本發(fā)明屬于微生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的試劑盒及方法。

背景技術(shù)：

細(xì)菌感染是臨床常見(jiàn)的感染性疾病，其發(fā)病率和死亡率高，如果得不到早期的診斷和治療，會(huì)嚴(yán)重危及患者的生命。從臨床樣本中直接分離得到細(xì)菌表示感染嚴(yán)重需要立即進(jìn)行抗菌治療。不同的致病菌對(duì)藥物種類和濃度的敏感性不同，治療成功的關(guān)鍵在于早期應(yīng)用合適足量的藥物。而傳統(tǒng)的檢測(cè)致病菌的方法如顯微鏡檢查、培養(yǎng)法、生物化學(xué)檢查和免疫學(xué)方法等，由于各種因素的影響，通常需要幾種方法聯(lián)合使用，而且耗時(shí)也較長(zhǎng)，需要1～3d，這期間用藥不當(dāng)往往使得患者病情加重或增加菌株耐藥性。特別是在多種細(xì)菌聯(lián)合感染的情況下，更增加了菌種鑒定和用藥的復(fù)雜性。因此，建立一種快速且特異性強(qiáng)的微生物檢測(cè)方法是十分必要的。

轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)(transcriptionmediatedamplification，tma)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種直接快速檢測(cè)rna的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，它克服了以往核酸擴(kuò)增的不足，更為簡(jiǎn)便高效，尤其適用于rna病毒的檢測(cè)。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(highresolutionmelting，簡(jiǎn)稱hrm)，是近年來(lái)興起的一種檢測(cè)基因突變、進(jìn)行基因分型和snp檢測(cè)的新工具，可以迅速的檢測(cè)出核酸片段中單堿基的突變。hrm技術(shù)主要是基于核酸分子物理性質(zhì)的不同。不同核酸分子的片段長(zhǎng)短、gc含量、gc分布等是不同的，因此任何雙鏈dna分子在加熱變性時(shí)都會(huì)有自己熔解曲線的形狀和位置。hrm技術(shù)的基本原理就是根據(jù)熔解曲線的不同來(lái)對(duì)樣品來(lái)進(jìn)行區(qū)分。焦磷酸測(cè)序(pyrosequencing)技術(shù)是新一代dna序列分析技術(shù)，被廣泛用于基因型分析領(lǐng)域。該技術(shù)無(wú)須進(jìn)行電泳，dna片段也無(wú)須特殊的熒光標(biāo)記，操作極為簡(jiǎn)便。本試劑盒借用tma技術(shù)和焦磷酸測(cè)序技術(shù)，開(kāi)發(fā)了一種tma-焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的試劑盒及方法，可以檢測(cè)二十余種臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌。本試劑盒主要用于輔助臨床醫(yī)生診斷和治療，其檢測(cè)臨床意義主要為：在進(jìn)行細(xì)菌感染治療時(shí)，合理正確地使用抗生素非常重要，而每種菌都有相應(yīng)適用的抗生素，如果不能快速準(zhǔn)確地鑒定細(xì)菌種類，就可能會(huì)導(dǎo)致手術(shù)治療失敗、并發(fā)癥增多、感染復(fù)發(fā)、住院時(shí)間延長(zhǎng)、昂貴抗生素及其它藥物的使用增加等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的試劑盒，以克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，從而細(xì)菌感染患者科學(xué)用藥提供依據(jù)和指導(dǎo)作用。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的引物和探針，包括如下序列：

(1)tma反應(yīng)引物：其核苷酸序列如seqidno.1～4所示；

(2)分子信標(biāo)探針：其核苷酸序列如seqidno.5～7所示；

(3)測(cè)序引物：其核苷酸序列如seqidno.8所示。

具體tma反應(yīng)引物包括正向引物f1、f2和反向引物r1、r2；

所述正向引物f1和反向引物r1的堿基序列表示如下：

正向引物f1：5’-gaagagtttgatcatggctcag-3’；

反向引物r1：5’-aattctaatacgactcactatagggagaaggttactcacccgtccgccact-3’；

所述正向引物f2和反向引物r2的堿基序列表示如下：

正向引物f2：5’-gcaacgcgaagaaccttacc-3’；

反向引物r2：5’-aattctaatacgactcactatagggagaaggacgacagccatgcagcacct-3’；

所述正向引物f1、f2的5’端標(biāo)記生物素；

所述反向引物r1、r2的5’端的31個(gè)堿基是增加的t7噬菌體啟動(dòng)子序列，而3’端20個(gè)堿基是與細(xì)菌16srrna互補(bǔ)的特異性序列；

