專利名稱：用于評(píng)估腎臟疾病的新生物標(biāo)記物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于評(píng)估腎臟疾病的新生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物對(duì)腎臟中病理學(xué)改變較敏感，特別是在疾病或損傷早期階段。此外，本發(fā)明涉及用于評(píng)估哺乳動(dòng)物受試者中腎臟疾病的方法，并涉及用于實(shí)施該方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
代謝組學(xué)(metabolomics)是對(duì)系統(tǒng)地涵蓋關(guān)鍵代謝產(chǎn)物的小分子量化合物的綜合的定量測(cè)量，這些關(guān)鍵代謝產(chǎn)物代表了中間代謝的途徑的整個(gè)范圍。在系統(tǒng)生物學(xué)方法中，其提供了通過遺傳藍(lán)圖，調(diào)節(jié)，蛋白豐度和修飾，和環(huán)境影響決定的改變的功能的資料解析。分析大陣列的代謝產(chǎn)物的能力提取出反應(yīng)明顯的生物學(xué)事件的真實(shí)功能的終點(diǎn)的生物化學(xué)信息，而其他的功能基因組學(xué)技術(shù)例如轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)，雖然非常有價(jià)值，但僅指示表型反應(yīng)的潛在原因。因此它們不能在表型水平必要地預(yù)示藥物效果、毒物學(xué)反應(yīng)或疾病狀態(tài)除非加上功能確認(rèn)。代謝組學(xué)通過特別描述此種功能信息縮小該信息差距，因?yàn)樵谏飳W(xué)液體和組織之間的代謝產(chǎn)物差異提供了與至各種表型反應(yīng)最緊密連接。不需要講，生物化學(xué)表型中的此種改變與藥物的、生物技術(shù)和健康產(chǎn)業(yè)有直接關(guān)系——一旦合適的技術(shù)使得能夠?qū)υ撔畔⑦M(jìn)行挖掘(mining)和整合。一般而言，表型不是必要地被基因型預(yù)測(cè)。基因型和表型之間的差距是通過許多生物化學(xué)反應(yīng)引起的，每種反應(yīng)對(duì)包括藥物、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素的多種影響都有個(gè)體依賴。在從基因到表型的生物分子的該鏈中，代謝產(chǎn)物是與表型最緊密連接的可定量的分子。許多表型和基因型狀態(tài)，例如對(duì)藥物的中毒反應(yīng)或疾病傳播被通過在生物學(xué)液體和組織中功能上相關(guān)的代謝產(chǎn)物的濃度的差異來預(yù)測(cè)。慢性腎臟疾病(CKD)為在腎小管和腎小球中的腎臟功能累進(jìn)的喪失，通常為不可逆的。CKD為世界范圍的公共健康問題，具有如腎衰竭、心血管疾病和早產(chǎn)兒死亡的并發(fā)癥。 CKD可由不同原因引起，但一個(gè)主要原因是作為來自2型糖尿病的并發(fā)癥，稱為糖尿病腎病 (DN)。在歐洲，有大約2230萬人受糖尿病折磨，且這些人中94. 9%患有2型糖尿病，這是在歐洲大多數(shù)工業(yè)化國(guó)家中終末期腎病(ESRD)的主要原因(Ha H等.2008)。患有ESRD 的患者的三分之一為糖尿病患者(Wolf G. &Ritz Ε. 2003)且最近的數(shù)據(jù)顯示在患有2型糖尿病的患者中ESRD的流行病學(xué)增加，最可能由于對(duì)高血壓和冠心病的更好治療，導(dǎo)致更多患者存活足夠長(zhǎng)的時(shí)間以發(fā)展出腎病和ESRD(Sampanis Ch. 2008)。在美國(guó)，每年用于治療ESRD的花費(fèi)于1995年為118億，預(yù)計(jì)至2010年超過兩倍，為283億美元。在歐洲的經(jīng)濟(jì)因素還沒有被廣泛地研究(Massi-Benedetti M&C0DE_2Advisory Board 2002)但在2型糖尿病的花費(fèi)(C0DE-2)研究中糖尿病并發(fā)癥對(duì)糖尿病治療的花費(fèi)的影響被評(píng)估。該研究顯示沒有并發(fā)癥的患者每年醫(yī)療費(fèi)用大約為1505歐元，與此相比有微血管并發(fā)癥的患者的每年醫(yī)療費(fèi)用為2563歐元，后者增加了 70% (Williams R等.2002)。世界領(lǐng)先的獨(dú)立醫(yī)學(xué)期刊最近總結(jié)一項(xiàng)包括近50萬成人的長(zhǎng)期研究，該研究證明幾乎所有受試者直到CKD晚期階段才知道他們的疾病。因?yàn)镃KD被認(rèn)為在較早期階段是可治療且可預(yù)防的(Wen CP 等.2008)，較早的檢測(cè)將使2型糖尿病患者減輕并發(fā)癥并對(duì)于公共健康系統(tǒng)和患者本身都減少健康護(hù)理費(fèi)用。腎臟具有幾種功能來維持身體的適當(dāng)功能，例如過濾出廢物產(chǎn)物和毒素、保持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和產(chǎn)生激素。