專利名稱：存在碳源時日本酒曲霉對蛋白水解酶的表達的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于日本酒曲霉菌，它們能夠在有碳源存在時以至少像不存在碳源時相同的量表達蛋白水解酶。特別是本發(fā)明涉及以修飾creA基因產物的表達作為手段，以便在有碳源存在時增加廣泛多種蛋白水解酶的量。
本領域的狀況可通過用酸、堿或酶水解降解蛋白質材料制備廣泛用于食品工業(yè)的水解蛋白。至于用酸或堿處理蛋白質材料，已表明這種處理過程也會破壞水解過程中產生的必需氨基酸，因此降低最后產品的營養(yǎng)價值。另一方面，通過加入酶水解很難達到完全水解，以致水解蛋白中仍能含有相當多的肽。但是，取決于用于蛋白水解的蛋白質和酶成分的性質，可能導致所形成的肽有非?？嗟奈兜?，并且因此特別不受歡迎。
在取代化學或生物分離材料的某些方法中，微生物本身被用于這種目的。在這種情況下，可利用的蛋白質材料是在由微生物分泌的多種酶，如淀粉酶、蛋白酶、肽酶等的作用下被水解。
這類微生物中的一種是傳統(tǒng)用于制備日本酒曲培養(yǎng)物的日本酒曲霉菌(見例如US 4,308,284)，這類霉菌包括例如曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬和/或毛霉屬(Mucor)微生物，特別是大豆曲霉、米曲霉、海棗曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉，米根霉、寡孢根霉、日本根霉、臺灣根霉，Circinelloides毛霉、日本毛霉，灰綠青霉和褐色青霉青霉(penicillum)。
根據植物專用名詞國際代碼(ICBN)規(guī)則，曲霉屬是一個無性屬。這意著真正的曲霉菌只通過分生孢子梗進行無性繁殖。但是，在可通過子囊孢子有性繁殖的真菌也可發(fā)現(xiàn)典型的曲霉屬分生孢子梗形態(tài)。某些曲霉菌分類學家因為他們不遵守ICBN術語規(guī)則而引起了混淆。他們試圖對分類方案作多種修正以便構巢曲霉(Aspergillusnidulans)包括在此屬之中，盡管實際上它的正確分類名稱是Emericella nidulans(Samson，曲霉，生物學及工業(yè)應用，PP 355-390，Bennett to klich編著，Boston)。實際上可認為這種被稱為構巢曲霉的微生物不屬于曲霉屬本身。
在EP 0 417 481中描述了一種用于生產發(fā)酵的大豆醬的方法，其中是通過將日本酒曲培養(yǎng)物與煮過的大豆和烘熱的小麥混合物相混合來制備日本酒曲。然后用日本酒曲培養(yǎng)物發(fā)酵過程中產生的酶在水懸液中，45℃-60℃將所獲得的日本酒曲水解3-8小時，進一步通過對此水解的日本酒曲懸液加入氯化鈉制備moromi，使此moromi發(fā)酵，然后擠壓，將所得到的液體施行巴斯德滅菌并使之澄清。
EP 0 429 760描述了一種生產調味劑的方法，其中制備了一種富含蛋白質原料的水懸液，通過用蛋白酶在pH 6.0-11.0水解此懸液而使蛋白質溶解，在pH4.6-6熱處理此懸液，隨后用日本酒曲培養(yǎng)物的酶催熟。
類似地，歐洲專利申請96 201 923.8也描述了一種生產肉調味香料的方法，其中制備了一種含有蔬菜蛋白質原料和蔬菜碳水化合物原料的混合物，該混合物初始至少含有45％干物質，將該混合物與日本酒曲培養(yǎng)物共溫育，并加入了一種或幾種用于肉食品傳統(tǒng)發(fā)酵過程的其它微生物，溫育此混合物直至形成肉調味香料。
然而，涉及使用不同微生物的所有這些方法也顯示出蛋白質原料未被完全水解的缺點，而為了達到基本完全水解使此原料與微生物一起較長時間的溫育，可能導致形成有害的代謝付產物。
因此，本領域需要盡可能地改善這些水解方法。然而對日本酒曲法的最佳化和進一步發(fā)展過程受到了嚴重的阻礙，因為缺乏關于所涉及水解酶性質，它們的調節(jié)以及過程參數(shù)對它們的表達和活性影響的知識，影響參數(shù)包括例如濕看、pH、水中溶性和鹽濃度。
