本發(fā)明屬于dna損傷體外檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體而言，本發(fā)明涉及煙堿致細(xì)胞dna損傷的體外定量分析方法。

背景技術(shù)：

煙堿是煙草制品和煙氣中的一種致癮性物質(zhì)，可以引起心血管疾病及生殖毒性。雖然目前人們一般認(rèn)為煙堿并不是一種致癌物，但是其可能是一種致癌增強(qiáng)劑。煙堿暴露大鼠的外周血細(xì)胞的微核化細(xì)胞顯著增多；體外實(shí)驗(yàn)表明煙堿可以通過氧化應(yīng)激方式導(dǎo)致dna鏈的斷裂。目前世界衛(wèi)生組織煙草控制框架公約(fctc)將煙堿列為煙氣優(yōu)先級(jí)管制污染物之一。此外，煙堿是n-亞硝基降煙堿等亞硝胺類物質(zhì)的前體物質(zhì)，其在體內(nèi)可能會(huì)轉(zhuǎn)化成具有致癌性的亞硝胺類物質(zhì)。所以，準(zhǔn)確檢測(cè)煙堿對(duì)細(xì)胞dna的損傷對(duì)于煙堿的遺傳毒性和危害性評(píng)價(jià)具有重要的意義。

dna雙鏈斷裂是dna最嚴(yán)重的一種損傷形式，如果這種損傷不能被正確或者及時(shí)修復(fù)就可能會(huì)導(dǎo)致染色體畸變或者細(xì)胞凋亡等。作為dna雙鏈斷裂的一種生物標(biāo)志物，磷酸化組蛋白γh2ax已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于臨床醫(yī)藥學(xué)、放射學(xué)及毒理學(xué)等研究方面。包括很多單體化合物和混合物通過γh2ax實(shí)驗(yàn)對(duì)其遺傳毒性進(jìn)行了測(cè)定和評(píng)價(jià)。例如，tanaka等利用γh2ax實(shí)驗(yàn)對(duì)卷煙煙氣冷凝物的遺傳毒性進(jìn)行了檢測(cè)和評(píng)價(jià)；smart等采用γh2ax實(shí)驗(yàn)對(duì)依托泊苷、米托蒽醌及甲基亞硝脲的dna雙鏈斷裂的劑量-效應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了研究。該實(shí)驗(yàn)因其靈敏性高、結(jié)合其他儀器檢測(cè)技術(shù)可以進(jìn)行大規(guī)模分析檢測(cè)，擁有其他遺傳毒性檢測(cè)技術(shù)并不具備的多種優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于化合物和有毒物質(zhì)的遺傳毒性篩選和評(píng)價(jià)。

目前對(duì)γh2ax進(jìn)行分析檢測(cè)的主要方法有流式細(xì)胞儀、elisa(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))、westernblot(蛋白質(zhì)印跡)、顯微鏡技術(shù)等。流式細(xì)胞儀和westernblot操作繁瑣，檢測(cè)前需要將貼壁細(xì)胞酶解成單細(xì)胞懸液，破壞了細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能完整性，且檢測(cè)通量較低。elisa不能提供細(xì)胞內(nèi)熒光焦點(diǎn)的分布情況且需要額外添加其他檢測(cè)蛋白對(duì)結(jié)果進(jìn)行校正，而顯微鏡技術(shù)的檢測(cè)通量低，且人為計(jì)數(shù)的誤差較大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種無需破壞細(xì)胞、簡(jiǎn)單、有效且靈敏度高的煙堿致dna損傷的定量分析方法，該方法的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確并且可視化，以克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。

本發(fā)明的目的通過將高內(nèi)涵技術(shù)和γh2ax的定量分析相結(jié)合而實(shí)現(xiàn)。具體而言，本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

一種基于高內(nèi)涵技術(shù)定量分析煙堿致細(xì)胞dna損傷的方法，所述方法包括以下步驟：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：將細(xì)胞接種在細(xì)胞培養(yǎng)液中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；

2)細(xì)胞染毒：吸棄所述細(xì)胞培養(yǎng)液，加入細(xì)胞染毒液繼續(xù)培養(yǎng)，所述細(xì)胞染毒液包含煙堿和細(xì)胞培養(yǎng)液；

