利用微滴式數(shù)字化pcr檢測外周血游離線粒體dna含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用微滴式數(shù)字化PCR技術(shù)建立檢測外周血游離線粒體DNA含量 的方法及其試劑盒，以及上述方法或上述的試劑盒在檢測外周血游離線粒體DNA含量中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在對外周血的分子診斷研究中，認(rèn)為外周血循環(huán)的核酸成分可成為反映疾 病狀態(tài)較好的指標(biāo)。外周血循環(huán)DNA主要包含核DNA和線粒體DNA(mtDNA)。不同于 核DNA，mtDNA來自于細(xì)胞線粒體，為環(huán)狀雙鏈、多拷貝的DNA，且具有致炎作用。因此， 檢測外周血游離mtDNA含量可能有助于監(jiān)測疾病，如腫瘤、創(chuàng)傷、慢性炎癥等。目前用 于檢測外周血游離線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)含量的方法主要是利用實(shí) 時焚光定量 PCR(quantitativereal_time PCR，qPCR)的絕對定量法（Ajaz S, Czajka A,Malik A:Accurate measurement of circulating mitochondrial DNA content from human blood samples using real-time quantitative PCR. Methods in molecular biology (Clifton, NJ 2015, 1264:117-131. h該法首先通過普通PCR擴(kuò)增線粒體基因組相 關(guān)基因，如ND1，C0X2基因等，將其克隆至質(zhì)粒載體，構(gòu)建含有線粒體基因的重組質(zhì)粒。經(jīng)過 濃度測定和計算后獲得質(zhì)粒的拷貝數(shù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，常用的濃度為10~10 sc〇pieS/iil。 在含量檢測中，DNA樣本與標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒同時進(jìn)行qPCR反應(yīng)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本mtDNA拷貝 數(shù)。然而，該方法在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在低拷貝數(shù)時準(zhǔn)確度下降，并且可能會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增， 從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。此外，目前的檢測方法在對樣本進(jìn)行分析前均需提取DNA，然而目 前商品化的DNA提取試劑盒均存在提取過程DNA的丟失情況，且得率不一，可能造成結(jié)果評 判上的差異。因此，迫切需要一種準(zhǔn)確性更高的檢測方法用于外周血DNA分子的診斷研究。
[0003] 微滴式數(shù)字化PCR (droplet digital PCR，ddPCR)是新一代的PCR技術(shù)，不同于傳 統(tǒng)的qPCR技術(shù)，其原理是通過形成油包水微滴，將PCR反應(yīng)分配至20000個微滴內(nèi)（nl/微 滴），進(jìn)行PCR反應(yīng)后，逐一對每個微滴進(jìn)行熒光信號的檢測，含有熒光信號的微滴判讀為 1，沒有熒光信號的微滴判讀為〇,根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例，計算得出靶 分子的起始拷貝數(shù)。因此，ddPCR無需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，可直接確定低至單拷貝待檢靶分子的 絕對數(shù)目。
[0004] 因此，ddPCR在稀有突變的檢測、基因拷貝數(shù)變異分析，以及基因表達(dá)分析等方面 的應(yīng)用中已顯示其優(yōu)勢。目前尚無關(guān)于利用ddPCR檢測mtDNA拷貝數(shù)方法的研究報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明涉及一種利用微滴式數(shù)字化PCR檢測外周血游離線粒體DNA含量的方法， 主要包括以下步驟：
[0006] 1)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：通過PCR擴(kuò)增MT-ND1基因，將MT-ND1PCR產(chǎn)物通過T-A克隆 至pMD?18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5 a .