為了維持該適當(dāng)?shù)哪I臟功能，腎臟中血液經(jīng)腎小球膜被過濾的速率必須被調(diào)節(jié)。高的腎小球過濾速率(GFR)對(duì)于保持水和溶質(zhì)的穩(wěn)定的和最佳的細(xì)胞外水平是必須的(Boron WF, &Boulpaep EL. 2003)。該GFR根據(jù)血清肌酸酐清除率、年齡、種族和性別計(jì)算，并被用于將CKD分成五個(gè)階段，其中最后一個(gè)是終末期腎病(ESRD)且透析和移植對(duì)于生存是需要的?，F(xiàn)已經(jīng)知道腎臟功能障礙越快被診斷和治療，保留剩余的腎單位并因此減緩疾病發(fā)展的幾率越大。評(píng)估和診斷腎臟疾病的常規(guī)標(biāo)記物包括GFR、肌酸酐和白蛋白。在非常早期階段增加之后，GFR在任何癥狀顯示之前減少。用GFR測(cè)量的缺點(diǎn)包括高成本和與常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)不相容。上述的血清肌酸酐為最通常使用的計(jì)算GFR的標(biāo)記物，但半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin)C已被提議作為更靈敏的標(biāo)記物，其可檢測(cè)甚至溫和的GFR減少(Herget-Rosenthal S等.2007)。不利之處是對(duì)于半胱氨酸蛋白酶抑制劑C不存在參考方法或統(tǒng)一校準(zhǔn)材料，且進(jìn)一步限制是高的糖皮質(zhì)激素劑量的甲狀腺機(jī)能障礙和潛在的存在心血管疾病對(duì)半胱氨酸蛋白酶抑制劑C水平的影響。由于這些單一標(biāo)記物中的限制，因此不建議完全地依賴GFR評(píng)估來進(jìn)行精確的臨床決定。除了腎臟疾病，年齡是影響GFR的第二大因素。因此，GFR的溫和的減少可能不總是由于腎臟損傷，而是由于年齡。同樣，GFR的減少不總是由于慢性腎臟疾病。GFR的測(cè)量也被認(rèn)為是不方便的且因此腎臟功能通常用血清肌酸酐濃度評(píng)估。血清肌酸酐已被長(zhǎng)時(shí)間用于檢測(cè)受損的腎臟疾病也被用于計(jì)算GFRGtar R.等.2002)。肌酸酐是來自肌肉代謝的磷酸肌酸酐的故障(breakdown)產(chǎn)品(Barr DB.等.2005)且它每天形成的量取決于肌肉量(mass)，但血漿濃度在個(gè)體中十分恒定。血清肌酸酐濃度受例如年齡、性別、種族和身體尺寸的影響，因此通常進(jìn)行肌酸酐清除的測(cè)量。來自身體的肌酸酐的清除是通過腎臟中腎小球過濾，但肌酸酐也通過腎小管從血液活性分泌。該速率取決于遺傳的和生物學(xué)的因素，例如性別和年齡，并導(dǎo)致GFR的15-20%高估。因此，肌酸酐被認(rèn)為不敏感的標(biāo)記物，尤其對(duì)于小的(small)和上年紀(jì)的人。還有，肌酸酐的另一缺點(diǎn)是它僅檢測(cè)較晚期階段的腎臟損傷。白蛋白是最豐富的血漿蛋白(Basi S，等.2008)且對(duì)腎臟的結(jié)構(gòu)損傷可通過升高的尿白蛋白排泄被反映，因此被稱為微量白蛋白，30-300mg/Mh。微量白蛋白尿在糖尿病發(fā)生之后發(fā)展一些年并在15-20年之后進(jìn)展為大量白蛋白尿(macroalbuminuria)，尿中白蛋白濃度高于300mg/Mh。白蛋白尿的存在為糖尿病腎病的標(biāo)志并通常用浸漬片(dipstick) 測(cè)量。白蛋白作為腎臟損傷的標(biāo)記物有一些缺點(diǎn)。首先，直到幾年前人們還相信不被近曲小管細(xì)胞重吸收的尿白蛋白被完整排泄，但事實(shí)上白蛋白被以完整的白蛋白和不被浸漬片測(cè)試檢測(cè)的白蛋白-衍生的肽，以及另一種也不被檢測(cè)的完整的白蛋白排泄。這給假陰性測(cè)試結(jié)果提供了空間。(Comper WD. &0sicka TM. 2005)。第二，白蛋白尿是已經(jīng)存在腎病的證據(jù)，因此不將白蛋白作為好的預(yù)測(cè)性的生物標(biāo)記物。如果糖尿病腎病在出現(xiàn)大量白蛋白尿之前被檢測(cè)到，則治療有可能預(yù)防或逆轉(zhuǎn)CKD的進(jìn)展。白蛋白尿的測(cè)量不能鑒定所有患有腎臟損傷的患者。兩種甲基精氨酸異構(gòu)體對(duì)稱的二甲基精氨酸(SDMA)和不對(duì)稱的二甲基精氨酸 (ADMA)在腎臟疾病背景中已經(jīng)被密集研究(參見Fleck C等.2001)。它們通過由蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)轉(zhuǎn)錄后修飾的精氨酸殘基形成。然而SDMA在生理學(xué)上是非常惰性的，至少在身體中通常不被代謝，ADMA是生物學(xué)重要的因?yàn)樗鳛橐谎趸厦?NOS)的內(nèi)生抑制劑的潛力，這意味著升高的ADMA濃度引起減少的NO的合成，并因此引起受損的內(nèi)皮功能。幾十年來ADMA的累積被認(rèn)為對(duì)高血壓、免疫防御和涉及CKD的特征有貢獻(xiàn)，且動(dòng)物研究已顯示實(shí)驗(yàn)上誘導(dǎo)的慢性NOS抑制引起系統(tǒng)高血壓和腎小球高血壓、腎小球局部缺血、腎小球硬化癥、腎小管間質(zhì)性損傷和蛋白尿(Zatz R&Baylis C，1998)。