免疫層析試紙條、便攜式檢測儀及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于定量檢測黃曲霉毒素M1的免疫層析試紙條，包括樣品結(jié)合區(qū)和檢測線，該樣品結(jié)合區(qū)噴涂有量子點標記的黃曲霉毒素M1單克隆抗體，該檢測線包被有黃曲霉毒素M1抗原/半抗原?載體蛋白偶聯(lián)物。該量子點標記的黃曲霉毒素M1單克隆抗體的發(fā)光波長為520~650 nm，其中每個量子點至多偶聯(lián)有2個黃曲霉毒素M1單克隆抗體。本發(fā)明還提供了一便攜式檢測儀，包括光源模塊和顯示模塊，配合該免疫層析試紙條定量檢測黃曲霉毒素M1。此外，本發(fā)明進一步提供了一種使用該免疫層析試紙條和該便攜式檢測儀定量檢測黃曲霉毒素M1的方法。
【專利說明】
免疫層析試紙條、便攜式檢測儀及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及食品檢測領(lǐng)域，具體涉及一種以優(yōu)選材料為基礎(chǔ)，利用量子點熒光免 疫層析快速定量檢測黃曲霉毒素Ml的免疫層析試紙條、便攜式檢測儀及檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃曲霉毒素是由某些霉菌(如黃曲霉和寄生曲霉)代謝產(chǎn)生的一組化學結(jié)構(gòu)類似、 致毒基團相同的化合物，經(jīng)常在儲存方式不當?shù)幕ㄉ?、玉米、水稻、小麥、高粱、葵花籽、?果、棉花種子等大宗商品中發(fā)現(xiàn)。目前已分離鑒定出20余種黃曲霉毒素，其中，主要有黃曲 霉毒素81、82、61、62及由81和82在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物[、]?2等。黃曲霉毒素 B1和Ml都是致癌致畸致突變的有毒化合物，主要危害肝臟、腎臟等部位，同時具有免疫毒 性，降低免疫能力，對人類健康造成危害。被黃曲霉污染的食品通常包括兩種，其一是被黃 曲霉毒素(主要為B1)污染的植物性食物，其二是經(jīng)由飼料被黃曲霉毒素(主要為Ml)污染的 乳或乳制品（如奶酪、奶粉等）。為了維護人類健康，多個國家和地區(qū)都對食品中黃曲霉毒素 的含量做了嚴格限量要求。
[0003] 乳制品作為嬰幼兒食物的主要來源，在我國的消費量逐年升高，其質(zhì)量安全問題 經(jīng)常會引起社會的廣泛關(guān)注。我國在《食品安全國家標準一一食品中真菌毒素限量KGB 2761-2011)中規(guī)定，在乳及乳制品及特殊膳食用食品（如各類嬰兒配方食品）中黃曲霉毒素 Ml的含量不得超過0.5 yg/kg。歐盟的相關(guān)標準更加嚴格地規(guī)定乳及乳制品中黃曲霉毒素 Ml的含量不得超過0.05yg/kg，嬰兒配方食品中黃曲霉毒素Ml的含量不得超過0.025yg/kg。 黃曲霉毒素Ml的檢測方法主要有色譜法、免疫化學法、電化學方法、化學發(fā)光及各種方法之 間的聯(lián)用。然而，常規(guī)的儀器分析方法存在樣品前處理復雜、儀器設(shè)備昂貴、檢測時間長等 問題，不能滿足在現(xiàn)場對樣品進行快速檢測的要求。中國專利201410079913.7和中國專利 201520275946.9基于免疫層析（immunochromatography)技術(shù)，分別利用包埋有焚光染料 的熒光微球和膠體金標記黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，制備檢測黃曲霉毒素Ml的免疫層析試 紙條。與傳統(tǒng)檢測方法相比，這兩種免疫層析試紙條具有操作簡單、檢測時間較短等特點。 但是，這些方法仍然存在一定的不足。前者采用基于傳統(tǒng)有機熒光染料的熒光微球作為熒 光探針，傳統(tǒng)有機熒光染料發(fā)光壽命較短，穩(wěn)定性欠佳，容易出現(xiàn)光漂白現(xiàn)象，另外使用該 試紙條進行檢測的過程中需要加熱樣品，操作較為繁瑣，增加了檢測大量樣品時所需的工 作量;后者采用膠體金顆粒作為吸收探針，膠體金顆粒粒徑均一性差，免疫標記物不穩(wěn)定， 靈密度相對較低。更重要的是，現(xiàn)有技術(shù)只能進行定性檢測，無法在實驗室和生產(chǎn)現(xiàn)場快速 的檢測乳和乳制品等中的黃曲霉毒素Ml的含量，難以直接判斷相關(guān)產(chǎn)品是否達到了相關(guān)食 品安全標準。
