具有改善的血管生成特性的外周血干細(xì)胞及其用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)涉及其能力可通過(guò)被用于需要血管形成的疾病的細(xì)胞因子動(dòng)員的外周血 干細(xì)胞的體外引發(fā)過(guò)程增強(qiáng)的細(xì)胞以及使用相同細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞治療法主要使用都能組織再生的成體干細(xì)胞或祖細(xì)胞，并且所述方法的示例 包括試圖通過(guò)使用骨髓源干細(xì)胞再生血管和肌肉。然而，未充分了解適用于用作成體干細(xì) 胞成分的細(xì)胞和組織的再生的干細(xì)胞的選擇方法，并且因此在這種方法的實(shí)際使用中出現(xiàn) 了困難。
[0003] 盡管對(duì)細(xì)胞治療進(jìn)行不斷的研究，但是一直存在干細(xì)胞數(shù)目絕對(duì)不足、干細(xì)胞存 活率低等等問(wèn)題。因此，需要不斷的努力以使臨床應(yīng)用有效并使細(xì)胞治療效率最大化。
[0004] 研究實(shí)際上是在使用用于干細(xì)胞的藥物（它可以防止細(xì)胞死亡）中的進(jìn)展以盡可 能減少干細(xì)胞丟失、誘導(dǎo)干細(xì)胞分化成更適合于組織再生的其他類型的細(xì)胞等等。
[0005] 缺血是指特定組織的血液供應(yīng)不足的狀態(tài)，導(dǎo)致氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng)和有害代 謝物的去除不足，最終導(dǎo)致組織損傷。臨床代表性的疾病的示例包括缺血性心血管病。對(duì)于 這樣的心血管疾病的治療的示例包括冠狀動(dòng)脈血管成形術(shù)，然而，盡管支架技術(shù)不斷發(fā)展， 但是仍不足以恢復(fù)已經(jīng)受損的組織。
[0006] 因此，引人注目的治療是使用心臟肌肉再生干細(xì)胞。
[0007] 韓國(guó)未審查專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 2007-0054140涉及臍帶血產(chǎn)生的多能干細(xì)胞以及 用于治療缺血性壞死疾病的包含該干細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品，并且它提供了用于治療由動(dòng)脈 粥樣硬化動(dòng)脈疾病引起的缺血性壞死病的細(xì)胞治療產(chǎn)品。
[0008] 細(xì)胞治療產(chǎn)品的不斷發(fā)展是缺血性相關(guān)疾病的根治性治療所必需的。

【發(fā)明內(nèi)容】
技術(shù)問(wèn)題
[0009] 本申請(qǐng)旨在提供用于需要血管形成的疾病的細(xì)胞治療產(chǎn)品。 技術(shù)解決方案
[0010] 在一個(gè)方面，本申請(qǐng)涉及制備具有改善的血管形成特性的經(jīng)動(dòng)員的外周血干細(xì)胞 (mobPBSC)的方法，其中所述方法包括提供利用細(xì)胞因子處理的人外周血；從上述血中分 離出成層的單核細(xì)胞；以及利用促紅細(xì)胞生成素（ΕΡ0)或活化的血小板上清液（APS)處理 上述單核細(xì)胞。
[0011] 本申請(qǐng)的外周血干細(xì)胞是自體的、同種異體的或異種的細(xì)胞，并且其特別是自體 細(xì)胞。
[0012] 在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)還提供了具有改善的血管形成特性并由本申請(qǐng)的方法制備 的mobPBSC〇
[0013] 在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)還涉及具有改善的血管形成特性并由ΕΡ0或APS活化的 mobPBSCo
