(qū)（FR)殘基被相應(yīng)的非人類殘基取代。此外，人源化抗體可包含未在受體 抗體或供體抗體中發(fā)現(xiàn)的殘基。
[0096] 通常，人源化抗體可包含基本全部的至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，且典型地，人源化抗體 可包含基本全部的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，其中，全部或基本全部高變環(huán)對(duì)應(yīng)于非人類免疫球蛋 白的高變環(huán)且全部或基本全部FR是人類免疫球蛋白序列的FR。在一種實(shí)施方式中，人源化 抗體包含表現(xiàn)出與受體(非人類)FR(例如，鼠FR)的序列一致性為至少65 %的人源化FR。人 源化抗體還可包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)(尤其是人類免疫球蛋白）的至少一部分。
[0097] 本領(lǐng)域已描述了對(duì)非人類抗體進(jìn)行人源化的方法。優(yōu)選地，人源化抗體含有從非 人類來(lái)源引入的一個(gè)或一個(gè)以上氨基酸殘基。這些非人類氨基酸殘基通常稱為"導(dǎo)入"殘 基，這些非人類氨基酸殘基典型地取自"導(dǎo)入"可變結(jié)構(gòu)域。人源化基本上可通過(guò)用高變區(qū) 序列取代人類抗體的相應(yīng)序列來(lái)實(shí)現(xiàn)。因此，這樣的人源化抗體是嵌合的，其中，用非人類 物種中的相應(yīng)序列取代基本上小于完整人類可變結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。實(shí)際上，典型地，人源化抗 體是人類抗體，在該人類抗體中，一些高變區(qū)殘基以及可能是一些FR殘基被嚙齒類抗體類 似位點(diǎn)中的殘基取代。待用于制備人源化抗體的人類可變結(jié)構(gòu)域(輕鏈和重鏈)的選擇對(duì)降 低抗原性是非常重要的。
[0098] 其他方法一般包括對(duì)抗體受體可變區(qū)骨架賦予供體CDR結(jié)合親和力。一種方法包 括同時(shí)嫁接并優(yōu)化可變區(qū)結(jié)合片段的結(jié)合親和力。另一方法涉及優(yōu)化抗體可變區(qū)的結(jié)合親 和力。
[00"] iv.抗體片段
[0100] "抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)。抗體片段的例 子包括?813、？313'、？(313'）2、？￥片段、雙價(jià)小抗體、線性抗體、單鏈抗體分子和由抗體片段形 成的多特異性抗體。
[0101 ]對(duì)抗體進(jìn)行木瓜酶消化產(chǎn)生兩個(gè)相同的抗原結(jié)合片段，稱為"Fab"片段，每個(gè)片段 具有單個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，以及殘余的"Fc"片段。Fab片段還包含輕鏈的恒定區(qū)和重鏈的第一 恒定區(qū)(CHI)。
[0102]胃蛋白酶處理產(chǎn)生含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab'）2片段且該片段仍能與抗原交 聯(lián)。Fab'片段與Fab片段不同之處在于Fab'片段的重鏈CHI結(jié)構(gòu)域羧基末端添加了幾個(gè)殘 基，所述殘基包括抗體鉸鏈區(qū)的一個(gè)或一個(gè)以上半胱氨酸。Fab'-SH是其中恒定結(jié)構(gòu)域的半 胱氨酸殘基具有至少一個(gè)游離的巰基的Fab'在本文中的名稱。F(ab'）2抗體片段起初作為 成對(duì)Fab '片段而產(chǎn)生，所述成對(duì)Fab '片段之間含有鉸鏈半胱氨酸。抗體片段的其他化學(xué)偶 聯(lián)為本領(lǐng)域所熟知的。
[0103] "Fv"是包含完整抗原識(shí)別和抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。該區(qū)域由一個(gè)重鏈可 變結(jié)構(gòu)域與一個(gè)輕鏈可變結(jié)構(gòu)域以緊密的非共價(jià)結(jié)合方式形成的二聚體構(gòu)成。在此構(gòu)型 中，每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域的三個(gè)高變區(qū)互相作用以限定VH-VL二聚體表面的抗原結(jié)合位點(diǎn)。六個(gè) 高變區(qū)共同地賦予抗體抗原結(jié)合特異性。然而，甚至單個(gè)可變結(jié)構(gòu)域(或只包含對(duì)抗原特異 的三個(gè)高變區(qū)的Fv的一半)也有能力識(shí)別并結(jié)合抗原，盡管親和力比整個(gè)結(jié)合位點(diǎn)低。