SDMA也已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在患有CKD的患者中顯著增加，甚至比ADMA多。并且，?；舛緣A已被關(guān)聯(lián)至CKD (Fougue D等.2006)。游離?；舛緣A的增加已在CKD患者的血清中觀察到，這是因?yàn)閾p傷的腎臟的減小的排泄功能。此外，氧化應(yīng)激已被關(guān)聯(lián)至腎臟疾病的發(fā)展多年(Loughrey CM.等.1994，Ha H 等.19%)。幾項(xiàng)研究顯示歸因于高血糖的增加的氧化應(yīng)激是糖尿病的微血管和大血管并發(fā)癥兩者的起源(Sakane N等.2008)。氧化應(yīng)激起源于豐富的葡萄糖和脂肪酸且當(dāng)這些物質(zhì)被供應(yīng)至線粒體代謝時(shí)，來自電子傳遞鏈的電子可能逃逸。蛋氨酸亞砜是活性氧物質(zhì) (ROS)的氧化的最直接指示劑之一(Mashima R等.200 ，但之前它還未被用作腎臟疾病的生物標(biāo)記物。此外，檸檬酸循環(huán)中間體在腎衰竭中的作用已被研究，其中在患有CKD的患者中檸檬酸鹽、富馬酸鹽、草酰乙酸鹽和蘋果酸鹽的濃度顯著增加。在患有CKD的患者中，腎代謝改變顯示出影響整個(gè)身體和腎氨基酸代謝的改變。 在正常條件下，僅有限量的氨基酸隨尿排出。苯丙氨酸向酪氨酸的轉(zhuǎn)變的損傷已被觀察到， 其導(dǎo)致苯丙氨酸在這些患者中的累積。此外，損傷的腎臟影響精氨酸的產(chǎn)生，這在臨床和動(dòng)物研究中都已以腎精氨酸合成的減少顯示。而且，減少的瓜氨酸的腎攝取和?；撬?、鳥氨酸、丙氨酸、酪氨酸和賴氨酸的釋放已被觀察到存在于有嚴(yán)重的(advanced)CKD的患者中。 此外，瓜氨酸至精氨酸的轉(zhuǎn)變顯示為減少。而且，有人建議色氨酸(trypthophan)代謝在CKD的發(fā)病中發(fā)揮作用。在腎臟的該路徑中的限速酶為吲哚胺-2、3-二氧化酶(IDO)，其將色氨酸轉(zhuǎn)化為N-甲?；?犬尿素， N-甲酰基-犬尿素反過來被分解代謝為犬尿素及之后的羥基犬尿素。IDO的增加的活性已在以前的研究中觀察到，這解釋了色氨酸的消耗。炎性標(biāo)記物例如C-反應(yīng)蛋白、白介素6、白介素18、腫瘤壞死因子(TNF)-Ci已被觀察到在有糖尿病和DN的患者的血清中增加并且胎球蛋白被觀察到減少。此情況發(fā)生在疾病的非常早期的階段，且與白蛋白尿的程度關(guān)聯(lián)。已知用于CKD或DN的診斷的生物標(biāo)記物包括例如幾種具有不同的分子量和遷移時(shí)間的多肽標(biāo)記物(US 2006286602A1,CA2473814A1,EP 1972940A1,US 2009081713A1)，例如慢性腎衰竭基因-Ia(CRFG-Ia)多肽(JP 11069985A，JP 11069984A)，以及多核苷酸標(biāo)記物(JP 2003235573A, JP 2004187620A)。上述半胱氨酸蛋白酶抑制劑C為所有用于診斷腎臟疾病的標(biāo)記物蛋白之一(JP 11064333A)，與全-(holo_)和 apo-視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)、Tamm-Horsfall-蛋白(THP， (DE 10327773A1)。鈣結(jié)合蛋白Dj8k (大的EF-手家族(EF-hand family)的鈣結(jié)合蛋白成員)、腎臟損傷分子-l(Kim-l，a包含細(xì)胞外的、六半胱氨酸免疫球蛋白區(qū)的1類膜蛋白)， a-2u球蛋白相關(guān)的蛋白(a-2u)，在人中也稱為lipocalin 2 (LCN2)或中性明膠酶相關(guān)的Iip0caIin(NGAL)(儲(chǔ)存于中性粒細(xì)胞的顆粒中)，骨橋蛋白(OPN)，也稱為分泌的磷蛋白 1(SPP1，分泌的，高酸的和糖基化的包含精氨酸-甘氨酸-天氨酸(RGD)細(xì)胞粘附基序的磷蛋白)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，已知促進(jìn)血管發(fā)生，增加血管滲透性，作為單核細(xì)胞的趨化劑，且在糖尿病、創(chuàng)傷愈合、炎性反應(yīng)和組織重塑中有作用(WO 2008116867A1)，N-乙?；邗；?acetyl muramoyl)-L-丙氨酸酰胺酶前體，脂肪細(xì)胞因子，AMBP蛋白前體 (α -1-微球蛋白)，C4b-結(jié)合蛋白α -鏈前體，血漿銅藍(lán)蛋白前體，補(bǔ)體C3前體，補(bǔ)體C9前體，補(bǔ)體因子D前體α -IB-糖蛋白，β -2-糖蛋白I前體，肝素輔因子II前體，鏈C區(qū)蛋白， 富亮氨酸-α-2-糖蛋白前體，色素上皮衍生的因子前體，血漿視黃醇結(jié)合蛋白前體和翻譯起始因子3亞單元10 (EP 1905846Α2)?？