3)免疫熒光標(biāo)記：吸棄所述細(xì)胞染毒液，進(jìn)行細(xì)胞中γh2ax的免疫熒光標(biāo)記與細(xì)胞核的dapi染色；

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量分析：分別進(jìn)行所述細(xì)胞的細(xì)胞核和γh2ax的熒光測(cè)定，以所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)檢測(cè)到的平均熒光強(qiáng)度來表征γh2ax的含量。

優(yōu)選地，所述步驟1)中，所述細(xì)胞為貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞；更優(yōu)選地，接種時(shí)，所述細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以單細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)液中；

更優(yōu)選地，細(xì)胞接種后將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)液中于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h。

優(yōu)選地，所述步驟2)中，所述細(xì)胞染毒液中煙堿的濃度為0-500μg/ml，優(yōu)選>0且≤500μg/ml，更優(yōu)選為15.63-500μg/ml；

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，所述細(xì)胞染毒液中煙堿的濃度可以是0、15.63、31.25、61.5、125、250或500μg/ml。

優(yōu)選地，在所述細(xì)胞染毒液中培養(yǎng)細(xì)胞1-24h、優(yōu)選24h。

優(yōu)選地，所述步驟3)包括：

3-1)吸棄所述細(xì)胞染毒液，洗滌細(xì)胞，加入多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定；

3-2)洗滌細(xì)胞，然后加入triton-100x以使細(xì)胞通透；

3-3)洗滌細(xì)胞，然后加入血清白蛋白封閉，之后加入一抗即抗γh2ax抗體進(jìn)行孵育；

3-4)洗滌細(xì)胞，然后加入免疫熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行孵育；

3-5)洗滌細(xì)胞，加入dapi進(jìn)行染色；

3-6)洗滌細(xì)胞，保存。

優(yōu)選地，所述步驟4)中，所述細(xì)胞的細(xì)胞核和γh2ax的熒光測(cè)定分別在兩組不同的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)下進(jìn)行；

優(yōu)選地，所述步驟3-4)中，免疫熒光標(biāo)記的二抗為alexafluor488標(biāo)記的二抗，并且所述步驟4)中，在通道一中以激發(fā)波長(zhǎng)358nm和發(fā)射波長(zhǎng)461nm進(jìn)行細(xì)胞核的熒光測(cè)定，在通道二中以激發(fā)波長(zhǎng)495nm和發(fā)射波長(zhǎng)519nm進(jìn)行γh2ax的熒光測(cè)定，以獲得通道一所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度，由此表征γh2ax的含量；

更優(yōu)選地，在兩個(gè)通道中，測(cè)量倍數(shù)為200倍，每孔分析和測(cè)定9個(gè)視野。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，步驟4)采用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)進(jìn)行，例如購(gòu)自thermoscientific的型號(hào)為arrayscanvti600的高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)。

任選地，本發(fā)明的方法還包括，設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對(duì)照組，從而在步驟4)中得到由非特異吸附引起的空白信號(hào)，由此從檢測(cè)到的熒光測(cè)定信號(hào)中扣除空白信號(hào)。

本發(fā)明的方法還可包括劑量-效應(yīng)曲線的繪制。即，通過在步驟2)中設(shè)置多種包含不同濃度的煙堿的細(xì)胞染毒液，進(jìn)行所述方法，最后根據(jù)γh2ax的平均熒光強(qiáng)度和煙堿的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

或者，本發(fā)明的方法還可包括時(shí)間-效應(yīng)曲線的繪制。即，通過在步驟2)中將細(xì)胞在包含相同濃度的煙堿的細(xì)胞染毒液中培養(yǎng)不同時(shí)間，進(jìn)行所述方法，最后根據(jù)γh2ax的平均熒光強(qiáng)度和培養(yǎng)時(shí)間繪制時(shí)間-效應(yīng)曲線。

根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方式，當(dāng)細(xì)胞為人肺癌細(xì)胞株a549時(shí)，可以如下進(jìn)行本發(fā)明的方法：

