專利名稱：一種誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡的藥物組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種用于誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡發(fā)生的藥物組合物。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤是骨髓漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，其發(fā)病率居惡性血液腫瘤的第二位。傳統(tǒng)化療藥物、靶向藥物以及外周血造血干細(xì)胞移植是多發(fā)性骨髓瘤主要治療方法，但其療效欠佳且易耐藥復(fù)發(fā)，現(xiàn)階段多發(fā)性骨髓瘤仍是一種不可治愈的惡性血液腫瘤。因此，發(fā)展新型安全有效的治療方法以提高多發(fā)性骨髓瘤患者生存期具有非常重要的意義。近年三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)單獨(dú)或與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用治療多發(fā)性骨髓瘤取得了一定的進(jìn)展，但其總體療效不如急性早幼粒細(xì)胞白血病等惡性血液病顯著。主要原因是多發(fā)性骨髓瘤好發(fā)于中老年(中位發(fā)病年齡70歲)，其骨髓組織發(fā)生不同程度的病變，多數(shù)患者對常規(guī)劑量的三氧化二砷治療產(chǎn)生骨髓抑制、感染、出血等現(xiàn)象。因此，設(shè)計(jì)安全有效的藥物組合方案，提高三氧化二砷抗多發(fā)性骨髓瘤的作用效應(yīng)并減少其對正常骨髓細(xì)胞的抑制作用，是當(dāng)前亟待解決的問題。促凋亡蛋白Bax和Bak在腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵的正調(diào)控作用，Bax和Bak轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體，促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeabilitytransition pore,MTP)開放和線粒體凋亡發(fā)生。抗凋亡分子Bcl_2和survivin在腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡過程中發(fā)揮關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控作用，Bcl-2與促凋亡蛋白Bax結(jié)合后，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(mitochondrial permeability transition pore, MTP)形成和線粒體凋亡發(fā)生；survivin直接抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3和Caspase-7的活性以阻斷細(xì)胞凋亡發(fā)生。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)As2O3單獨(dú)作用骨髓瘤細(xì)胞U266后,抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin表達(dá)上調(diào)，隱丹參酮單獨(dú)作用骨髓瘤細(xì)胞U266后，抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，而As2O3和隱丹參酮聯(lián)合作用Bcl-2和survivin顯著下調(diào)。同時(shí)As2O3和隱丹參酮聯(lián)合作用骨髓瘤細(xì) 胞U266后，促凋亡蛋白Bax和Bak從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)移定位增力口，細(xì)胞色素C由線粒體向胞漿釋放增加，而As2O3或隱丹參酮單獨(dú)用藥組Bax和Bak從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)移定位以及細(xì)胞色素C由線粒體向胞漿釋放未發(fā)生明顯變化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，線粒體凋亡通路標(biāo)記蛋白剪切型Caspase 9、Caspase 3和PARP表達(dá)水平明顯上調(diào),而As2O3或隱丹參酮單獨(dú)用藥組剪切型Caspase 9,Caspase 3和PARP未發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果說明As2O3和隱丹參酮聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞U266線粒體凋亡發(fā)生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡發(fā)生的藥物組合，由As2O3和隱丹參酮組成，且As2O3:隱丹參酮=(0.25 I) iiM:(10 20) PM。優(yōu)選以As2O3:隱丹參酮=0.5 ii M: 15 ii M組合。本發(fā)明提供的隱丹參酮是從唇形科植物丹參干燥根及根莖中分離純化獲得的二萜醌類化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為:
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述的一種誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡的藥物組合物在制備誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明采用As2O3和隱丹參酮聯(lián)合誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡作用影響進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示在(0.25 I) iiM As2O3:( 10 20) U M隱丹參酮的選定劑量范圍內(nèi)，兩者聯(lián)合應(yīng)用具有協(xié)同抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用，隨著作用濃度的增高，協(xié)同抑制骨髓瘤細(xì)胞增殖的作用逐漸增強(qiáng)。I U M As2O3單獨(dú)應(yīng)用或與(10 20) ii M隱丹參酮聯(lián)合應(yīng)用會(huì)對原代正常骨髓細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生不同程度的抑制作用，隨著作用濃度的增高，原代正常骨髓細(xì)胞增殖活性抑制作用逐漸增強(qiáng)。20 ii M隱丹參酮單獨(dú)應(yīng)用或與(0.25 I) ii M As2O3聯(lián)合應(yīng)用同樣會(huì)對原代正常骨髓細(xì)胞增殖活性產(chǎn)生不同程度的抑制作用，隨著作用濃度的增高，原代正常骨髓細(xì)胞增殖活性抑制作用逐漸增強(qiáng)。0.5uM As2O3和15 ii M隱丹參酮聯(lián)合應(yīng)用不僅具有較強(qiáng)的抗骨髓瘤作用，而且對原代正常骨髓細(xì)胞的增殖活性基本無影響。因此，本發(fā)明人選擇0.5 ii M As2O3和15 ii M隱丹參酮聯(lián)合應(yīng)用作為安全有效的抗骨髓瘤藥物組合。本發(fā)明對0.5iiM As2O3和15iiM隱丹參酮聯(lián)合應(yīng)用藥物組合誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行相關(guān)作用機(jī)理研究，結(jié)果顯示該組合藥物能顯著抑制骨髓瘤細(xì)胞U266抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin的表達(dá)水平,增加促凋亡蛋白Bax和Bak從胞衆(zhòng)向線粒體轉(zhuǎn)移定位以及細(xì)胞色素C由線粒體向胞漿釋放，上調(diào)線粒體凋亡通路標(biāo)記蛋白剪切型Caspase 9、Caspase 3和PARP的表達(dá)水平。因此，As2O3和隱丹參酮組合物能有效誘導(dǎo)骨髓瘤線粒體凋亡發(fā)生，在制備誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡藥物中具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前途。