[0004] 量子點（quantum dots，QDs)又被稱為半導體納米晶，通常由II-VI族及III-V 族元素組成，具有尺寸可調(diào)、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、斯托克位移較大等特點。量子點摩爾 吸光系數(shù)和熒光量子產(chǎn)率較高，可以產(chǎn)生較強的熒光信號，提高了檢測的靈敏度。同時，量 子點光化學穩(wěn)定性好、耐光漂白性能佳，提高了檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。綜上所述，量子點是一 種理想的熒光探針材料，在基于免疫層析技術(shù)的檢測領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢和廣泛的應用前 景?，F(xiàn)階段，用作熒光探針的量子點主要有單核量子點（CdSe，CdTe，CdS)和核殼式量子 點（CdSe/ZnS，CdSe/ZnSe)，可以基于有機物與無極金屬化合物或有機金屬化合物之間的 高溫裂解反應在非極性有機溶劑中制備。在有機體系中合成得到的量子點具有幾乎完美的 晶體結(jié)構(gòu)、良好的單分散性、較強的光穩(wěn)定性和較高的熒光產(chǎn)率，但是常規(guī)合成方法中使用 的三丁基膦、三辛基膦等有機膦化合物劇毒、易燃、不穩(wěn)定、易爆炸、價格昂貴，并且對操作 環(huán)境有較高的要求，限制了量子點產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)及應用。此外，在制備量子點熒光探針 的過程中，量子點與相應的抗體分子的偶聯(lián)產(chǎn)物存在均一性和分散性較差、易于發(fā)生團聚、 發(fā)光效率較低、發(fā)射光譜半峰寬過寬等問題，影響了相關(guān)產(chǎn)品的檢測性能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，利用免疫層析技術(shù)和量子點材料，提供了一種 快速定量檢測黃曲霉毒素Ml的免疫層析試紙條、便攜式檢測儀及檢測方法。
[0006] 本發(fā)明提供了一種用于定量檢測黃曲霉毒素Ml的免疫層析試紙條，包括樣品結(jié)合 區(qū)和檢測線。該樣品結(jié)合區(qū)噴涂有量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，該檢測線包被 有黃曲霉毒素Ml抗原/半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物。該量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體 中的每個量子點最多偶聯(lián)有2個黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，該量子點標記的黃曲霉毒素Ml 單克隆抗體的發(fā)光波長為520~650 nm〇
[0007] 優(yōu)選地，該檢測線包被有黃曲霉毒素Ml半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物 進一步地，該免疫層析試紙條還包括質(zhì)控線，該質(zhì)控線包被有羊抗鼠抗體。
