抗Ki67蛋白單克隆抗體及其用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及可特異結合Ki67蛋白的單克隆抗體 UMAB107,產(chǎn)生所述單克隆抗體的細胞株，及應用該抗體用于診斷的方法和用途。
【背景技術】
[0002] Ki67是一種大分子蛋白質(zhì)，存在于細胞核內(nèi)，由兩條肽鏈組成，相對分子量分別 為345kDa和395kDa。Ki67抗原是1983年由Gerdes等人確定的，他們首次利用霍奇金淋 巴系IA28細胞核對小鼠進行免疫，制備出了 Ki67抗體。由于當時的實驗地點為德國的城 市kiel，并且由于Ki67抗體所用的組織培養(yǎng)板編號是67號，故被命名為Ki67。1993年， Schluter等得出其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)他包含有40個弱的和10個強的PGST區(qū)（富含脯氨 酸、谷氨酸、絲氨酸、蘇氨酸）。PGST區(qū)很不穩(wěn)定，是蛋白容易降解的部位，故Ki67對蛋白酶 非常敏感，這使Ki67的半衰期比較短，約為lh，所以Ki67不容易被分離、提取。
[0003] Ki67是一種增殖細胞相關的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關。Ki67可以識別 除G0期以外的G1、S、G2和Μ期的細胞。Ki-67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤的分化程度、浸潤、 轉(zhuǎn)移以及預后密切相關。Ki67在細胞增殖中是不可缺少標記，是目前已知的增殖抗原中最 具增殖能力代表性、應用最廣泛的增殖細胞標記之一。因此廣泛用于各種惡性腫瘤的標記， 在惡性腫瘤早期診斷、治療及選擇方法、治療療效的評估和判斷預后中存在巨大潛力。
[0004] Ki67作為增殖標記物抗原在疾病，特別是腫瘤的研究中有廣闊的應用前景，是目 前國內(nèi)外研究的熱點。在乳腺癌方面的研究中，健康乳腺組織可以表達Ki67的水平很低 (〈3%的水平），乳腺癌的Ki67表達大約為78%。在乳腺癌中，腫瘤大小、組織學分級、淋巴 結轉(zhuǎn)移、病理分期等臨床病理因素對于乳腺癌患者預后的影響很大。Ki67能可靠反映出乳 腺正常組織和病變組織的增殖活性，Ki67還可以通過與ER、PR、053、C. erbB-2的聯(lián)合檢測， 更好地評估乳腺癌的生物學行為及增殖活性，可以更精確的幫助臨床醫(yī)師進行乳腺癌的高 危、復發(fā)和轉(zhuǎn)移因素的分析，為臨床個體化治療提供更多的理論依據(jù)。
[0005] 目前臨床上通常通過免疫組織化學（IHC)病理實驗檢測腫瘤細胞中Ki67的表達 狀況。IHC實驗的核心為特異性結合Ki67的單克隆抗體，其性能的優(yōu)劣直接決定著整個檢 測的靈敏度和特異性。因此，研制出一種結合特異性較高的針對Ki67蛋白的單克隆抗體具 有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種結合特異性較高的Ki67蛋白的單克隆抗 體，及其在制備用于檢測Ki67蛋白的免疫檢測工具中的應用。
[0007] 本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微 生物中心（簡稱為CGMCC)，保藏日期為2014年8月22日，保藏編號為CGMCC No. 9574。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種特異性結合Ki67蛋白的單克隆抗體UMAB107,由上述雜交瘤 細胞株產(chǎn)生。
[0009] 本發(fā)明所述單克隆抗體的制備方法如下：
[0010] (1)重組表達載體的構建：通過基因合成的方式合成Ki67的第1160-1493位氨基 酸的核苷酸序列并引入酶切位點Sgfl、Mlul，通過Sgfl和Mlul兩個酶切位點將目的序列 連接到載體pET23a-N-His上，構建Ki67重組表達質(zhì)粒；
[0011] (2)Ki67重組蛋白的表達與純化：將Ki67重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta PlysS，表達純化，獲得純化的Ki67重組蛋白；