[0104] "單鏈Fv"或"scFv"抗體片段包含抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域，其中，這些結(jié)構(gòu)域存在于 單個(gè)多肽鏈中。Fv多肽可進(jìn)一步包含VH和VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽連接體，所述多肽連接體能 夠使scFV形成抗原結(jié)合的預(yù)期結(jié)構(gòu)。參見PLUCKTHUN，113THE PHARMACOLOGY 0F MONOCLONAL ANTIBODIES 269-315(Rosenburg和Moore主編 1994)。另外參見國(guó)際公布WO 93/16185、美國(guó)專利第 5,587,458 號(hào)和第 5,571,894 號(hào)。
[0105]為了產(chǎn)生抗體片段已開發(fā)出多種技術(shù)。傳統(tǒng)地，這些片段通過(guò)蛋白酶水解消化完 整抗體而得到。然而，現(xiàn)在這些片段可直接由重組宿主細(xì)胞產(chǎn)生。
[0106] V.結(jié)合與標(biāo)記
[0107] 抗-HF-相關(guān)蛋白抗體可以它們"裸露的"形式或非結(jié)合的形式給藥，或可具有與它 們結(jié)合的其它藥劑。
[0108] 例如抗體可為可檢測(cè)地標(biāo)記的形式?？贵w可通過(guò)使用放射性同位素、親和標(biāo)記(例 如生物素、親和素等）、酶標(biāo)(例如辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶等）、熒光標(biāo)記(例如FIFC或 羅丹明等）、順磁性原子等等而被可檢測(cè)地標(biāo)記。實(shí)現(xiàn)這樣的標(biāo)記的過(guò)程為本領(lǐng)域所熟知 的。
[0109] vi.雙特異性抗體
[0110] 本發(fā)明的雙特異性抗體是含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的小抗體片段。每一片段包含重 鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)，所述重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)連接于在同一多肽鏈(VH-VL)中的輕鏈可變 結(jié)構(gòu)域(VL)。通過(guò)使用長(zhǎng)度太短以致于無(wú)法使在同一條鏈上的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域配對(duì)的連接體， 結(jié)構(gòu)域被迫與另一條鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對(duì)并產(chǎn)生兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0111] 制備雙特異性抗體的方法為本領(lǐng)域所熟知。全長(zhǎng)雙特異性抗體的傳統(tǒng)生產(chǎn)是基于 兩個(gè)免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(duì)的共表達(dá)，其中兩條鏈具有不同的特異性。
[0112] 在另一方法中，具有預(yù)期的結(jié)合特異性的抗體可變結(jié)構(gòu)域(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn)） 可融合于免疫球蛋白恒定結(jié)構(gòu)域序列。具體地，可變結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域 融合，所述重鏈恒定結(jié)構(gòu)域包含至少部分鉸鏈區(qū)、CH2區(qū)和CH3區(qū)。在一種實(shí)施方式中，融合 蛋白包含第一重鏈恒定區(qū)(CHI)，因?yàn)樗休p鏈結(jié)合必需的位點(diǎn)。編碼免疫球蛋白重鏈融 合和免疫球蛋白輕鏈(如果需要的話）的多核苷酸可插入單獨(dú)的表達(dá)載體中并共轉(zhuǎn)染到合 適的宿主有機(jī)體內(nèi)。當(dāng)構(gòu)建體中所使用的不等比例的三條多肽鏈提供最優(yōu)產(chǎn)量時(shí)，上述方 法在調(diào)整實(shí)施方式中的三個(gè)多肽片段的相互比例方面提供高度的靈活性。然而，當(dāng)至少兩 條多肽鏈以相等速率表達(dá)引起高產(chǎn)時(shí)，或者當(dāng)所述速率沒有特別意義時(shí)，在一個(gè)表達(dá)載體 中插入兩條或全部三條多肽鏈的編碼序列是可能的。