從Katz等，基因150(1994)，287-292已知，對于真菌Emericellanidulans，其蛋白水解酶的表達和分泌受到包括碳降解產物抑制作用、氮和硫代謝產物抑制作用在內的至少三種一般控制環(huán)路的支配，此種微生物天生地利用這些水解酶提供其繁殖所需要的氮、硫和碳源。
這三種調控環(huán)路確?；|中可利用的氮、碳和硫源，按照它們氮、能量和硫的產生順序地被利用。已發(fā)現(xiàn)氮代謝產物的抑制作用也由Emericella nidulans中areA基因產物施加的(Arst等分子和普通遺傳26(1973)111-141)，而對于其它的真菌，推測可能有其它一些基因負責此功能。實際上已被研究的絕大多數(shù)真菌似乎都具有行使這種功能的areA同源基因。
在以米曲霉進行的麥麩發(fā)酵過程中，只有使葡萄糖濃度降低至某一閾值之下才能檢測出蛋白水解活性。這些觀察結果表明蛋白質的存在并不誘發(fā)米曲霉中蛋白水解酶的任何表達，但似乎僅僅被碳去抑制。在使用大豆日本酒曲的發(fā)酵過程中，發(fā)現(xiàn)由于淀粉酶活性釋放了大量的葡萄糖，最后將導致對蛋白酶-編碼基因的碳分解代謝物抑制作用。
因此有必要改進水解蛋白質的方法，以便導致高程度的蛋白水解作用，并獲得具有極好感官特性的水解產物。
發(fā)明概述通過提供屬于曲霉、根霉、毛霉或青霉屬的日本酒曲霉實現(xiàn)了此目標，這種日本酒曲霉的蛋白水解活性不被碳抑制。
按照本發(fā)明，已對該微生物中creA基因的表達進行了修飾，以致其基因產物將形成一種多肽，此多肽表現(xiàn)出對引起阻斷蛋白酶轉錄的DNA序列降低的結合親和性或者完全沒有結合親和性。
在另一優(yōu)選的實施方案中，通過某種方式對creA基因的合成進行了修飾，以致相應的基因產物基本上不被轉錄或完全不被轉錄，或者不被翻譯成功能性產物。例如通過將一個構建體導入此微生物的基因組可實現(xiàn)此目的，此物建體可導致產生creA反義m RNA而因此阻礙creA基因翻譯成功能性多肽。另一方面還可將一些突變導入creA基因，以致不發(fā)生任何轉錄，最后，還可使creA基因完全缺失，以致在有碳源存在時不會發(fā)生抑制作用。
借助于經典的技術可以獲得導致微生物具有所需性狀的突變，例如借助于突變法和選擇法，或者使用基因工程技術可對creA基因實現(xiàn)選擇性突變。
此外，還可以使creA突變與areA基因產生增加的特性相結合，areA基因對蛋白酶的產生是一種陽性刺激物。發(fā)明詳述在附圖中

圖1是λGem12克隆的限制性酶切圖譜。編碼區(qū)位于被亞克隆進入pUC19的4.3 KB PstI-SpHI片段上。
理論上，在creA基因內產生減小或者甚至中斷其基因產物對相應DNA序列結合的突變將導致麥麩日本酒曲中更早地開始產生蛋白酶，結果形成較高的蛋白酶產量，并因此導致蛋白酶分泌增加。大豆日本酒曲中creA突變理論上也應減弱對蛋白酶產生的碳分解代謝物抑制作用，并應導致較高的蛋白酶產量。
在基因130(1993)241-245中，Drysdale等還曾報導，在構巢曲霉中creA基因及其二側序列的缺失可導致致死性表型。因此推測，除了起蛋白質抑制劑的作用之外creA還有其它能維持生命的調節(jié)作用，沒有creA微生物就不能夠生長繁殖。
與這種一般性信念不同，本發(fā)明驚人地發(fā)現(xiàn)實際上有可能產生可生存的creA突變體，這種突變體甚至在有碳源存在時也能夠表達廣泛多種不同的蛋白水解酶。為了實現(xiàn)此目標，采用了如下的程序。
推測creA突變體可作為areA抑制基因突變面被分離出。areA基因是與廣泛多種蛋白水解多肽轉錄激活有關的幾種基因中的一種。areA基因由細胞內谷氨酰胺是否存在來控制，細胞內谷氨酰胺實際上代表一種氮依賴性控制。
在EP 97111 387.2中詳述了一種areA無效突變體米曲霉NF2(CNCM 1882)，已表明這種曲霉突變體在含有0.2％大豆蛋白和50mM葡萄糖的極限基本培養(yǎng)基(見下面)上不能夠生長，該專利在此被引入作為參考。同樣的突變體在小麥面筋日本酒曲中也不能生長。