[0014] 在本申請(qǐng)中，利用EPO處理的細(xì)胞與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比較而言增加整合素β-1 和β-2的以及⑶14/⑶16的雙表達(dá)，并且增加通過(guò)ΕΡ0受體迀移的IL8、IL10和FGF基因 和蛋白質(zhì)的表達(dá)。此外，利用APS處理的細(xì)胞與未處理的細(xì)胞相比較而言增加IL9、IL17、 PDGF和VEGF的基因表達(dá)，增加ΕΡ0受體、〇)34、〇)31、1^2、〇乂〇?4、整合素€1-5、整合素0-1 和整合素β-2的表達(dá)以及增加⑶14/⑶16的雙重表達(dá)。
[0015] 本申請(qǐng)還提供了用于治療缺血性疾病并包含本申請(qǐng)的mobPBSC的組合物。所述組 合物可有效用于治療缺血性心臟疾病。缺血性心臟疾病的示例包括心肌梗塞、心絞痛、充血 性心臟衰竭、外周血管阻塞、心臟肥大、低心臟收縮、低心臟擴(kuò)張、適應(yīng)不良性心臟肥大、收 縮期心臟衰竭、舒張期心臟衰竭和高血壓性心臟衰竭。
[0016] 本申請(qǐng)的細(xì)胞具有改善的血管形成特性，并且它涉及旨在用于促進(jìn)血管形成并包 含mobPBSC的組合物。
[0017] 在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)還涉及治療缺血性疾病的方法，其包括向需要缺血性疾病 治療的受試者施用根據(jù)本申請(qǐng)制備的細(xì)胞或包含所述細(xì)胞的組合物。
[0018] 可使用本申請(qǐng)的治療的缺血性疾病如上文所述。 有益效果
[0019] 本申請(qǐng)的APS-或ΕΡ0-引發(fā)的mobPBSC誘導(dǎo)血管生成；因此，它們可用于需要促進(jìn) 血管形成的各種疾病（例如，發(fā)生在肌肉、腦、心臟、腎臟或大腸的缺血性疾?。?，其示例包 括由缺血造成的組織損傷、腦梗塞、中風(fēng)、再灌注損傷、心肌梗死、充血性心臟衰竭、外周血 管梗阻、心臟肥大、低心臟收縮、低心臟擴(kuò)張、適應(yīng)不良性心臟肥大、收縮期心臟衰竭、舒張 期心臟衰竭、高血壓性心臟衰竭、動(dòng)脈和二尖瓣疾病、心臟血管合并肺動(dòng)脈瓣疾病或者缺血 性心臟血管再生或恢復(fù)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1示出了分離mobPBSC的過(guò)程的模擬圖-其基于密度差從人血中通過(guò)細(xì)胞因 子（G-CSF)動(dòng)員，然后在ΕΡ0培養(yǎng)液中引發(fā)干細(xì)胞。
[0021] 圖2示出了通過(guò)FACS法利用ΕΡ0引發(fā)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的mobPBSC的識(shí)別特征。
[0022] 圖3示出了在mobPBSC的細(xì)胞群體（由G-CSF動(dòng)員并在ΕΡ0培養(yǎng)液中引發(fā)）中鑒 別血管新生相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)增加。還鑒別的是，作為通過(guò)ΕΡ0受體迀移的結(jié)果，隨 下游JAK、AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子被活化而發(fā)生這樣的表達(dá)增加。
[0023] 圖4示出了當(dāng)處理mobPBSC的細(xì)胞群的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液（由G-CSF動(dòng)員并在 ΕΡ0培養(yǎng)液中引發(fā)）時(shí)改善人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)的管形成和迀移能力，并且這樣的改 善通過(guò)ΕΡ0受體迀移而發(fā)生。
[0024] 圖5示出了mobPBSC的細(xì)胞群（由G-CSF動(dòng)員并在ΕΡ0培養(yǎng)液中引發(fā)）顯示出與 HUVEC和ECM(纖連蛋白）的粘附性更強(qiáng)并且這樣的現(xiàn)象歸因于整合素增加。