[0113] 雙特異性抗體還使用亮氨酸拉鏈和單鏈Fv(sFv)二聚體來(lái)產(chǎn)生。
[0114] e.纖維化治療的診斷、預(yù)后及評(píng)估
[0115] 因此，另一方面，本發(fā)明提供使用本文描述的HF-相關(guān)多肽診斷及預(yù)后纖維化的方 法。在具體的非限制性實(shí)施方式中，該方法在檢測(cè)細(xì)胞或血清/血漿中的HF-相關(guān)多肽、促進(jìn) 受治者中纖維化的診斷和受治者中纖維化嚴(yán)重性的診斷、促進(jìn)受治者預(yù)后的確定、測(cè)定受 治者對(duì)纖維化的易感性及評(píng)估受治者對(duì)治療的響應(yīng)性(例如，通過(guò)提供對(duì)治療效果的測(cè)量 (例如，在化療方案之中或之后評(píng)估腫瘤負(fù)荷））方面有用。這些方法可包括檢測(cè)患者生物樣 本(例如，血清/血漿或疑似或即將產(chǎn)生的纖維化組織或細(xì)胞）中HF-相關(guān)多肽的水平。本發(fā) 明的檢測(cè)方法可在分離的細(xì)胞上或在全部組織或體液(例如，血液、血漿、血清、尿液，等等） 中體外或體內(nèi)實(shí)施。在一種實(shí)施方式中，HF-相關(guān)多肽可用來(lái)檢測(cè)并評(píng)估纖維化。這些生物 標(biāo)記可應(yīng)用于表現(xiàn)出纖維化的任何疾病，例如肝纖維化、腎纖維化、心纖維化、皮膚纖維化、 胰纖維化等，但更優(yōu)選地，所述纖維化是肝纖維化。
[0116] f.檢測(cè)HF-相關(guān)多肽
[0117]本發(fā)明提供檢測(cè)血清或血漿中HF-相關(guān)多肽的方法。各種已知方法中的任何一種 均可用于檢測(cè)，包括但不限于:使用編碼的多肽的特異性抗體的免疫測(cè)定和對(duì)編碼的多肽 的功能性檢測(cè)，所述使用編碼的多肽的特異性抗體的免疫測(cè)定例如，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)、蛋白斑點(diǎn)印跡、蛋白印跡、透射比濁法、散射比濁法等等； 所述對(duì)編碼的多肽的功能性檢測(cè)例如生物活性。HF-相關(guān)多肽還可使用非抗體途徑來(lái)定量， 所述非抗體途徑例如，但不限于，使用質(zhì)譜進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測(cè)。
[0118]在閱讀本發(fā)明的說(shuō)明書之后，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見的是，本文所 述的檢測(cè)方法和其他方法可易于改變。這樣的改變?cè)诒景l(fā)明預(yù)期的范圍之內(nèi)。例如，在上面 的檢測(cè)方案中，檢測(cè)中使用的探針可固定于固相支持物上，且測(cè)試樣本與固定的探針接觸。 測(cè)試樣本與探針的結(jié)合隨后可以各種方式檢測(cè)，例如，通過(guò)檢測(cè)結(jié)合于測(cè)試樣本的可檢測(cè) 標(biāo)記，從而有利于檢測(cè)測(cè)試樣本-固定的探針復(fù)合物。
[0119]本發(fā)明進(jìn)一步提供使用HF-相關(guān)多肽的特異性抗體檢測(cè)生物樣本中HF-相關(guān)多肽 的存在和/或測(cè)量HF-相關(guān)多肽水平的方法。具體地，檢測(cè)生物樣本中HF-相關(guān)多肽的存在的 方法可包含如下步驟:使樣本與單克隆抗體接觸并檢測(cè)樣本中抗體與HF-相關(guān)多肽的結(jié)合。 更具體地，抗體可使用化合物來(lái)標(biāo)記，從而產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)，所述化合物包括但不限于:放 射性標(biāo)記、酶、發(fā)色團(tuán)和熒光基團(tuán)。