乖⒓?xì)胞毒素和細(xì)胞生長(zhǎng)抑制劑可被用作生物標(biāo)記物(W02008101231A2)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子23(FGF-2;3)和脂肪細(xì)胞因子(adiponectin)已被發(fā)現(xiàn)為對(duì)于慢性腎臟疾病的進(jìn)展獨(dú)立地或組合地為良好預(yù)示的標(biāo)記物(WO 2008089936A1)。用于診斷和檢測(cè)腎臟疾病或其誘因(predisposition)的另一方法通過檢測(cè)來自受試者的樣品中的von Hippel-Lindau 腫瘤抑制劑(pVHL)、CXC 趨化因子受體 4 (CXCR4)，integrin β -1、血小板衍生的生長(zhǎng)因子α多肽(PDGF-A)，缺氧可誘導(dǎo)的因子la (HIF 1 α )和/或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGFi3) (US2008/0038269A1)。通過測(cè)量乳鐵蛋白，髓過氧化酶和癌胚抗原(CEA) (JP 9072906A)和纖連蛋白(JP 9274036A)腎臟疾病也可被診斷。另一所述方法測(cè)量樣品中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的水平以確定腎臟纖維化的存在和進(jìn)展及相關(guān)的腎障礙，特別是與糖尿病、高血糖和高血壓關(guān)聯(lián)的并發(fā)癥。(US 2004/0224360A1)在基因組學(xué)領(lǐng)域，也有幾種生物標(biāo)記物用于腎臟疾病評(píng)估。一個(gè)發(fā)明包含鑒定僅在臨床或科學(xué)有益的細(xì)胞，例如足細(xì)胞或近曲小管細(xì)胞中表達(dá)的基因(CN 1863928A)。人白細(xì)胞抗原(HLA)基因標(biāo)記物HLA-A11，HLA-DR9和HLA-DQA 1*0302都是糖尿病和腎病的易感基因(CN 101294215A)。解聚素和有血小板反應(yīng)蛋白類型1基序-4的金屬蛋白酶、蛋白聚糖酶(aggrecanase)-l(ADAMTS4)已被發(fā)現(xiàn)用于CKD的血液生物標(biāo)記物(W0 2009002451A2) 以及基因鈣結(jié)合蛋白-擬8k、KIM-I、0ΡΝ、EGF、叢生蛋白、VEGF, 0AT-K1、醛縮酶A、醛縮酶B、 Podocin, a-2u，C4(EP 1925677A2)和神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT) (W0 03057874A1)。RNA標(biāo)記物也被用作腎臟疾病的標(biāo)記物(EP 2058402 (Al)。例如，腎臟RNA標(biāo)記物選自腎近曲小管的表皮細(xì)胞中表達(dá)的腎臟特異性的雄激素調(diào)節(jié)蛋白(KAP)、腎臟損傷分子-I(KIM-I)(—種在近曲小管上皮細(xì)胞中表達(dá)的膜蛋白)，在缺血損傷之后和用腎毒物治療后在腎臟中誘導(dǎo)表達(dá)的肝磷脂結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子(HB-EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (FGF-I)、用腎毒物出料后腎臟中誘導(dǎo)的角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF-7)和FGF-7受體FGFR2 IIIb、水通道蛋白，水通道1、2和3 (在腎臟中大量表達(dá))、Tamm-Horsfal 1糖蛋白(在腎臟上皮細(xì)胞中表達(dá)并位于Henle管的粗升支(thick ascending limbs)和腎臟的遠(yuǎn)曲小管) 和最后的，早期生長(zhǎng)反應(yīng)基因(Egr-I)，原癌基因(c-fos)和應(yīng)激反應(yīng)基因(hsp70)的表達(dá)， 其在腎臟缺血損傷之后被激活。先有技術(shù)中描述的用于評(píng)估腎臟疾病的其他方法包括通過使用兩種或多種底物測(cè)量尿中蛋白酶活性并分析蛋白酶活性作用該底物的類型(wo 2008001840A1)或測(cè)量人體中催化的鐵(US 2007238760A1)。即使有幾種被推薦的用于評(píng)估腎臟疾病的生物標(biāo)記物，但所描述的那些且特別是在當(dāng)今的臨床使用中的那些不是足夠敏感的且僅在該疾病的晚期階段被檢測(cè)到。因此，對(duì)于腎臟中的病理改變，特別是在疾病或損傷的早期階段的更敏感的標(biāo)記物仍有顯著的醫(yī)學(xué)需求。雖然上述標(biāo)記物例如白蛋白和肌酸酐已經(jīng)用于發(fā)現(xiàn)處于患腎病風(fēng)險(xiǎn)的糖尿病患者，但是最重要的是發(fā)現(xiàn)新型的和更敏感的代謝生物標(biāo)記物，這些生物標(biāo)記物有能力在較早階段預(yù)測(cè)或檢測(cè)糖尿病腎病，使其能用治療介入以防止或至少減緩最終引起ESRD的腎臟損傷的進(jìn)展并控制相關(guān)的并發(fā)癥?？