[0012] (3)單克隆抗體的篩選與制備：采用上述純化的Ki67重組蛋白免疫B6/C57小鼠， 取小鼠脾臟細胞與SP2/0細胞進行融合，有限稀釋法獲得單克隆，ELISA法篩選陽性雜交瘤 細胞，獲得能分泌抗Ki67特異性抗體的雜交瘤細胞株，命名為UMAB107,亞型鑒定為IgG2a ; 制備小鼠腹水，通過親和層析柱純化Ki67單克隆抗體。分別通過Western Blot、免疫組化 實驗驗證該單克隆抗體的靈敏度和特異性。
[0013] 進一步采用OriGene高密度蛋白芯片對上述單克隆抗體的特異性進行驗證：
[0014] OriGene高密度蛋白芯片上包含10, 000個HEK293T細胞蛋白過表達裂解物，每種 蛋白裂解液在芯片上具有兩個拷貝的重復。蛋白裂解液被印跡在硝酸纖維素膜上。每一鐘 蛋白裂解液的定位可以通過Excel文件進行準確定位。蛋白芯片上蛋白分為40個亞矩陣， 每個亞矩陣上有一些參照，通過參照，可以定量每個芯片點上蛋白的含量，監(jiān)控每次免疫反 應數(shù)據(jù)的重復性，以及定位陽性信號的方向。
[0015] 本發(fā)明將所述單克隆抗體UMAB107與上述芯片雜交并確定陽性信號位點，結果顯 示：本發(fā)所述明單克隆抗體UMAB107特異性結合Ki67蛋白，而與其他蛋白無交叉反應。
[0016] DAK0公司的MIB1抗體是目前臨床免疫組化（IHC)應用的"金標準"抗體，本發(fā)明 采用免疫組化的方法分別以本發(fā)明制備的Ki67單克隆抗體UMAB107和DAK0公司的MIB1抗 體為一抗，對人的扁桃體、乳腺癌和直腸組織進行染色，比較UMAB107與MIB1的靈敏度，結 果顯示UMAB107和MIB1在人的扁桃體、乳腺癌和直腸組織中的染色模式和染色強度一致， 說明二者在染色特性上沒有差別。為UMAB107替代MIB1應用臨床診斷提供了有力的證據(jù)。
[0017] 同時采用免疫組化的方法分別以本發(fā)明制備的Ki67單克隆抗體UMAB107和DAK0 公司的MIB1抗體為一抗，對鼠直腸組織進行染色，比較UMAB107與MIB1的靈敏度，結果顯 示UMAB107能檢測到鼠直腸中的Ki-67的表達，而MIB1則不能，說明本發(fā)明制備的Ki67單 克隆抗體UMAB107能同時識別人源和鼠源的KI-67,而MIB1不識別鼠源KI-67。
[0018] 進一步分別以本發(fā)明制備的Ki67單克隆抗體UMAB107和DAK0公司的MIB1抗體 為一抗，按照所述免疫組化的方法檢測629份臨床病理組織樣本中的細胞增殖核抗原標記 指數(shù)（燈67-1^1)，結果顯示1]嫩8107在95%的樣本中的燈67-1^都高于[81。綜上所述說 明本發(fā)明所述Ki67單克隆抗體UMAB107優(yōu)于MIB1抗體。
[0019] 本發(fā)明還提供了單克隆抗體UMAB107在制備用于檢測Ki67蛋白的免疫檢測工具 中的應用。
[0020] 具體地，所述免疫檢測工具為試劑盒、芯片或試紙。
[0021] 在具體的實施例中，本發(fā)明提供了一種免疫組化檢測試劑盒，包括上述單克隆抗 體UMAB107 ;可檢測組織細胞中Ki67的表達狀況。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述單克隆抗體在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。
[0023] 其中所述腫瘤具體是指腫瘤細胞的增殖與Ki67的表達密切相關的腫瘤。包括但 不限于乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、黑色素瘤、膀胱癌或頭頸腫瘤。
[0024] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供了一種雜交瘤細胞株（保藏編號為CGMCC No. 9574)，以及由此雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體UMAB107。本發(fā)明還提供了單克隆抗體 UMAB107在制備用于檢測Ki67蛋白的免疫檢測工具中的應用，含單克隆抗體UMAB107的免 疫組化試劑盒，以及單克隆抗體UMAB107在制備用于標記腫瘤的試劑盒中的應用。本發(fā)明 所述單克隆抗體可與Ki67蛋白特異性結合，而與細胞內(nèi)其他蛋白無交叉反應，顯著提高了 Ki67蛋白免疫檢測的特異性和可靠性，廣泛適用于用于各種腫瘤的標記。
[0025] 保藏信息
[0026] 用于保藏的雜交瘤細胞株UMAB107的分類命名為：Ki67鼠單克隆抗體的雜交瘤細 胞株；
[0027] 保藏單位全稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；
[0028] 保藏單位簡稱：CGMCC ;<