[0120]與合適的對(duì)照相比時(shí)，檢測(cè)到HF-相關(guān)多肽的特異性抗體或其功能等同物的特異 性結(jié)合是HF-相關(guān)多肽存在于樣本中的象征。合適的對(duì)照包括已知不含HF-相關(guān)多肽的樣本 和與非特異性針對(duì)編碼的多肽的抗體(例如，抗-獨(dú)特型抗體)接觸的樣本。本領(lǐng)域已知檢測(cè) 特異性抗體-抗原相互作用的各種方法并可用于下列方法，包括但不限于，標(biāo)準(zhǔn)免疫組織學(xué) 方法、免疫沉淀、酶免疫分析和放射免疫測(cè)定。一般而言，特異性抗體將直接或間接地被可 檢測(cè)地標(biāo)記。直接標(biāo)記包括放射性同位素；產(chǎn)物可檢測(cè)的酶（例如，熒光素酶、3-半乳糖苷 酶，等等）；熒光標(biāo)記(例如，異硫氰酸熒光素、羅丹明、藻紅蛋白，等等）；發(fā)射熒光的金屬(例 如，通過(guò)諸如EDTA之類的金屬螯合基團(tuán)連接于抗體的112Eu或鑭系元素的其他成員）；化學(xué) 發(fā)光化合物(例如，魯米諾、異魯米諾、吖啶鹽，等等）；生物發(fā)光化合物(例如，熒光素、水母 蛋白（綠色熒光蛋白），等等）?？贵w可連接(偶聯(lián))于不溶支持物，例如聚苯乙烯板或珠。非直 接標(biāo)記包括編碼的多肽的特異性抗體（"特異性一抗"）的特異性二抗和特異性結(jié)合配對(duì)物 的成員，其中，所述二抗如上文所述被標(biāo)記，所述特異性結(jié)合配對(duì)物的成員例如，生物素-親 和素，等等。生物樣本可接觸并固定于諸如硝化纖維之類的固體支持物或載體上，所述固體 支持物或載體能夠固定細(xì)胞、細(xì)胞顆?；蚩扇艿鞍?。隨后所述支持物可用合適的緩沖液來(lái) 洗滌，然后與可檢測(cè)地標(biāo)記的特異性一抗接觸。檢測(cè)方法是本領(lǐng)域所知曉的并將根據(jù)可檢 測(cè)標(biāo)記發(fā)射的信號(hào)來(lái)選擇檢測(cè)方法。檢測(cè)一般通過(guò)與合適對(duì)照及合適標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比來(lái)實(shí) 現(xiàn)。
[0121] g.試劑盒
[0122] 檢測(cè)方法可作為試劑盒的部分而提供。因此，本發(fā)明還提供用于檢測(cè)生物樣本中 HF-相關(guān)多肽的存在和/或檢測(cè)HF-相關(guān)多肽水平的試劑盒。使用這些試劑盒的步驟可由臨 床實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)性實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)師或個(gè)人進(jìn)行。本發(fā)明的試劑盒用于檢測(cè)在纖維化過(guò)程中差異 性表達(dá)的HF-相關(guān)多肽。該試劑盒可提供在步驟中有用的額外組分，包括，但不限于，緩沖 劑、展開劑、標(biāo)記、反應(yīng)表面、檢測(cè)方法、對(duì)照樣本、標(biāo)準(zhǔn)、說(shuō)明書及解釋信息。
[0123] 實(shí)施例
[0124]比較來(lái)自健康個(gè)體的血漿與來(lái)自肝硬化患者的血漿時(shí)建立的差異表達(dá)蛋白
[0125] 與健康個(gè)體相比時(shí)，本發(fā)明的
【發(fā)明人】發(fā)現(xiàn)多種蛋白在HCV-誘發(fā)的肝硬化患者的人 類血漿樣本中差異表達(dá)。該發(fā)現(xiàn)通過(guò)使用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)來(lái)比較這些 血漿樣本而實(shí)現(xiàn)，所述雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳是一種在凝膠基質(zhì)上雙向分離蛋白得到離 散蛋白斑點(diǎn)的技術(shù)。使用寬范圍pH 3至pH 10的2D-PAGE先前已在國(guó)際公布W0/2008/031051 中使用以鑒別肝纖維化的血清中的生物標(biāo)記。本發(fā)明中纖維化生物標(biāo)記的鑒別不同于國(guó)際 公布10/2008/031051，因?yàn)槭褂昧苏秶?13至?!15.6。選擇此?!1范圍是因?yàn)樗谌N豐 度最高的血漿/血清蛋白（清蛋白、IgG、鐵傳遞蛋白）的主要同等型的范圍之外。這是首次將 該pH 3至pH 5.6范圍用于生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。
