本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的方法及引物。

背景技術(shù)：

aldh2基因編碼的乙醛脫氫酶和adh1b基因編碼的乙醇脫氫酶是酒精代謝過程中的關(guān)鍵酶，乙醇脫氫酶負(fù)責(zé)將乙醇(酒的成分)氧化為乙醛，生成的乙醛作為底物進(jìn)一步在乙醛脫氫酶催化下轉(zhuǎn)變?yōu)闊o害的乙酸(醋的成分)。編碼基因的多態(tài)性造成酶催化能力的改變會影響酒精代謝進(jìn)而引起乙醛等有害物質(zhì)的堆積，影響身體健康。其中aldh2基因存在的g1510a多態(tài)性(rs671)會導(dǎo)致氨基酸序列第487位上的谷氨酸被賴氨酸所替換(即，glu487lys)，具有催化活性的野生型稱為g等位基因(即，aldh2*1)，而催化能力顯著降低的突變型稱為a等位基因(即aldh2*2)。adh1b基因存在的a143g多態(tài)性(rs1229984)會導(dǎo)致氨基酸序列第48位的組氨酸被精氨酸所替換(即，his48arg)，野生型a等位基因(即，adh1b*1)會減緩乙醇代謝，突變型稱為g等位基因(即，adh1b*2)可導(dǎo)致乙醇脫氫酶活性極大增強(qiáng)，乙醇代謝至乙醛的速度較快，促進(jìn)了體內(nèi)乙醛的堆積。乙醛毒性高于乙醇，是造成宿醉的主要原因之一。

硝酸甘油具有舒張血管，降低心臟前后負(fù)荷，擴(kuò)張冠狀動脈，減少心肌耗氧等作用，是治療心絞痛的經(jīng)典藥物。但臨床上部分病人在使用硝酸甘油時(shí)并不能迅速有效地緩解心絞痛。研究發(fā)現(xiàn)，起舒張血管作用的實(shí)際是由硝酸甘油轉(zhuǎn)化釋放的no所介導(dǎo)的，而在轉(zhuǎn)化過程中起關(guān)鍵作用的是乙醛脫氫酶。aldh2基因snp位點(diǎn)rs671多態(tài)性導(dǎo)致乙醛脫氫酶酶活性顯著降低，從而影響了硝酸甘油治療心絞痛的有效率。

焦磷酸測序技術(shù)(pyrosequencing)是一種新型的酶聯(lián)級聯(lián)測序技術(shù)，焦磷酸測序法適于對已知的短序列的測序分析，其可重復(fù)性和精確性能與sanger測序法相媲美，而速度卻大大的提高。在整個(gè)反應(yīng)體系中，以單鏈的pcr產(chǎn)物作為模板，測序引物與其退火結(jié)合，四種dntp按照既定的順序加到反應(yīng)體系中，dntp與模板鏈上的堿基互補(bǔ)結(jié)合，在dna聚合酶的作用下釋放與摻入量等摩爾數(shù)的焦磷酸基團(tuán)ppi。硫酸化酶催化釋放的ppi與腺苷-5'-磷酸硫酸酐形成等量的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosinetriphosphate,atp)，atp驅(qū)動熒光素酶介導(dǎo)的熒光素向氧化態(tài)轉(zhuǎn)化，并發(fā)生光信號。通過微弱光檢測裝置及處理軟件可獲得一個(gè)特異的檢測峰，峰值的高低則和相匹配的堿基數(shù)成正比，根據(jù)獲得的峰值圖即可讀取準(zhǔn)確的dna序列信息。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是，提供一種靈敏、準(zhǔn)確、操作簡便的新型檢測方法，實(shí)現(xiàn)對aldh2基因snp位點(diǎn)rs671型和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984型多態(tài)性的同時(shí)快速檢測，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測方法的不足。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的引物，包括seqidno.：1～4所示的擴(kuò)增引物、seqidno.：5～6所示的測序引物；其中seqidno.：1和seqidno.：3的5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；