紤]到先有技術(shù)中存在的上述問題，本發(fā)明的目的是提供用于評(píng)估腎臟疾病的新的生物標(biāo)記物，所述標(biāo)記物對(duì)于腎臟中病理改變更敏感，特別是在疾病或損傷的早期階段。 最佳地，所述標(biāo)記物在生物學(xué)樣品例如在血液和/或尿中應(yīng)容易地被檢測(cè)到，其水平應(yīng)與腎臟損傷的程度始終關(guān)聯(lián)，且其水平應(yīng)改變。此外，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于評(píng)估生物學(xué)樣品中腎臟疾病的方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)，本發(fā)明人基于他們對(duì)代謝組學(xué)的研究——因?yàn)檫@可以理解在疾病過程中腎臟中發(fā)生的生物化學(xué)改變并提供幾種新的和潛在的較好的生物標(biāo)記物。 事實(shí)上，腎臟是特別的代謝主動(dòng)的器官，在此代謝產(chǎn)物被排泄或再次吸收，這取決于它們?cè)谏眢w中的功能。因此，對(duì)于用于腎臟疾病的代謝生物標(biāo)記物將有顯著的進(jìn)步，這也將給出更多關(guān)于腎臟的功能和其中的生物化學(xué)反應(yīng)的信息。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在使用一組隨著進(jìn)行性腎臟疾病而改變的代謝產(chǎn)物而不是僅使用如先有技術(shù)中的單一標(biāo)記物時(shí)，所有涉及的途徑和機(jī)制的較綜合的圖片被給出。發(fā)明_既述因此，本發(fā)明，如所附權(quán)利要求書中限定的，提供適合用于評(píng)估腎臟疾病的新的生物標(biāo)記物(即新的生物標(biāo)記物組)，所述生物標(biāo)記物對(duì)腎臟中病理學(xué)改變更敏感，特別是在疾病或損傷早期階段。此外，本發(fā)明還提供用于評(píng)估哺乳動(dòng)物受試者中腎臟疾病的方法，以及適于實(shí)施該方法的試劑盒。附圖簡(jiǎn)述在說明書附件中進(jìn)行對(duì)下

圖1-14的參考。這些證明了依照本發(fā)明的進(jìn)行性腎臟疾病中代謝生物標(biāo)記物的增加或減少的實(shí)例。圖1涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5中對(duì)稱的二甲基精氨酸 (SDMA)，并顯示階段5患者與階段3和階段4患者相比具有高度顯著性(ρ << 0. 01)增加的比，這表明SDMA是CKD的進(jìn)展的好的生物標(biāo)記物。圖2涉及CKD的階段3-5中SDMA比并顯示階段5患者與階段3和階段4患者相比具有高度顯著性(P << 0. 01)增加的比。圖3涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5中SDMA/精氨酸比的箱線圖，并顯示階段5患者與階段3和階段4患者相比具有高度顯著性(ρ << 0. 01)增加的比， 這表明還有SDMA/精氨酸比是CKD的進(jìn)展的好的生物標(biāo)記物。該比為作為好的預(yù)示性標(biāo)記物的SDMA/Arg指示的，且反映了蛋白精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶II的增加的活性。
圖4涉及CKD的階段3-5中SDMA/精氨酸比的箱線圖并顯示階段5患者與階段3 和階段4患者相比具有高度顯著性(ρ << 0. 01)增加的比。SDMA為好的預(yù)示性標(biāo)記物且反映了蛋白精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶II的增加的活性。圖5涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5?；舛緣A戊二?；舛緣A的箱線圖，并顯示戊二?；舛緣A在CKD較晚的階段具有提高的水平。圖6顯示CKD的階段3-5中戊二?；舛緣A的箱線圖。圖7涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5中瓜氨酸/精氨酸比的箱線圖，并顯示階段5患者與這階段3患者相比具有高度顯著性(p<<0.01)增加的比，該比指示在尿素循環(huán)中改變的酶活性。圖8涉及CKD的階段3-5中瓜氨酸/精氨酸比的箱線圖。圖9涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5中鳥氨酸/精氨酸比的箱線圖，并顯示僅在非糖尿病患者中階段5患者與階段3患者相比具有高度顯著性(ρ <<0. 01)增加的比，這表明該生物標(biāo)記物對(duì)于不同類型的腎臟疾病之間的不同的診斷將是重要的。圖10涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5中蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比的箱線圖，并顯示在階段5患者中與階段3患者相比該氧化應(yīng)激標(biāo)記物高度顯著性(ρ << 0.01)增加。