[0126] 新型生物標(biāo)記在疾病中的發(fā)現(xiàn)受血清和血漿中的跨越了十個(gè)數(shù)量級(jí)的動(dòng)態(tài)蛋白 濃度范圍的限制。因此，高豐度蛋白（尤其是白蛋白、免疫球蛋白和鐵傳遞蛋白）限制了低豐 度蛋白的檢測(cè)。為了克服尋找生物標(biāo)記中的這個(gè)問題，很多人嘗試了基于抗體和基于染料 親和力的初步分離策略以在電泳前從樣本中將高豐度蛋白耗竭從而提高低豐度蛋白的表 現(xiàn)。但是，免疫沉淀法是昂貴的，因?yàn)樾枰罅靠贵w來(lái)耗竭這些高豐度的蛋白，而染料親和 法效率較低且特異性較低，伴隨著大量非白蛋白的不必要的去除，且因此可能在蛋白質(zhì)組 分析中除去了潛在的生物標(biāo)記。不像本發(fā)明使用的大量蛋白（2mg)，由于高豐度蛋白除去過(guò) 程中的回收問題以及濃縮過(guò)程中的損失，多個(gè)樣本在耗竭后以類似的高水平蛋白加樣很有 挑戰(zhàn)性。
[0127] 雖然有血漿中高豐度蛋白的問題，國(guó)際公布W0/2008/031051中已在寬范圍pH 3至 pH 10中使用2D-PAGE成功鑒別了肝纖維化的幾個(gè)新型候選生物標(biāo)記。本申請(qǐng)中，這組肝纖 維化的生物標(biāo)記通過(guò)使用窄范圍pH 3至pH 5.6的2D-PAGE得以增加，該范圍在白蛋白、免疫 球蛋白和鐵傳遞蛋白的主要同等型范圍之外，從而使得加樣的蛋白比國(guó)際公布W0/2008/ 031051多四倍。這使低豐度特征點(diǎn)的表現(xiàn)得以提高且使分離得以改善。使用此pH范圍實(shí)現(xiàn) 了血清酸性蛋白組及血漿酸性蛋白組基于凝膠的分離得以顯著改善，并使在使用寬范圍pH 3至pH 10的國(guó)際公布W0/2008/031051中不可見的低豐度肝纖維化生物標(biāo)記得以鑒別。
[0128] 實(shí)施例1
[0129]雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D-PAGE)
[0130]為了鑒別HCV-誘發(fā)的肝瘢痕化的生物標(biāo)記，在基于2D-PAGE的蛋白組學(xué)研究中分 析健康個(gè)體的血漿樣本和HCV-誘發(fā)的肝硬化患者的血漿樣本(每組6名個(gè)體）。全部血漿樣 本收集于P100管(BD，0xford，UK)中。選擇這些P100血漿管是因?yàn)榕c其他血液收集管不同， 它們含有專有蛋白穩(wěn)定劑，所述專有蛋白穩(wěn)定劑當(dāng)血液被收集時(shí)立刻溶解，所述專有蛋白 穩(wěn)定劑提高蛋白的回收及保存，使它們適用于蛋白組分析和生物標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)。與分析來(lái)自 不同程度肝纖維化患者的血清的國(guó)際公布W0/2008/031051不同，本發(fā)明僅集中探討來(lái)自健 康個(gè)體的樣本和來(lái)自肝硬化患者的樣本之間差異表達(dá)的蛋白。采用該方法是因?yàn)橄惹霸谳p 度纖維化和中度纖維化中鑒別的所有差異表達(dá)蛋白在肝硬化中也被發(fā)現(xiàn)，這表明在本研究 中分析這些中間階段將不會(huì)產(chǎn)生任何其它候選纖維化生物標(biāo)記。將2毫克血漿蛋白在第一 向凝膠中使用pH 3至pH 5.6的非線性梯度通過(guò)電荷分離，然后在第二向中使用9%至16% (w/v)的SDS-PAGE梯度通過(guò)分子量(尺寸）分離。如Gangadharan等，（2007)在Clin · Chem.， 53，1792中所述的那樣進(jìn)行電泳、熒光染色和凝膠掃描。
[0131] 實(shí)施例2
[0132] 差異圖像分析與蛋白鑒別
[0133] 通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助圖像分析，在正常血漿樣本與肝硬化血漿樣本之間比較生成的斑 點(diǎn)的二維陣列。全部2D-PAGE凝膠的掃描圖像由如Gangadharan等，（2007 )，Cl in. Chem .，53， 1792所述的計(jì)算機(jī)輔助圖像分析來(lái)進(jìn)行分析。大于或等于2倍差異的差異表達(dá)改變被認(rèn)為 是顯著的。如Gangadharan等，（2007)，Clin .Chem.，53,1792所述，總共57個(gè)差異表達(dá)的特征 點(diǎn)被切割、用胰蛋白酶消化并進(jìn)行質(zhì)譜分析。
[0134] 實(shí)施例3
[0135] 鑒別肝硬化引起的肝纖維化的人類血漿生物標(biāo)記