[0008]優(yōu)選地，本發(fā)明中所使用的量子點為水溶性量子點，該水溶性量子點的直徑為30~ 60 nm〇
[0009]進一步地，本發(fā)明中所使用的水溶性量子點先經(jīng)油相合成再經(jīng)水相轉(zhuǎn)移制得。該 油相合成步驟采用無膦法制備油溶性量子點。該水相轉(zhuǎn)移步驟中采用兩親性高分子包覆該 油溶性量子點。該兩親性高分子與該油溶性量子點之間的相互作用力為非共價鍵作用。 [00 10] 優(yōu)選地，該油溶性量子點的直徑為10~30 nm，該油溶性量子點為CdS、CdSe、CdTe、 ZnS、ZnSe、CdSe/ZnS、CdSe/CdS、CdSe/CdS/ZnS、ZnSe/ZnS、ZnSe/CdSe/ZnS、CuInS 2/ZnS、 CuInZnxS2+x/ZnS、CdxZm-xSe/ZnS、CdS/ZnSe、ZnSe/CdSe/ZnS、CdTe/CdSe 中的一種或幾種的 組合。
[0011] 優(yōu)選地，該兩親性高分子包括聚馬來酸酐十六醇酯。
[0012] 在一優(yōu)選實施方式中，該免疫層析試紙條的檢測下限為0.05 ng/mL，定量檢測范 圍為0.05~1.0 ng/mL。
[0013] 優(yōu)選地，該免疫層析試紙條還包括二維碼，該二維碼記載免疫層析試紙條信息和 檢測項目數(shù)據(jù)。
[0014] 本發(fā)明還提供了一便攜式檢測儀，配合所述免疫層析試紙條定量檢測黃曲霉毒素 Ml。該便攜式檢測儀包括光源模塊和顯不模塊。該光源模塊產(chǎn)生的光的波長為360~485 nm， 用于激發(fā)該免疫層析試紙條的量子點發(fā)光;該顯示模塊定量顯示被測樣品中黃曲霉毒素Ml 的濃度。
[0015] 本發(fā)明進一步提供了一種使用所述免疫層析試紙條定量檢測黃曲霉毒素Ml的方 法，包括以下步驟： 提供一便攜式檢測儀； 處理樣品； 將所述處理后的樣品滴加在該免疫層析試紙條上； 將所述加有處理后的樣品的免疫層析試紙條插入該便攜式檢測儀;以及 用該便攜式檢測儀定量檢測黃曲霉毒素Ml的濃度。
[0016] 進一步地，該樣品為奶制品。對于脂肪度大于5%的液態(tài)奶制品，通過離心去除上層 脂肪層后，取下層液體進行檢測;對于脂肪度小于5%的液態(tài)奶制品，直接取樣進行檢測。對 于固態(tài)奶制品，先將該固態(tài)奶制品按比例溶于蒸餾水配置為液體奶制品，混勻后根據(jù)其脂 肪度進行處理及檢測。
[0017] 本發(fā)明通過對免疫層析試紙條所采用的量子點及量子點標記的黃曲霉毒素Ml單 克隆抗體的結(jié)構(gòu)和性能進行嚴格控制，該檢測卡能夠在常溫下對黃曲霉毒素Ml進行快速、 靈敏、準確的定量檢測，在較大的濃度區(qū)間內(nèi)具有線性關(guān)系，檢測結(jié)果的穩(wěn)定性高，定量檢 測結(jié)果的偏差小于15%，檢測靈敏度可以達到0.05 ng/mL，滿足了國內(nèi)外相關(guān)食品安全標準 對樣品中黃曲霉毒素Ml含量的檢測需求。
【附圖說明】
[0018] 圖1為第一實施方式中免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0019]圖2為第一實施方式中合成量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的不意圖。 [0020]圖3為另一實施方式中免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021]圖4為一具體實施例中使用免疫層析試紙條檢測黃曲霉毒素Ml的標準曲線。
[0022]應當指出的是，上述附圖不是按比例繪制的，并且附圖中相似結(jié)構(gòu)或功能的組件 出于說明的目的通常由相同的標號代表。還應當指出的是附圖僅是為了便于優(yōu)選實施例的 描述。附圖未表明所描述實施例的每一方面，也不限制本發(fā)明的范圍。