[0007] 2)樣本制備：利用質(zhì)粒小提試劑盒提取E. coli DH5 a的重組質(zhì)粒，調(diào)整質(zhì)粒拷貝 數(shù)，并稀釋成1~l〇6copies/ y 1。
[0008] 3)提取血漿DNA和Exosome DNA :采集外周血至EDTA-NaJjt凝管，分離血漿。 將500 y 1血漿分為兩等分，其中250 y 1血漿采用磁珠法直接提取DNA，250 y 1首先分離 exosome，在exosome沉淀中加含有1U DNasel溶液中重懸并在37°C孵育lh以去除exosome 外的DNA。
[0009] 4)對血衆(zhòng)進(jìn)行預(yù)處理：取500 y 1血衆(zhòng)，1600g離心5min，上清轉(zhuǎn)至新1. 5ml EP管； 16000g離心5min，取上清過0. 22 y m -次性過濾器；取預(yù)處理的血漿按1:1比例依次加入 1~104copies/ y 1 MT-NDl-pMD18-T標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，混勻，混合樣本直接作為模板進(jìn)行DD-PCR 分析。
[0010] 5)利用ddPCR分析重組質(zhì)粒mtDNA拷貝數(shù)，包括設(shè)計引物和探針，利用重組質(zhì)粒、 血漿DNA、血漿exosome DNA以及經(jīng)處理或未處理的血漿作為模板，擴(kuò)增體系形成微滴后在 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增完畢后，將已完成PCR反應(yīng)的96孔板置于BIO-RAD DX200Droplet Reader進(jìn)行微滴讀取，利用QuanatSoft 1. 6軟件進(jìn)行分析。
[0011] 在一個實(shí)施方案中，所述方法步驟1中PCR擴(kuò)增MT-ND1基因的引物序列如下：前 向引物為 5' CAGCCGCTATTAAAGGITCG3'，反向引物為 5' AGAGTGCGTCATATGITGTTC 3'，擴(kuò)增片 段長度 1041bp[Homo sapiens mtDNA(GeneBank No. NC_012920)np3017-4057]〇
[0012] 在一個實(shí)施方案中，所述方法步驟2中質(zhì)粒拷貝數(shù)使用以下公式調(diào)整：
[0013] MffDNA (dal tons) = (pMD18-T vector + Insert) X 660 (dal tons/bp)= (2692bp+1041bp) X 660 (daltons/bp) = 2. 46 X 106 (daltons)；
[0014] CNDNA(copies / y 1) = CDNA (ng/ y 1) X 6. 02 X 1 014/MffDNA = C DNA(ng/ y 1) X 6. 02 X 1014/2. 46 X 106= C DNA(ng/ y 1) X 2. 45 X 108.
[0015] (CNdna:質(zhì)?？截悢?shù)；CDNA :質(zhì)粒DNA濃度；MffDNA:質(zhì)粒分子量）
[0016] 在一個實(shí)施方案中，所述方法步驟5中所用引物和探針如 下：F : CCCTAAAACCCGCCACATCT ;R:GAGCGATGGTGAGAGCTAAGGT ;探針： CCATCACCCTCTACATCACCGCCC，使用 BHQ1 作為淬滅基團(tuán)。
[0017] 在一個實(shí)施方案中，所述方法步驟5的擴(kuò)增體系中還包含空白對照和陰性對照， 其中空白對照為不含DNA模板的PCR體系，陰性對照為使用pMD-18-T質(zhì)粒作為模板。
[0018] 在一個實(shí)施方案中，所述方法步驟5生成微滴的步驟如下：
[0019] 1)將20 y 1體系加入微滴生成卡上Sample孔中，70 y 1的微滴生成油加入Oil孔 中，該過程避免氣泡產(chǎn)生和交叉污染，套上干凈的專用膠條；
[0020] 2)將微滴生成卡置于微滴生成器上，進(jìn)行微滴生成過程，在該過程中，Sample孔 中體系與微滴生成油在負(fù)壓的作用下，一并被混合至Droplet孔（微滴孔）以形成微滴；
[0021] 3)取出微滴生成卡，吸取40 iil微滴至干凈96孔板相應(yīng)的孔內(nèi)，蓋上專用鋁箱紙， 在180 °C按壓封口后，普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。
[0022] 本發(fā)明利用ddPCR技術(shù)的檢測原理，建立檢測mtDNA拷貝數(shù)的方法并應(yīng)用于外周 血游離mtDNA的分析。所述方法不僅具備優(yōu)于qPCR的高靈敏度、特異性和重復(fù)性的特點(diǎn)， 且其對干擾物（如抗凝劑等）耐受能力高于qPCR。此外，本發(fā)明在建立檢測方法的基礎(chǔ)上， 進(jìn)一步利用血漿樣本直接作為ddPCR的模板，進(jìn)行血漿mtDNA的分析，不僅消除由于提取所 帶來檢測不確定性，更加便于臨床檢驗(yàn)。
