本發(fā)明是關(guān)于一種分選型流式細(xì)胞儀，涉及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

流式細(xì)胞分選儀是對直線流動狀態(tài)中的單列顆粒進(jìn)行多參數(shù)定性、定量分析和分選的方法，該方法具有高速、高通量、高活性、精準(zhǔn)從單顆粒水平檢測和分選樣本的特點(diǎn)。流式細(xì)胞分選儀的檢測參數(shù)包括散射光和熒光信號。散射光信號包括前向(fsc)和側(cè)向散射光信號(ssc)。前向散射光信號主要用于檢測樣本大小，側(cè)向散射光主要用于檢測樣本結(jié)構(gòu)。

普通流式細(xì)胞分選儀的前向散射光靈敏度和分辨率低，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于側(cè)向散射光的靈敏度和分辨率。靈敏度指前向散射光可檢測的最小顆粒樣本，分辨率指前向散射光可分辨的最小差異樣本。普通流式細(xì)胞分選儀前向散射光的靈敏度為0.5um，分辨率為0.1um，而樣本每減小1倍，產(chǎn)生的散射光強(qiáng)度會減少6倍，所以大大限制了流式細(xì)胞分選儀對直徑小于0.5um，差異小于0.1um小顆粒樣本的檢測和分選，這包括如人工納米粒子、微生物、胞外囊泡、細(xì)胞器等樣本。因此，設(shè)計具有高靈敏度、高分辨率的前向散射光檢測器，可擴(kuò)大現(xiàn)有流式細(xì)胞分選儀的應(yīng)用領(lǐng)域，實現(xiàn)流式細(xì)胞分選儀檢測和分選微小差異小顆粒樣本的目的。另外，在檢測直徑小于0.5um以下的小顆粒樣本時，普通流式細(xì)胞分選儀的液流系統(tǒng)存在以下問題：鞘液過濾系統(tǒng)只能去除鞘液中顆粒較大的雜質(zhì)。因為雜顆粒和小顆粒樣本的大小相當(dāng)，所以雜顆粒的前向散射光信號會掩蓋住小顆粒樣本的前向散射光信號，大大增加了激光檢測時無效顆粒數(shù)的比例，從而降低了檢測和分選的效率和準(zhǔn)確性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種高分辨率和高靈敏度的分選型流式細(xì)胞儀。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種分選型流式細(xì)胞儀，其特征在于，該流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)和分選系統(tǒng)；所述液流系統(tǒng)用于使得鞘液包裹樣本流進(jìn)行噴射；所述光路系統(tǒng)包括激光器系統(tǒng)、聚光鏡、針孔、準(zhǔn)直透鏡、濾光片、光電轉(zhuǎn)換器和擋光條，所述激光器系統(tǒng)發(fā)出的激光照射所述樣本流中的樣本產(chǎn)生散射光，與激光入射方向相同的所述樣本流的后方設(shè)置用于匯聚樣本前向散射光的所述聚光鏡，所述聚光鏡的像方焦點(diǎn)上設(shè)置所述針孔，聚焦后的前向散射光經(jīng)過所述針孔發(fā)射到所述準(zhǔn)直透鏡，經(jīng)所述準(zhǔn)直透鏡出射的平行光通過所述濾光片濾除雜散射光后發(fā)射到所述光電轉(zhuǎn)換器，所述光電轉(zhuǎn)換器用于將前向散射光轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒎糯蠛蟀l(fā)送到所述檢測分析系統(tǒng)，所述聚光鏡的正前方與激光入射光同平面的位置設(shè)置不透光的所述擋光條；所述分選系統(tǒng)用于對帶有電荷的所述樣本進(jìn)行分選。

進(jìn)一步地，所述液流系統(tǒng)包括正壓泵、鞘液桶、囊式過濾器組件、樣本管路、樣本管、噴嘴、廢液收集器、廢液桶和負(fù)壓泵；所述正壓泵通過氣路管連接所述鞘液桶的進(jìn)氣口，所述鞘液桶通過鞘液管路連接所述囊式過濾器組件，鞘液經(jīng)所述囊式過濾器組件過濾后并經(jīng)鞘液管路進(jìn)入所述噴嘴形成鞘液流；所述樣本管通過樣本管路連接所述噴嘴，所述樣本管內(nèi)的樣本經(jīng)樣本管路進(jìn)入所述噴嘴形成樣本流；所述鞘液流包裹樣本流一同從所述噴嘴處噴出，最后所述鞘液流包裹著樣本流經(jīng)所述廢液收集器流入所述廢液桶，所述廢液桶還通過廢液收集氣路管連接所述負(fù)壓泵。

進(jìn)一步地，所述囊式過濾器組件采用將0.22um囊式過濾器和0.1um囊式過濾器串聯(lián)，使所述鞘液依次經(jīng)過0.22um囊式過濾器過濾和0.1um囊式過濾器過濾。