[0023]主要元件符號說明


【具體實施方式】
[0024] 請參閱圖1，本發(fā)明的第一實施方式提供了一種用于定量檢測黃曲霉毒素Ml的免 疫層析試紙條100。該免疫層析試紙條100包括底襯50,加樣區(qū)10、樣品結(jié)合區(qū)20、層析膜32、 吸水區(qū)40被按順序粘貼在底襯50上。該加樣區(qū)10具有加樣孔12。該加樣區(qū)10的始端與該底 襯50的始端對齊，該吸水區(qū)40的末端與該底襯50的末端對齊，該樣品結(jié)合區(qū)20的末端與該 層析膜32的始端相連，該層析膜32的末端與該吸水區(qū)40相連。該層析膜32上具有條帶狀的 檢測線34和質(zhì)控線36,垂直于該免疫層析試紙條100較長的兩邊。該檢測線34包被有黃曲霉 毒素Ml抗原/半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物，位于靠近樣品結(jié)合區(qū)20的一端；該質(zhì)控線36位于遠 離樣品結(jié)合區(qū)20的一端。
[0025] 在一實施例中，該樣品結(jié)合區(qū)20為玻璃纖維膜，該層析膜32為硝基纖維素，該檢測 線34包被有黃曲霉毒素Ml半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，該質(zhì)控線36包被有羊抗鼠抗體，該 吸水區(qū)40為吸水紙，該底襯50為PVC底板。
[0026]為實現(xiàn)對黃曲霉毒素Ml的定量檢測，該樣品結(jié)合區(qū)20噴涂有量子點標記的黃曲霉 毒素Ml單克隆抗體22,其中每個量子點表面至多偶聯(lián)有2個黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，發(fā)射 波長為520~630 nm。如圖2所示，該量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體22是由包覆有兩 親性高分子的水溶性量子點26與黃曲霉毒素Ml單克隆抗體24通過偶聯(lián)（bioconjugation) 反應制得的。該水溶性量子點26的直徑為30~60 nm。具體地，該水溶性量子點26的制備包括 油相合成和水相轉(zhuǎn)移兩個步驟，即通過油相合成制備油溶性量子點27及通過水相轉(zhuǎn)移將兩 親性高分子28包覆在該油溶性量子點27表面。
[0027]其中，該油溶性量子點27選自 CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、CdSe/ZnS、CdSe/CdS、 CdSe/CdS/ZnS、ZnSe/ZnS、ZnSe/CdSe/ZnS、CuInS2/ZnS、CuInZnxS2+x/ZnS、CdxZm- xSe/ZnS、 CdS/ZnSe、ZnSe/CdSe/ZnS、CdT e/CdSe中的一種或幾種的組合。該油溶性量子點27是采用無 膦法（phosphine-free synthesis)制備的具有核殼結(jié)構(gòu)的量子點，其直徑為10~30 nm， 發(fā)光波長為520~650 nm。通過控制反應時間得到所需粒徑及發(fā)射波長的量子點。
[0028]其中，該兩親性高分子28的疏水端通過疏水作用力、范德華力或氫鍵等非共價鍵 作用與該油溶性量子點27表面的疏水基團相互作用，包覆在該油溶性量子點27的表面，得 到該水溶性量子點26。通過進一步控制該兩親性高分子28的分子量及水相轉(zhuǎn)移反應的條 件，所制備的該水溶性量子點26的粒徑為30~60nm。在一實施例中，該兩親性高分子28為聚 馬來酸十六醇酯。
