專利名稱：鉤端螺旋體InvA蛋白的制備及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及鉤端螺旋體InvA蛋白(invasion associated protein)。本發(fā)明的InvA蛋白與鉤體的致病力有關(guān)，并具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
背景技術(shù)：
鉤端螺旋體是系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化上結(jié)構(gòu)和遺傳特征都較特殊的一類微生物，它所導(dǎo)致的鉤端螺旋體病是在世界范圍內(nèi)流行的人獸共患的自然疫源性疾病。我國是鉤體病高發(fā)國家，近幾十年來曾有數(shù)次大規(guī)模的流行，給農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)造成極大的損失。雖然近年來總體發(fā)病率及死亡率已有下降，但各種流行因素(如洪澇、地震等自然災(zāi)害)依然存在，極有可能導(dǎo)致局部或全面暴發(fā)流行，加上近年來流行菌群的更迭，鉤體病仍然嚴(yán)重威脅著我國人民的健康。1995年，鉤體病被列入法定傳染病。
賴型鉤體是我國獨(dú)有的菌型，也是最主要的流行菌型之一，它毒力強(qiáng)，流行范圍廣，可引起腎炎、黃疸、腦炎尤其是急性肺彌漫性大出血(PDH)而致口鼻涌血死亡。近年有學(xué)者對鉤體脂多糖，鞘磷脂酶H，外膜蛋白OmpL1、LipL41和LipL21等進(jìn)行了研究，但目前對鉤體病發(fā)病機(jī)理和免疫保護(hù)機(jī)制的認(rèn)識仍不十分清楚，對多數(shù)致病因子在體內(nèi)的功能和作用靶點(diǎn)知之甚微。
我國在鉤體病的防治方面取得了巨大的成功，但對該病的致病、免疫機(jī)理，疫苗的高效安全廣譜保護(hù)等問題仍未解決。鉤體的致病及免疫作用為研究的熱點(diǎn)。因此，本發(fā)明從賴型鉤體的基因組克隆出鉤體致病相關(guān)基因invA，表達(dá)并純化該蛋白，進(jìn)一步分析表明蛋白對體外培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖作用。本發(fā)明的鉤體InvA蛋白，可用于開發(fā)相關(guān)基因工程藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明，通過基因工程技術(shù)，將鉤端螺旋體invA基因裝載在合適的載體中，將要其轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，在體外表達(dá)、純化得到高純的InvA融合蛋白，并發(fā)現(xiàn)該蛋白具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
具體實(shí)施例方式
1)以賴型鉤端螺旋體017株基因組為模板，設(shè)計外膜蛋白基因invA引物，克隆invA基因。
2)通過基因工程手段，將克隆的外膜蛋白的InvA基因轉(zhuǎn)入pET32a(+)載體，轉(zhuǎn)化人表達(dá)宿主細(xì)胞，例如E.coli BL21(DE3)。
3)在體外誘導(dǎo)表達(dá)Trx-InvA融合蛋白，通過SDS-PAGE凝膠電泳和Western blotting等分子生物學(xué)手段進(jìn)行鑒定分析。
4)采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白分離純化技術(shù)，純化表達(dá)蛋白。如離心、離子交換層析、疏水層析、親和層析、高效液相色譜等。
5)純化得到InvA蛋白。
6)以純化的InvA蛋白進(jìn)行功能分析和鑒定，如加入ANA-1細(xì)胞，以XTT等方法檢測細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)能明顯的促進(jìn)ANA-1等細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例實(shí)施例1鉤端螺旋體InvA蛋白疫苗的制備用常規(guī)的基因工程方法，從鉤端螺旋體基因組中克隆出invA基因，將鉤端螺旋體外膜蛋白invA基因插入融合表達(dá)載體pET32a(+)，表達(dá)的受體菌選用大腸桿菌BL21(DE3)。常規(guī)條件發(fā)酵后，提取重組菌體蛋白，然后進(jìn)行SDSPAGE電泳，分子量與預(yù)測值吻合。大腸桿菌表達(dá)的外膜蛋白InvA是Trx融合蛋白，通過親和柱分離純化，得到純化的鉤端螺旋體Trx-InvA蛋白。
實(shí)施例2ANA-1細(xì)胞的增殖試驗(yàn)小鼠骨髓巨噬細(xì)胞株ANA-1以含10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，CO2濃度5％。細(xì)胞活力以臺盼藍(lán)染色檢測。收集ANA-1細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個/ml，在96孔板中每孔加人100μl細(xì)胞，加入50μl Trx-InvA蛋白至終濃度分別為0.125μg/ml、0.25μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml及2μg/ml，每個濃度重復(fù)3孔，以PBS為陰性對照，只加培養(yǎng)液作空白對照。37℃，5％CO2培養(yǎng)72h后，滴加10μl 1mg/ml XTT和1.5μl 10mM Vitamin K3繼續(xù)培養(yǎng)4h，在450nm波長測定OD值。結(jié)果表明當(dāng)?shù)鞍诐舛刃∮?.5μg/ml時對ANA-1細(xì)胞有明顯的促進(jìn)增殖作用，且具有濃度依賴關(guān)系。但濃度為1μg/ml和2μg/ml增殖速度稍有降低。
賴型鉤端螺旋體InvA蛋白的氨基酸序列1-50 MDKPYRKNVGMVVFNSRGEVLVGERLNFLGSCQFPQGGIDDDEDPIKAAM51-100 RELYEEVGIDSGKIVAEYPDWISYDFPENLLLNRHLQKYRGQLQKWFLIY101-150WDGEVDQCDLDIHEREFGTVRFIPIKNTLNTVVPFKKDVYYKIVNDFGPK151-162IQNFLQDIGNRS
權(quán)利要求
1.一種鉤端螺旋體蛋白InvA。其特征在于，為賴型鉤體017株的致病相關(guān)蛋白，該蛋白具有提高細(xì)胞存活能力，并促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。
2.如權(quán)利要求1所述的蛋白InvA，其特征在于，包含完整的蛋白，與其它蛋白融合或其保守性多肽，活性片段等多種存在形式。
3.InvA蛋白具有提高細(xì)胞生存能力和促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，其特征在于，InvA能增強(qiáng)鉤體在各種應(yīng)激狀態(tài)(如缺氧、高溫等)時的存活能力，也可對異種細(xì)胞(如小鼠骨髓巨噬細(xì)胞株ANA-1)具有促進(jìn)增殖的作用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及鉤端螺旋體蛋白InvA(invasion associated protein)。本發(fā)明的InvA蛋白與鉤體的致病力有關(guān)，并具有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用?？捎糜陂_發(fā)相關(guān)基因工程藥物。
文檔編號C07K14/20GK1690075SQ200410022370
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者鮑朗, 朱慶平, 張會東 申請人:四川大學(xué)