進(jìn)一步地，所述分選系統(tǒng)包括超聲液流振蕩器、電壓偏轉(zhuǎn)板和分選收集管；所述超聲液流振蕩器固定設(shè)置在所述噴嘴上方，用于將鞘液流包裹樣本流振蕩斷裂成單個液滴，所述電壓偏轉(zhuǎn)板用于對帶有電荷的所述樣本進(jìn)行偏轉(zhuǎn)，分選后的所述樣本進(jìn)入所述分選收集管。

進(jìn)一步地，所述聚光鏡采用高倍數(shù)值孔徑的物鏡20×(0.45na)，用于收集小于30°范圍內(nèi)的前向散射光。

進(jìn)一步地，所述擋光條采用不透明黑色鋁制材料，所述擋光條的形狀為長方形，所述擋光條的長度與所述聚光鏡的直徑相同，所述擋光條的寬度為3～7mm。

進(jìn)一步地，所述激光器系統(tǒng)的激光器采用波長為405nm，激光功率為100mw，所述濾光片的中心波長與所述激光器波長相匹配，所述濾光片采用帶通濾光片。

進(jìn)一步地，所述光電轉(zhuǎn)換器采用具有放大功能的光電倍增管或雪崩光電二極管。

進(jìn)一步地，該分選型流式細(xì)胞儀還包括一設(shè)置在所述準(zhǔn)直透鏡后方的偏振光檢測元件。

進(jìn)一步地，所述噴嘴采用100um噴嘴，鞘液壓力為7psi，所述超聲液流振蕩器的液流振蕩頻率為19～20khz，上樣速度為5000個/秒。

本發(fā)明由于采取以上技術(shù)方案，其具有以下優(yōu)點(diǎn)：1、為了提高前向散射光的檢測靈敏度，需要盡可能多的去除來自鞘液的雜顆粒，本發(fā)明采用0.22um和0.1um串聯(lián)的囊式濾器，使鞘液流先后經(jīng)過0.22um和0.1um囊式濾器過濾，濾掉大部分來自鞘液的直徑大于0.1um的噪音顆粒，同時延長濾器的使用壽命，這樣可減少鞘液中噪音顆粒產(chǎn)生的前向散射光信號，減少激光檢測時無效顆粒數(shù)的比例，從而提高檢測和分選的效率和準(zhǔn)確性，提高前向散射光的檢測靈敏度，通過實驗證明本發(fā)明的靈敏度可以達(dá)到80nm，分辨率可以達(dá)到20nm。2、本發(fā)明僅僅通過前向散射光就可以檢測直徑小于0.5um小顆粒樣本，并對20nm差異的樣本進(jìn)行區(qū)分和分選，因此擴(kuò)大了流式細(xì)胞分選儀的應(yīng)用領(lǐng)域。3、本發(fā)明通過增大擋光條的遮擋角度，會進(jìn)一步減弱激光及衍射光環(huán)的噪音信號，從而達(dá)到提高信噪比的目的。4、在檢測直徑小于0.5um的小顆粒樣本時，本發(fā)明將前向散射光經(jīng)聚光鏡匯聚后，穿過針孔的全部前向散射光收集到光電轉(zhuǎn)換器，提高前向散射光的收集，從而提高前向散射光的檢測靈敏度和分辨率。本發(fā)明特別是對于無熒光標(biāo)記樣本的差異檢測和分選具有重要意義。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的分選型流式細(xì)胞儀的整體結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明的鞘液流和樣本流的管路連接示意圖；

圖3是本發(fā)明的光路系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明的前向散射光檢測聚苯乙烯材料微球的效果圖；

圖5是本發(fā)明的利用前向散射光分選聚苯乙烯材料微球前后的效果圖，其中，圖5a為分選前結(jié)果，圖5b和c為分選后結(jié)果。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖來對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描繪。然而應(yīng)當(dāng)理解，附圖的提供僅為了更好地理解本發(fā)明，它們不應(yīng)該理解成對本發(fā)明的限制。

如圖1～3所示，本發(fā)明提供的分選型流式細(xì)胞儀包括液流系統(tǒng)、光路系統(tǒng)、檢測分析系統(tǒng)和分選系統(tǒng)。其中，液流系統(tǒng)包括正壓泵1、氣路管2、鞘液桶3、囊式過濾器組件4、樣本管路5、樣本管6、鞘液管路7、噴嘴8、廢液收集器9、廢液收集管路10、廢液桶11、廢液收集氣路管12和負(fù)壓泵13；光路系統(tǒng)包括激光器系統(tǒng)14、聚光鏡15、針孔16、準(zhǔn)直透鏡17、濾光片18、光電轉(zhuǎn)換器19和擋光條20；檢測分析系統(tǒng)可以采用計算機(jī)21；分選系統(tǒng)包括超聲液流振蕩器22、電壓偏轉(zhuǎn)板23和分選收集管24。