[0029]其中，該兩親性高分子28的親水端具有可與該黃曲霉毒素Ml單克隆抗體24形成共 價鍵或分子間特異性相互作用的基團，通過偶聯(lián)反應制備該量子點標記的黃曲霉毒素Ml單 克隆抗體22。該偶聯(lián)反應既可以是利用化學交聯(lián)劑實現(xiàn)的共價鍵偶聯(lián)，也可以利用分子間 特異性相互作用(或分子識別，molecular recognition)實現(xiàn)的非共價健偶聯(lián)。在本發(fā)明 的一實施例中，該偶聯(lián)反應采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺（EDC)和N-羥基硫 代琥珀酰亞胺（Sulfo-NHS)作為交聯(lián)劑，其一般步驟為:將該水溶性量子點26與EDC和NHS 在緩沖液中混合均勻后，向其中加入一定量的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體，反應一定時間后， 加入1%牛血清白蛋白或水解乳清蛋白溶液封閉，通過反復離心、洗滌對產(chǎn)物進行純化。通 過控制各反應物之間的摩爾比、添加/混合方式、反應溫度、反應時間等使該量子點標記的 黃曲霉毒素Ml單克隆抗體22中的每個量子點上至多偶聯(lián)有2個抗體。利用瓊脂糖凝膠電泳 對所制備的量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體22進行表征，觀察其在瓊脂糖凝膠中的 位移和迀移速率，得到該水溶性量子點26偶聯(lián)的該黃曲霉毒素Ml單克隆抗體24的數(shù)量。
[0030] 該量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體22的光吸收值、焚光值、及焚光回收率 可通過連續(xù)波長多功能酶標儀進行檢測。此外，該方法利用樣品溶液的吸光值實現(xiàn)了對樣 品中量子點的濃度的定量控制。在一具體實施例中，將10此樣品加入240 yL緩沖液稀釋25 倍，混勻后，取樣l〇〇yL稀釋后的樣品溶液加入酶標板孔中，進行復孔測試。利用終點法在 400nm波長處單點掃描檢測稀釋后的樣品溶液的吸收值。對復孔數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值，然后以 吸收值為2.0為標準對樣品進行定容。之后，將1 yL樣品加入399 yL的緩沖液稀釋400倍?；?勻后，取150 yL稀釋后的樣品溶液加入酶標板孔中，進行復孔測試。在365 nm的激發(fā)波長下 連續(xù)掃描610 nm-650 nm范圍內(nèi)的熒光值，對復孔數(shù)據(jù)結(jié)果取平均值，再還原至原倍（用400 乘以該平均值)得到偶聯(lián)后該量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體22的熒光值。將偶聯(lián) 產(chǎn)物的該熒光值除以采用相同檢測方法所得的偶聯(lián)前水溶性量子點26的熒光值，得到熒光 回收率。
[0031] 在一優(yōu)選實施例中，對具有相同光吸收值的不同批次的量子點標記的黃曲霉毒素 Ml單克隆抗體22的熒光值和熒光回收率進行檢測。下表示出的檢測結(jié)果表明，本發(fā)明提供 的實施方式能夠?qū)⑴悸?lián)反應后量子點的熒光損失降到30%之內(nèi)。
[0032] 進一步地，本發(fā)明所提供的免疫層析試紙條還可以具有二維碼。請參閱圖3,在另 一實施方式中，免疫層析試紙條200包括二維碼210、免疫層析檢測區(qū)230和外殼220。其中， 該二維碼210被設(shè)置于外殼220的表面，該免疫層析檢測區(qū)230被設(shè)置于該外殼220的內(nèi)部。 該二維碼210記載有檢測項目數(shù)據(jù)，包括該檢測卡的名稱信息、檢測項目、生產(chǎn)批號、質(zhì)控區(qū) 最低有效亮度、標準曲線方程、保質(zhì)期等。更重要的是，該二維碼210所記載的檢測項目數(shù)據(jù) 包括該檢測項目所對應的一種或多種檢測模式，及每種檢測模式所需的檢測等待時間。該 免疫層析檢測區(qū)230的結(jié)構(gòu)如上文中免疫分析試紙條110基本相同，此處不再贅述。將該免 疫層析檢測區(qū)230裝入具有二維碼210的外殼220中。