圖1是隱丹參酮(CPT)和三氧化二砷(iAsm)體外聯(lián)合應(yīng)用對骨髓瘤細(xì)胞U266凋亡標(biāo)記蛋白的影響。 圖2是隱丹參酮(CPT)和三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合應(yīng)用對骨髓瘤細(xì)胞U266抗凋亡蛋白Bcl-2和survivin表達(dá)水平的影響。圖3是隱丹參酮(CPT)和三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合應(yīng)用對骨髓瘤細(xì)胞U266促凋亡蛋白Bax線粒體轉(zhuǎn)移定位的影響。圖4是隱丹參酮(CPT)和三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合應(yīng)用對骨髓瘤細(xì)胞U266促凋亡蛋白Bak線粒體轉(zhuǎn)移定位的影響。圖5是隱丹參酮和三氧化二砷(As2O3)聯(lián)合應(yīng)用對骨髓瘤細(xì)胞U266細(xì)胞色素C線粒體釋放的影響。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1:隱丹參酮和三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用對骨髓瘤細(xì)胞U266增殖活性的影響 骨髓瘤細(xì)胞U266 (購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫)在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640 (購
自Gibco)中培養(yǎng)(37°C、5% C02、飽和濕度)，取第四代細(xì)胞按4 XioVml的濃度接種200 U I于96孔培養(yǎng)板。設(shè)定對照組、隱丹參酮(購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司)組、三氧化二砷組、二者合用組及溶劑二甲基亞砜(DMSO)空白對照組，每組均做3復(fù)孔。待細(xì)胞生長密度達(dá)60-70%，分別加入隱丹參酮(10、15或20 11] )、三氧化二砷(0.25、0.5或1 y M)以及隱丹參酮和三氧化二砷的聯(lián)合應(yīng)用組，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，加入5 mg/ml的四甲基偶氮唑鹽(MTT)20 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，終止培養(yǎng)，離心去除培養(yǎng)液，每孔加入150 U IDMS0,振蕩10 min后,在Thermo Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀上選擇波長490 nm測定各孔吸光值(A值)，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)A值計(jì)算細(xì)胞抑制率，計(jì)算公式為:細(xì)胞抑制率(％)=(陰性對照組A值-加藥組A值)/陰性對照組A值X 100%。結(jié)果參見表1，隱丹參酮10、15 PM或三氧化二砷0.25、0.5 U M單獨(dú)作用24小時(shí)均對骨髓瘤細(xì)胞U266無明顯增殖抑制作用，但兩者合用可見明顯的協(xié)同抑制效應(yīng)，其中15V- M的隱丹參酮與0.5 V- M的三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用的抑制率最大,達(dá)66±8.9% ;隱丹參酮20 UM或三氧·化二砷I U M單獨(dú)作用24小時(shí)對骨髓瘤細(xì)胞U266增殖具有一定的抑制作用，當(dāng)20 PM的隱丹參酮與0.25 PM或0.5 U M的三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用可見顯著的增殖抑制效應(yīng)(56.1±10.6%和80.4±16.8%)，1 y M的三氧化二砷與10 yM或15 PM的隱丹參酮聯(lián)合應(yīng)用亦可見顯著的增殖抑制效應(yīng)(81.9±10.3%和92.2±6.7%)。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡的藥物組合物，其特征是:該藥物由As2O3和隱丹參酮組成，且As2O3:隱丹參酮=0.25 I ii M: 10 20 ii M。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡的藥物組合物在制備誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋`亡的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞線粒體凋亡發(fā)生的藥物組合，由0.25～1μMAs2O3和10～20μM隱丹參酮組成。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明三氧化二砷和隱丹參酮聯(lián)合作用顯著誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞U266發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制是抗凋亡蛋白Bcl-2、survivin和XIAP表達(dá)下調(diào)，促凋亡蛋白Bax和Bak從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)移定位增加，細(xì)胞色素C由線粒體向胞漿釋放增加，線粒體凋亡通路標(biāo)記蛋白Caspase9、Caspase3和PARP活化，進(jìn)而誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞U266發(fā)生線粒體凋亡。本發(fā)明所述的藥物組合物通過促進(jìn)線粒體凋亡而達(dá)到抑制多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的目的，因此As2O3和隱丹參酮組合物在制備誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞凋亡藥物中具有廣闊的應(yīng)用開發(fā)前途。
文檔編號A61P35/00GK103099816SQ20131004202
公開日2013年5月15日 申請日期2013年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月4日
發(fā)明者那仁滿都拉, 陳喆, 劉培, 徐石 申請人:浙江大學(xué)