[0136] 差異圖像分析顯示了潛在的血漿生物標(biāo)記的初步證據(jù)。參見圖1至圖4。該分析顯 示脂轉(zhuǎn)移抑制蛋白、鋅-α-2-糖蛋白、pH 5.46至pH 5.49處的結(jié)合珠蛋白、結(jié)合珠蛋白相關(guān) 蛋白、載脂蛋白C-III、載脂蛋白E、C4b-結(jié)合蛋白β鏈、對(duì)氧磷酶/芳香酯酶1、視黃醇結(jié)合蛋 白4、甲清蛋白、α-2-HS-糖蛋白、皮質(zhì)類固醇結(jié)合球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白和纖維蛋白 原γ鏈的表達(dá)在肝硬化血清中減少了，而完整補(bǔ)體C3dg、免疫球蛋白J鏈、性激素結(jié)合球蛋 白、14-3-3蛋白ζ/δ、脂聯(lián)素和α-1-抗胰蛋白酶的表達(dá)增加了。還觀察到糖蛋白血液結(jié)合素 的翻譯后修飾。
[0137] 已在國(guó)際公布W0/2008/031051中所述的纖維化生物標(biāo)記也被鑒別：CD5抗原樣蛋 白和Iga/κ鏈增加;α-1-抗胰凝乳蛋白酶、簇蛋白、補(bǔ)體C4、間-α-胰蛋白酶抑制劑重鏈H4和 運(yùn)甲狀腺素蛋白減少。就間-α_胰蛋白酶抑制劑重鏈Η4而言，由質(zhì)譜對(duì)肽序列的分析證實(shí)該 蛋白的未裂解形式減少了，而先前在國(guó)際公布W0/2008/031051中只有35kDa和70kDa的裂解 片段被鑒別為是減少的。
[0138] 所有上述蛋白被質(zhì)譜分析鑒定為最高得分蛋白。在凝膠特征點(diǎn)中鑒別出其他較低 得分蛋白，盡管不能被排除，但是所述較低得分蛋白較不可能是產(chǎn)生差異表達(dá)改變的原因。 鑒別出的較低得分蛋白是IgA鏈和載脂蛋白AI增加，白蛋白、AMBP、凝血酶原、色素上皮衍生 因子和血清淀粉樣P-組分減少。
[0139]
[0141] 實(shí)施例4
[0142] 血清/血漿中的這些新型蛋白的測(cè)量將有助于纖維化和肝硬化的可靠診斷，可減 少肝活檢的需要。這些測(cè)量可使用靶向這些蛋白的抗體的免疫測(cè)定而實(shí)現(xiàn)。
[0143] 已發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C3的一個(gè)片段在肝硬化中增加并觀察到所述片段在2D-PAGE凝膠上約 pi 4.9的等電點(diǎn)的39kDa處。由質(zhì)譜鑒定的該片段的氨基酸范圍為955個(gè)至1201個(gè)。補(bǔ)體 C3dg的氨基酸范圍為955個(gè)至1303個(gè)且其理論分子量和等電點(diǎn)（39kDa和pi 5)與所觀察到 的凝膠特征點(diǎn)相符，證明該特征點(diǎn)中的補(bǔ)體C3是補(bǔ)體C3dg。已知補(bǔ)體C3dg在氨基酸1010至 1013處具有可被纖溶酶(纖維分解相關(guān)的酶)裂解的硫酯位點(diǎn)。已知纖溶酶在纖維化中減 少，這與肝硬化中觀察到的未裂解的補(bǔ)體C3dg增加的水平一致。在國(guó)際公布W0/2008/ 031051中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體C3的一個(gè)片段在纖維化和肝硬化中減少，觀察到所述片段在49kDa pi 6.9處，且質(zhì)譜鑒定的氨基酸表明它是硫酯位點(diǎn)前的補(bǔ)體C3的α鏈，證明纖維化中纖溶酶介 導(dǎo)的對(duì)補(bǔ)體〇3的裂解減少(6&即3(11^抑11等，（2007)，(：1丨11.〇16111.，53，1792)。因此在本發(fā)明 中，靶向補(bǔ)體C3的纖溶酶裂解位點(diǎn)（即與氨基酸1010至1013處硫酯位點(diǎn)重疊)的抗體將有助 于確定裂解的程度。目前似乎沒有針對(duì)補(bǔ)體C3硫酯位點(diǎn)區(qū)域的商售抗體。針對(duì)裂解區(qū)的抗 體可更可靠地幫助確定肝瘢痕化中未裂解的補(bǔ)體C3的增加水平。
[0144] 已知總結(jié)合珠蛋白在纖維化中減少且目前與其他蛋白一同使用以診斷肝纖維化 (參見國(guó)際公布W00216949)。在本發(fā)明中，發(fā)現(xiàn)含有pH 5.46至pH 5.49處的β結(jié)合珠蛋白的 2D-PAGE特征點(diǎn)在肝硬化中減少并顯得比總結(jié)合珠蛋白更為可靠。已知結(jié)合珠蛋白含有四 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，所述糖基化位點(diǎn)全部在其β鏈上。在血漿/血清中辟吉合珠蛋白通常被 糖基化。當(dāng)通過(guò)2D-PAGE分離血漿/血清時(shí)，發(fā)現(xiàn)β結(jié)合珠蛋白為pH 4.7和pH 5.8之間一排等 間隔的特征點(diǎn)，所述特征點(diǎn)可在肝瘢痕化中顯示為減少。在本發(fā)明中，pH 5.46至pH 5.49處 的結(jié)合珠蛋白的2D-PAGE凝膠特征點(diǎn)在肝硬化中減少并顯得比pH 4.7和pH 5.8之間的β結(jié) 合珠蛋白的其他特征點(diǎn)更為可靠。