[0033]本發(fā)明的第二實施方式提供了一便攜式檢測儀，配合前面所述的免疫層析試紙條 實現(xiàn)對黃曲霉毒素Ml的定量檢測。該便攜式檢測儀包括光源模塊、顯示模塊和供電模塊。其 中，該光源模塊能夠發(fā)射波長為360-485 nm的紫外光或藍光，該顯示模塊能夠直接顯示被 測樣品中黃曲霉毒素Ml的濃度，該供電模塊為220V電源或機內(nèi)安裝的低電壓鋰電池。該顯 示模塊所顯示的樣品中黃曲霉毒素Ml的濃度由公式1計算得出： Y = (A-D)/{1+(X/C)B} + D 公式 1 其中，A、B、C、D為四個擬合參數(shù)，X為黃曲霉毒素Ml的濃度，Y為被同一光源激發(fā)時檢測 區(qū)（T)和質(zhì)控區(qū)（C)檢測得到的發(fā)光強度的比值(T/C比）。
[0034] 為配合上述免疫層析試紙條200的使用，在另一實施方式中，該便攜式檢測儀進一 步包括讀碼模塊。該讀碼模塊能夠讀取該免疫層析試紙條200中該二維碼210所記載的檢測 項目數(shù)據(jù)。將加有樣品的該免疫層析試紙條200插入該便攜式檢測儀進行檢測時，該攜式檢 測儀首先讀取該二維碼210記載的檢測項目數(shù)據(jù)，判斷所使用的檢測卡是否過期、檢測卡所 對應的生產(chǎn)批次是否合格、被測標的物的類型及能夠準確檢測的被測標的物的濃度范圍 (線性范圍）等信息。若讀取的檢測項目數(shù)據(jù)均滿足相應條件，該便攜式檢測儀根據(jù)該二維 碼210記載的檢測項目數(shù)據(jù)確定檢測等待時間，在相應時刻用光源激發(fā)該免疫層析試紙條 200中的量子點發(fā)光，處理和分析該免疫層析試紙條200產(chǎn)生的光信號，顯示檢測結(jié)果，即黃 曲霉毒素Ml的濃度。
[0035] 本發(fā)明的第三實施方式提供了一種使用上述免疫層析試紙條100定量檢測樣品中 黃曲霉毒素Ml的方法，包括： 提供一便攜式檢測儀。該便攜式檢測儀同第二實施方式所述，此處不再贅述。
[0036]準備樣品14。在一【具體實施方式】中，該樣品14為奶制品，需根據(jù)該奶制品的特征選 擇不同樣品處理方式。如果該樣品14為液態(tài)奶制品，對于脂肪度大于5%的液態(tài)奶制品，將其 在4°C下用6 000 rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，去除上層脂肪層后，取下層液體待檢;對于脂肪度 小于5%的液態(tài)奶制品，可直接用于檢測。如果該樣品14為固態(tài)奶制品，如奶粉等，將固態(tài)奶 制品按1:8的比例溶于蒸餾水配置為液體奶，即向1 g的奶粉中加入8 g的蒸餾水，混勻后參 照液態(tài)奶制品的相關(guān)方法對樣品進行處理。
[0037]在一【具體實施方式】中，檢測前先將該免疫層析試紙條100置于室溫環(huán)境。待其平衡 至室溫后，檢查該免疫層析試紙條100的外包裝是否完好，確認其完好后打開包裝袋取出該 免疫層析試紙條100。同時，提前開啟該便攜式檢測儀，預熱光源。將該樣品14按上述方法處 理后，用移液器取80 yL處理后的該樣品14緩慢地垂直滴入該免疫層析試紙條100的該加樣 孔12。然后，將該免疫層析試紙條100插入該便攜式檢測儀對該樣品14中黃曲霉毒素Ml的濃 度進行定量檢測。