其中，seqidno.：1～2所示引物對用于擴(kuò)增aldh2基因；seqidno.：3～4所示引物對用于擴(kuò)增aldh2基因；seqidno.：5所示測序引物用于snp位點(diǎn)rs671測序；seqidno.：6所示測序引物用于adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984測序。

其中，所述的酒精代謝基因?yàn)閍ldh2基因和adh1b基因。

上述焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的引物在在檢測aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性中的應(yīng)用在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

一種焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的方法，該方法包括如下步驟：

(1)提取dna模板；

(2)多重pcr：將seqidno.：1～4所示的4條引物混合，進(jìn)行多重pcr；

(3)單鏈純化：使用鏈霉親和素包被的磁珠對pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈純化；

(4)焦磷酸測序：將seqidno.：5～6所示的2條引物混合，進(jìn)行多重焦磷酸測序；

步驟(1)中，所述的dna模板為口腔黏膜細(xì)胞dna或edta抗凝全血的dna。

步驟(2)中，多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性2min，95℃變性25s，60℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。

步驟(2)中，seqidno：1～4所示引物濃度的比例是1：1。

步驟(4)中，seqidno：5～6所示引物的濃度是1：1。

步驟(4)中，設(shè)置測序序列：c/tgc/taggacag。

步驟(4)中，設(shè)置堿基加樣順序：actgctaga。

有益效果：

本發(fā)明提供了一種可以同時(shí)擴(kuò)增及檢測aldh2基因和adh1b基因序列片段的引物，該引物的特異性好，不會發(fā)生交叉反應(yīng)，準(zhǔn)確性好。此外，本發(fā)明提供的焦磷酸測序檢測序列和加樣順序，配合pcr擴(kuò)增引物和焦磷酸測序引物實(shí)現(xiàn)了一種在一次測序反應(yīng)中同時(shí)檢測aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性的焦磷酸測序方法。與傳統(tǒng)普通焦磷酸測序一次測序反應(yīng)中只能檢測一個(gè)snp多態(tài)性相比，本發(fā)明檢測的通量更高，有效減少檢測時(shí)間、人力和成本。同時(shí)，還具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確、特異性好、靈敏度高、檢測周期短、操作簡單并能有效滿足臨床檢驗(yàn)要求的優(yōu)點(diǎn)，可以為健康飲酒和硝酸甘油的臨床用藥提供指導(dǎo)。

附圖說明

圖1為aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984聯(lián)合測序法檢測結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)代表分配序列，縱坐標(biāo)代表儀器所采集到的熒光信號強(qiáng)度。

圖2為aldh2基因snp位點(diǎn)rs671焦磷酸檢測結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)代表分配序列，縱坐標(biāo)代表儀器所采集到的熒光信號強(qiáng)度。

圖3為adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984焦磷酸檢測結(jié)果圖，其中橫坐標(biāo)代表分配序列，縱坐標(biāo)代表儀器所采集到的熒光信號強(qiáng)度。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：引物。

針對aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984的基因多態(tài)性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了大量引物，通過引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好、不會發(fā)生交叉反應(yīng)且pcr反應(yīng)條件非常接近的引物。

擴(kuò)增aldh2基因序列片段的引物對：

f1(seqidno.：1)：5′-cggggagtggccgggagttgggc-3′，5’進(jìn)行生物素標(biāo)記

r1(seqidno.：2)：5′-cctcaagccccaacaggccctga-3′；

擴(kuò)增adh1b基因序列片段的引物對：

f2(seqidno.：3)：5′-cagcttctctttattctgtagat-3′，5’進(jìn)行生物素標(biāo)記

r2(seqidno.：4)：5′-cctaaaatcacaggaagggggg-3′；

aldh2基因snp位點(diǎn)rs671的焦磷酸測序引物：

seqidno：5：5′-actcacagttttcactt-3′；

adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984的焦磷酸測序引物：

seqidno：6：5′-accacgtggtcatctgt-3′。

實(shí)施例2：aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性的同時(shí)檢測。

1、提取edta抗凝全血的dna樣品：提取方法參照tianampblooddnakit(購自tiagen，貨號dp318)的說明書，將dna樣品稀釋至50ng/μl，備用；