所述分子信標(biāo)探針的堿基序列表示如下：

分子信標(biāo)探針p1：5’-gcgcggcctaatacatgcaagtcgagcgaacggacggggagcttgcccgcgc-3’；

分子信標(biāo)探針p2：5’-gcccgttagagatagaggcttcaccttcggaggacaatgtgaacgggc-3’；

分子信標(biāo)探針p3：5’-cgcgcgggccgaacacaaaaagttaagcttcttagcgccgattgtagccgcgcg-3’；

所述分子信標(biāo)探針p1在其寡核苷酸dna分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)cy5，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)dabcyl；p1的5’端和3’端的6個(gè)堿基是形成探針特征性發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖端區(qū)的反向互補(bǔ)序列，探針?lè)肿又虚g的40個(gè)堿基是與細(xì)菌16srrna反義鏈互補(bǔ)的特異性序列；

所述分子信標(biāo)探針p2在其寡核苷酸dna分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)hex，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)dabcyl；p2的5’端和3’端的7個(gè)堿基是形成探針特征性發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖端區(qū)的反向互補(bǔ)序列，探針?lè)肿又虚g的34個(gè)堿基是與細(xì)菌16srrna反義鏈互補(bǔ)的特異性序列；

所述分子信標(biāo)探針p3在其寡核苷酸dna分子的5’端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)fam，3’端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)dabcyl；p3的5’端和3’端的7個(gè)堿基是形成探針特征性發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖端區(qū)的反向互補(bǔ)序列，探針?lè)肿又虚g的40個(gè)堿基是與細(xì)菌16srrna反義鏈互補(bǔ)的特異性序列；

tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌試劑盒，該試劑盒包括rna提取試劑、2×tma反應(yīng)液、5×酶混合液、單鏈純化試劑、測(cè)序試劑。

其中，所述rna提取試劑包括：裂解液、洗滌液i、洗滌液ⅱ、洗脫液te；

所述裂解液包括如下組分：2～8m胍鹽、50～200mmtris、0.5％～10％體積百分?jǐn)?shù)的表面活性劑，所述胍鹽為異硫氰酸胍或鹽酸胍，所述的表面活性劑為tween20、np40或者tritonx-100；

所述洗滌液i包括如下組分：2～6m胍鹽、50～200mmtris、0.5％～10％體積百分?jǐn)?shù)的表面活性劑，所述胍鹽為異硫氰酸胍或鹽酸胍，所述的表面活性劑為tween20、np40或者tritonx-100；

所述洗滌液ⅱ包括如下組分：10～100mmtris、20～100mmedta、65～80％體積百分?jǐn)?shù)的乙醇；

所述洗脫液te包括如下組分：10mmtris、1mmedta，ph8.0。

其中，所述2×tma反應(yīng)液包括：0.4～1μmseqidno.1～4所示的寡核苷酸、0.05～0.5μm3種分子信標(biāo)探針、80mmtris-hcl(ph8.0)、24mmmgcl2、140mmkcl、2mmdntps、4mmntps和30％(v/v)二甲基亞砜。

其中，所述5×酶混合液包括：200um-mlv、1000ut7rnapol和105μgbsa；

所述單鏈純化試劑包含：75％(v/v)乙醇溶液，0.2mnaoh，10mmph7.6三(羥甲基)氨基甲烷醋酸鹽溶液，結(jié)合緩沖液，退火緩沖液，鏈親和素包被的磁珠；

所述測(cè)序試劑包含：dna聚合酶、atp硫酸化酶、熒光素酶、三磷酸腺苷雙磷酸酶、底物aps、熒光素和dntp。

上述tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌試劑盒在檢測(cè)致病細(xì)菌中的應(yīng)用。

使用上述tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌試劑盒檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的方法，包括步驟：

(1)待測(cè)樣品或細(xì)菌rna的提取；

(2)tma擴(kuò)增：取步驟(1)提取好的rna溶液5ul，加入10ul2×tma反應(yīng)液中，混勻，65℃，5min，41℃，2min；然后加入5ul5×酶混合液，混勻，置于41℃恒溫?cái)U(kuò)增30min(可直接放置roche熒光定量pcr儀上)；

(3)熔解曲線檢測(cè)：在熒光定量pcr儀上設(shè)置：95℃，2min；按照0.14℃/step升溫速率，從35℃到75℃逐漸升高溫度，熔解曲線分析程序記錄每一次升溫分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光值，meltinganalysis程序在熒光定量pcr儀(lightcycler480型，roche公司)上進(jìn)行；

(4)結(jié)果分析：根據(jù)步驟(3)中檢測(cè)樣本的熔解曲線峰值(tm)來(lái)判斷結(jié)果。首先是質(zhì)控系統(tǒng)判斷，即陰性對(duì)照和空白對(duì)照均無(wú)熔解峰，否則系統(tǒng)檢測(cè)無(wú)效。當(dāng)系統(tǒng)檢測(cè)有效時(shí)，判斷待測(cè)樣本結(jié)果，不同菌對(duì)應(yīng)不同熔解tm值；