1)細(xì)胞培養(yǎng)：采用含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液于37℃、5％co2條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞株a549，當(dāng)細(xì)胞匯合率達(dá)到70-80％時(shí)，采用0.25％的胰蛋白酶進(jìn)行消化后獲得單細(xì)胞懸液，然后以每孔100μl濃度為10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的接種量接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液中于37℃，5％co2條件下培養(yǎng)24h。

2)細(xì)胞染毒：吸棄培養(yǎng)24h后的細(xì)胞培養(yǎng)液，加入細(xì)胞染毒液繼續(xù)培養(yǎng)，所述細(xì)胞染毒液為分別包含0、15.63、31.25、61.5、125、250、500μg/ml煙堿的步驟1)中的細(xì)胞培養(yǎng)液。濃度組至少設(shè)置兩組空白對(duì)照，空白對(duì)照組僅添加含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液，于37℃，5％co2的條件下培養(yǎng)24h。

3)免疫熒光標(biāo)記：

3-1)吸棄細(xì)胞染毒液，每孔加入100μlpbs(磷酸鹽緩沖液，ph7.2～7.4；全文同)洗滌細(xì)胞兩次，每次至少5min；然后每孔加入50μl4％的多聚甲醛溶液在室溫下固定15min；

3-2)固定好的細(xì)胞再用pbs洗滌兩次，每次至少5min；然后加入50μl0.5％的triton-100x溶液(在pbs中)于室溫下通透15min；

3-3)通透后的細(xì)胞再用pbs洗滌兩次，每次至少5min；然后每孔加入3％bsa封閉液(在pbs中)于37℃下封閉1h，之后加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液(1:200，v/v)，一組空白孔中僅加入50μl1％bsa作為陰性對(duì)照孔，另一組空白孔加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液作為空白對(duì)照孔，孵育條件為：37℃下恒溫孵育2h或者4℃過夜；

3-4)一抗孵育后的細(xì)胞再用pbs洗滌三次，每次至少5min；然后每孔加入50μlalexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；

3-5)二抗孵育后的細(xì)胞再用pbs洗滌三次，每次至少5min；然后加入50μl1μg/ml的dapi(在pbs中)在室溫下染核10min；

3-6)pbs洗滌三次后，每孔加入100μlpbs，4℃避光保存，待測(cè)。

4)高內(nèi)涵技術(shù)定量分析：通道一(細(xì)胞核熒光測(cè)定)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為358nm和461nm，通道二(目標(biāo)物γh2ax的熒光測(cè)定)設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為495nm和519nm，測(cè)量倍數(shù)為200，每孔分析和測(cè)定9個(gè)視野，以通道一所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所檢測(cè)的平均熒光強(qiáng)度表征γh2ax的含量。

5)數(shù)據(jù)處理：設(shè)置在步驟3-3)中沒有加入一抗、僅在步驟3-4)中加入二抗的空白對(duì)照組，在步驟4)中所檢測(cè)信號(hào)即為由非特異吸附引起的空白信號(hào)，從所有樣品測(cè)試孔的檢測(cè)信號(hào)中扣除空白信號(hào)；最后根據(jù)目標(biāo)物γh2ax的熒光強(qiáng)度和煙堿的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

參見圖1，本發(fā)明提供了一種基于高內(nèi)涵技術(shù)來定量分析煙堿致細(xì)胞dna損傷的方法，克服了現(xiàn)有煙堿體外染毒和dna損傷檢測(cè)方法的不足。具體而言，本發(fā)明提供了一種評(píng)估染毒毒物為煙堿時(shí)所導(dǎo)致的dna雙鏈斷裂情況的方法，其中磷酸化組蛋白γh2ax作為煙堿誘導(dǎo)的dna雙鏈斷裂的生物標(biāo)志物，并且采用高內(nèi)涵技術(shù)對(duì)γh2ax進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率和靈敏度。在本發(fā)明的方法中，細(xì)胞在暴露煙堿后，通過細(xì)胞免疫熒光染色γh2ax和高內(nèi)涵自動(dòng)成像與分析實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞樣本的直接、高通量檢測(cè)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的方法還具有如下優(yōu)良效果：