[0025] 圖6示出了當(dāng)制備免疫系統(tǒng)受抑制的無(wú)胸腺裸小鼠的后肢缺血模型并且然后將 mobPBSC(由細(xì)胞因子動(dòng)員并由ΕΡ0引發(fā)）注入小鼠時(shí)觀察到優(yōu)良的血管形成特性。還鑒別 的是，當(dāng)21天后使用CD34 (分化簇34 (綠色）：對(duì)人類細(xì)胞具有特異性的抗體）進(jìn)行后肢 組織的免疫熒光染色時(shí)，CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞引物，將由G-CSF動(dòng)員并在ΕΡ0培養(yǎng)液中引 發(fā)的mobPBSC引入到血管生成物中。
[0026] 圖7示出了在誘導(dǎo)小鼠心臟缺血后，當(dāng)將mobPBSC(由細(xì)胞因子動(dòng)員并由ΕΡ0引發(fā) 的）注入免疫系統(tǒng)受抑制的無(wú)胸腺裸小鼠內(nèi)時(shí)，促進(jìn)心臟恢復(fù)。
[0027] 圖8示出了利用APS引發(fā)mobPBSC的方法的示意圖，相對(duì)于未活化的血小板上 清液（幼稚血小板上清液）和APS而言，分離出mobPBSC之后Giemsa染色的結(jié)果和利用 ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定）對(duì)細(xì)胞因子進(jìn)行分析的結(jié)果。
[0028] 圖 9 是mobPBSC被刺激（利用Veh/APS) 6 小時(shí)后RT-PCR對(duì)IL-8、IL-10、IL-13、 IL-17、bFGF、TNF-、CXCR4和EP0R(促紅細(xì)胞生成素受體）的基因表達(dá)的分析結(jié)果。
[0029] 圖10示出了通過(guò)FACS法由Veh/APS引發(fā)的mobPBSC的識(shí)別特征。
[0030] 圖11示出了Veh/APS引發(fā)的mobPBSC中纖連蛋白粘附素的觀察結(jié)果。
[0031] 圖12示出了識(shí)別趨化性和細(xì)胞迀移的實(shí)驗(yàn)過(guò)程的示意圖，以及所觀察的Veh/APS 引發(fā)的mobPBSC趨向SDF-1的趨化性結(jié)果。
[0032] 圖 13 示出了上清液中有關(guān)IL-8、IL-10、TNF-、IL-17、PDGF和VEGF表達(dá)的ELISA 的分析結(jié)果，其中培養(yǎng)Veh/APS引發(fā)的mobPBSC，以及利用上述上清液處理的HUVEC的基質(zhì) 膠管道形成和迀移的分析結(jié)果。
[0033] 圖14示出了將Veh/APS引發(fā)的mobPBSC注入免疫系統(tǒng)受抑制的無(wú)胸腺裸小鼠 的缺血性后肢模型內(nèi)之后灌注程度的組織學(xué)分析和測(cè)定結(jié)果，以及被注入APS引發(fā)的 mobPBSC的細(xì)胞的血管生成。
[0034] 圖15示出了其中將APS引發(fā)的mobPBSC注入免疫系統(tǒng)受抑制的無(wú)胸腺裸鼠的缺 血性后肢模型中的組比對(duì)照組更促進(jìn)血管生成。
[0035] 圖16是將基質(zhì)膠注入免疫系統(tǒng)受抑制的裸鼠內(nèi)以比較周圍血管形成特性的結(jié) 果，并且表明與對(duì)照組相比較而言，注入mobPBSC(由G-CSF動(dòng)員并由APS引發(fā)的）之后所 觀察的優(yōu)良的血管形成特性。
[0036] 圖17示出了APS的安全穩(wěn)定性。
[0037] 在上述所有圖中，* :Ρ〈0· 05 :Ρ〈0· 01 以及 *林：Ρ〈0· 001。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 在一個(gè)方面，本申請(qǐng)涉及制備具有改善的血管形成特性的mobPBSC的方法，其中 所述方法包括提供利用細(xì)胞因子處理的人外周血；從上述血液分離出成層的單核細(xì)胞；以 及利用ΕΡ0或APS處理上述單核細(xì)胞。
[0039] 在本申請(qǐng)中，"血管形成"包括"血管生成"和"血管新生"兩者。血管生成的特征 在于內(nèi)皮祖細(xì)胞原位分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞并且這些細(xì)胞聚集形成新的血管，在早期胚胎中 的主血管叢形成過(guò)程中發(fā)生。血管生成是由預(yù)先存在的血管生長(zhǎng)以及血管通過(guò)分支生