在areA無效突變體中，areA基因產物不再刺激蛋白酶編碼基因的轉錄，導致此微生物表現(xiàn)出蛋白酶分泌減少。
此外，存在碳源如葡萄糖、果糖或蔗糖時，creA基因產物抑制蛋白酶編碼基因的轉錄，最終導致areA無效突變體不能夠利用蛋白作為氮源。因而，帶有有效creA基因的areA無效突變體將不能夠在這樣的環(huán)境中生長和繁殖。
為了分離出creA突變體，可以在上述的培養(yǎng)基中(0.2％大豆蛋白，50mM葡萄糖)使米曲霉的areA無效突變體經受誘變劑的作用，例如紫外線照射、用EMS(乙基甲磺酸鹽)、甲基甲磺酸鹽，或者DMSO、亞硝基胍等處理。
理論上在至少某些能夠生長在此培養(yǎng)基上的菌落中，其creA基因已發(fā)生了突變，以致它的基因產物不能行使其正常的作用，因此能夠在這種培養(yǎng)基(見上面)中生長。
然后可以分析這種菌落存在的蛋白水解活性增加，通過測定在creA控制之下的一些酶的活性可實現(xiàn)此目的，這些酶包括例如醇脫氫酶、淀粉酶、乙酰胺酶等等。
例如，可以對生長在上述參照培養(yǎng)基上的菌落研究其對Fluor-乙酸鹽的超敏感性。在野生型菌株活性的creA蛋白在有葡萄糖存在時可阻止誘導乙酸鹽利用酶。在此條件下Fluor-乙酸鹽不被代謝利用。然而對于creA突變體，其中的creA基因產物沒有繼承其固有的功能，因此這些乙酸鹽利用酶都以基本上組成型方式被轉錄了。結果，F(xiàn)1uor-乙酸鹽將被轉變成為對此微生物有毒的化合物?？煽匆姷慕Y果是，在creA基因內具有突變，致使其基因產物基本無效的菌株將不能生長在含有Fluor-乙酸鹽和碳源的培養(yǎng)基中。
根據它們在有碳源存在時對烯丙醇的超敏感性也可鑒別creA突變體。在野生型菌株，活性的creA蛋白正常情況下阻止誘導醇脫氫酶，這種酶將上述底物氧化成一種對此微生物有毒的化合物酮acreoline。在抑制性條件下即存在碳源時，烯丙醇正常地將不被氧化成毒性化合物，因為creA行使了它抑制醇脫氫酶轉錄的固有功能。但是，對于其CreA基因不再有功能的突變體，醇脫氫酶基本上組成型表達，即使存在碳源也使此霉菌因acreoline而中毒。
除了通過誘變劑和選擇所需的性狀對areA無數(shù)突變體進行上述隨機誘變之外，還可以借助于基因工程技術以適合的方式修飾creA基因。
為此，可以將一個構建體摻入此霉菌的基因組，此物建體含有對creA被轉錄成為反義RNA的DNA序列。借助于例如在Maniatis，實驗室手冊，冷泉港，1992中所述的，本領域熟知的技術可以實現(xiàn)此目的。這種方案具有如下優(yōu)點以適當?shù)姆绞酵ㄟ^使其轉錄取決于已知對給定系統(tǒng)誘發(fā)轉錄的特定分子是否存在，可控制反義RNA本身的作用。克隆給定DNA片段以及啟動子的載體和誘導它們的方法是本領域熟知的，并可以在例如上述Maniatis的著作中找到。
進而可按這樣一種方式修飾creA基因，以致使它的基因產物基本上或者甚至完全無效。通過將某些突變導入此DNA序列可實現(xiàn)此目的，就使相應的多肽喪失其通過例如結合于相應的調節(jié)DNA序列而行使其調節(jié)作用的能力。而且，還可以使creA基因部分或者甚至完全缺失，以致在存在碳源時完全不發(fā)生表達。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，盡管親緣關系不同，但使用含有構巢曲霉的相應基因編碼區(qū)的DNA序列作探針，并在雜交過程中采用低嚴格條件也可分離出米曲霉的creA基因。
由于采用了低嚴格條件，最初分離出了許多不同的菌落，以后通過增加條件的嚴格性將它們排除。
在分離出嚴格雜交菌落的DNA之后，可將完整的米曲霉creA基因置于4.3KB PstI-SphI片段，可將它克隆進入適當?shù)妮d體如質?；虿《据d體并進行測序。在后面SEQ ID NO I中顯示了所獲得的這種序列。