[0145] 實(shí)施例5
[0146] 新型生物標(biāo)記中的每一個(gè)的纖維化分級(jí)可用公式表示。測(cè)定肝纖維化不同階段的 血清中這些生物標(biāo)記的平均濃度。目前臨床上使用0至6的分級(jí)評(píng)估肝纖維化，其中0代表未 纖維化，1-5代表從輕度到中度/嚴(yán)重的嚴(yán)重性增加的纖維化中間階段，6為肝硬化(Ishak， (1995)，J Hepatol，22,696)。通過(guò)確定這七個(gè)階段中的新型生物標(biāo)記的濃度范圍，可指定 從0至6的類似評(píng)分系統(tǒng)。所有新型生物標(biāo)記的分值相加的結(jié)果將給出更為可靠的纖維化程 度指標(biāo)，而非檢測(cè)單個(gè)生物標(biāo)記。
[0147] 實(shí)施例6
[0148] 免疫測(cè)定
[0149] 本發(fā)明提供用于評(píng)估纖維化的試劑盒，所述試劑盒檢測(cè)HF-相關(guān)多肽。這通過(guò)使用 結(jié)合于HF-相關(guān)多肽的抗體來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些抗體可用于進(jìn)行免疫測(cè)定，例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELI SA )、放射性免疫測(cè)定、蛋白斑點(diǎn)印跡、蛋白印跡、透射比濁法、散射比濁法等等。HF-相 關(guān)多肽還可使用非抗體途徑來(lái)定量，所述非抗體途徑例如，但不限于，使用質(zhì)譜進(jìn)行多反應(yīng) 監(jiān)測(cè)。
[0150]就ELISA而言，檢測(cè)可在96孔板中進(jìn)行。一種選擇是使用非競(jìng)爭(zhēng)性單位點(diǎn)結(jié)合 ELISA。在這種檢測(cè)中，用碳酸氫鹽緩沖液制備已知濃度的抗原(在該實(shí)施例中，指新型生物 標(biāo)記和血清樣本），將所述抗原加入96孔板并在4°C下過(guò)夜孵育。然后用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS)和吐溫的溶液(PBS-T)洗板三次，再用含有牛血清白蛋白的PBS溶液封閉。37 °C下孵育 1小時(shí)后，加入針對(duì)抗原(在該實(shí)施例中，指目標(biāo)生物標(biāo)記)的一抗，37°C下孵育板1小時(shí)再用 PBS-T洗滌三次。然后加入辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗(針對(duì)一抗的動(dòng)物來(lái)源），并在37 °C下 孵育板1小時(shí)，然后用PBS-T洗滌三次。最后，向每孔加入諸如2，2 連氮-雙(3-乙基苯并噻 唑啉-6-磺酸)之類的過(guò)氧化物酶底物，30分鐘后在酶標(biāo)儀上讀取405nm處的吸光度。
[0151] 可選地，可使用夾心ELISA。在這種類型的檢測(cè)中，一種抗體結(jié)合于板孔的底部。加 入抗原(該情況下指生物標(biāo)記蛋白），并通過(guò)洗滌除去未結(jié)合的產(chǎn)物。然后加入結(jié)合于該抗 原的被標(biāo)記的另一抗體。對(duì)結(jié)合的另一抗體的量進(jìn)行定量(通常通過(guò)比色度）。除了新型生 物標(biāo)記外，本發(fā)明的
【發(fā)明人】提出結(jié)合珠蛋白可通過(guò)ELISA測(cè)量。血清中的結(jié)合珠蛋白水平 (結(jié)合臨床醫(yī)師測(cè)定的肝功能測(cè)試)將建立用于肝纖維化的更為可靠的得分。
[0152] 盡管上述內(nèi)容涉及特定的優(yōu)選實(shí)施方式，將被理解的是，本發(fā)明并不局限于此。本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)對(duì)公開的實(shí)施方式做出各種改變并且這些改變將在本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。