1)本發(fā)明的方法可以在細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行，例如96孔板，因此所需細(xì)胞量和樣品量少，可同時(shí)對(duì)96個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)通量更高；

2)檢測(cè)前無需破壞細(xì)胞，也無需酶解制備單細(xì)胞懸液或提取蛋白，所以樣本處理更為簡(jiǎn)單和快捷；

3)高內(nèi)涵技術(shù)具有高分辨率的成像獲取功能，因此γh2ax在細(xì)胞核內(nèi)的分布可直接觀測(cè)，且圖像資料也便于存儲(chǔ)以備再分析；

4)通過細(xì)胞核識(shí)別，可對(duì)每個(gè)細(xì)胞核內(nèi)熒光標(biāo)記的γh2ax進(jìn)行定量分析，所以檢測(cè)結(jié)果更為靈敏和準(zhǔn)確。

附圖說明

以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中：

圖1示出了本發(fā)明方法的流程圖。

圖2示出了煙堿誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生γh2ax的劑量-效應(yīng)曲線，其中細(xì)胞染毒液中沒有添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9。

圖3示出了煙堿誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生γh2ax的劑量-效應(yīng)曲線，其中細(xì)胞染毒液中添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9。

圖4示出了煙堿誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生γh2ax的時(shí)間-效應(yīng)曲線。

具體實(shí)施方式

以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的藥品原料、試劑材料等，如無特殊說明，均為市售購(gòu)買產(chǎn)品。

一抗：小鼠抗人γh2ax抗體，購(gòu)自biolegend，貨號(hào)613402；

使用時(shí)配制成溶液：取100μl小鼠抗人γh2ax抗體加入1％的bsa溶液中，1:200(v/v)稀釋，充分混勻。

二抗：alexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體，購(gòu)自武漢珈源量子點(diǎn)公司，貨號(hào)ym002；

使用時(shí)配制成溶液：取100μlalexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體加入pbs溶液中，1:200(v/v)稀釋，充分混勻。

大鼠肝s9溶液：購(gòu)自moltox，貨號(hào)11-101.1。

使用時(shí)配制成10％s9混合物：由4體積溶液a、60體積溶液b、16體積溶液c、10體積溶液d與10體積大鼠肝s9溶液混合而成，其中溶液a含有0.2mol/l的mgcl2和0.825mol/l的kcl；溶液b含有0.176mol/l的na2h2po4和0.024mol/l的nah2po4；溶液c含有0.025mol/l的nadp。溶液d含有0.05mol/l的葡萄糖-6-磷酸鹽；溶液a-d均采用去離子水配制。

高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)，購(gòu)自thermoscientific，型號(hào)arrayscanvti600。

實(shí)施例1

在細(xì)胞染毒液中沒有添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9時(shí)，測(cè)定煙堿暴露24h后誘導(dǎo)的γh2ax。

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的a549細(xì)胞，以每孔10000個(gè)細(xì)胞種植于96孔板，在含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液中于37℃，5％co2培養(yǎng)箱孵育24h。

吸棄培養(yǎng)24h后的細(xì)胞培養(yǎng)液，用分別含有0、15.63、31.25、62.5、125、250及500μg/ml煙堿的細(xì)胞培養(yǎng)液(同樣是含10％fbs和2mmol/ll-谷氨酰胺的rpmi-1640培養(yǎng)液)作為細(xì)胞染毒液，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24h。

染毒結(jié)束后吸棄細(xì)胞染毒液，每孔加入100μlpbs洗滌兩次，每次至少5min；然后每孔加入50μl4％的多聚甲醛溶液在室溫下固定15min；固定好的細(xì)胞用pbs緩沖液洗滌兩次，每次至少5min；然后每孔加入50μl0.5％的triton-100x溶液室溫下通透15min；通透后的細(xì)胞用pbs洗滌兩次，每次至少5min；然后每孔加入3％bsa封閉液(在pbs中)于37℃下封閉1h，之后每個(gè)樣品孔加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液(1:200，v/v)，一組空白孔中僅加入50μl1％bsa作為陰性對(duì)照孔，另一組空白孔加入50μl含有小鼠抗人γh2ax抗體溶液作為空白對(duì)照孔。孵育條件為：37℃下恒溫孵育2h或者4℃過夜；一抗孵育后的細(xì)胞用pbs洗滌三次，每次至少5min；然后每孔加入50μlalexafluro488標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體溶液(1:200，v/v)于37℃下避光孵育2h；二抗孵育后的細(xì)胞再用pbs洗滌三次，每次至少5min；然后每孔加入50μl1μg/ml的dapi(在pbs中)在室溫下避光染核10min；pbs洗滌三次后，每孔加入100μlpbs，4℃避光保存。