在對此DNA序列的分析中，可發(fā)現(xiàn)一個潛在性開放讀框，此讀框可產生具有被鑒定為如下SEQ ID NO II氨基酸序列的多肽。
然后可將如此被鑒定的DNA序列用于將特定的變突導入creA基因。通過如下方法可實現(xiàn)此目的例如在適當?shù)妮d體如高拷貝數(shù)載體pUC或M13中克隆此片段；缺失部分編碼序列或在讀框內引入終止密碼子；以及將修飾過的creA基因導入areA突變體如米曲霉NF2(CNCM1882)。然后可以在含有蛋白質(即0.2％大豆)和50mM葡萄糖的極限基本培養(yǎng)基(見下面)上，根據它們的生長能力選擇creA-areA雙重突變體，而areA突變體將不能生長。
在確定野生型背景中適當修飾的構建體被有效地轉移時使用了一種標記如抗性基因，在分離出具有所需特性的creA突變體之后可以從霉菌的基因組刪除這種抗性基因。用于克隆、將突變和/或缺失導入給定的基因、以及將DNA序列導入微生物的技術是本領域已知的，并且可以參考Maniatis等的同上著作。
下面的實施例將對本發(fā)明作進一步說明。菌株和質粒用于擴增creA基因的構巢曲霉G332(pabaA1，yA2，xprD1)是通過Dr.A.J.Clutterbuck從Glesgow基因保存中心獲得。米曲霉TK3(af1R1，omA1)是從洛桑Nestle菌株收集研究中心獲得。米曲霉NF1(PyrG1)是米曲霉TK3的尿苷營養(yǎng)缺陷型衍生株，已通過定向破壞使其中編碼乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶的PyrG基因失活。米曲霉NF2(CNCM1882)是areA被破壞的突變體，來源于如在EP97111378.2中所描述的米曲霉NF1。
載體lambda Gem-12是從Promega獲得，pUC19(yanisch-PerronC，Vieire，J.和Messing.J.改進的M13噬菌體克隆載體和宿主菌株M13mp18和pUC19的核苷酸序列)是從美國新英格蘭Biolabs公司獲得。培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(MM)每升含有1.5g KH2PO4(Merck，Darmstadr，F(xiàn)RG)，0.5g MgSO4·7H2O(Merck，Darmstadt，F(xiàn)RG)，0.5g KCl(Merck)。為了選擇突變體，對MM加入了50mM葡萄糖(Merck，Jar-mstadt，F(xiàn)RG)，0.2％大豆蛋白(蛋白質技術國際組織)和2％惰性瓊脂。在含有0.08％脫氧膽酸鈉(Fluka，Buchs，瑞士)和0.2％大豆蛋白作唯一碳源和氮源的MM上，或者在含有1％脫脂牛奶(Difco)和2％惰性瓊脂(Difco)的MM上進行蛋白酶的培養(yǎng)板測定。實施例1分離creA突變體為了分離出與蛋白水解活性產生有關的creA突變體，如在EP97111378.2中所述制造了areA無效突變體。進而紫外線照射108個米曲霉NF2(CNCM1882)的分生孢子，并種植在含有0.2％大豆蛋白，50mM葡萄糖和2％惰性瓊脂(Difco)的極限基本培養(yǎng)基上。選擇出孢子形成的四個集落，定名為NF14-NF17，發(fā)現(xiàn)它們在存在50mM葡糖糖時對15mM烯丙醇敏感，表明這四個突變體是creA突變體。而且顯示在存在葡萄糖時NF14-NF17能分泌蛋白酶。實施例2分離ereA基因在低嚴格條件(55℃，5XSSC，1％SDS)下，以包含構巢曲霉creA基因編碼區(qū)的1.3KB PCR產物篩選GEM 12中米曲霉TK3(同上述)的基因組文庫。
繁殖總共100個陽性克隆，并通過增加溫度至大約60℃在稍微增加嚴格度的條件下再次與此探針雜交。按下面分離出了三個最強雜交克隆。
