一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途。該單克隆抗體是由保藏于CGMCC保藏號為CGMCC?No.6606的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體；該制備方法通過克隆煙曲霉蛋白的基因；將克隆的基因插入表達載體，構(gòu)建重組表達載體；用重組表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，誘導表達，親和層析，得到純化的該煙曲霉蛋白的重組蛋白；用該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞融合，建立雜交瘤細胞系，從中篩選出分泌該煙曲霉蛋白抗體最穩(wěn)定、抗體活性最高的雜交瘤細胞株，它們所產(chǎn)生的抗體即為所需的單克隆抗體；該單克隆抗體可制備曲霉病診斷試劑。該單克隆抗體的具有高度特異性和強親和力，制備方法簡單高效。
【專利說明】一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程、細胞工程和曲霉病的免疫診斷領(lǐng)域，涉及一種煙曲霉蛋白單克隆抗體及其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]近期研究證明，以測定真菌抗原、抗體和循環(huán)代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)的血清學診斷方法潛力較大[1~4]。曲霉在體內(nèi)發(fā)生侵襲性感染時，由孢子狀態(tài)延伸生長成菌絲，此時向體液中釋放菌絲蛋白，并刺激機體產(chǎn)生抗體。鑒于曲霉感染的這個特征，一般認為，血循環(huán)中抗原或特異抗體水平上升，預示著菌絲體延伸和/或曲霉感染的發(fā)展。由于曲霉蛋白質(zhì)成分復雜，而且基礎(chǔ)疾病、前期用藥不同的病人其機體處于不同免疫狀態(tài)，導致體內(nèi)曲霉抗原、抗體種類和量也有差別[5~8]。因此，作為實驗室診斷用的目標抗原和抗體，應該選擇在不同免疫狀態(tài)的病人罹患侵襲性曲霉病時，在其體內(nèi)優(yōu)勢大量表達、并能夠強烈刺激人體產(chǎn)生抗體的曲霉蛋白質(zhì)抗原組分。
[0003]我們用免疫蛋白質(zhì)組學法篩選煙曲霉免疫優(yōu)勢抗原時[9]，發(fā)現(xiàn)了一個與確診侵襲性曲霉病(IA)血清發(fā)生強免疫反應的新的煙曲霉蛋白，即硫氧還蛋白還原酶GliT (TR)，分子量約36.2KDa。用SignalP軟件預測結(jié)果顯示，TR帶有信號肽(signalP probability, 0.808) ；WoLF PSORT 軟件預測結(jié)果顯示 TR 為胞外蛋白(Query Protein WoLFPSORTprediction:extr, 12.0; cyto, 6.5 ；cyto_nucl, 4.0 ；mito, 3.0 ；pero, 2.0);用 BLAST 程序進行同源性分析顯示，TR與人源性蛋白質(zhì)沒有同源性，與其他真菌蛋白質(zhì)的同源性也很低，如與白念珠菌蛋白質(zhì)的同源性為25%，熱帶念珠菌25%，光滑念珠菌24%，季也蒙念珠菌27%，釀酒酵母菌24%，馬爾尼菲青霉27%[1°]，是一個理想的診斷標志物。TR可以作為煙曲霉的特異性抗原用于曲霉病尤其是IA的血清學診斷。
[0004]為此，我們克隆表達了該蛋白，并建立了 ELISA法來檢測血清中的ant1-TR水平，結(jié)果顯示，煙曲霉孢子感染一周后即出現(xiàn)ant1-TR抗體陽性，且抗體滴度快速上升。檢測血清ant1-TR抗體在免疫功能相對正常的非粒缺IPA患者中診斷的敏感性和特異性為80.9%和96%，明顯優(yōu)于現(xiàn)有試劑盒GM的檢測(43.5%，p < 0.05) [10]。而聯(lián)合檢測ant1-TR抗體和抗原TR，可明顯提高檢測的敏感性。
[0005]因此，制備出特異性識別煙曲霉TR蛋白、且與之高親和力結(jié)合的單克隆抗體，用于配制診斷曲霉病的試劑組合物，是目前生物醫(yī)學領(lǐng)域亟待解決的問題。
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【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明的目的就是為了解決上述問題，提供一種針對煙曲霉TR的單克隆抗體。
[0018]本發(fā)明的另一個目的是提供該單克隆抗體的制備方法。
[0019]本發(fā)明還有一個目的是提供該單克隆抗體在制備曲霉病診斷試劑中的應用。
[0020]一種煙曲霉蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
[0021]本發(fā)明的單克隆抗體應理解為可以是IgG或IgM，也可以是該抗體的Fab片段、F(ab’)2片段、單鏈抗體等，其抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征。
[0022]分泌本發(fā)明所述單克 隆抗體的雜交瘤細胞Ant1-TRl，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏號為CGMCC N0.6606，保藏時間為2012年9月24日。