2、多重pcr擴(kuò)增：

(1)配制pcr擴(kuò)增引物混合物，aldh2基因snp位點(diǎn)rs671及adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984的引物濃度比為1：1，引物混合物終濃度為10μmol/l，震蕩混勻微離心。pcr擴(kuò)增采用takarapcramplificationkit(購自takara公司，貨號r011)，以提取得到的樣本dna為模板，反應(yīng)體系如表1所示；

表1多重pcr擴(kuò)增體系

(2)多重pcr擴(kuò)增反應(yīng)條件包括：95℃預(yù)變性2mins，95℃變性25s，60℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min，結(jié)束后16℃保溫；

(3)pcr擴(kuò)增結(jié)束后，取pcr擴(kuò)增產(chǎn)物取5μl做瓊脂糖凝膠電泳檢測有片段，表明pcr擴(kuò)增成功。

3、制備焦磷酸測序單鏈模板：配制焦磷酸測序引物混合物，aldh2基因snp位點(diǎn)rs671及adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984的測序引物濃度比為1：1，引物混合物終濃度為10pmol/μl，震蕩混勻微離心。使用擴(kuò)增出條帶的pcr產(chǎn)物50μl與200μg鏈霉親和素包被的磁珠，在室溫25℃下孵育20分鐘，用vacuumpreptool將與磁珠結(jié)合后的pcr產(chǎn)物吸起，然后在70％乙醇中清洗10s；denatureationbuffer洗10s；最后移到washingbuffer中清洗20s；vaccumpreptool放入含有aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984測序引物的板中，搖動，釋放磁珠。將樣品放入85℃烘箱2分鐘，再冷卻到室溫。

4、焦磷酸測序：打開pyromark^tmidv1.0軟件，在snp測序模式下設(shè)置測序序列：c/tgc/taggacag；設(shè)置堿基加樣順序：actgctaga。室溫條件下，在焦磷酸測序儀(pyromarkq96id)上進(jìn)行測序反應(yīng)。

5、結(jié)果判定：帶生物素標(biāo)記的正向dna序列經(jīng)焦磷酸測序，測序結(jié)果圖中“actgctaga”的第二和第三位堿基“ct”為aldh2基因snp位點(diǎn)rs671多態(tài)性的判別位點(diǎn)，對應(yīng)正向序列的g/a；第四和第五位堿基“ct”為adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性的判別位點(diǎn)，對應(yīng)正向序列的g/a。

實(shí)施例3：臨床樣品檢測。

將本發(fā)明所述的焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的引物及方法對20例臨床樣本進(jìn)行aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性的同時(shí)檢測，檢測方法按照實(shí)施例2中的步驟實(shí)施。同時(shí)，使用普通焦磷酸測序法對樣品分別進(jìn)行aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性檢測，檢測結(jié)果與聯(lián)合檢測方法進(jìn)行比對。比對結(jié)果如表1所示：

表1樣品檢測結(jié)果對照表

利用本發(fā)明提供的的焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的引物及方法分析20例樣本得到的檢測結(jié)果與普通焦磷酸測序法得到的檢測結(jié)果一致。圖1為利用本發(fā)明提供的引物及方法檢測上述20例樣品時(shí)的部分結(jié)果圖；圖2為焦磷酸測序法檢測aldh2基因snp位點(diǎn)rs671多態(tài)性結(jié)果圖。

本發(fā)明所提供的引物和檢測方法在aldh2基因snp位點(diǎn)rs671和adh1b基因snp位點(diǎn)rs1229984多態(tài)性進(jìn)行準(zhǔn)確分型鑒定時(shí)，可實(shí)時(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程、反應(yīng)時(shí)間短、pcr產(chǎn)物簡單處理即可上焦磷酸測序儀測序、操作簡便及高通量樣品檢測，并比金標(biāo)準(zhǔn)方法，即毛細(xì)管電泳測序法靈敏度更高，更適合用于臨床檢驗(yàn)的要求。

sequencelisting

<110>杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

<120>一種焦磷酸測序聯(lián)合測序法檢測酒精代謝基因的引物及其應(yīng)用

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