從作為7.3KB Bam HI片段的Gem 12亞克隆米曲霉creA基因。通過DNA印跡分析表明其編碼區(qū)定位在已亞克隆進入pUC19的4.3KBPstI-SphI片段上，產生了pNFF212，并對此片段進行了完全測序。在下面給出了米曲霉creA基因的核苷酸序列和所推斷的氨基酸序列。對在推定的啟動子區(qū)中適合CREA DNA-結合位點SYGRGG共有序列(Kulmburg等，1993)的基元序列下面加單線并以粗體字標示。對CREA蛋白(Dowzer等1989)中包含DNA-結合的C2H2鋅指區(qū)的區(qū)域下面加雙線并以粗體字標志。
800 TCTCGCACAGCATGAGCCGTTCTCACTTTCACGAGGACGAGGATGGTTACACTCATCGCG859leSerHisSerMetSerArgSerHisPheHisGluAspGluAspGlyTyrThrHisArgV860 TCAAGCGCTCAAGGCCTAACTCACCAAACTCGACCGCTCCGTCCTCACCGACTTTCTCTC919alLysArgSerArgProAsnSerProAsnSerThrAlaProSerSerProThrPheSerH920 ACGACTCTCTTTCCCCAACGCCAGACCACACTCCGTTGGCAACCCCTGCTCATTCGCCAC979isAspSerLeuSerProThrProAspHisThrProLeuAlaThrProAlaHisSerProA980 GCTTGAGGTCATTGGGATCTAGCGAACTCCACCTTCCTTCGATTCGCCATCTGTCCCTCC1039rgLeuArgSerLeuGlySerSerGluLeuHisLeuProSerIleArgHisLeuSerLeuH1040 ATCACACCCCTGCCCTTGCTCCAATGGAGCCCCAGCCGGAAGGCCCCAACTATTACAGTC1099isHisThrProAlaLeuAlaProMetGluProGlnProGluGlyProAsnTyrTyrSerP1100 CCAGCCAGTCTCATGGTCCCACAATCAGCGATATCATGTCCAGACCCGACGGAACACAGC1159roSerGlnSerHisGlyProThrIleSerAspIleMetSerArgProAspGlyThrGlnA1160 GTAAACTGCCCGTTCCACAGGTTCCCAAGGTCGCGGTGCAAGATATGCTGAACCCCAGCG1219rgLysLeuProValProGlnValProLysValAlaValGlnAspMetLeuAsnProSerA1220 CTGGGTTTTCGTCGGTTTCCTCATCGACGAATAACTCTGTCGCAGGAAATGATTTGGCAG1279laGlyPheSerSerValSerSerSerThrAsnAsnSerValAlaGlyAsnAspLeuAlaG1280 AACGTTTCTAGCCTGGTGCGGCTGCGAAACCCTTTCAATGTATAAAGTTTTGGGCTCAAA1339luArgPheEnd1340 AAAAATTCTTGACTGTCATACGCGCTACGAAACGAATAGACTTTGTGCATTTACAGTGCG13991400 TGGTTCATGGGCATCCTTGGTGTCGGCTGGCTTTCTTTGCTTACTTTGTTCGAGTATACT14591460 TTTGCGAGGCGTCCATAGTGATAGACGGGTGGGATATTCTTGTGGCTTTTTCCGTGCTTG15191520 TTCGATTCTCCCCTTTCGCTCTCCTTGAAAAATACCTTTCTTATCCTATAACCATTTGTT15791580 TCATTATCCCAATGGGAATTGGCTCTACAGCTCTTATTCATTTTGTCTACTCCTCTCCTG16391640 AGGCCCAGTCCCCTGATAATTCCGGGCTCTACCATATACATTTCATTTCGACTATGTCAG16991700 TTTCCGCTTCGATTTAGACCTCGAGCAGGACGAGAGGGTTCCGAAAGAAAATACAAACAA17591760 