[0023]可通過實質(zhì)上通用的基因重組技術(shù)，獲得煙曲霉TR基因工程蛋白用于動物的免疫接種和篩選、鑒定抗體的抗原，但本發(fā)明優(yōu)選表達載體pET_28a( + )，使目的基因的表達最有效，最易于純化。[0024]本發(fā)明所述的單克隆抗體的制備方法，包括以下步驟:
[0025]首先用基因工程技術(shù)制備煙曲霉TR蛋白:從煙曲霉菌絲中提取TR基因(SEQ IDN0.1)，對該基因進行克隆，并構(gòu)建攜帶該基因的原核細胞表達載體，將該載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，誘導被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌高效表達重組TR蛋白。再用獲得的該基因工程蛋白接種小鼠，待動物體內(nèi)對重組TR蛋白形成免疫應答后，從該動物體內(nèi)提取脾淋巴細胞，與能在體外無限增殖的小鼠骨髓瘤細胞融合，建立雜交瘤細胞系，從該細胞系中篩選出所有能產(chǎn)生特異性抗體的細胞株。對產(chǎn)生抗體的這些細胞株進行反復篩選和單克隆化培養(yǎng)，采用ELISA法對分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞進行篩選，對抗體效價進行測定，采用Western印跡法、免疫組織化學法、免疫細胞化學法以及阻斷試驗對所制備的單克隆抗體的特異性進行了鑒定，優(yōu)選出抗體親和力最強，特異性最高的單克隆細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606，該雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體即為本發(fā)明的單克隆抗體。[0026]一種用于診斷曲霉病的試劑組合物，該組合物含有作為活性成分的有效量的上述單克隆抗體。
[0027]本發(fā)明所述的單克隆抗體在制備曲霉病診斷試劑中的應用。
[0028]本發(fā)明所述的雜交瘤細胞系在制備曲霉病診斷試劑中的應用。
[0029]本發(fā)明的有益效果:
[0030]首先，本發(fā)明提供了一種單克隆抗體，該抗體能特異性結(jié)合于煙曲霉的TR蛋白，該抗體也能特異性結(jié)合于人或動物組織中煙曲霉的TR蛋白，包括釋放到外周血中的TR蛋白。
[0031]本發(fā)明單克隆抗體的具有高度特異性和強親和力，能用于診斷曲霉病的檢測試劑制備。
[0032]本發(fā)明所制備的單克隆抗體可適用于檢測曲霉病病人的體液中的TR蛋白，以幫助判斷真菌的類型。
[0033]本發(fā)明所制備的單克隆抗體適用于檢測病人病變組織中曲霉表達的TR蛋白，以幫助判斷真菌的類型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1:RT_PCR擴增煙曲霉TR DNA片段的瓊脂糖凝膠電泳圖
[0035]其中:M.DNA分子量標準；1.陰性對照2.RT-PCR產(chǎn)物。
[0036]圖2:瓊脂糖凝膠電泳分析重組質(zhì)粒PMD18-T/TR的酶切鑒定圖
[0037]其中:M，DNAmarker ;1，pMD18_T/TR 質(zhì)粒雙酶切；2，pMD18_T/TR 質(zhì)粒
[0038]圖3:TR基因的DNA測序分析。
[0039]圖4:重組TR的SDS-PAGE分析圖
[0040]其中:1，誘導的pET28a ( + )/TR菌體超聲破碎上清；2，未誘導轉(zhuǎn)化菌；3，純化的重
[0041]組蛋白質(zhì)；M,蛋白質(zhì)分子量marker。
[0042]圖5:重組TR蛋白的質(zhì)譜鑒定圖譜及肽段匹配情況
[0043]其中:A，重組TR蛋白的質(zhì)譜鑒定圖；B，與TR匹配的肽段(黑體標示)
[0044]圖6:ffestern blot印跡鑒定TR單克隆抗體的特異性[0045]圖7 JsoStrip小鼠單克隆抗體亞類(型)測定結(jié)果。
[0046]圖8:TR單克隆抗體與曲霉的間接免疫熒光分析圖:抗TR單克隆抗體與煙曲霉、黃曲霉和黑曲霉的TR發(fā)生特異性結(jié)合反應。
[0047]圖9:1A兔模型肺組織免疫組織化學分析的光鏡圖之一:IA兔模型肺組織中曲霉菌絲表達的TR與抗TR單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，菌絲染成黃褐色。
[0048]圖10:1A兔模型肺組織免疫組織化學分析的光鏡圖之二:IA兔模型肺組織中曲霉菌絲表達的TR與抗TR單克隆抗體的反應被游離的TR蛋白所阻斷，未出現(xiàn)黃褐色菌絲。
[0049]圖11:1A患者肺組織免疫組織化學分析的光鏡圖之一:IA患者肺組織中曲霉菌絲表達的TR與抗TR單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，菌絲染成黃褐色。
[0050]生物材料保藏信息
[0051]Ant1-TRl，分類命名為分泌抗曲美硫氧還蛋白還原酶GliT(TR)單克隆抗體的小鼠雜交瘤細胞，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCCN0.6606，保藏地址為北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2012年9月24日。