正壓泵1通過氣路管2連接鞘液桶3的進(jìn)氣口，鞘液桶3用于盛放鞘液，鞘液桶3通過鞘液管路7連接囊式過濾器組件4，鞘液經(jīng)囊式過濾器組件4過濾后并經(jīng)鞘液管路7進(jìn)入噴嘴8形成鞘液流；樣本管6用于盛放樣本，樣本管6通過樣本管路5連接噴嘴8，樣本管6內(nèi)的樣本經(jīng)樣本管路5進(jìn)入噴嘴8形成樣本流；鞘液流包裹樣本流一同從噴嘴8處噴出，最后鞘液流包裹著樣本流進(jìn)入廢液收集器9經(jīng)廢液收集管路10流入廢液桶11，廢液桶11還通過廢液收集氣路管12連接負(fù)壓泵13。

激光器系統(tǒng)14發(fā)出的激光照射樣本流中的樣本產(chǎn)生散射光，與激光入射方向相同的散射光為前向散射光，與激光入射方向相同的樣本流的后方設(shè)置聚光鏡15，聚光鏡15用于匯聚樣本的前向散射光，調(diào)節(jié)樣本流的位置，使被測樣本位于聚光鏡15的物方焦點(diǎn)上，聚光鏡15的像方焦點(diǎn)上設(shè)置針孔16，針孔16用于去除物方焦點(diǎn)處以外的雜信號，聚焦后的前向散射光經(jīng)過針孔16后發(fā)射到準(zhǔn)直透鏡17，準(zhǔn)直透鏡17將發(fā)散的入射光準(zhǔn)直成平行光，經(jīng)準(zhǔn)直透鏡17出射的平行光通過濾光片18濾除激光的激發(fā)波長以外的雜散射光后發(fā)射到光電轉(zhuǎn)換器19，光電轉(zhuǎn)換器19用于將前向散射光轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘柌⒎糯蟀l(fā)送到計算機(jī)21，另外，在聚光鏡15的正前方并與激光入射光同平面的位置安裝不透光的擋光條20，黑色擋光條20用于阻止激光及其衍射光環(huán)入射到聚光鏡15中，防止造成掩蓋前向散射光信號的現(xiàn)象。

超聲液流振蕩器22固定設(shè)置在噴嘴8上方，用于將鞘液流包裹樣本流振蕩斷裂成單個液滴，電壓偏轉(zhuǎn)板23用于對帶有電荷的樣本進(jìn)行偏轉(zhuǎn)，分選后的樣本進(jìn)入分選收集管24。

在一個優(yōu)選的實施例中，如圖2所示，為了進(jìn)一步提高散射光檢測的靈敏度，去除來自鞘液的噪音信號，同時延長過濾器的使用壽命，本發(fā)明的囊式過濾器組件4采用將0.22um囊式過濾器41和0.1um囊式過濾器串聯(lián)42，使鞘液依次經(jīng)過0.22um囊式過濾器過濾41和0.1um囊式過濾器過濾42，濾掉大部分來自于鞘液的直徑大于0.1um的噪音顆粒。本發(fā)明通過采用兩個囊式過濾器使得鞘液噪音信號減少為平均400個/秒，雖然還有一定比例的噪音信號，但相對于平均5000個/秒以上的樣本速度，前向散射光的噪音水平較低。由此可見，本發(fā)明可將前向散射光檢測器的下限從檢測直徑0.2um的聚苯乙烯微球提高到0.1um左右。

在一個優(yōu)選的實施例中，對于直徑小于0.5um的小顆粒樣本，樣本的前向散射光趨向于大角度分布，并且檢測樣本越小，前向散射光分布越接近球狀，此外，小顆粒樣本自身產(chǎn)生的前向散射光強(qiáng)度較弱。所以，如果使用小角度收集范圍的聚光鏡，會導(dǎo)致收集的樣本前向散射光強(qiáng)度較弱，使小顆粒樣本的前向散射光信號淹沒在背景噪音信號中。為了提高前向散射光的檢測靈敏度和分辨率，需要增大聚光鏡15的收集角度，本發(fā)明的聚光鏡15采用高倍數(shù)值孔徑的物鏡為20×(0.45na)(0.45是指數(shù)值孔徑的數(shù)值)，可收集小于30°范圍內(nèi)的前向散射光，增強(qiáng)了小顆粒樣本前向散射光信號的強(qiáng)度，提高了小顆粒樣本前向散射光的檢測靈敏度和分辨率。

