一種寡核苷酸文庫修飾的顆粒及其制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理，具體地說是一種寡核苷酸文庫修飾的顆粒及其在 蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物樣品內(nèi)蛋白質(zhì)的組成極其復(fù)雜，而且動(dòng)態(tài)范圍比較寬，濃度差異大(豐度差異 大)，比如血楽樣品中如10種1?豐度蛋白質(zhì)含量占到總蛋白質(zhì)含量的90%，如22種蛋白質(zhì)占 到99%，余下幾千種蛋白卻僅占到1%，高豐度蛋白質(zhì)的存在會(huì)掩蓋低豐度蛋白質(zhì)，從而干擾 對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的鑒定，而這些低豐度蛋白質(zhì)往往存在潛在的生物學(xué)意義，在疾病標(biāo)志物 的發(fā)現(xiàn)與治療方面可能會(huì)發(fā)揮重要生物功能a Proteome Res.，2011，10, 5 - 16)。因此在 蛋白質(zhì)樣品分析過程中需要降低其中高豐度蛋白質(zhì)的豐度差別，縮小這種差異以方便用現(xiàn) 有的檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到低豐度蛋白質(zhì)成為蛋白質(zhì)樣品預(yù)處理的核心問題之一。
[0003] 目前發(fā)展的去除高豐度蛋白質(zhì)的技術(shù)方法主要包括染料配體法、超速離心過濾 法、免疫去除法及預(yù)分級(jí)技術(shù)。染料配體法是將汽巴藍(lán)F3GA及其衍生物固定在聚甲基丙 烯酸縮水甘油酯顆粒表面，通過染料跟白蛋白的相互作用去除人血清白蛋白（Journal of Chromatography B，2006, 832, 216-223)。該方法樣品的處理量大，但特異性較差。超速離 心過濾法主要通過選擇具有不同截留分子量的膜實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離，并去除某些分子量較 大的高豐度蛋白質(zhì)（Molecular & Cellular Proteomics, 2003, 2, 1096 - 1103)。然而高豐 度蛋白質(zhì)并非都是大分子量的蛋白質(zhì)，因此會(huì)存在對(duì)高豐度蛋白質(zhì)去除不充分，而且可能 會(huì)同時(shí)去除高分子量的低豐度蛋白質(zhì)等問題。與前兩種去除方法相比，免疫去除法的特異 性很高（Mol Cell Proteomics2008, 7, 1963-1973; J Proteome Res2010, 9, 4982-4991; J Proteome Res.，2007, 6, 947-954)。然而，該方法仍存在很多不足，如，低豐度蛋白質(zhì)易與 部分高豐度蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合，產(chǎn)生共去除現(xiàn)象（Electrophoresis2010, 31，471-482) ;已發(fā)現(xiàn)的抗體種類少（20種）；處理樣品的體積有限；去除后的樣品被稀釋；不同蛋白質(zhì) 去除效率有一定差異性等。近期，人們還通過采用液相等電聚焦和多維液相色譜等方法進(jìn) 行樣品的預(yù)分級(jí)，有效地降低了樣品的復(fù)雜程度（J. ProteomeRes.，2009, 8, 1143 - 1155;E lectrophoresis, 2009, 30:249-261;Electrophoresis, 2010, 31, 3580 - 3585;J. Proteome Res. , 2009, 8, 1143 - 1155; J. Proteome Res. , 2010, 9, 1902-1912)。但是液相等電聚焦方法 只能根據(jù)已有的等電點(diǎn)膜將樣品按照有限的等電點(diǎn)區(qū)間進(jìn)行分級(jí)。因此，高豐度蛋白質(zhì)所 在級(jí)分仍存在對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的掩蓋問題。