[0038]在另一實施方式中，提供了一種使用具有上述二維碼210的免疫層析試紙條200， 配合具有讀碼模塊的便攜式檢測儀定量檢測樣品中黃曲霉毒素Ml的方法。在一實施例中， 將處理后的樣品滴入該免疫層析試紙條200的加樣孔后，立即將該免疫層析試紙條200插入 該便攜式檢測儀并選擇"標準檢測"模式;該便攜式檢測儀讀取該二維碼210記載的檢測項 目數(shù)據(jù)后，進入倒計時狀態(tài)，在預先設(shè)置的等待時間后進行檢測并給出被測樣品中黃曲霉 毒素Ml的濃度。在另一實施例中，將處理后的樣品滴入該免疫層析試紙條200的加樣孔后， 將該免疫層析試紙條200室溫靜置15分鐘后，再將該免疫層析試紙條200插入該便攜式檢測 儀并選擇"快速檢測"模式;該便攜式檢測儀讀取該二維碼210記載的檢測項目數(shù)據(jù)后直接 開始進行檢測并給出被測樣品中黃曲霉毒素Ml的濃度。
[0039]在一具體實施例中，使用本發(fā)明所揭露的免疫層析試紙條100和便攜式檢測儀，依 照本發(fā)明的樣品處理和檢測方法，檢測一組不同濃度的標準樣品。請參閱圖4，x軸為黃曲霉 毒素Ml的濃度，y軸為檢測時免疫層析試紙條100上檢測線34(T)上的熒光強度與質(zhì)控線36 (C)上的熒光強度的比值(T/C值）。通過Logistic四參數(shù)曲線模型擬合得到定量檢測黃曲霉 毒素Ml的標準曲線方程:y = (7.02+0.34) / {l + (x/0.14)Q·84} - 0.34 (即擬合后公式1 中的△=7.02，13=0.84，〇=0.14,0=0.34)。在0.05 1^/1111^~11^/1111^的濃度范圍內(nèi)，該擬合曲 線的相關(guān)系數(shù)r的平方(r2)為0.993,說明本發(fā)明所揭露的免疫層析試紙條在該濃度范圍內(nèi) 具有非常好的線性關(guān)系，檢測靈敏度可以達到0.05 ng/mL，能夠滿足國內(nèi)外所有相關(guān)食品 安全標準對樣品中黃曲霉毒素Ml含量的檢測要求。
[0040] 本發(fā)明實現(xiàn)了在生產(chǎn)現(xiàn)場、實驗室或檢測機構(gòu)快速準確地定量檢測乳、乳制品及 相關(guān)膳食用食品中黃曲霉毒素Ml的含量。本發(fā)明通過控制量子點標記黃曲霉毒素Ml單克隆 抗體的偶聯(lián)產(chǎn)物的性質(zhì)，提高了量子點-抗體偶聯(lián)物的分散性，避免了量子點-抗體偶聯(lián)物 團聚的發(fā)生，從而提高了免疫試紙條產(chǎn)品的穩(wěn)定性和靈敏性。
[0041] 此外，本發(fā)明簡化了基于量子點探針的免疫層析試紙條檢測卡的制備工藝，特別 是在合成量子點的過程中避免了毒性較高、對反應條件要求苛刻的有機膦類化合物的使 用，減輕了對環(huán)境的污染及對相關(guān)實驗人員的潛在危害。本發(fā)明還對檢測卡所采用的量子 點及量子點標記的黃曲霉毒素Ml單克隆抗體的結(jié)構(gòu)和性能進行了嚴格的控制，得到了具有 高發(fā)光強度、高量子產(chǎn)率、穩(wěn)定分散的量子點探針，從而提高了檢測黃曲霉毒素Ml的靈敏 度、準確度、適用范圍及檢測結(jié)果的可重復性和可信度。
[0042]本發(fā)明方法無需對乳及乳制品產(chǎn)品進行復雜的預處理，并通過便攜式檢測儀讀取 檢測卡上的二維碼所記載的檢測項目數(shù)據(jù)對檢測卡及被檢樣品進行一系列預判和信息錄 入，減輕了檢測人員的工作量，簡化了檢測過程，提高了檢測速度，適用于大批量樣品的快 速定量檢測。
[0043]本發(fā)明公開了一種快速、靈敏、定量檢測黃曲霉毒素Ml的免疫層析試紙條、便攜式 檢測儀及檢測方法。應當理解的是，所述實施方式并不限于已揭露的具體形式或方法，相反 地，本發(fā)明將涵蓋本發(fā)明原理范圍內(nèi)的所有更改、替代和改變方式。
【主權(quán)項】