(5)焦磷酸測(cè)序：當(dāng)按照步驟(4)無(wú)法判定出細(xì)菌種屬時(shí)，將步驟(3)產(chǎn)物取出與鏈親和素包被的磁珠結(jié)合進(jìn)行單鏈純化；然后將單鏈純化產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序；將測(cè)序結(jié)果與ncbi數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)確定所測(cè)樣本菌屬。

有益效果：

本發(fā)明的試劑盒根據(jù)目前已有的細(xì)菌16srrna基因序列的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物和探針，保證檢測(cè)方法的特異性。本發(fā)明采用改進(jìn)的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的核酸擴(kuò)增技術(shù)(tma)-熔解曲線技術(shù)-焦磷酸測(cè)序技術(shù)，特異性強(qiáng)，具有與pcr檢測(cè)方法相似的靈敏度，低污染(擴(kuò)增產(chǎn)物rna在自然環(huán)境下易于降解)、快速(tma-熔解曲線檢測(cè)只需要1小時(shí)左右，單鏈純化+焦磷酸測(cè)序也僅需1小時(shí)即可完成)，能在1小時(shí)左右完成臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌80％菌屬的鑒定，而2小時(shí)內(nèi)可完成所有臨床感染細(xì)菌種屬的鑒定。將在臨床微生物的快速鑒定和檢測(cè)分析中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說(shuō)明

圖1：異變形桿菌、陰溝腸桿菌、洋蔥克雷伯菌檢測(cè)結(jié)果圖，其中1為奇異變形桿菌、2為陰溝腸桿菌、3為洋蔥克雷伯菌、4為陰性對(duì)照、5為空白對(duì)照。

圖2：越南伯克霍爾德氏菌焦磷酸測(cè)序結(jié)果。

圖3：紐氏放線菌焦磷酸測(cè)序結(jié)果。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書(shū)中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

實(shí)施例1：一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的方法

1.提取臨床標(biāo)本rna(利用試劑盒中的rna提取試劑)

儀器：天隆np968核酸提取儀

步驟：

a.取5個(gè)臨床標(biāo)本，離心收集沉淀，加入300μl生理鹽水，混勻后轉(zhuǎn)移至96深孔板裂解孔中，加入300μl試劑盒中的裂解液，150μl異丙醇(自備)和20μl試劑盒中的磁珠；

b.核酸提取儀上提取rna，大約15～30min。

2.tma熔解曲線檢測(cè)

儀器：roche羅氏480ii實(shí)時(shí)熒光定量pcr

a.以步驟1所得rna為模板，利用細(xì)菌16srrna保守區(qū)的特異性引物(seqidno.1～4)和分子信標(biāo)探針(seqidno.5～7)進(jìn)行tma-熔解曲線檢測(cè)；

其中，所述的tma擴(kuò)增體系為：2×tma反應(yīng)液10μl(包含引物f1、f2、r1、r2和分子信標(biāo)探針p1、p2、p3)，5×酶混合液4μl，提取好的rna6μl；反應(yīng)條件為：65℃5min；41℃，30min；然后95℃，2min；35～75℃，升溫速率為0.14℃/step，收集每一次升溫分子信標(biāo)探針產(chǎn)生的熒光值。

b.根據(jù)步驟a所得熔解曲線tm位置的不同，完成常規(guī)細(xì)菌的鑒定，如圖1所示。

3.焦磷酸測(cè)序

儀器：qiagenpyromarkq96id測(cè)序儀

3.1單鏈純化：

對(duì)于一些不常見(jiàn)的或者步驟2不能完全區(qū)分的樣本，利用試劑盒中的單鏈純化試劑對(duì)步驟2的tma擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈純化,具體操作步驟如下：

1)在使用前，確保所有溶液都達(dá)到室溫；打開(kāi)烘箱電源開(kāi)關(guān)，使溫度達(dá)到80℃；

2)在psq96板中加入45μlannealingbuffer(退火緩沖液)和1-2μl10um的測(cè)序引物(seqidno：8)；

3)在振蕩器上充分混勻sepharosebeads(鏈親和素標(biāo)記的磁珠)；

4)將所需sepharosebeads量(按每樣本3μl計(jì)算)轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5mleppendorf管中；

5)在sepharosebeads中加入bindingbuffer(結(jié)合緩沖液)，使得平均每個(gè)樣品約有50μl的體積，在振蕩器上將混合物充分混勻；

