專利名稱：：6-O-β-D-葡萄糖基-3,6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及6-0-p-D-葡萄糖基-3，6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的制備方法，屬于醫(yī)藥
技術領域：
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背景技術：
：化合物6-0-p-D-葡萄糖基-3,6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷(以下簡稱化合物l)，見化學式(I):化合物1能夠提高機體免疫力，據(jù)文獻報道，在PHA刺激下，其能顯著誘導IL-2活性，且提高率高達80.9%,而對照組僅有51.1%，并在LPS刺激下，可誘導IL-1p和IL一8活性[Yesilada，E，Bedir,E,Calis，I,7^h/"/'，f,。力邁ofo，f.EffectsoftriterpenesaponinsfromAstragalusspeciesoninvitrocytokinerelease.J.Ethnopharmacology2005;96:71-77]。IL-2是一種由T細胞激活的細胞因子，具有顯著的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用；IL-lP可激活T細胞和巨噬細胞，并有抗菌活性；IL-8也是一種常見的中性粒細胞趨化性細胞因子，可提髙炎癥應答。此外，在ConA誘導下，ljig/ml化合物1可明顯刺激脾細胞增殖<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>7fe^'aJ.，Asa《Ma/.CycloartaneandoleananesaponinsfromEgyptianAstragalusspp.asmodulatorsoflymphocyteproliferation.PlantaMed.2002;68:986-994]。但化合物1的多為化學合成，鮮有從植物中提取或者其他途徑獲得的報道。CH2OH藥用真菌新型(雙向性)固體發(fā)酵工程(簡稱雙向發(fā)酵)的是將發(fā)酵菌種和發(fā)酵基質(zhì)所構成發(fā)酵組合內(nèi)的發(fā)酵基質(zhì)，由以往僅由富含碳、氮等營養(yǎng)的農(nóng)副產(chǎn)品(甘蔗渣、麥麩等)構成的營養(yǎng)基質(zhì)(其產(chǎn)品稱藥用菌質(zhì))，改變?yōu)椴捎镁哂幸欢ɑ钚猿煞值闹兴幉淖鳛樗幮曰|(zhì)，以確保既能提供真菌生長所需營養(yǎng)又能因真菌產(chǎn)生的酶而改變中藥材組織、成分，從而產(chǎn)生新的性味功能，故具有雙向性,其產(chǎn)品稱藥性菌質(zhì)，如兼用營養(yǎng)、藥性兩種基質(zhì)則稱為全性基質(zhì)，產(chǎn)品也稱藥性菌質(zhì)。藥性菌質(zhì)，?？杀仍撜婢蛩幮曰|(zhì)本身或兩者簡單相加有更良好的藥效，主要表現(xiàn)在增效、擴用、解毒等方面。申請?zhí)枮?00610038850.6,名稱為中藥多菌種混合固體發(fā)酵技術及其應用的發(fā)明專利申請公開說明書公開了采用混合中藥材和混合菌種雙向發(fā)酵制備用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)藥物和飼料添加劑；專利號為ZL200510038072.6,名稱為一種飼料添加劑及其制備工藝和在制造預防禽流感的飼料中的應用的發(fā)明專利說明書公開了應用全性基質(zhì)和藥用真菌混合發(fā)酵制備飼料添加劑的制備方法。應用雙向發(fā)酵法制備純品化合物的報道尚未見報道。