圖11涉及CKD的階段3-5中蛋氨酸亞砜(MetSO)/蛋氨酸(Met)比的箱線圖，并顯示階段5患者與3階段患者相比具有高度顯著性(p<<0.01)增加的比，這表明MetSO/ Met比是CKD的進(jìn)展的好的生物標(biāo)記物。圖12涉及CKD的階段3-5中富馬酸鹽的箱線圖，并顯示出，因?yàn)樵谠缙陔A段不存在富馬酸鹽，因此富馬酸鹽用作定性標(biāo)記物。圖13涉及糖尿病患者和非糖尿病患者中CKD的階段3-5中alpha酮戊二酸鹽的箱線圖，并顯示階段5糖尿病患者與階段3糖尿病患者相比具有高度顯著性(ρ << 0. 01) 增加的比。圖14涉及CKD的階段3-5中alpha酮戊二酸鹽的箱線圖。優(yōu)選實(shí)施方案描述通過使用依照本發(fā)明的特異的(成組的)生物標(biāo)記物和方法，已能夠更合適且可靠地評(píng)估腎臟疾病?！霸u(píng)估”在本發(fā)明的意義中是指診斷疾病的發(fā)生并檢測(cè)疾病的進(jìn)展，特別是在不同的階段檢測(cè)并標(biāo)記疾病。本發(fā)明使得能夠以改進(jìn)的方式并在疾病的早期階段預(yù)測(cè)和診斷腎臟疾病，并使得能更敏感地檢測(cè)腎臟中的病理學(xué)改變。事實(shí)上，依照本發(fā)明的生物標(biāo)記物在生物學(xué)樣品中是容易地被檢測(cè)的，特別在血液和/或在尿中，它們的水平與腎臟疾病/損傷的程度始終關(guān)聯(lián)，且它們的水平改變。此外，評(píng)估也應(yīng)包含以下事實(shí)這些標(biāo)記物適合于在動(dòng)物模型或在I期臨床試驗(yàn)中評(píng)估腎毒性。換句話說，它們適合于評(píng)估臨床前的和臨床的腎毒性，即，也在藥物研發(fā)的非常早期階段，意即在動(dòng)物模型中或在I期臨床試驗(yàn)中。一般而言，生物標(biāo)記物是有價(jià)值的工具，因?yàn)樗軌驅(qū)煞N或多種生物學(xué)狀態(tài)彼此區(qū)別開，作為正常生物學(xué)過程、致病過程的指示劑，或作為對(duì)藥物介入的反應(yīng)。代謝產(chǎn)物是小分子化合物(< IkDa)，比大多數(shù)蛋白、DNA和其他大分子小。蛋白活性的小改變引起生物化學(xué)反應(yīng)的大改變，并且它們的代謝產(chǎn)物(=代謝的生物標(biāo)記物，看身體的代謝)，其濃度，流動(dòng)和運(yùn)輸機(jī)制是對(duì)疾病和藥物介入敏感的。這使得能夠得到生理學(xué)和病理生理學(xué)物質(zhì)的個(gè)體曲線，其反映遺傳學(xué)和環(huán)境因素例如營(yíng)養(yǎng)、體力活動(dòng)、腸微生物(gut microbal) 及藥物治療。因此，代謝的生物標(biāo)記物比例如其為生物標(biāo)記物但不是代謝的生物標(biāo)記物的蛋白或激素給出更廣泛的信息?？紤]到這些問題，在此使用的術(shù)語代謝的生物標(biāo)記物被定義為適合作為腎臟疾病的狀態(tài)，特別是CKD的指示劑的化合物，其為在哺乳動(dòng)物身體里的代謝過程期間出現(xiàn)的代謝產(chǎn)物或代謝化合物。術(shù)語代謝的生物標(biāo)記物也將包含關(guān)于酶反應(yīng)的產(chǎn)物/底物比。依照本發(fā)明測(cè)量的代謝的生物標(biāo)記物(組)有義務(wù)包含以下類別的代謝產(chǎn)物 (即，被分析物)至少兩種氨基酸、至少兩種?；舛緣A和至少兩種生物源的胺。這些類別的定義為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，然而，優(yōu)選的這些類別的成員概述于以下表1-3中。此夕卜，生物源的胺被理解為一組天然產(chǎn)生的通過天然氨基酸的酶的脫羧基衍生的生物學(xué)活性化合物。生物源的物質(zhì)是通過生命過程提供的物質(zhì)，且所述生物源的胺包含胺基團(tuán)。它們的大多數(shù)作為神經(jīng)遞質(zhì)，但在調(diào)節(jié)例如血壓和體溫方面也有一些活性。已令人驚異地發(fā)現(xiàn)測(cè)量一組包含這些類別的代謝產(chǎn)物的生物標(biāo)記物使得能以改進(jìn)的方式并在疾病的早期階段預(yù)測(cè)并診斷腎臟疾病。特別是，這使得能對(duì)腎臟中病理學(xué)改變進(jìn)行更敏感的檢測(cè)。如果該組的一個(gè)類別的代謝產(chǎn)物或如果其數(shù)量增加則腎臟疾病的評(píng)估變得較少敏感且較少可靠。這特別適用于疾病的早期階段，所述疾病依照已知方法使用已知所有生物標(biāo)記物不能可靠地被檢測(cè)。事實(shí)上，同時(shí)測(cè)量至少兩種氨基酸、至少兩種酰基肉毒堿和至少兩種生物源的胺使得能夠更可靠地診斷腎臟疾病，并且特別是CKD和DN，已經(jīng)處于階段1-3但也處于階段4和5。此種事實(shí)既未在先有技術(shù)中被描述，也不能從先有技術(shù)中明顯得到。優(yōu)選地，生物標(biāo)記物組還包含關(guān)于酶反應(yīng)的產(chǎn)物/底物的比，更優(yōu)選，SDMA/精氨酸比，瓜氨酸/精氨酸比，鳥氨酸/精氨酸比和/或蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比(參照，所附的圖)。