自動(dòng)聚焦后，設(shè)置高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)的通道一(細(xì)胞核熒光測(cè)定)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為358nm和461nm，設(shè)置通道二(目標(biāo)物γh2ax的熒光測(cè)定)的激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為495nm和519nm，測(cè)量倍數(shù)為200倍，每孔分析和測(cè)定9個(gè)視野，γh2ax以通道一所識(shí)別的有效細(xì)胞的有效細(xì)胞核內(nèi)通道二所測(cè)定的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)行表征。

試驗(yàn)中設(shè)置空白對(duì)照組，即沒有加入一抗，僅加入熒光標(biāo)記的二抗抗體，所檢測(cè)信號(hào)即為由非特異吸附引起的空白信號(hào)；所有樣品測(cè)試孔的檢測(cè)信號(hào)應(yīng)扣除空白信號(hào)；最后根據(jù)目標(biāo)物γh2ax的熒光強(qiáng)度和煙堿的濃度繪制劑量-效應(yīng)曲線。

圖2所示為不同濃度的煙堿在染毒24h后誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。由圖可知，隨著煙堿濃度的升高，a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax逐漸增多，呈現(xiàn)出顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)煙堿的濃度為500μg/ml時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的γh2ax超過正常組(即煙堿濃度為0時(shí))的1.5倍。

實(shí)施例2

在細(xì)胞染毒液中添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9時(shí)，測(cè)定煙堿暴露24h后誘導(dǎo)的γh2ax。

實(shí)驗(yàn)過程按照實(shí)施例1所述進(jìn)行，唯一的區(qū)別是，細(xì)胞染毒液除包含細(xì)胞培養(yǎng)液與煙堿之外，與10％s9混合物混合，使得細(xì)胞染毒液中含有1％s9混合物。

圖3所示為細(xì)胞染毒液中添加1％s9后，不同濃度的煙堿在染毒24h后誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax的劑量-效應(yīng)關(guān)系曲線。如圖可知，隨著染毒濃度的增大，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的γh2ax先下降后再升高。

細(xì)胞染毒液中添加s9可以增強(qiáng)煙堿在體外的代謝轉(zhuǎn)化，因此添加體外代謝活化系統(tǒng)s9可以避免體外測(cè)試中由于細(xì)胞代謝能力的不足而導(dǎo)致的測(cè)試結(jié)果為假陰性的可能。因此，通過添加和不添加s9可以更準(zhǔn)確地了解煙堿在體外對(duì)細(xì)胞dna損傷的誘導(dǎo)，并由此證明了本發(fā)明的方法是客觀、可用的。

實(shí)施例3

在細(xì)胞染毒液中沒有添加代謝活化系統(tǒng)大鼠肝s9時(shí)，測(cè)定500μg/ml煙堿分別暴露1、2、4、8、12和24h后誘導(dǎo)的γh2ax。

實(shí)驗(yàn)過程按照實(shí)施例1所述進(jìn)行，唯一的區(qū)別是，煙堿在細(xì)胞染毒液中的濃度固定在濃度500μg/ml，染毒時(shí)間分別為1、2、4、8、12和24h。

圖4所示為500μg/ml的煙堿在染毒1、2、4、8、12和24h后誘導(dǎo)a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系曲線。由圖可知，隨著染毒時(shí)間增加，a549細(xì)胞產(chǎn)生的γh2ax逐漸增多，呈現(xiàn)出顯著的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。

以上對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式的描述并不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明作出各種改變或變形，只要不脫離本發(fā)明的精神，均應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的范圍。