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種應用生物轉化方式制備6-0-p-D-葡萄糖基-3，6,16，25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的方法。本發(fā)明是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一種制備6-0-3-D-葡萄糖基-3，6,16,25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的方法，包括以下步驟1、生物轉化方式制備固體發(fā)酵物(1)將中藥粉碎，過篩，調(diào)節(jié)至適宜的含水量，滅菌，得含中藥的固體培養(yǎng)基；(2)將固體培養(yǎng)基干重量5-15%的藥用真菌接種在上述固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24-30°C，發(fā)酵濕度為45-60%,發(fā)酵時間為30-45天，得固體發(fā)酵物；(3)收集固體發(fā)酵物，經(jīng)50-70。C干燥，粉碎處理；其中，步驟(1)中藥為黃芪或黃芪渣；步驟(2)藥用真菌為靈芝菌、猴頭菌、灰樹花菌、云芝菌、槐耳菌、香菇菌中的任一種，優(yōu)選靈芝菌；2、將烘干粉碎處理的固體發(fā)酵物提取分離化合物(1)取步驟l獲得的干燥固體發(fā)酵物粉粒適量，乙醇回流提取，回收溶劑，得浸膏；(2)將浸膏用水溶解，用水飽和的正丁醇萃取，蒸干溶劑，得萃取物；(3)萃取物用硅膠柱層析，用氯仿-甲醇混合物(v/v:10:0-10:5)洗脫，合并相同餾分，揮去溶劑；(4)加入中性氧化鋁，氧化鋁柱干法層析，氯仿-甲醇混合液(v/v:10:0-10:5)洗脫，揮去溶劑，得式(I)的化合物；其中，步驟(l)中的乙醇濃度為70%,回流提取2次，每次2h;步驟(2)中，水飽和的正丁醇萃取之后用1%的NaOH溶液和水飽和的正丁醇洗滌；步驟(3)、(4)中，層析方法為干法層析。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明使用廢棄的中藥材黃芪藥渣與靈芝菌絲體進行固體發(fā)酵制備目的化合物，簡單易行，既環(huán)保，又可以變廢為寶。提取分離過程中未采用大孔樹脂法富集化合物，省去反復活化處理大孔樹脂的步驟；合并的正定醇液釆用1%氫氧化鈉溶液洗滌，可除去大量酴酸性雜質(zhì)和有色色素；最后使用中性氧化鋁層析柱進行純化，有效地除去色素雜質(zhì)，可直接得到純品，無需重結晶，提高了純品的得率，值得推廣應用。圖l為本發(fā)明化合物l的質(zhì)譜圖2為本發(fā)明化合物1的紫外吸收光譜圖3為本發(fā)明化合物1的IR(KBr)圖譜；圖4為本發(fā)明化合物1的H'-NMR圖譜。具體實施例方式下面將結合附圖，詳細說明本發(fā)明的具體實施例方式以下各實施例組分的重量均按干重計算。實施例1固體發(fā)酵物的制備取黃芪藥渣，粉碎，過10目篩，加水，使黃芪藥渣含水量為52%,裝入IO個培養(yǎng)瓶，12(TC滅菌2小時；冷卻后，接種10%的靈芝菌，溫度調(diào)節(jié)為27。C，發(fā)酵32天，即得固體發(fā)酵物；收集面體發(fā)酵物，經(jīng)6(TC烘干，測含水量8%，粉碎處理。實施例2固體發(fā)酵物的制備取黃芪藥渣，粉碎，過10目篩，加水，使黃貧藥渣含水量為45%,裝入IO個培養(yǎng)瓶，12rC滅菌l.5小時；冷卻后，接種5%的靈芝菌，溫度調(diào)節(jié)為25。C,發(fā)酵45天，即得固體發(fā)酵物；收集固體發(fā)酵物，經(jīng)5(TC烘干，含水量10%粉碎處理即得。實施例3固體發(fā)酵物的制備取黃芪藥渣，粉碎，過10目篩，加水，使黃芪藥渣含水量為60%,裝入IO個培養(yǎng)瓶，121'C滅菌2小時；冷卻后，接種15%的槐耳菌，溫度調(diào)節(jié)為3(TC，發(fā)酵40天，即得固體發(fā)酵物；收集固體發(fā)酵物，經(jīng)7(TC烘干，含水量6%粉碎處理即得。