【具體實施方式】
[0052]以下通過實施例對本發(fā)明作進一步的闡述。
[0053]實施例1:煙曲霉蛋白TR基因的克隆及原核表達
[0054]要制備TR單克隆抗體，首先要進行TR基因的克隆和原核表達，為制備TR單克隆抗體奠定基礎(chǔ)。我們利用RT-PCR法和T/A克隆策略，從煙曲霉菌絲中克隆TR基因，經(jīng)過PCR、雙酶切鑒定后，進行DNA測序(SEQ ID N0.1)0然后，構(gòu)建重組表達載體pET_28a (+)/TR,經(jīng)過PCR和雙酶切鑒定后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，IPTG誘導表達和SDS-PAGE檢測重組TR，鈷離子親和層析純化重組蛋白。
[0055]1.1實驗標本:煙曲霉菌絲
[0056]1.2制備TR雙鏈cDNA片段
[0057]1.2.1引物設(shè)計
[0058]用Primer5分析軟件設(shè)計，PCR引物序列如下:
[0059]TR 上游引物(primerl):5' ~CACACATATGTCGATCGGCAAACTAC~3' (SEQ ID N0.2)(劃線處為Nde I酶切位點)
[0060]TR 下游引物(primer2):5 ' ~ACTGAATTCCTATAGCTCCTGATCGAGACG~3 ' (SEQ IDN0.3)(劃線處為EcoR I酶切位點)。
[0061]1.2.2煙曲霉總RNA的提取
[0062]取50mg煙曲霉菌絲放入研缽中，立即加入適量的液氮，在菌絲呈凍結(jié)狀態(tài)下充分研磨，使之成為粉末狀，緊接著轉(zhuǎn)移至含Iml Trizol RNA提取液的離心管中，顛倒混勻，室溫放置15分鐘。加入0.2ml氯仿，充分混勻，4°C 12000rpm離心15分鐘。轉(zhuǎn)移上層無色水相至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘。4°C 12000rpm離心10分鐘，棄上清，加入1ml75%乙醇，渦旋振蕩，4°C 7500rpm離心5分鐘。棄上清，用50 μ IDEPC (焦碳酸二乙酯)處理水溶解RNA沉淀，8g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA提取的效果，將標本RNA溶液凍存在_70°C冰箱待用。[0063]1.2.3逆轉(zhuǎn)錄反應
[0064]總反應體系(20 μ I)組成如下:
[0065]
【權(quán)利要求】
1.一種煙曲霉蛋白單克隆抗體，該單克隆抗體是由保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其抗原結(jié)合片段保持該單克隆抗體的結(jié)合特征。
3.分泌權(quán)利要求1所述單克隆抗體的雜交瘤細胞Ant1-TRl，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606，保藏日期為2012年9月24日。
4.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于包括以下步驟: a、克隆煙曲霉的一種蛋白的基因； b、將克隆的煙曲霉蛋白的基因插入表達載體，構(gòu)建成重組表達載體； C、將構(gòu)建的重組表達載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)異丙基硫代_β-D-半乳糖苷誘導獲得該煙曲霉蛋白高效表達產(chǎn)物，再經(jīng)親和層析，得到純化的該煙曲霉蛋白的重組蛋白； d、用純化的該重組蛋白接種小鼠，取其脾淋巴細胞與小鼠Sp2/0骨髓瘤細胞融合,建立雜交瘤細胞系； e、從上述雜交瘤細胞系中篩選分泌該煙曲霉蛋白抗體的雜交瘤細胞株，選出最穩(wěn)定、抗體活性最高的細胞株，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.6606，該雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體即為權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述煙曲霉蛋白的基因是用逆轉(zhuǎn)錄PCR法從煙曲霉mRNA中擴增出煙曲霉硫氧還蛋白還原酶的cDNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于所述表達載體優(yōu)選pET_28a (+ )ο
7.一種用于診斷曲霉病的試劑組合物，其特征在于所述的試劑組合物含有作為活性成分的有效量的權(quán)利要求1所述的單克隆抗體。
8.權(quán)利要求1所述的單克隆抗體在制備曲霉病診斷試劑中的應用。
9.權(quán)利要求3所述的雜交瘤細胞系在制備曲霉病診斷試劑中的應用。
【文檔編號】G01N33/577GK103897060SQ201210579111
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】史利寧, 李芳秋 申請人:中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院