SDMA/精氨酸比涉及酶蛋白精氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)，瓜氨酸/精氨酸比涉及一氧化氮合酶(N0Q，鳥氨酸/精氨酸比涉及精氨酸，且蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比涉及通過活性氧物質(zhì)(R0Q的氧化。此外通過測(cè)量這些比，依照本發(fā)明的生物標(biāo)記物組和方法的診斷性能可被進(jìn)一步改進(jìn)。更優(yōu)選地，依照本發(fā)明的生物標(biāo)記物組還包含一種或多種選自以下的代謝產(chǎn)物 多胺、磷酸卵磷脂、還原的單糖和寡糖(糖)、鞘磷脂、類花生酸、膽汁酸和能量代謝中間產(chǎn)物。這些類別的優(yōu)選的實(shí)例在以下表4-9中給出。此外，通過額外測(cè)量這些類別的代謝產(chǎn)物，依照本發(fā)明的生物標(biāo)記物組和方法的診斷性能可被進(jìn)一步改進(jìn)。特別優(yōu)選的生物標(biāo)記物組為以下的類別其中氨基酸選自Cit，Phe, Asn, Trp, His, Orn, Tyr, Met, Ala, Arg, Thr, Lys, Gin, Ser, Val, Glu 和 Pro，?；舛緣A選自 CO, C5-DC (C6-0H)，C5:1-DC, C8, C9, ClO，C10:l, C14:l 禾口 C18:1，生物源的胺選自 MetSO，肌酸酐，SDMA，ADMA，總DMA和血清素，且比選自SDMA/精氨酸比、鳥氨酸/精氨酸比，和/或蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比。如上所述，待評(píng)估的疾病是腎臟疾病。優(yōu)選地其為慢性腎臟疾病(CKD)，更優(yōu)選地為糖尿病腎病(DN)。
所述生物學(xué)樣品得自哺乳動(dòng)物，優(yōu)選得自小鼠、大鼠、豚鼠、狗、迷你豬或人。生物學(xué)樣品優(yōu)選為血液或尿樣品，然而，使得能進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)量的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他生物學(xué)樣品也是合適的。因此，依照本發(fā)明的方法為體外方法。為測(cè)量生物學(xué)樣品中的代謝產(chǎn)物的濃度，使用定量分析的方法例如色譜、光譜和質(zhì)譜，而質(zhì)譜是特別優(yōu)選的。 色譜可包含GC，LC, HPLC和UPLC ；光譜可包含UV/Vis，IR和NMR ；質(zhì)譜可包含ESI-QqQ， ESI-QqTOF, MALDI-QqQ, MALDI-QqTOF 和 MALDI-TOF-TOF。優(yōu)選的是使用 FIA-和 HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜。這些分析方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。為測(cè)量代謝產(chǎn)物量，靶向的代謝組學(xué)被用于定量生物學(xué)樣品中的代謝產(chǎn)物，包括分析物級(jí)別的氨基酸、生物源的胺、多胺、?；舛緣A、磷酸卵磷脂、還原的單糖和寡糖、鞘磷脂、類花生酸、膽汁酸和能量代謝中間產(chǎn)物。低于能量代謝中間產(chǎn)物應(yīng)理解磷酸化的糖， 單價(jià)、二價(jià)和三價(jià)有機(jī)酸，和核苷酸。然而，依照本發(fā)明有必要的是在測(cè)量的代謝產(chǎn)物中至少分析物級(jí)別的氨基酸、?；舛緣A和生物源的胺被包括。在存在同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物時(shí)進(jìn)行定量并通過上述方法測(cè)定。適合作為依照本發(fā)明待測(cè)的代謝產(chǎn)物的包括分析物的縮寫 (BC碼)的分析物的列表在以下表格中被表示。表1:氨基酸(μΜ)
權(quán)利要求
1.用于評(píng)估腎臟疾病的代謝的生物標(biāo)記物組，其中所述生物標(biāo)記物組包含至少兩種氨基酸，至少兩種?；舛緣A和至少兩種生物源的胺。
2.權(quán)利要求1的生物標(biāo)記物組，所述生物標(biāo)記物組還包含關(guān)于酶反應(yīng)的產(chǎn)物/底物的比，優(yōu)選地，SDMA/精氨酸比，瓜氨酸/精氨酸比，鳥氨酸/精氨酸比和/或蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比。