而多維液相色譜方法不僅操作繁瑣、運(yùn)行時(shí)間 長，而且也難以避免去除高豐度蛋白質(zhì)的同時(shí)造成低豐度蛋白質(zhì)的共洗脫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對(duì)以上方法目前存在的不足，本發(fā)明提供一種簡便高效的蛋白質(zhì)樣品處理方法 以降低蛋白質(zhì)樣品中高豐度蛋白質(zhì)的豐度。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] 采用寡核苷酸文庫修飾的顆粒處理蛋白質(zhì)樣品，并依次采用氯化鈉溶液，甘氨酸 溶液，尿素溶液及十二烷基磺酸鈉溶液分別對(duì)顆粒上的蛋白質(zhì)進(jìn)行洗脫，以降低蛋白質(zhì)樣 品中高豐度蛋白質(zhì)的豐度，縮小蛋白質(zhì)樣品內(nèi)高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)的豐度差異。
[0007] 所述寡核苷酸文庫修飾的顆粒的制備與蛋白質(zhì)樣品處理的具體步驟如下，
[0008] (1)寡核苷酸文庫的修飾：
[0009] a.磁性基質(zhì)顆粒：將寡核苷酸文庫溶液與磁性顆粒以0. 2-10nmol/mg的比例在三 羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液（Tris-HCl)中室溫條件下反應(yīng)0. 5-12h。
[0010] b.聚丙烯酸酯基質(zhì)材料：將寡核苷酸文庫溶液與功能化的聚丙烯酸酯基質(zhì)材料 以0. 5-250nmol/mg的比例在磷酸緩沖溶液中室溫條件下反應(yīng)6-24h。
[0011] C.金顆粒：將寡核苷酸文庫溶液與金顆粒以摩爾數(shù)為50:1的比例在水溶液中室 溫條件下反應(yīng)6-24h。
[0012] (2)蛋白質(zhì)樣品的處理：采用（1)制備的顆粒與蛋白質(zhì)樣品在I-KTC條件下孵育 0.5-10h〇
[0013] (3)蛋白質(zhì)洗脫：將顆粒去除上清液后，采用Tris-HCl緩沖溶液洗滌，去除上清 液。順序采用氯化鈉溶液（NaCl)，甘氨酸溶液（Gly-HCl)，尿素溶液(含有乙二胺四乙酸鈉） 和十二烷基磺酸鈉溶液(含有二硫蘇糖醇）分別洗滌，并收集洗滌后的溶液。
[0014] (4)蛋白質(zhì)酶解
[0015] 將上述洗脫液與原始血清蛋白質(zhì)樣品分別進(jìn)行胰酶酶解。具體過程如下：將樣品 變性后加入二硫蘇糖醇反應(yīng)I. 5h，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的還原過程，再按加入碘乙酰胺溶液，避光條 件下反應(yīng)40min對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行烷基化，最后加入與蛋白質(zhì)質(zhì)量比為25:1_50:1的膜蛋白酶， 37°C進(jìn)行酶解反應(yīng)16h。
[0016] (5)反相液質(zhì)聯(lián)用分析與數(shù)據(jù)處理
[0017] 將上述蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行反相液質(zhì)（RPLC-MS/MS)分析。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用Mascot 檢索。
[0018] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0019] (1)本發(fā)明制備的寡核苷酸文庫修飾的顆粒與四種洗脫試劑的應(yīng)用能夠有效降低 樣品中高豐度蛋白質(zhì)的豐度，從而縮小蛋白質(zhì)樣品內(nèi)高豐度蛋白質(zhì)與低豐度蛋白質(zhì)的豐度 差異；（2)制備的顆粒穩(wěn)定，制備方法與樣品處理結(jié)果重現(xiàn)性好，；（3)樣品處理方法耗費(fèi) 少，操作簡便，通過使用磁鐵或離心操作便能實(shí)現(xiàn)，不需要液相色譜、電泳儀等儀器輔助，且 無需使用抗體柱等。
【附圖說明】
[0020] 圖1寡核苷酸文庫鍵合前后紫外吸收結(jié)果；
[0021] 圖2血漿蛋白質(zhì)樣品中前十種高豐度蛋白質(zhì)豐度變化結(jié)果。前十種高豐度蛋 白質(zhì)分別為：1，白蛋白（Albumin) ;2，α-2-巨球蛋白質(zhì)（Alpha-2-m