[0023] 附圖簡述
[0024] 圖1顯示了重組質(zhì)粒的qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中圖la為10~106copies/ y 1重組質(zhì) 粒的擴(kuò)增曲線，圖lb為標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0025] 圖2顯示了重組質(zhì)粒的ddPCR結(jié)果，其中圖2a為1~104copies/y 1重組質(zhì)粒 的ddPCR -維微滴圖，圖2b為血漿DNA、重組質(zhì)粒（102copies/ y 1)、空白對照、陰性對照的 ddPCR -維微滴圖；圖2c為qPCR和ddPCR的相關(guān)性分析結(jié)果。圖3顯示了 ddPCR檢測血 衆(zhòng) mtDNA 和 exosome mtDNA 的結(jié)果，其中圖 3a 為血衆(zhòng) mtDNA 和 exosome mtDNA 的 ddPCR - 維微滴圖；圖3b和圖3c為18例血漿mtDNA和exosome mtDNA拷貝數(shù)結(jié)果。
[0026] 圖4為血漿樣本ddPCR檢測結(jié)果，其中圖4a是血漿樣本的ddPCR -維微滴圖；圖 4b是血漿樣本陽性微滴數(shù)和總微滴數(shù)分布圖，P1~P6為樣本編號；圖4c是兩種血漿前處 理方法的結(jié)果比較
[0027] 圖5為各血漿樣本mtDNA拷貝數(shù)分析結(jié)果，灰色部分代表原血漿樣本的mtDNA拷 貝數(shù)，黑色部分代表加入的質(zhì)?？截悢?shù)。
[0028] 圖6為抗凝劑EDTA-NaJ# ddPCR的影響，其中圖6a為模板含量低的結(jié)果，圖6b為 模板含量高微滴飽和的情況。 具體實(shí)施方案
[0029] 實(shí)施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建和樣品制備
[0030] 1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0031] 首先，通過 PCR 擴(kuò)增 MT-ND1 基因，前向引物為 5' CAGCCGCTATTAAAGGITCG3'， 反向引物為 5'AGAGTGCGTCATATGITGTTC 3'。擴(kuò)增片段長度 1041bp[Homo sapiens mtDNA(GeneBank No. NC_012920)np3017-4057]〇
[0032] 1)配制PCR反應(yīng)體系
[0033]
[0034] 2) PCR反應(yīng)條件：
[0035]
[0036] 3)PCR產(chǎn)物電泳：配制1%瓊脂糖凝膠，于120V電壓下電泳20min
[0037] 將MT-ND1PCR產(chǎn)物通過T-A克隆至pMD?18-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coli DH5a .
[0038] 2?樣本制備
[0039] 2. 1重組質(zhì)粒
[0040] 利用質(zhì)粒小提試劑盒提取E. coli DH5 a的重組質(zhì)粒，根據(jù)以下公式調(diào)整質(zhì)粒拷貝 數(shù)，并稀釋成1~l〇6copies/ y 1。
[0041 ] MffDNA (dal tons) = (pMD18-T vector + Insert) X 660 (dal tons/bp)= (2692bp+1041bp) X 660 (daltons/bp) = 2. 46 X 106 (daltons)；
[0042] CNDNA(copies / y 1) = CDNA (ng/ y 1) X 6. 02 X 1 014/MffDNA = C DNA(ng/ y 1) X 6. 02 X 1014/2. 46 X 106= C DNA(ng/ y 1) X 2. 45 X 108.
[0043] (CNdna :質(zhì)?？截悢?shù)；CDNA :質(zhì)粒DNA濃度；MffDNA:質(zhì)粒分子量）
[0044] 2. 2 血衆(zhòng) DNA 和 Exosome DNA
[0045] 采集外周血至EDTA-Na2抗凝管，分離血漿。將500 yl血漿分為兩等分，其中 250 y 1血衆(zhòng)采用磁珠法直接提取DNA，250 y 1首先分離exosome，在exosome沉淀中加含有 1U DNasel溶液中重懸并在37°C孵育lh以去除exosome外的DNA。
[0046] 2. 3血漿預(yù)處理
[0047] 1)取500 y 1血衆(zhòng)，1600g離心5min，上清轉(zhuǎn)至新1. 5ml EP管；
[0048] 2) 16000g離心5min，取上清過0? 2