[0153]本說(shuō)明書中引用的所有公開出版物、專利申請(qǐng)及專利的全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用并入本 文。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 至少一種HF-相關(guān)的多肽在制備用于檢測(cè)及評(píng)估人類患者的血清或血漿樣本中的肝 纖維化的試劑盒中用途，其中將所述人類患者的血清或血漿樣本中至少一種HF-相關(guān)的多 肽的水平與所述至少一種HF-相關(guān)的多肽的對(duì)照水平比較用于檢測(cè)及評(píng)估所述人類患者中 血清或血漿樣本中的肝纖維化，其中所述至少一種HF-相關(guān)的多肽選自：皮質(zhì)類固醇結(jié)合球 蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋白、 載脂蛋白C-III、C4b結(jié)合蛋白β鏈、完整/裂解的補(bǔ)體C3dg、裂解的補(bǔ)體C3dg、纖維蛋白原γ 鏈、pH 5.46至pH 5.49處的結(jié)合珠蛋白、結(jié)合珠蛋白相關(guān)蛋白、血液結(jié)合素、免疫球蛋白J 鏈、視黃醇結(jié)合蛋白4、血清對(duì)氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結(jié)合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。2. 如權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述至少一種HF-相關(guān)的多肽包括皮質(zhì)類固醇結(jié)合 球蛋白。3. 至少一種HF-相關(guān)的多肽在制備用于人類患者的血清或血漿樣本中的肝纖維化的嚴(yán) 重性分級(jí)的試劑盒中用途，其中將所述人類患者的血清或血漿樣本中至少一種HF-相關(guān)的 多肽的水平與所述至少一種HF-相關(guān)的多肽的對(duì)照水平比較用于所述人類患者的血清或血 漿樣本中的肝纖維化的嚴(yán)重性分級(jí)，其中所述至少一種HF-相關(guān)的多肽選自：皮質(zhì)類固醇結(jié) 合球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋 白、載脂蛋白C-III、C4b結(jié)合蛋白β鏈、完整/裂解的補(bǔ)體C3dg、裂解的補(bǔ)體C3dg、纖維蛋白原 γ鏈、pH 5.46至pH 5.49處的結(jié)合珠蛋白、結(jié)合珠蛋白相關(guān)蛋白、血液結(jié)合素、免疫球蛋白 J鏈、視黃醇結(jié)合蛋白4、血清對(duì)氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結(jié)合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其中，所述至少一種HF-相關(guān)的多肽包括皮質(zhì)類固醇結(jié)合 球蛋白。5. 至少一種HF-相關(guān)的多肽在制備用于測(cè)定人類患者的血清或血漿樣本中的肝纖維化 的預(yù)后的試劑盒中的用途，其中將所述人類患者的血清或血漿樣本中至少一種HF-相關(guān)的 多肽的水平與所述至少一種HF-相關(guān)的多肽的對(duì)照水平比較用于測(cè)定所述人類患者的血清 或血漿樣本中的肝纖維化的預(yù)后，其中所述至少一種HF-相關(guān)的多肽選自：皮質(zhì)類固醇結(jié)合 球蛋白、富亮氨酸α-2-糖蛋白、14-3-3蛋白ζ/δ、甲清蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、α-2-HS-糖蛋 白、載脂蛋白C-III、C4b結(jié)合蛋白β鏈、完整/裂解的補(bǔ)體C3dg、裂解的補(bǔ)體C3dg、纖維蛋白原 γ鏈、pH 5.46至pH 5.49處的結(jié)合珠蛋白、結(jié)合珠蛋白相關(guān)蛋白、血液結(jié)合素、免疫球蛋白 J鏈、視黃醇結(jié)合蛋白4、血清對(duì)氧磷酶/芳香酯酶1、性激素結(jié)合球蛋白和鋅-α-2-糖蛋白。6. 如權(quán)利要求5所述的用途，其中，所述至少一種HF-相關(guān)的多肽包括皮質(zhì)類固醇結(jié)合 球蛋白。
【文檔編號(hào)】G01N33/576GK105866423SQ201610085002
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2010年5月13日
【發(fā)明人】雷蒙德·A·德韋克, 貝文·甘加達(dá)蘭, 妮科爾·齊茲曼
【申請(qǐng)人】牛津大學(xué)之校長(zhǎng)及學(xué)者