6)將以上混合物加入tma擴(kuò)增產(chǎn)物(約50μl反應(yīng)體積)中，每樣本加50μl；

7)常溫下、在振蕩器上將pcr板混勻10分鐘，使得sepharosebeads與生物素標(biāo)記產(chǎn)物充分結(jié)合；

8)在vacuumprepworkstation中，四個(gè)液體槽中依次加入180ml純水、120ml70％乙醇、washingbuffer和denaturationbuffer；

9)打開(kāi)vacuumprepworkstation的泵，將vacuumpreptool在純水中清洗30秒；

10)將vacuumpreptool移到pcr板孔中，抓取結(jié)合了生物素標(biāo)記核酸的sepharosebeads；

11)拿起pcr板，檢查beads是否都被吸附在了vacuumpreptool上；

12)將vacuumpreptool放入70％乙醇中15秒，然后移到denatureationbuffer中15秒，再移到washingbuffer中清洗30秒；

13)把tool懸放在含有測(cè)序引物的psq板孔的上方，不要接觸液面，關(guān)掉泵，將vacuumpreptool放入含有測(cè)序引物的psq板中，旋轉(zhuǎn)搖動(dòng)，以釋放sepharosebeads；

14)將放有純化樣本的psq96板放在thermoplate上，置于80℃烘箱中加熱2分鐘，取出后冷卻到室溫，然后放入測(cè)序儀，進(jìn)行下游pyrosequencing反應(yīng)。

3.2純化完畢后清洗：

1)不開(kāi)真空泵和閥門，使用少量純水清洗vacuumpreptool，使少量未脫落的beads洗脫下來(lái)；

2)更換純水后再打開(kāi)真空泵和閥門，用約300ml純水清洗tool；

3)關(guān)掉真空泵和閥門，將vacuumpreptool側(cè)放，室溫晾干；

4)清洗所有盛裝試劑溶液的塑料槽，自然晾干；

5)用濕布擦拭純化設(shè)備表面。

3.3焦磷酸測(cè)序

1)調(diào)出設(shè)定好的運(yùn)行程序文件，點(diǎn)擊“view”的下拉鍵，選擇“run”，按照軟件自動(dòng)計(jì)算本次實(shí)驗(yàn)的各試劑使用量，添加各試劑成分至試劑加樣倉(cāng)；

2)把準(zhǔn)備好的樣本和試劑艙放入儀器相應(yīng)的位置，點(diǎn)擊屏幕右下端的“run”開(kāi)始焦磷酸測(cè)序；

3)檢測(cè)完成后，首先點(diǎn)擊軟件進(jìn)程狀態(tài)窗口的“close”鍵以保存測(cè)序結(jié)果；

3.4焦磷酸測(cè)序結(jié)果分析

1)在“sqaruns”文件夾中雙擊鼠標(biāo)，打開(kāi)上述運(yùn)行文件，選擇“sqamode”，點(diǎn)擊“analyzeall”鍵，對(duì)所有檢測(cè)標(biāo)本進(jìn)行分析；

2)讀取每個(gè)檢測(cè)樣本的堿基序列，在網(wǎng)上genebank中進(jìn)行比對(duì)分析，確定所檢測(cè)樣本菌屬類型，如圖2、圖3所示。

綜上，本發(fā)明所選取的靶序列，以及應(yīng)用本發(fā)明的試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、高效、實(shí)用、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌及疑難細(xì)菌，能夠滿足臨床檢驗(yàn)實(shí)際工作的要求，利于臨床細(xì)菌感染患者準(zhǔn)備合理地進(jìn)行抗菌藥物治療提供指導(dǎo)，進(jìn)而避免抗生素的濫用，為患者節(jié)省寶貴的治療時(shí)間，提高患者生活質(zhì)量。

sequencelisting

<110>杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司

<120>一種tma熔解曲線法聯(lián)合焦磷酸測(cè)序技術(shù)檢測(cè)臨床常見(jiàn)致病細(xì)菌的試劑盒及其應(yīng)用

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<212>dna

<213>引物f1

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<210>2

<211>51

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<213>引物f2

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<213>引物r2

<400>4

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<212>dna

<213>分子信標(biāo)探針p1

<400>5

gcgcggcctaatacatgcaagtcgagcgaacggacggggagcttgcccgcgc52

<210>6

<211>48

<212>dna

<213>分子信標(biāo)探針p2

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gcccgttagagatagaggcttcaccttcggaggacaatgtgaacgggc48

<210>7

<211>54

<212>dna

<213>分子信標(biāo)探針p3

<400>7

cgcgcgggccgaacacaaaaagttaagcttcttagcgccgattgtagccgcgcg54

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>測(cè)序引物

<400>8

ttactcacccgtccgccact20