AAATTATAGTAATCTGCGTTTACTTTGGCATAATACAGTAGTCATTAGTTGAGGTAGGCA18191820 TAATCTGGATGTCTAACCATCACTTGCCCTAACCTCCTACCATCTGCTGCTAGTATTTGT18791880 CTTACCCGAAACCCAATTCAACGAGATAGATGGATTGACGAATAACAATTTGTTGTCCAG19391940 CGACATGCATGATACATGCGTACGTACATACACTAATAGTAGTCACAGACCAGTTCATCA19992000 CATCCTGGTCTCGGGTATTCAGATACGGAAATGCGTAAGATTGGAAGGGTCTAAGAAAAA20592060 GCAAAGAAAAAGGAAAAGTTAACACTGGCTGGCGCTCTCTTTCCATCTCTGATCAATGTT21192120 ATTGTTCGTCACTCAGCTGTGGACGTGGCTCCAGTCAAGTTGTGAATTATGATAGGGTAT21792180 TGTTGACTTGACAAGTTGATCTTGATGGAATCAAATCTTCTCCCCGCCAGATTCTGACGC22392240 TTGAGGCTCTCGGATCGAATGAACAACTTTTCGCACCACATCAACCGGTTGCCGCGTGAT22992300 GCTGGAGACAAACCGACCCAAACGTCACGGTCACACGGAGGATACGTTTGCTAGAGCCAG23592360 CTGATACCCCAAGAGACAAGAAGGTAAAGGTCGCAAAAATCTTTTCAATAAGATGGCATC24192420 TTCCCCCCACCAACCCTTAACCATTCTCCTTTCAAGCTGTGTTGCCCCGCTTTGGTGCAT24792480 GGGCTTGGGTAGTGCGGTCGCAAAACTACTAATTTAATGACCGACTGCTGCTGCTTTTTC25392540 ACTCGCCGCTCACGGACTAAGCATGTGGGAACAGGATCGCCCCGTCACTATTTCAGATCG25992600 TGTCGTATCAAGGTGTTCGCCCGGTGCTGCTGGCACGAACGCCGGCCATCCAAGATCATT26592660 GTTCTCATTCAAACCGGGCGGCTTACGTCTAGCCGCGGACGTAAGCACGAAGAGTGTGTG27192720 TAGTGGTGGGAGTGAAGCCGTTGCCGAAACCATGCCGTCCTCCACGGCCGTCCCGTCGTT27792780 ATCAAGCGACGCTGCCTCCGCTTCATCCTCATCAGCGGGTGTATCTCTGGAGACAAGATG28392840 GGCGGAAGGTCTCACCGGCCAGGAGATATTAGAAGACGATGGAACGGGCGCGCTCGTCGT28992900 CCCGCCGTCCCGCCCTGCTCGGCAATATCATCACCATACCTATATCTGTCTGTTcTATAT29592960 CTTAGATTGTCACCACACCTTCGACGATGTCGAGCAATGGAAGACTCACGTTCTGAGCCA30193020 CTTCCGAACCCACGAACCACCGCGAACAGCCCGATGCCCTCTATGTCCGGGTGAGCGGTT30793080 CAGCGACACCCCCGAACAGAAAGGATGGGATCGCATGC 3117實施例3對creA基因的基因修飾在此DNA序列中，在位置+226-228和+229-231導入終止密碼子，將編碼二肽TyrLys的序列TACAAG改變成了TAGTAG(終止終止)，如在快速變換方案(Stratagene，Basel)中所描述的，使用寡核苷酸序列 CTTCCCCGTCCATAGTAGTGTCCCCTGTG和它的互補序列CACAGGGGACACTACTATGGACGGGGAAG，通過定點誘變將此突變導入pNFF212。