將實施例1得到的干燥粉碎的固體發(fā)酵物提取分離取固體發(fā)酵物粉粒lkg,加70%乙醇提取液回流提取2次，每次2小時，合并2次的提取液，減壓回收乙醇至稠膏狀，得浸膏。將浸膏加適量水溶解，水溶液用水飽和的正丁醇振搖萃取3次，合并正丁醇液，用l。/。NaOH溶液充分洗滌2次，再用正丁醇飽和的水洗滌1次，正丁醇液蒸千，得萃取物。殘渣拌入硅膠，干法上硅膠柱，氯仿與甲醇混合液(V/V=10:2)洗脫，每份取8亳升，合并相同餾分，放置，揮去溶劑，拌入中性氧化鋁，干法上氧化鋁柱，氯仿與甲醇混合液(V/V=10:3)洗脫，合并相同餾分，放置，揮去溶劑，得化合物1純品100mg,得率為40.1%。黃芪藥渣為黃芪藥材提取后的剩余物，通常被作為廢棄物處理，但藥渣常含有未被提取完全的有效成分，本發(fā)明所用原料黃芪藥渣中就含有黃芪甲苷成分，根據(jù)表l結果，可得知化合物1來源于黃貧甲苷的生物轉化。黃貧甲苷是黃芪藥材及其藥渣的原生苷，化合物1則是黃芪甲苷水解失去一分子糖后生成的次生苷。即黃芪藥渣在與靈芝菌種發(fā)酵過程中產(chǎn)生了可以水解黃疾甲苷并得到化合物1的酶，所以可推斷，只要在發(fā)酵過程中與黃芪藥材或藥渣生成該水解酶的菌種均可產(chǎn)生化合物1。表l各樣品中黃芪甲苷和化合物1的含量樣品黃芪甲苷(°/)化合物1(%)藥渣和靈芝發(fā)酵前0.0350藥渣和靈芝發(fā)酵后o0.030發(fā)酵前空白樣品o0發(fā)酵后空白樣品o0黃芪藥渣0.0370表2不同種類樣品提取獲得化合物1的含量樣品取樣量(g)化合物1含量(％)化合物1得率(°"化合物l標準品(685ug/ml)培養(yǎng)基為10%藥渣+90%農(nóng)副產(chǎn)品的樣品30.92250.00329510.4培養(yǎng)基為20%藥渣+80/。農(nóng)副產(chǎn)品的樣品29.92460.00710515.3培養(yǎng)基為30%藥渣+70%農(nóng)副產(chǎn)品的樣品30.54330.00912121.6培養(yǎng)基為40%藥渣+60°/。農(nóng)副產(chǎn)品的樣品30.36480.0120029.7培養(yǎng)基為100%藥渣16.905940.0300240.1黃芪甲苷是黃芪或其藥渣中的有效單體成分，而化合物1來源于黃疾甲苷的轉化，因此，理論上，固體培養(yǎng)基中黃芪的比重越大，黃芪甲苷的含量亦越高，化合物l的含量也就越大，表4提供的實驗數(shù)據(jù)也說明了這一點?；衔锢砘卣骷肮庾V數(shù)據(jù)-.白色粉末，m.p.181.5~182.5。C,FABMS(圖1):切/z675[M+Na]+，/々653[M+H]+，歷々691[M+K]+，確定其分子式為C36H6。010。紫外吸收光譜顯示(圖2):最大吸收波人max-206nm。IR(KBr)(圖3):V,(cnf1):3388.7(OH)，2968.6(環(huán)丙烷基)，2933.5(CH2),2872.4(CH3)，1454.1(CH2),1378.1(CH3)?！?NMR(500MHz,CD30D):見表3。表3:化合物1的'Hand13CNMR數(shù)據(jù)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>232.07，m27.0，t243.79,m82.6，d2572.5，s26L16，s26.8q27L29，s27.6，q281.32，s28.5，q290.98，s15.9，q301.05，s20.2，q1'4.36，d(7.7)104.9，d2'3.20,t(8.3)75.7，d3'3.34，t(1.3)78.7，d4'3.30,m71.8，d5'77.8，d6'3.87，dd(1.6，11.5),6'a;3.68,dd(5.2,11.5),6'b63.0，t綜合以上光譜分析，確定化合物的結構為6-O-P-D-葡萄糖基-3，6，16，25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷。以上已以較佳實施例公開了本發(fā)明，然其并非用以限制本發(fā)明，凡采用等同替換或者等效變換方式所獲得的技術方案，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。權利要求1、一種結構如式(I)的四羥基環(huán)菠蘿蜜烷型三萜皂苷化合物。2、一種權利要求l的化合物的制備方法，包括以下步驟(1)生物轉化方式制備固體發(fā)酵物(a)將中藥粉碎，過篩，調(diào)節(jié)至適宜的含水量，滅菌，得含中藥的固體培養(yǎng)基；(b)將固體培養(yǎng)基干重量5-15%的藥用真菌接種在上述固體培養(yǎng)基中，發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24-30匸，發(fā)酵濕度為45-60%，發(fā)酵時間為30-45天，得固體發(fā)酵物；(c)收集固體發(fā)酵物，經(jīng)50-70'C干燥，粉碎處理，備用；(2)將烘干的固體發(fā)酵物提取分離化合物(a)取步驟(1)獲得的干燥固體發(fā)酵物粉粒適量，乙醇回流提取，回收溶劑，得浸膏；(b)將浸膏用水溶解，用水飽和的正丁醇萃取，蒸干溶劑，得萃取物；(c)萃取物用硅膠柱層析，用氯仿-甲醇混合物洗脫，合并相同餾分，揮去溶劑；(d)加入中性氧化鋁，氧化鋁柱層析，氯仿-甲醇混合液洗脫，揮去溶劑，得式(I)的化合物。3、根據(jù)權利要求2所述的一種權利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(1)中，步驟(a)所述中藥為黃芪或黃芪渣；步驟(b)所述藥用真菌為在發(fā)酵過程中能與黃貧藥材或其藥渣生成可水解黃芪甲苷得到化合物1的酶的菌種。4、根據(jù)權利要求2或3所述的一種權利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(l)、(b)中，所述藥用真菌選自靈芝菌、猴頭菌、灰樹花菌、云芝菌、槐耳菌、香菇菌中的任一種。5、根據(jù)權利要求4所述的一種權利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(1)、(b)中，所述藥用真菌優(yōu)選靈芝菌。6、根據(jù)權利要求2所述的一種權利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，步驟(a)中的乙醇濃度為70%，回流提取2次，每次2h;步驟(b)中，水飽和的正丁醇萃取之后用NaOH溶液和水飽和的正丁醇洗滌；步驟(c)、(d)中，層析方法為干法層析，氯仿-甲醇混合物中兩者的體積比10:0-10:5。7、根據(jù)權利要求2或6所述的一種權利要求1的化合物的制備方法，其特征在于，步驟(2)(b)中，NaOH溶液的濃度為1%。全文摘要本發(fā)明公開了一種6-O-β-D-葡萄糖基-3，6，16，25-四羥基環(huán)菠蘿蜜烷的制備方法，首先將藥用真菌接種于中藥材或其藥渣組成的固體培養(yǎng)基中，在一定的發(fā)酵條件下，發(fā)酵，收集固體發(fā)酵物，干燥、粉碎提取分離后，即可獲得本品。本發(fā)明簡單易行，實現(xiàn)變廢為寶，提取分離過程中未采用大孔樹脂法富集化合物，省去反復活化處理大孔樹脂的步驟；將合并的正定醇萃取液采用氫氧化鈉溶液洗滌，可除去大量酚酸性雜質(zhì)和有色色素，最后使用中性氧化鋁層析柱進行純化，有效地除去極性與目標成分相似的色素雜質(zhì)，可直接得到純品，無需重結晶，提高了純品的得率，值得推廣應用。文檔編號C07J53/00GK101376669SQ20081015622公開日2009年3月4日申請日期2008年10月7日優(yōu)先權日2008年10月7日發(fā)明者劉維周,張李陽,鳴阮,陳玉勝,霍光明,饒玉鵬申請人:南京曉莊學院