3.權(quán)利要求1和/或權(quán)利要求2的生物標(biāo)記物組，其中所述氨基酸選自表1，所述?；舛緣A選自表2，且所述生物源的胺選自表3，如說明書中分別指出的。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的生物標(biāo)記物組，所述生物標(biāo)記物組還包含一種或多種選自以下的代謝產(chǎn)物多胺、磷酸卵磷脂、還原的單糖和寡糖、鞘磷脂、類花生酸、膽汁酸，和磷酸化的糖，單價(jià)、二價(jià)、三價(jià)有機(jī)酸，和核苷酸。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的生物標(biāo)記物組，其中所述氨基酸選自Cit、Phe,Asn, Trp、 His、Orn, Tyr、Met、Ala、Arg、Thr, Lys、Gin、Ser, Val.Glu 和 Pro，所述酰基肉毒堿選自 CO、 C5-DC(C6-0H)、C5:1-DC、C8、C9、CIO、CIO: 1、C14:1 和 C18: 1，所述生物源的胺選自 MetSO、 肌酸酐、SDMA、ADMA、總DMA和血清素，且所述比選自SDMA/精氨酸比、瓜氨酸/精氨酸比、鳥氨酸/精氨酸比，和/或蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比。
6.包含至少兩種氨基酸，至少兩種?；舛緣A和至少兩種生物源的胺的代謝產(chǎn)物的組合作為用于評(píng)估腎臟疾病的生物標(biāo)記物組的用途。
7.一種用于評(píng)估哺乳動(dòng)物受試者中腎臟疾病的方法，所述方法包括從所述受試者獲得生物學(xué)樣品，優(yōu)選血液和/或尿，以及在所述生物學(xué)樣品中測(cè)量至少兩種氨基酸的量、至少兩種?；舛緣A的量和至少兩種生物源的胺的量。
8.權(quán)利要求7的方法，所述方法還包含在所述生物學(xué)樣品中測(cè)量關(guān)于酶反應(yīng)的產(chǎn)物/ 底物的比，優(yōu)選地為SDMA/精氨酸比，瓜氨酸/精氨酸比，鳥氨酸/精氨酸比和/或蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比。
9.權(quán)利要求7和/或權(quán)利要求8的方法，其中所述氨基酸選自表1，所述?；舛緣A選自表2，且所述生物源的胺選自表3，如說明書中分別指出的。
10.權(quán)利要求7至9中任一項(xiàng)的方法，所述方法還包括在所述生物學(xué)樣品中測(cè)量一種或多種選自多胺、磷酸卵磷脂、還原的單糖和寡糖、鞘磷脂、類花生酸、膽汁酸，和能量代謝中間體的代謝產(chǎn)物的量。
11.權(quán)利要求7-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述氨基酸選自Cit、Phe,Asn, Trp、His、 Orn, Tyr、Met、Ala、Arg、Thr, Lys、Gin、Ser, Val、Glu 和 Pro，所述?；舛緣A選自 CO、 C5-DC(C6-0H)、C5:1-DC、C8、C9、C10、CIO: 1、C14:1 和 C18: 1，所述生物源的胺選自 MetSO， 肌酸酐、SDMA、ADMA、總DMA和血清素，且所述比選自SDMA/精氨酸比、瓜氨酸/精氨酸比、鳥氨酸/精氨酸比，和/或蛋氨酸亞砜/蛋氨酸比。
12.權(quán)利要求7-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述測(cè)量為基于定量分析方法，優(yōu)選色譜、光譜和質(zhì)譜。
13.權(quán)利要求12的方法，其中色譜包括GC、LC、HPLC和UPLC；光譜包括UV/Vis、IR和匪R ；且質(zhì)譜包括 ESI-QqQ、ESI-QqTOF, MALDI-QqQ, MALDI-QqTOF 和 MALDI-T0F-T0F。
14.權(quán)利要求7-13中任一項(xiàng)的方法，其中所述腎臟疾病為慢性腎臟疾病(CKD)，優(yōu)選地為糖尿病腎病(DN)。
15.適用于實(shí)施權(quán)利要求7-14中任一項(xiàng)的方法的試劑盒，所述試劑盒包含設(shè)備，所述設(shè)備包含一個(gè)或多個(gè)孔和一個(gè)或多個(gè)用至少一種內(nèi)標(biāo)物浸漬的插入物。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于評(píng)估腎臟疾病的代謝的生物標(biāo)記物組，所述生物標(biāo)記物組包含至少兩種氨基酸，至少兩種?；舛緣A和至少兩種生物源的胺。而且，本發(fā)明涉及一種用于評(píng)估哺乳動(dòng)物受試者中腎臟疾病的方法以及適于實(shí)施所述方法的試劑盒，所述方法包括從所述受試者獲得生物學(xué)樣品，優(yōu)選血液和/或尿，以及測(cè)量所述生物學(xué)樣品中的至少兩種氨基酸的量、至少兩種?；舛緣A的量和至少兩種生物源的胺的量。通過使用依照本發(fā)明的特異的生物標(biāo)記物和方法，能夠更合適且可靠地評(píng)估腎臟疾病。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102460160SQ200980159664
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2009年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月2日
發(fā)明者烏瑞卡·倫丁, 克勞斯·溫伯格 申請(qǐng)人:比奧克拉泰斯生命科學(xué)股份公司