在一個優(yōu)選的實施例中，由于激光及其衍射光環(huán)噪音信號很強(qiáng)，所以即使很小比例的激光及其衍射光環(huán)噪音信號漏到聚光鏡15中也會造成信噪比降低，影響前向散射光的檢測分辨率。本申請在檢測直徑小于0.5um的小顆粒樣本時，采用增寬型的擋光條20用于增大擋光條的遮擋角度，擋光條20采用不透明黑色鋁制材料，形狀為長方形，長度與聚光鏡的直徑相同為2.5cm，寬度可以為3～7mm，能夠有效提高前向散射光檢測的信噪比，其中最優(yōu)的寬度為5mm，擋光條20的遮擋角度可以達(dá)到15°，即小于15°的光信號不被聚光鏡15接收，聚光鏡15只接收15°～30°范圍的前向散射光，從而提高前向散射光檢測的信噪比，進(jìn)一步提高前向散射光的分辨率。

在一個優(yōu)選的實施例中，由于較短波長的激發(fā)光可提高前向散射光的檢測分辨率，因此本發(fā)明的激光器系統(tǒng)14的激光器波長選用405nm，激光功率為100mw，濾光片18選擇帶通濾光片405±5nm，使光電轉(zhuǎn)換器19中只能接收405nm±5nm波長的前向散射光，去除其他波長的雜顆粒信號。

在一個優(yōu)選的實施例中，光電轉(zhuǎn)換器19可以采用具有放大功能的光電倍增管或雪崩光電二極管等，從而提高前向散射光的檢測靈敏度和分辨率，本實施例中采用的是光電倍增管。

在一個有限的實施例中，當(dāng)本發(fā)明的分選型流式細(xì)胞儀需要具備偏振檢測功能時，檢測樣本前向散射光的偏振性，可以在準(zhǔn)直透鏡17的后方設(shè)置用于偏振光檢測的元件，將原有的前向散射光分為垂直和水平兩個振動方向的前向散射光，再分別被兩個光電轉(zhuǎn)換器接收。

在一個優(yōu)選的實施例中，為了保證樣本分選時液流斷點(diǎn)的穩(wěn)定，低鞘液壓力需要使用較大的噴嘴。本發(fā)明實施例的噴嘴8采用100um噴嘴，鞘液壓力為7psi，超聲液流振蕩器22的液流振蕩頻率為19～20khz，上樣速度為5000個/秒，即單個樣本接受激光照射的時間約為0.2毫秒。

在一個優(yōu)選的實施例中，實驗前需要盡可能去除鞘液管路7和樣本管路5中的雜顆粒，首先采用75％乙醇高速沖洗鞘液管路7和樣本管路5約20分鐘，然后用滅菌后的超純水沖洗鞘液管路和樣本管路約30分鐘，最后加入0.1um孔徑濾膜過濾后新配置的鞘液。

在一個優(yōu)選的實施例中，在流式細(xì)胞分選儀分選時，為了給包裹樣本的鞘液滴加電，從而使包裹樣本的帶電鞘液滴在電場中發(fā)生偏轉(zhuǎn)，然后落入分選收集管24，所以本發(fā)明的鞘液采用最常用的磷酸鹽緩沖液，為了檢測小于0.5um的小顆粒樣本，實驗前鞘液要經(jīng)0.1um濾膜過濾，并現(xiàn)用現(xiàn)配，如果長時間放置，鞘液中會形成較大的顆粒物，增加噪音信號。

在一個優(yōu)選的實施例中，在檢測小于0.5um的小顆粒樣本時，為了每個小顆粒樣本被充分檢測，需要增加激光檢測每個小顆粒樣本的時間，所以選擇較低的鞘液壓力和樣本壓力，本發(fā)明設(shè)置的鞘液壓力7psi左右，樣本高于鞘液的壓力差一般不超過0.5psi。

綜上所述，本發(fā)明的分選型流式細(xì)胞儀大大提高了普通流式細(xì)胞分選儀前向散射光的檢測靈敏度和分辨率。前向散射光檢測最小可檢測直徑80nm的聚苯乙烯微球，并可利用前向散射光將直徑相差20nm的直徑130、150、170聚苯乙烯材料微球?qū)崿F(xiàn)了基線分離(圖4)。此外，還將混合的直徑130和150nm聚苯乙烯微球分選出來，分選純度達(dá)到90％以上，其中，圖5a為分選前結(jié)果，圖5b和c為分選后結(jié)果。

上述各實施例僅用于說明本發(fā)明，其中各光學(xué)元件可以采用常用的支架進(jìn)行支撐固定，且光學(xué)元件的位置等都是可以有所變化的，只要滿足本發(fā)明的光路傳播條件即可，另外，各部件的結(jié)構(gòu)、連接方式和制作工藝等都是可以有所變化的，凡是在本發(fā)明技術(shù)方案的基礎(chǔ)上進(jìn)行的等同變換和改進(jìn)，均不應(yīng)排除在本發(fā)明的保護(hù)范圍之外。