這種突變將導致截去此DNA結合鋅指功能區(qū)creA基因產物的N-末端。通過將此構建體導入A.oyrzaeNF2(CNCM1882，EP97111378.2)，在含有0.2％大豆蛋白和50mM葡萄糖，以2％惰性瓊脂固化的MM平板上培養(yǎng)此微生物時，可直接選擇creA-areA雙重突變體。實施例4對creA基因的修飾進而可按如下方法從此霉菌基因組中刪除creA基因。用EcoRI部分地消化pNFF212，并從瓊脂糖凝膠中回收此線性分子。去磷酸化并連接于來自pNFF38(A.Doumas，Pvan den Broek，M.Affolter，M.Mornod(1998)對來自日本酒曲霉米曲霉的脯氨?；幕拿富?dppIV)的特征鑒定，應用與環(huán)境微生物學64，4809-4815)的1843bp構巢曲霉pyrG片段，產生了pNFF234。在pNFF234中，creA編碼區(qū)被功能性構巢曲霉pyrG基因中斷，截去了緊靠此DNA結合的鋅指區(qū)下游的基因產物。
為了獲得creA突變體，用BstXI消化pNFF234，并通過轉化將它導入米曲霉NFl。在不含尿苷的MM上選擇出原代轉化體，并在有50mM葡萄糖存在時篩選它們對烯丙醇和Fluor-乙酸鹽的超敏感性。然后通過DNA印跡分析或PCR測定敏感轉化體是否存在所需的基因取代。實施例5對表達的測定為了進一步證明creA基因中的突變，進行了如下幾種測定。
1)淀粉酶測定使實施例1中獲得的菌株生長在含有1％淀粉和50mM葡萄糖作碳源的極限基本培養(yǎng)基(同上述)上。在這些條件下，其中的淀粉酶被葡萄糖抑制的野生型菌株當用KI溶液染色時將不產生染色環(huán)。與此相反，creA突變體將產生染色環(huán)，因為淀粉酶的表達不再被葡萄糖抑制。
2)乙酰胺酶測定。
當生長在含有乙酰胺和葡萄糖作碳源的極限基本培養(yǎng)基(同上述)時，還可以測定菌株的乙酰胺酶活性。在這些條件下野生型菌株不產生乙酰胺酶活性，而creA突變體能產生。
3)透明環(huán)的產生在含有1％脫脂牛奶和50mM葡萄糖的極限基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板上(開始培養(yǎng)板顯得混濁)，30℃二天之后，creA突變體表現(xiàn)出透明環(huán)，而野生型菌株不顯示。
權利要求
1.一種屬于曲霉屬、根霉屬、毛霉屬或青霉屬的日本酒曲霉，它的蛋白水解活性不被碳抑制。
2.按權利要求1的日本酒曲霉，其中的creA基因不行使其固有的功能。
3.按權利要求2的日本酒曲霉，其中的creA基因不被轉錄為能夠被翻譯成功能性多肽的mRNA。
4.按權利要求1-3中任何之一的日本酒曲霉，其中已使creA基因突變，致使它的基因產物基本上沒有功能。
5.按權利要求1的日本酒曲霉，其中已使其creA基因缺失。
6.按權利要求1的日本酒曲霉，它是米曲霉I-2165(NF14)。
7.按權利要求1-5的日本酒曲霉，已使其中的areA基因或它的功能性衍生物過度表達。
8.一種產生蛋白水解酶的方法，包括培養(yǎng)權利要求1-7的日本酒曲霉并可任選地以濃縮物形式分離出此酶，是在此霉菌可表達蛋白水解酶的條件下在存在碳源的適當培養(yǎng)基中培養(yǎng)此霉菌。
9.權利要求1-7的日本酒曲霉用于水解含蛋白質原料的用途。
10.權利要求8的用途，與酶和/或提供氨酰基脯氨酸二肽酶活性的微生物組合。
全文摘要
本發(fā)明是關于一種日本酒曲霉菌,它能夠在有碳源存在時以至少像不存在碳源時相同的量表達蛋白水解酶。特別是本發(fā)明涉及以creA基因突變作為手段,以便在有碳源存在時增加廣泛多種蛋白水解酶的量。
文檔編號C07K14/37GK1343253SQ00804882
公開日2002年4月3日 申請日期2000年3月2日 優(yōu)先權日1999年3月11日
發(fā)明者M·阿福爾特, J·德羅伊, P·范登布雷科 申請人:雀巢制品公司