1. 一種用于定量檢測黃曲霉毒素 Ml的免疫層析試紙條，包括樣品結(jié)合區(qū)和檢測線，所 述樣品結(jié)合區(qū)噴涂有量子點標記的黃曲霉毒素 Ml單克隆抗體，所述檢測線包被有黃曲霉毒 素 Ml抗原/半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物； 所述量子點標記的黃曲霉毒素 Ml單克隆抗體中的每個量子點最多偶聯(lián)有2個黃曲霉毒 素 Ml單克隆抗體，所述量子點標記的黃曲霉毒素 Ml單克隆抗體的發(fā)光波長為520~650 nm。2. 如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，還包括質(zhì)控線，所述檢測線包被 有黃曲霉毒素 Ml半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠抗體。3. 如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述量子點為水溶性量子點，所 述水溶性量子點的直徑為30~60 nm〇4. 如權(quán)利要求3所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述水溶性量子點先經(jīng)油相合成 再經(jīng)水相轉(zhuǎn)移制得;所述油相合成步驟采用無膦法制備油溶性量子點，所述水相轉(zhuǎn)移步驟 中采用兩親性高分子包覆所述油溶性量子點;所述兩親性高分子與所述油溶性量子點之間 的相互作用力為非共價鍵作用。5. 如權(quán)利要求4所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述油溶性量子點的直徑為10~ 30 nm，所述油溶性量子點為CdS、CdSe、CdTe、ZnS、ZnSe、CdSe/ZnS、CdSe/CdS、CdSe/CdS/ ZnS、ZnSe/ZnS、ZnSe/CdSe/ZnS、CuInS2/ZnS、CuInZnxS2+x/ZnS、CdxZm- xSe/ZnS、CdS/ZnSe、 ZnSe/CdSe/ZnS、CdTe/CdSe中的一種或幾種的組合;所述兩親性高分子包括聚馬來酸酐十 六醇酯。6. 如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述免疫層析試紙條的檢測下限 為0.05 ng/mL，定量檢測范圍為0.05~1.0 ng/mL。7. 如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條，其特征在于，所述免疫層析試紙條包括二維 碼，所述二維碼記載免疫層析試紙條信息和檢測項目數(shù)據(jù)。8. -便攜式檢測儀，配合如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條定量檢測黃曲霉毒素 Ml， 包括光源模塊和顯不模塊，所述光源模塊產(chǎn)生的光的波長為360~485 nm，用于激發(fā)所述免 疫層析試紙條的量子點發(fā)光，所述顯示模塊定量顯示被測樣品中黃曲霉毒素 Ml的濃度。9. 一種使用如權(quán)利要求1所述的免疫層析試紙條定量檢測黃曲霉毒素 Ml的方法，包括 以下步驟： 提供一便攜式檢測儀； 處理樣品； 將所述處理后的樣品滴加在所述免疫層析試紙條上； 將所述加有處理后的樣品的免疫層析試紙條插入所述便攜式檢測儀；以及 用所述便攜式檢測儀定量檢測黃曲霉毒素 Ml的濃度。10. 如權(quán)利要求9所述的定量檢測黃曲霉毒素 Ml的方法，其特征在于，所述樣品為奶制 品，對于脂肪度大于5%的液態(tài)奶制品，通過離心去除上層脂肪層后，取下層液體進行檢測； 對于脂肪度小于5%的液態(tài)奶制品，直接取樣進行檢測;對于固態(tài)奶制品，先將該固態(tài)奶制品 按比例溶于蒸餾水配置為液體奶制品，混勻后根據(jù)其脂肪度進行處理及檢測。
【文檔編號】G01N33/577GK105866416SQ201610329041
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月18日
【發(fā)明人】柴向東, 袁航, 李林松
【申請人】深圳市正海生物科技有限公司